일시적 또는 영구적 인 뇌허혈 모델에서 백혈구 부분 집단의 Stereological 및 유동 세포 계측법 특성

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Medicine
 

Summary

다음 스트로크 뇌 골수 세포 특성화 광학 분별 법을 이용하여 수행 Stereology를, 뇌의 유세포 분석에 의해 현탁액 백혈구 수있다. 둘 허혈성 뇌에서 발견되는 주된 서브 세트 골수 세포 표현형의 정확한 구별을 수행하는 유용한 기술이다.

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Ballesteros, I., Cuartero, M. I., Moraga, A., de la Parra, J., Lizasoain, I., Moro, M. Á. Stereological and Flow Cytometry Characterization of Leukocyte Subpopulations in Models of Transient or Permanent Cerebral Ischemia. J. Vis. Exp. (94), e52031, doi:10.3791/52031 (2014).

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Abstract

미세 아교 세포의 활성화뿐만 아니라 haematogenous 식세포와 호중구의 혈관 외 유출은 뇌졸중 후 뇌 손상에서 중추적 역할을하는 것으로 생각된다. 이 골수 세포 개체군은 서로 다른 표현형 및 기능을 표시하고 구별 할 필요가 있고 조직 손상에 대한 그들의 규제와 공헌을 연구하는 특징으로 할 수 있습니다. 정확한 stereological 방법 및 유세포 분석 :이 프로토콜은 뇌 면역 세포의 특성화를 위해 두 가지 방법을 제공합니다. stereological 체계적인 접근법은 랜덤 샘플링에 의해 추정이자 (뇌 경색)의 영역에서 세포의 총 수를 계산 광학 분별 법에 기초한다. 두 번째 접근법은 특성화 뇌 현탁액 백혈구를 분리 및 미세 아교 세포의 특성 분석을 허용 유세포들을 특성화하는 간단한 방법을 제공하고, 단핵구 및 호중구 허혈성 조직의 침투. 또한, 교리독점적 사망률의 낮은 속도 및 카발리 법으로 경색 량을 특성화 뇌 조직 학적 처리 절차 재현성 경색을 발생, 뇌 피질에 영향을 쥐 뇌허혈 모델 etails.

Introduction

형태 학적 표현형 및 미세 아교 세포 유전자 발현의 변화뿐만 아니라, 혈관 외 유출 및 haematogenous 식세포의 활성화 및 호중구가 뇌 손상 1-4 다음 병리 생리 캐스케이드에서 핵심적인 역할을 수행 할 것으로 생각된다. 이 프로토콜은 두 가지 방식 허혈성 뇌 골수 세포의 다른 서브 세트들의 수를 추정하고 자신의 표현형을 특성화를 수행하기 위해 제공한다. 또한, 또한, 방법 경색을 평가 포함 원위부 중뇌 동맥 일시적 또는 영구적 결찰 (MCA) 및 총 경동맥 (CCA)로 구성되어 마우스에서 대뇌 허혈 실험 모델의 설명을 제공한다 stereological 소프트웨어를 사용하여 정확한 카발리 법에 의해.

허혈성 뇌의 골수 세포의 서브 세트를 결정하기에 첫 번째 방법은 광학 분별 접근법에 기초하여 5 stereological 방법이다. 이것은 대부분이며일반적으로 생명 과학 분야 stereological 프로브를 사용하고 오류 5-7의 낮은 계수와 높은 정확도를 제공한다. 이 때문에 섹션으로 조직의 분열의 세포 추정에 대한 편견을 피할 수로 조직이, 섹션으로 잘라 때이 세포 정량을위한 최고의 선택입니다. 이 방법은 숫자, 역학과 허혈성 조직 (8)의 침투 호중구 개체군의 표현형 변화를 특징 짓는 매우 강력한 방법입니다.

두 번째 접근법은 특성화 뇌 백혈구 현탁액을 분리 및 유동 세포 계측법에 의해이를 특성화하는 간단한 방법을 제공 캄파넬라 협력자 (9)로부터 개질 된 프로토콜에 기초한다. 종래의 면역 조직 화학 기법과 대조적으로, DIFF에 기초하여 자신의 골수 세포 (CD45 하이는 CD11b +)을 특성화 (LO는 CD11b + CD45) 미세 아교 세포를 구별 허용 유동 세포 계측법 및 침투CD45 9-13의 erent 발현 수준. 또한, 염증성 단구 (CD45 안녕으로 CD11b + LY-6G - LY-6C 안녕은), 호중구는 (CD45 안녕으로 CD11b + LY-6G +) 및 허혈성 조직의 다른 백혈구 부분 집합 구별 할 수있다. 이 접근법은 뇌 허혈 실험 모델에서 신경 염증을 평가하는 신뢰성 있고 신속한 분석을 제공한다. 그러나, 조직 처리가 활성화 상태와 반 정량적 특성을 제공 허혈성 조직에서 발견되는 다양한 세포 집단의 수에 영향을 미칠 수있다.

Protocol

참고 : 대학교 콤 플루 텐세의 동물 복지위원회의 가이드 라인에 부착 된 모든 실험 프로토콜 (EU 지침 609분의 86 / CEE 및 65분의 2,003 / CE 다음).

1. 뇌허혈 모델

참고 :이 논문에서 뇌허혈 모델은 나일론 봉합사로 결찰에 의한 CCA (경동맥)과 MCA (중뇌 동맥) 모두의 영구적 또는 일시적 폐쇄를 포함한다.

  1. 수술 전 준비
    1. 고압 증기 멸균 또는 유리 구슬 살균기 모든 수술기구를 소독. 뿐만 아니라 70 % 에탄올로 소독 외과 영역.
    2. 적절한 마취제와 마우스를 마취. 2.5 % 이소 플루 란으로 유도를 달성하고 증발기를 사용하여 80 % 공기 / 산소 20 %의 혼합물에 이소 플루 란으로 1.5 %를 유지한다. 마취 동안 건조를 방지하기 위해 마우스 눈에 인공 눈물을 적용합니다.
    3. 수수료에 연결된 가열 패드에 마우스를 놓고수술하는 동안 생리 학적 수준에서 온도 직장에 배치 프로브와 설정 온도 (36.5 ± 0.5 ° C)와 dback 장치.
  2. 결찰에 의한 경동맥 동맥 폐쇄
    1. 지느러미 드러 누움에 마우스를 놓고 테이프로 고정. 70 % 에탄올 또는 포비돈 - 요오드와 피부를 소독 상부 복부 부분의 머리를 잘랐다.
    2. 수술 현미경, 목의 복부 표면 주위에 1cm의 중간 선 절개를합니다.
    3. 떨어져 모든 연부 조직 (서브 상악, 설하 및 이하선을 포함한 유선 조직)를 당겨 기관에 측면 지역화 왼쪽 경동맥 (CCA)를 식별합니다. 근육을 후퇴 왼쪽 CCA를 노출합니다. 조심스럽게 미주 신경의 해부.
    4. 일단 6/0 나일론 봉합사를 사용하여 합자하여 왼쪽 CCA를 폐색, 해부. (일시적인 뇌허혈 모델 원한다면 재관류를 허용하도록) 또는 영구 매듭 매듭으로 결찰.
    5. 원래의 위치로 유선 조직을 놓고 6/0 나일론 봉합사 목 피부에 절개를 닫습니다.
      참고 : 가짜 동물 MCAO 동물과 같은 수술을 실시하지만, CCA는 폐색되지 않습니다.
  3. 결찰에 의한 말초 중뇌 동맥 폐쇄
    1. 그 오른쪽에 마우스를 놓고 테이프로 고정. 70 % 에탄올 또는 포비돈 - 요오드와 두피를 소독 마우스 머리털을 절단 (절단 후 모발을 제거).
    2. 수술 현미경, 눈과 귀 사이에 피부 절개를합니다. 멀리 피부를 이동하고 테이프로 누르고 있습니다.
    3. 오른쪽에서 왼쪽으로 시간적 근육 절개를 가로. 그런 다음, 시간적 근육의 오른쪽에 제 2 수직 절개를 (절단 시간 정맥 않도록주의). 두개골에서 시간적 근육 떨어져 당겨 깨끗한 두개골 표면을 유지하기 위해 봉합을 누르고 있습니다.
    4. 두개골 표면을 청소저온 멸균 식염수로 두개골 투명성 통해 좌측 중대 뇌동맥 (MCA)의 정확한 위치를 검출한다. 광대뼈 아치와는 squamosal 뼈 사이의 전두엽의 스테인레스 스틸 버 라운드 개두술을 (직경 1mm) 수행합니다. 신중하게 두개골을 제거하고 MCA를 노출합니다.
    5. 뇌의 표면에 감기 멸균 식염수 용액을 소량 바르고 집게를 사용하여 수막 (경질 및 지주막의 mater)을 제거한다.
    6. 단지 정면과 후방 MCA 가지 사이의 분기점 전에 말초 트렁크 왼쪽 MCA의 결찰을 수행합니다. 9/0 나일론 봉합사를 사용하여 합자하여 왼쪽 MCA를 막다. (일시적인 뇌허혈 모델 원한다면 재관류를 허용하도록) 또는 영구 매듭 매듭으로 결찰. CCA와 MCA 폐색 사이의 기간은 작업자의 경험에 따라 약 10~20분입니다.
    7. 원래의 위치로 시간 근육을 놓고 incisio을 닫습니다6/0 나일론 봉합사와 목 피부에 명.
    8. 마취 (일반적으로 5 ~ 10 분)에서 복구 및 부 프레 노르 핀의 복강 내 (IP) (0.3 ㎎ / ㎏)와 마우스를 주입하는 케이지에 마우스를 돌려줍니다.
      1. 불편을 감지하는 몇 시간 동안 마우스를 모니터 (이 흉골 드러 누움을 유지하기 위해 충분한 의식을 회복 할 때까지 무인 마우스를 두지 마십시오). 손실 수술 후 체중이 일반적으로 관찰되기 때문에, 식사를 용이하게하기 위해 페트리 접시에 으깬 음식을 놓습니다.
    9. 동물이 완전히 회복 될 때, 다른 동물의 회사로 돌아갑니다.
    10. 과도 MCAO 모델이 요구되는 경우, 다시 마우스를 마취하고 (일반적으로 0.5-2 시간 (도 1) 사이) 재관류를 허용 CCA와 MCA의 매듭을 제거한다.
      참고 : 가짜 동물 MCAO 동물과 같은 수술을 실시하지만 MCA는 폐색되지 않습니다.

2. 관류 및 섹션에 ì뇌 조직의 oning

  1. 24 MCAO 후 48 시간은, 치명적인 마취제의 투여 (예를 들어, 펜 토바 비탈 나트륨, IP 86 ㎎ / ㎏ 또는 이소 플루 란과 과다 복용)와 마우스를 희생.
  2. 인산 완충액에서 4 % 파라 포름 알데히드 (PFA) (PH 7.4)이어서 인산염 완충액과 0.1 M 마우스를 관류.
  3. 다음과 같이 뇌를 제거합니다 :
    1. 바로 위에 척수 동물 참살.
    2. 두개골을 노출 머리의 피부에 후방 - 전방 절개를합니다. 측면 벽의 접합부와 두개골의 바닥에 두 개의 측면 컷을 확인하고 뼈의 작은 조각을 제거합니다.
    3. 시상 봉합 따라 두개골을 통해 상처를 확인합니다.
    4. 뇌를 노출 집게를 사용하여 각 반구를 덮는 두개골을 제거합니다. 두개골에서 뇌를 분리하고 4 % PFA 솔루션으로 전송하기 위해 주걱을 사용합니다.
  4. 4 ºC에서 4 % PFA 솔루션에서 3 시간 동안 후 수정.
  5. PFA 솔루션 및 incubat 제거뇌를 cryoprotect 30 % 자당 용액에 48 시간 동안 뇌 전자.
  6. 자당 용액을 제거하고 차가운 이소 펜탄 (-40 ° C)에 신속하게 뇌를 동결. 스토어는 -80 ºC에서 뇌를 냉동.
  7. 동결 박절기와 코로나 뇌 섹션 (30 μm의)을 구합니다. cryopreservative 솔루션 10 개의 시리얼 세트를 수집합니다. 각 직렬 세트는 적절 브레 그마에 1.94와 -2.46 후방 사이에 마우스 뇌 샘플 300 μm 인 interslice 거리를 약 14 ~ 16 관상 조각으로 구성되어있다.

3. Nissl 염색 및 경색 볼륨 평가

  1. 크레 실 바이올렛으로 Nissl 염색
    1. superfrost 현미경 슬라이드에 마운트 뇌 섹션. 섹션 7-8의 대략 총 수; Nissl 염색 섹션 카발리 법에 의한 경색 량 검지, 1/20 슬라이스 샘플링 분획 (단계 2.7에서 수집 된 10 개의 직렬 세트들 중 하나의 1/2 부분을 사용 600 μ의 interslice의 거리; m)이 사용된다. 적절한 전후방 방향을 유지하기 위해주의 (경색 영역은 오른쪽에 배치됩니다).
    2. 다음과 같이 기존의 Nissl 염색을 수행합니다
      1. 슬라이드 장착 단원에서는 몇 시간 동안 건조시킵니다.
      2. 슬라이드 장착 섹션을 재수 5 분 동안 0.1 % 크레 실 바이올렛 용액으로 염색.
      3. 등급의 EtOH로 탈수 시리즈 (70 %, 90 %, 100 %; 변화 당 5 분). 자일 렌과 슬라이드에 장착 된 부분을 청소, distrene-80 가소제 자일 렌 (DPX) 설치 미디어를 추가하고 유리 커버 슬립 커버.
  2. 카발리의 방법에 의한 경색 량 추정 stereological 소프트웨어를 사용하여 직렬 섹션 Nissl을 묻은
    1. (카발리 방법 (14) 및 카메라, 컴퓨터 동력 XYZ 스테이지 장착 현미경으로 구성 Stereology를 시스템 및 소프트웨어 stereological 경색 량을 계량하는 메인을 표 1에 나타난 파라미터를 사용하여) 아래 방향은 PC에 관련되어 있지만, 방향이 다른 운영 체제에 따라 다를 수 있습니다.
    2. 적절한 순서에 PC, 현미경, 무대 컨트롤러와 카메라를 켭니다. stereological 소프트웨어를 시작합니다.
    3. 장소에 10 배 목표를 이동하고 다운 메뉴 목적 드롭 10X를 선택합니다.
    4. 첫 번째 Nissl 염색 섹션에서 이동하고 적절한 기준점을 찾을 수 있습니다. 기준점을 설정하기 위해 마우스를 클릭 (활성 기쁨 무료 버튼에 필요한 이동시킬 수 있습니다).
    5. "장착 부분의 두께"(계정에 수축을 고려하여 실제 섹션 두께) 추정. "초점 위치 측정기"버튼을 누르고 섹션의 아래에서 위로 두께를 계산합니다.
    6. contralesional과 ipsilesional 영역과 경색 영역에 대한 윤곽 도구를 만듭니다.
      1. 메뉴 "디스플레이"를 클릭하고 "디스플레이 설정"을 선택합니다. 이 t을 엽니 다그는 설정 대화 상자를 표시합니다.
      2. "형상 유형을 추가" "윤곽"탭을 선택하고 버튼을 클릭합니다.
      3. 정량화 다운 메뉴 윤곽에는 표시하기 위해 각 지역에 대한 윤곽을 만듭니다. 확인을 클릭합니다.
    7. contralesional 및 ipsilesional 반구와 경색 영역 마커 도구를 만듭니다.
      1. 메뉴 "디스플레이"를 클릭하고 디스플레이 설정 대화 상자를 엽니 다 "디스플레이 설정"을 선택합니다.
      2. "마커"탭을 선택하고 사용 가능한 마커를 통해 두 번 클릭하여 이름을 마커를 변경합니다. 마커 표시 줄에는 표시합니다. 확인을 클릭합니다.
    8. 과장을 활성화합니다.
      1. 메뉴 "도구 / 시리얼 과장"을 클릭합니다. "새로운 섹션"버튼을 사용하여 새 섹션을 추가합니다. 이 버튼은 "직렬 제 설정 대화 상자"를 엽니 다.
      2. 30 μm의로 "블록 사전"을 설정합니다. 설정단계 3.2.5에서 추정 한 값으로 "장착 부분의 두께".
      3. 20.로 "평가 간격에게"1/20 슬라이스 샘플링 비율을 설정합니다.
      4. 0 확인을 클릭로 "첫 번째 섹션의 상단에 대한 Z 축 값을"설정 1로 "시작 섹션 번호"를 설정합니다.
    9. 반대쪽 반구의 윤곽을 윤곽을 그립니다.
      1. Contralesional 반구 도구를 선택 다운 메뉴 형상으로부터 (이전 단계 3.2.6에서 만든).
      2. 반대쪽 반구의 윤곽을 윤곽을 그립니다.
      3. contralesional 반구를 추적 마치려면 마우스 오른쪽 버튼을 클릭하고 "형상 닫기"를 선택합니다.
    10. 카발리 에리에 의해 contralesional 반구의 윤곽을 추정한다.
      1. 메뉴 "프로브"를 클릭하고 카발리 에리 견적을 선택합니다. 100 ㎛로 "그리드 간격"을 설정합니다. 0 "B 설정으로"그리드 회전 "을 설정30 μm의로 "사전을 잠급니다. 확인을 클릭합니다.
      2. 마커 바에서 "contralesional 반구"버튼을 선택합니다. 마우스 오른쪽 Contralesional 반구 형상의 내부를 클릭합니다.
      3. "페인트 카발리 에리 마커 모드"를 선택합니다. 마우스 오른쪽 단추로 다시 contralesional 반구 윤곽 내부를 클릭하고 "형상에 페인트 마커"를 선택합니다.
      4. 프로브 및 카발리 에리 견적을 클릭하여 카발리 에리 견적을 비활성화하고 마커 바에서 contralesional 마커 버튼을 비활성화합니다.
    11. ipsilesional 반구 경색 영역 (단계 3.2.7와 3.2.8)에 대해 동일한 절차를 반복합니다. 각 섹션의 영역의 추정 후에 데이터를 저장한다.
    12. Nissl 염색 섹션의 나머지 부분에서, 반대측 ipsilesional 및 경색 영역을 계산합니다.
      1. 단계 3.2.6에서와 같이 새 섹션을 만듭니다. "직렬 섹션 설정"대화 상자에 입력 된 값을 수정하지 마십시오. 확인을 클릭합니다.
      2. 단계를 반복 3.2.7-3.2.8 새로운 섹션.
    13. 스프레드 시트 파일에 정량의 결과를 내 보냅니다.
      1. 스테레오 탐정 메뉴에서 "프로브"를 클릭합니다. "디스플레이 프로브 실행 목록"을 선택합니다. 이것은 "이전 Stereological이 대화 상자를 실행합니다"가 열립니다.
      2. 그들을 클릭하여 모든 섹션을 선택합니다. "결과보기"버튼을 누릅니다. 이는 각 지역의 예상 지역 및 볼륨이 표시되는 경우 "카발리 에리 견적이 결과"가 열립니다.
      3. 스프레드 시트 파일에 결과를 내보내려면, 각 지역 (표 2)에서 얻은 주요 결과를 Excel 파일로는 "클립 보드로 모든 결과를 복사"붙여 넣기를 클릭합니다.
    14. mm 3 나, 어디 공식 15 % IH = InfVol / ContrVol * 100을 사용하여 (%의 IH) 경색 인 반구 %로 익스프레스 경색 볼륨
ove_content "> InfVol (경색 조직 권) = ΣInfArea 내가,
ContrVol (Contralesional 반구 볼륨) = ΣContrArea

광학 분별에 의한 뇌허혈 후 침투 호중구 4. Stereological 정량화

  1. 뇌 단면 염색 :
    1. 광학 분별 기 (16)에 의해 호중구 침윤 MCAO 이후의 총 수를 추정하는, 1/10 슬라이스 샘플링 분획을 사용한다. 쥐 방지 Ly6G 항체 (1A8)과 자유 부동 섹션의 오른쪽 이차 항체와 기존의 면역 형광 기법을 사용하여 발현 사이 호중구. 그것은 호중구 식별을 위해 필요한 것은 아니지만 또한, DAPI 또는 TOPRO 같은 핵 머신으로 대조 염색, 경색 영역을 식별하는 것이 용이 할 수있다.
    2. 오른쪽에 배치 경색 면적 superfrost 현미경 슬라이드에 마운트 뇌 섹션.
  2. Quantific광학 분별에 의한 허혈성 뇌에 침투 백혈구의 ATION
    1. 표 3에 나타낸 파라미터를 이용 Stereology를 시스템과 광 방식에 의해 분별 허혈성 뇌의 백혈구 침투를 정량화한다. 섹션 3에서 단계를 3.2.1-3.2.5 반복합니다.
    2. 이 섹션 3의 단계 3.2.6에 설명 된 바와 같이 경색 영역에 대한 윤곽 도구를 만듭니다.
    3. 이 섹션 3의 단계 3.2.7에 설명 된 바와 같이 호중구 마커 도구를 만듭니다.
    4. 과장을 활성화하고 단계 3.2.8에서와 같이 새 섹션을 만들 수 있습니다. 이 경우에, (1/10 슬라이스 샘플링 분획 호중구 수를 추정하기 위해 사용된다) 10 "평가 간격"으로 설정.
    5. "경색 영역"윤곽 도구를 선택 다운 메뉴 형상으로부터 (이전 단계 4.2.1에서 만든). 10X 목적의 경색 영역을 대략적으로 윤곽을 그립니다. neutroph을 수행하기 위해 100 배에 목적 변경위원장 정량 (다운 메뉴 목적 드롭 100X를 선택하는 것을 잊지 마세요).
    6. 메뉴 "프로브"를 클릭하고 "광학 분별"을 선택합니다. X와 Y의 격자 크기를 모두 230으로 "프레임을 계산의 XY 배치"로 설정합니다. 30 μm의로 "블록 사전"0 설정으로 "그리드 회전"을 설정합니다. 확인을 클릭합니다.
    7. 마커 바에서 "호중구"버튼을 선택합니다. 마크 경색 지역에서 호중구 스테인드. 마무리되면, "프로브"와 "광학 분별"을 클릭하여 광학 분별 프로브를 비활성화합니다. 마커 바에서 호중구 버튼을 비활성화합니다.
    8. 각 섹션 (4.2.4-4.2.9)에 대해 동일한 절차를 반복합니다.
    9. 스프레드 시트 파일에 정량의 결과를 내 보냅니다.
      1. 스테레오 탐정 메뉴에서 "프로브"를 클릭합니다. "이전 Stereological 실행합니다"를 열고 "프로브 실행 목록을 표시"를 선택대화 상자를 표시합니다.
      2. 그들을 클릭하여 모든 섹션을 선택합니다. 호중구의 예상 번호가 표시됩니다 "광학 분별 결과"를 엽니 다 "결과보기"버튼을 누릅니다.
      3. 스프레드 시트 파일에 "클립 보드로 모든 결과를 복사"붙여 넣기를 클릭하여 스프레드 시트 파일에 결과를 보냅니다.

5. 뇌 해리와 유동 세포 계측법 분석

주 : 신선한 뇌 조직에 대한 유세포 분석기 골수성 모집단 특성화 고정 뇌 면역 염색 된 부분에서 수행 이전 호중구 특성화에 대한 대안으로서 사용될 수있다.

  1. 뇌 분리 및 단일 세포 현탁액 준비
    1. 확인 10 ㎖ / RPMI (로스웰 파크 메모리얼 연구소 매체)의 동물 RPMI 8 ㎖, 30 % 퍼콜 1 ㎖ 및 10 배 PBS (인산 완충 생리 식염수) 1 ㎖를 함유하는 용액 -Percoll.
    2. R단계 2.3에 설명 된대로 MCAO 후 가져 가십시오 마우스 뇌.
    3. 현미경, 뇌에서 뇌 허혈성 마우스에서 동측 피질 (또는 가짜와 순진한 동물에 대한 유사한 지역)의 코어 및 경색 주변 지역을 해부하다. 뇌 조직 무게를 빙냉 RPMI-퍼콜 (가중치 스텝은 실험군 간의 정규화 행할 수있다) 5 ㎖ 넣.
    4. 테플론 방앗와 포터 Elvehjem 형 조직 분쇄기를 사용하여 단일 세포 현탁액 중의 조직을 해리.
    5. 50 ㎖ 초 원심 분리기 튜브에 세포 현탁액을 전송하고 샘플 RPMI-퍼콜 솔루션의 5 개를 가하여.
    6. 25 ºC에서 30 분 동안 7,800 XG에 세포 현탁액을 원심 분리기. 원심 분리 후, 미엘린에 대응 백색 착색 층이 용액의 상단에 표시되도록.
    7. 40 ㎛의 나일론 메쉬 straine 통해 펠렛 세포를 포함 신중 미엘린 층을 제거하고, 전체 세포 현탁액을 필터R.
    8. 50 ML 튜브에서 솔루션을 모든 세포가 필터링되어 있는지 확인하고 배치하는 스트레이너에 RPMI의 10 ML을 추가합니다. 실온에서 10 분 동안 600 XG에 세포 현탁액의 50 ㎖를 RPMI의 30 ML을 추가하고 원심 분리기.
    9. 뜨는을 취소하고 PBS 1 ml로 백혈구 펠렛을 재현 탁. 용해 완충액 (150 mM의 CL NH 4, 10 mM의 NaHCO3을 0.1 mM의 EDTA) 4 ㎖에 첨가하고, 세포 현탁액에서 적혈구를 용해시키기 위해 RT에서 2-3 분 동안 세포를 배양한다. 4 ºC에서 10 분 동안 600 XG에 용액을 원심.
  2. 세포 염색 및 유동 세포 계측법
    1. PBS-BSA (1 %) 한 200 μl를 포함, 유동 세포 계측법에 대한 라벨링 칵테일을 준비합니다 (100) 된 Fc-블록, 1시 40분 항 CD45-를 PerCP 쥐, 1시 40분 방지 Ly6G-APC 쥐, 1시 40분 방지 CD11b를-FITC 쥐와 ​​샘플 당 1시 40분 방지 LY-6C-PE 쥐.
    2. 라벨 칵테일의 세포를 재현 탁과 얼음에서 45 분 동안 샘플을 품어.
    3. 라벨 칵테일을 씻으십시오차가운 PBS 1 ml의 원심 ºC 4에서 10 분 동안 600 XG에 세포. FACS 흐름의 100 μL로 펠렛을 재현 탁하고 유동 세포 계측법에 의하여 전체 세포 현탁액을 획득.
    4. 세포 집단을 특성화하고 정량화 분석 소프트웨어 유동 세포 계측법을 사용합니다.
      1. CD45는 CD11b + LO :이 프로토콜은 다음과 같이 제조 표지 칵테일에 대응 메인 백혈구 아형이 특징 화 상주 소교 세포; CD45 하이는 CD11b + LY-6G + : 호중구; CD45 하이는 CD11b + LY-6G - LY-6C 안녕하세요 : 염증성 단핵구.

Representative Results

여기에 도시 뇌허혈 모델 선조체 관개 MCA의 lenticulostriatal 분기 (도 1)에 흡장되지 않으므로 선조체 조직에 영향을주지 않고 단독으로 본 피질 경색을 발생시킨다. Nissl 염색으로, 손상된 영역은 담색 피질 영역 (도 2)로 식별 할 수있다. 이 모델은 Nissl 염색 섹션에서 카발리 에리 방법에 의해 추정 MCAO (% IH 15.89 ± 0.28) (그림 2) 후 24 시간에서 높은 재현성 경색 볼륨을 특징으로한다. 카발리 법에 의한 경색 부피의 추정 및 contralesional ipsilesional 반구 Gundersen 님의 에러 (CE)의 계수뿐만 아니라 경색 영역 (표 2)에서 반사되는 낮은 에러와 함께 정확한 접근법이다. 손상된 조직 부피는 3 mm에서뿐만 아니라 섹션 3.2.13에 수식을 이용한 %를 IH로 표현 될 수있다. 또한, 추정ipsilesional contralesional 영역과의 합계 용적의 경색 부피를 보정하고 손상된 조직 (표 2)의 과대 평가를 피하기 위해 부종 지수의 계산을 허용한다.

뇌 조직의 일련 단면 처리 감안 이것은 광학 분별 방법 (도 3표 4)를 사용하여, 허혈 영역에 침투 호중구와 같은 세포의 아 집단의 총 수의 정확한 추정을 수행의 장점을 취할 수 표 3 매개 변수.이 프로토콜은 24 시간과 pMCAO (그림 3D) 후 마우스에서 82,856 ± 8,143 48 시간에 23,328 ± 3,623의 경색 지역에서 호중구 (Ly6G 양성 세포)의 총 수를 추정하고있다. 이전의 연구와 일치, 호중구의 침윤 직접 경색 크기 (그림 3E)와 관련된다. t 추정광학 분별 법에 의해 호중구의 수는 그 Gundersen 님 (표 4)에 의해 반사되는 CE 낮은 에러와 함께 정확한 접근법이다.

백혈구 분리 및 특성화 프로토콜을 유동 세포 계측법은 허혈성 마우스의 ipsilesional 반구의 피질에서 47,922 ± 23,174 골수 세포의 분리를 할 수 있습니다. 이 세포 현탁액에있는 이벤트 총 10-30 %로 포함한다. 세포 파편 (그림 4)에 관련이 프로토콜에 존재하는 낮은 FSC 매개 변수를 사용하여 캡처 사건의 대부분. CD11b를 염색으로 CD11b + 세포는 이전에 표시된 바와 같이이 200 9에서 FSC 임계 값을 설정하여 상기 분석에서 제외 될 수 있음을, 세포 파편이 마커로 표지되지 않은 것을 시사하고, (도 4)보다 높은 FSC 값을 가지고 있음을 보여준다. 이 방법으로 얻은 세포 파편의 양에 따라 샘플 과정에 그 차이를 알 수ING (타이밍, 조직 보존, 시료 온도 효율적인 제거 미엘린 등) 그것을 차지하고있다. 또한, 셀 멤브레인의 사용은 시료에서 셀룰러 클램프의 존재를 피하기 위해 필요하다; 이 단계는 이전의 세포 얼룩을 수행해야합니다. CD11b를 발현하고 CD45에 기초도 5에 도시 게이팅 전략을 사용하여, 우리는 허혈성 조직에 침투 거주자 골수 세포를 구별 할 수있다. 허혈성 반구이는 CD11b + 인구 증가는 (도 4,도 5표 5) 순으로 이들 세포의 대부분이 미세 아교 세포는 허혈 후 확산되어있는 것을 나타내는 CD45의 낮은 발현에 관련되는 가짜 그룹과 비교했을 때 . 허혈성 뇌는 CD11b + CD45 하이 셀 모집단의 출현에 의해 입증되는 바와 같이 이러한 차이 (인해 주변으로부터 세포 침윤에도 4 쉽다그림 5와 순진한와 가짜 뇌에서 적은 수이다 표 5). 뇌 허혈는 CD11b + 세포 침윤 인구의 기여는 매우 역동적 인 과정 4이다. 결찰에 의해 MCAO 모델에서, 30 % 내지 병변의 크기 및 특성이 행해졌 시간 따라 합계는 CD11b + 세포의 60 %로 변할 수있다. LY-6G + 세포로서 특성화 호중구, 그들이는 CD11b + CD45의 70-80 %가 포함 같이, 뇌허혈이 모델을 이용하여 허혈성 마우스 뇌 MCAO 이후 24 시간에서 발견되는 가장 많은 침윤 세포 집단이다 하이. LY-6C 하이 염증성 단핵 세포 - 세포의 나머지는 대부분으로 CD11b + CD45 하이 LY-6G의 하위 집단이다. 이 모델에서는, 본 인구 (24)로부터 48 시간 후 MCAO에 허혈성 뇌 영역의 수를 증가시키는 것이다.


그림 1 :. MCA의 결찰 수술 (A) 시간적인 근육의 수축 후에는, 작은 개두술은 마우스 두개골에서 수행된다. MCA는 매듭 또는 9/0 봉합사를 사용하여 매듭 결찰한다. (B) MCAO 모델에 의해 생성 된 대뇌 피질의 병변의 대표 이미지. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 2
그림 2 : 카발리 에리에 의해 경색 볼륨의 정량화. (A) Nissl 염색 뇌 섹션의 대표 이미지 영구 MCA 결찰 후 24 시간. 높은 배율 Nissl 염색 후 hipocromatic 영역을 보여주는MCAO 후 손상된 영역 (코어)를 식별합니다. 경색 주변 (PI) 영역이 또한 도시되어있다. (B) (N = MCAO 이후, 일련 Nissl 염색 섹션 50 쥐를 24 시간을 카발리 방법을 사용하여 % 경색 반구 (%의 IH)로 표현 경색 량 정량 ).

그림 3
그림 3 : 경색 영역 (24)에서 호중구 및 결찰 후 48 시간의 Stereological 정량화, 광학 분별 방법을 사용. MCAO 후 24 시간에서 허혈 영역에 침투 호중구 (Ly6G 양성 세포)의 (A) 대표 이미지입니다. 경계 획정은 경색 영역을 보여줍니다. (B, C) ​​광학 분별에 의한 호중구 정량 광 해부학자의 예. (D) (24)의 경색 지역에서 총 호중구의 정량화 및 48 시간 (N = 4 마우스). (E)경색 (24)의 크기와 MCA 결찰 후 48 시간과 호중구의 수의 상관 관계. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 4
그림 4 :. 물리적 매개 변수 (SSC와 FSC)에 기초 순진, 가짜 허혈성 (MCAO 후 24 시간) 반구에서 얻은 뇌 백혈구의 대표 도트 플롯 분산 분석으로 CD11b (빨간색)을 표현하는 이벤트의 인구는 확인되었다 모든 그룹에서. 이 인구는 CD45의 발현에 따라 게이트 및 특징이었다. CD45 (녹색) 낮은 수준을 발현하는 세포는 허혈 및 비 허혈성 뇌 피질의 존재 및 소교 세포에 맞습니다. 대조적으로, 세포 (노란색) 높은 수준의 CD45를 발현 만했다허혈성 반구와 가짜 그룹의 낮은 정도에서 발견. 는 CD11b + CD45 안녕하세요 인구의 추가 분석 호중구 (LY-6G + 세포, 파랑)과 염증성 단핵구 (LY-6C 안녕 세포, 오렌지)가 주요 세포 뇌에서 발견 소집단 뇌졸중 후 24 시간을 침투 있음을 나타냅니다. 제발 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 5
도 5 :. 허혈성 조직에 침투 된 골수 세포로부터 상주 차별화 전략 게이팅는 CD11b + 세포는 먼저 이소 타입 형광 강도 (A)에 따른 게이트 하였다. 허혈성 뇌의 세포 현탁액의 대표 도트 플롯은 패널의 위쪽 오른쪽 모서리에 표시됩니다. 에또한,이 기술을 이용하여 취득한 이벤트들의 총 수 및 CD11b를 + 이벤트 수에 대한 일반적인 값은 (도시 아니 셀 / 허혈성 뇌 반구]. (A)는 CD11b + 세포의 CD45 형광 강도 분석을 패널에 나타낸다 게이트는 CD11b + 아군의 CD45와 CD11b를 표현의 B. 대표 도트 플롯 분석은 패널의 위쪽 오른쪽 모서리에 표시됩니다. 또한, 허혈성 뇌 반구 당 획득 CD45 보라 CD45 안녕 세포의 전형적인 수가이 기술을 사용하여 (B)에 도시되어있다.

카발리 에리 방법에 사용되는 매개 변수
섹션 두께 (t) 30 μm의
목표 10X
슬라이스 샘플링 비율 (SSF) (1)/ 20
섹션 사이의 거리 600 μm의
그리드 간격 100 ㎛

표 1 : 경색 조직의 stereological 정량에 사용되는 매개 변수.

결과 Contralesional Ipsilesional 경색
지역 (μm²) 151460000 155060000 22600000
볼륨 (μm³) 90876000000 93036000000 13560000000
볼륨에 대한 수정
프로젝션 이상 (μm³)
89957100000 92046300000 <강한> 13416600000
오류 계수 (Gundersen 님)
m = 0
0.068 0.077 0.067
오류 계수 (Gundersen 님)
m = 1
0.015 0.017 0.015
오류 계수 (Gundersen 님)
알파 (Q)
0.068 0.077 0.067
% 경색 반구 14.90
뇌 Oedema (IPS 권 / 계속 권) 1.02

표 2 : 스테레오 탐정 소프트웨어 사용 카발리 법에 의해, contralesional ipsilesional 경색 부피의 대표적인 예.

광학 분별 사용 범위 = "2"> 매개 변수
섹션 두께 (TSF) 30 μm의
목표 100X
슬라이스 샘플링 비율 (SSF) 1/10
프레임 높이를 계산 40 μm의
프레임 폭을 계산 40 μm의
X 격자 크기 230 μm의
X 격자 크기 230 μm의
안전 가드 2 μm의
광학 Disector 높이 14 μm의

표 3 : 스테레오 탐정 소프트웨어를 사용하여 광학 프로브 분별 뇌허혈 후 호중구 침윤 stereological 정량화에 사용 파라미터.

광학 분별에 의한 호중구의 추정
샘플링 위치의 수 (430)
형상 인수 6.24
총 마커 카운트 (166)
광학 분별에 의해 추정 된 호중구 117,608.03
오류 계수 (Gundersen 님), m = 0 0.22
오류 계수 (Gundersen 님), m = 1 0.09

표 4 : 스테레오 탐정 소프트웨어를 사용하여 광학 분별 프로브 뇌 허혈 후 예상 침투 호중구의 대표적인 예.

는 CD11b + 호중구 단핵구 미세 아교 세포
소박한 25,863 ± 4,575.8 473 ± 75.8 525 ± 191.4 19,012 ± 1,523
샴 24 시간 24,563 ± 5,263 873 ± 192.5 1124 ± 391.5 23,734 ± 2,910
pMCAO 24 시간 47,922 ± 23,174 4874 ± 748.7 4826 ± 1345 35,395 ± 10,833

표 5 : 접근 유동 세포 계측법과 뇌 허혈 후 추정 된 골수 세포의 대표 결과.

Discussion

여기에서 소개 뇌허혈 모델은 높은 재현성 경색 볼륨이 24 ~ 48 시간과 다른 접근 방법 8,15,17으로 MCA 결찰 후 7 일 결정 제공합니다. 이 MCAO 모델 연구에 사용 된 동물의 수를 최소화하는 다른 사람에 비해 낮은 사망률 (1 % 미만)을 갖는다. 사망률이 낮은 비율을 얻기 위해 중요한 단계 뇌졸중 유도 후 생존에 손상을 줄 수있는 감염을 방지하기 위해 적절한 무균 상태를 유지하는 것이다. 이 MCAO 모델은 또한 원하는 시간 매듭 후방 재관류 CCA 및 MCA 과도 결찰술 일시적인 모델로서, 병진 연구 18 임상 관련 모델 간주 영구 MCAO 모델로서 이용 될 수 없다 19. 이 방법은 성공적으로 마우스 및 래트 17,20 사용되어왔다. 이 모든 증거는 결찰에 의해 MCAO 여러 응용 프로그램과 뇌경색의 높은 다양한 모델을 나타냅니다. criti이 기술의 CAL 단계는 실체 현미경 침습 수술을 필요로한다는 것이다; MCA뿐만 아니라 광대뼈 손상되지로서 개두술은 매우 신중하게 수행되어야한다. 그러나 가짜 동물의 사용 수술에 의존하는 효과를 구별 할 수있는 유용한 도구가 제공 (수술하지만 CCA와 MCA 결찰을 실시한다 수행되지 않습니다). 이 기술에 따라 뇌 손상의 정도는 다양한 방법에 의해 정량화 될 수있다. 뇌 절편, Nissl 염색 및 카발리 의한 체적의 후속 추정 우리 프로토콜은 손상된 영역의 정확한 정량 분석​​이 가능하며 직렬 뇌 섹션이 또한 서로 다른 면역 분석에 이용 될 수 있기 때문에, 연구의 이러한 유형에서 사용 된 마우스의 수를 최소화한다. 이 방법론의보다 나은 성능이 Stereology를 소프트웨어에 사용 된 적절한 파라미터를 선택하는 것이 중요하다 (표 1) 번째를 추정 할 필요식 상이한 영역의 전자 량 : V = 1 / SSF는 * f를 * t의 *의 ΣP (SSF는 t가 섹션의 평균 두께, 슬라이스 샘플링 분획이고, f는 그리드 간격의 면적이며 ΣP 구조 타격 포인트의 수).

결찰술 원위 MCAO은 백혈구 침윤 및 면역 세포 아 집단 뇌 손상 1-4 다음 염증 과정에 참여하는 8, 13를 특성화하는 것이 유용 할 수있다. 여기서는 뇌 면역 세포 특성화, 정확한 접근법 stereological 나은 여러 백혈구의 아 집단을 특성화 유세포 분석을위한 두 가지 방법을 제안한다.

직렬 뇌 절편을 살려, 호중구의 총수의 정량화 세포 샘플 재치 수의 세포의 총 수를 추정 광학 분별 법 (16)에 의해 달성 될 수있다하 방향 X에 편견 가상 계산 공간 사이의 균일 한 거리와 우리의 경우, 경색 영역을 관심의 전체 영역을 커버 편견 가상 계산 공간의 체계적인 무작위 샘플링 (SRS) 세트, Y 및 Z를이 방법에 대한 정확한 도구를 제공합니다 결찰 후 서로 다른 시간에 허혈성 뇌에 총 호중구 수를 추정한다. 이 본 연구에 도시되지 않았지만,이 프로토콜은 또한 허혈 21 후에 다른 침윤 백혈구 등의 허혈성 뇌에서 발견 된 임의의 다른 세포 집단의 정확한 정량 다른 호중구 개체군의 추정을 위해 사용될 수있다 (단핵구 / 대 식세포) 또한 생존 신경을 추정 또는 뇌졸중 후 신경의 정량. 것들 허혈 영역에서 호중구 부량 표 3에 나타낸 바와 같이, 원하는 영역의 정확한 추정을위한 가장 중요한 단계는, 해당 변수의 선택이다.이러한 매개 변수는 (ΣQ- 함께 카운트 세포의 총 수이고 N = ΣQ- X 1 / SSF X 1 / ASF X 1 / TSF를 수학 식을 이용하여 전체 포지티브 세포 수 (N)를 계산하는 Stereology를 소프트웨어에 사용될 분별, SSF는 ASF 샘플링 면적 분율이고, TSF는 샘플링 분획 두께) (5)이고, 부 샘플링 비율이다. 이 방법론은 다른 정량화 기법보다 느리지 만 (예를 들어, 조직, 대표적인 이미지 또는 필드 당 호중구 수의 밀도 측정의 MG 의한 호중구 마커의 분석), 그것은 공평하고 정확한 제공 고체 기법이 될 수있는 장점을 갖는다 세포 수의 정량.

뇌 백혈구 분리 방식은 바이어스 할 필요 생체 염색 또는 유전자 조작에 의해 시스템이없는 동시 식별 및 여러 면역 세포 아형의 정량화 수 있습니다. 특징 골수 페이지에서 정렬 이후 세포opulations 또는 면역 자기 분리가 이러한 유전자 또는 단백질 발현에 대한 추가 연구 하류 여러 애플리케이션에 사용될 수있다. 이 방법으로 얻은 호중구, 단핵구 및 미세 아교 세포의 정확한 특성은 면역 조직 화학적 연구, 뇌의 선천성 면역 반응을 매개하는 다른 골수 세포에 특정 기능을 할당 할 수있는 장점으로 기존의 방법에 대해 높은 특이성을 제공합니다. 또한, 추가로 혈액 태어난 식세포 (는 CD11b + CD45 하이 CD68 +)와 같이, 적절한 라벨 다른 뇌 개체군을 특성화하도록 확장 될 수 있으며 다른 CNS 병리 또는 부상의 연구에 적용 할 수있다. 따라서이 기술은 뇌의 염증 반응의 이질성을 탐구하는 필수적인 도구를 제공합니다. 이 기술의 주요 제한을 변경할 수있는 새로운 뇌 조직으로부터 백혈구 현탁액의 제조에 상주세포 또는 항원 변경의 활성화 상태. 이 기술은 면역 조직 화학 연구에 비해보다 상세한 정 성적 특성 분석을 할 수 있지만, 그것은 세포의 분리에 기초하여 덜 정확한 정량화를 제공한다. 그럼에도 불구하고, 우리 세포 격리 프로토콜의 효율은 다른 출판 방법론 9 유사하고이를 효율적으로 제어하고 MCAO 그룹 사이 또는 심지어 다른 처리 8 실시 MCAO 그룹 사이의 뇌 면역 세포의 수의 차이를 검출하는데 사용될 수있다.

이 프로토콜의 중요한 단계는 해부 조직, 조직 파괴 절차 및 미엘린 제거한다. 조직 수집에 대해서, 정규화 단계 인해 상이한 박리 성능에 변동을 피하기 위해 (수집 된 조직을 칭량) '도 포함될 수있다. 또한, 다른 그룹 사이 MCAO 정규화는 경색 량 통해 발생할 수 (미리 자기 R에 의해 결정esonance). 이 문제를 해결하는 또 다른 방법은 허혈성과 대조군의 전체 동측 반구를 사용하거나, 심지어 사용 된 동물의 수를 최소화하는 대조군으로서 마우스의 허혈성 반구 반대측을 사용하는 것이다. 이 방법은 각 절개 차이점을 회피 동안, 주요 단점이있다; 희석 배수는 독점적 동측 피질의 코어 및 경색 주변 영역에있는 골수 세포의 수를 셀의 총 개수를 증가 아니지만 의해 부가된다. 조직 파괴에 대해서는,이 프로토콜은 뇌 세포의 기계적 파쇄 단계 효소 처리를 방지하고 표면 항원 변조 9,22, 염증 세포 개체군의 추가적인 정성 및 정량 분석을위한 필수적인 문제를 방지를 나타낸다. 관심의 세포 현탁액의 제조뿐만 아니라, 뇌 샘플로부터 미엘린 제거 downst와의 간섭을 피하기 위해 추천 단계는이러한 면역 자기 세포 분리 또는 세포 계측법 (23, 24) 흐름으로 연 응용 프로그램. 이것은 여러 가지 방법, 예컨대 수크로오스 또는 퍼콜 구배, 또는 항 미엘린 비드를 사용하여 달성 될 수있다. 여기, 세포 수율을 개선하는 데 사용됩니다 수초를 제거하는 퍼콜 사용과 함께 뇌 세포 현탁액 분리, 기계적 중단을위한 다른 방법을 비교하고 25 생존 이전의 연구를 기반으로.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Photonic Led F1 WPI 571329-8 Equipment
Temp Controller  Panlab  HB 101/2 Equipment
Volvere GX NSK Ne22L Equipment
Microscope WPI PZMIII-BS Equipment
Stainless Steel Burrs FST 19007-14 Surgical material
Forceps Dumont #5/45  FST 11251-35 Surgical material
Forceps Dumont #5SF FST 11252-30 Surgical material
Suture 6/0 LorcaMarin 55108 Surgical material
Suture 9/0 LorcaMarin 61966 Surgical material
Nikon Eclipse  Nikon TE300 Equipment
Isoflurane Esteve 571329-8 Chemical
Sodium Pentobarbital Vetoquinol 570681 Chemical
Freezing microtome Leica Microsystems GmbH SM2000R Equipment
Superfrost slides Thermo Scientific  2014-07 Lab material
Cresyl violet acetate Sigma C5042 Chemical
Microscope  Nikon Nikon Eclipse TE300 Equipment
XYZ motorized computer stage and controller Ludl electronics Products Equipment
Stereo Investigator System Microbrightfield Version 7.003 software Software
5 ml Tissue Grinder, Potter-Elv with teflon pestle Thomas Scientific 0913X70 Lab Material
Polypropylene 50 ml Oak Ridge Centrifuge Tube Nalgene 3119-0050  Lab material
Percoll Sigma p1644-100 Chemical
RPMI 1640 Lonza BE12-702F Chemical
Beckman Ultracentrifugue Beckman Coulter Equipment
Beckman Coulter ultracentrifuge rotor 45 Ti Beckman Coulter Equipment
BD Sterile Cell Strainer, 40 Micron BD BD 352340 Lab Material
Bovine Serum Albumin Sigma A3733-500G Reagment
FcR Blocking Reagent, mouse Miltenyi 130-092-575 Antibody
CD11b-FITC, human and mouse Miltenyi 130-098-085 Antibody
CD45-PE, mouse Miltenyi 130-102-596 Antibody
Anti-Ly-6G-APC, mouse Miltenyi 130-102-936 Antibody
PerCP/Cy5.5 anti-mouse Ly-6C Biolegend 128012 Antibody
BD FACS Flow BD 342003 Reagment
BD FACSCalibur; 4-color BD 342975 Equipment
BD Cell Quest Pro Software BD Software
FlowJo software Treestar inc. Software

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References

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