Stéréologique et cytométrie de flux Caractérisation des sous-populations leucocytaires dans les modèles de transitoires ou permanentes ischémie cérébrale

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Summary

Cerveau cellules myéloïdes caractérisation suivante course peut être réalisée par stéréologie selon la méthode de fractionnement optique, ou par une analyse de cytométrie en flux de cerveau leucocytes suspensions. Les deux sont des techniques utiles pour effectuer une distinction phénotypique précise des principaux sous-ensembles de cellules myéloïdes dans le cerveau ischémique.

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Ballesteros, I., Cuartero, M. I., Moraga, A., de la Parra, J., Lizasoain, I., Moro, M. Á. Stereological and Flow Cytometry Characterization of Leukocyte Subpopulations in Models of Transient or Permanent Cerebral Ischemia. J. Vis. Exp. (94), e52031, doi:10.3791/52031 (2014).

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Abstract

activation de cellules microgliales, ainsi que l'extravasation des macrophages et des neutrophiles hématogènes, est censée jouer un rôle central dans les lésions cérébrales après un AVC. Ces sous-populations de cellules myéloïdes peuvent afficher différents phénotypes et fonctions et doivent être distingués et caractérisé pour étudier leur réglementation et leur contribution à des lésions tissulaires. Ce protocole prévoit deux méthodes différentes pour le cerveau immunitaire caractérisation des cellules: une approche stéréologique précis et une analyse de cytométrie en flux. L'approche stéréologique est basé sur la méthode de fractionnement optique, qui calcule le nombre total de cellules dans une zone d'intérêt (cerveau infarci) estimée par un échantillonnage aléatoire systématique. La seconde approche de caractérisation fournit un moyen simple pour isoler des suspensions cerveau de leucocytes et de les caractériser par cytométrie de flux, ce qui permet la caractérisation de la microglie, les monocytes et les neutrophiles infiltré du tissu ischémique. En outre, il a également DÉTAILS un modèle d'ischémie cérébrale chez les souris qui affecte exclusivement cortex cérébral, infarctus générer hautement reproductibles avec un faible taux de mortalité, et la procédure de traitement du cerveau histologique pour caractériser volume de l'infarctus par la méthode Cavalieri.

Introduction

Morphologiques, phénotypiques et d'expression génique des altérations de la microglie, ainsi que extravasation et l'activation des macrophages et des neutrophiles hématogènes sont soupçonnés de jouer un rôle central dans la cascade physiopathologique suivante lésion cérébrale 1-4. Ce protocole fournit deux approches pour estimer le nombre de différents sous-ensembles de cellules myéloïdes du cerveau ischémique et pour effectuer leur caractérisation phénotypique. En outre, il fournit également une description d'un modèle expérimental d'ischémie cérébrale chez les souris, qui consiste en la ligature transitoire ou permanent à la fois distale Artère cérébrale moyenne (MCA) et l'artère carotide commune (CCA), y compris la façon d'évaluer l'infarctus par la méthode Cavalieri précise en utilisant un logiciel stéréologique.

La première approche pour caractériser des sous-ensembles de cellules myéloïdes du cerveau ischémique est une méthode stéréologique basé sur l'approche de fractionnement optique 5. Ce est le pluscouramment utilisé sonde stéréologique en sciences de la vie et fournit un degré élevé de précision avec de faibles coefficients d'erreur 5-7. Ce est le meilleur choix pour la quantification de cellules lorsque le tissu est coupé en sections, car elle évite les biais sur l'estimation de la cellule en raison de la fragmentation du tissu en sections. Cette méthode est un moyen très puissant pour caractériser numéros, la dynamique et les changements phénotypiques des sous-populations de neutrophiles infiltrés du tissu ischémique 8.

La seconde approche de caractérisation est basée sur un protocole modifié à partir de Campanella et collaborateurs 9 qui fournit un moyen simple pour isoler cerveau suspensions de leucocytes et de les caractériser par cytométrie de flux. Contrairement aux techniques immunohistochimiques classiques, la cytométrie en flux caractérisation permet de différencier entre la microglie (CD45 lo CD11b +) et infiltré cellules myéloïdes (CD45 salut CD11b +) en fonction de leur diffles niveaux d'expression de CD45 Ørente 9-13. En outre, les monocytes pro-inflammatoires (CD45 salut CD11b + Ly-6G - Ly-6C salut), les neutrophiles (CD45 salut CD11b + Ly-6G +) et d'autres sous-ensembles de leucocytes le tissu ischémique peuvent être distinguées. Cette approche fournit un test fiable et rapide pour évaluer la neuro-inflammation dans des modèles expérimentaux de l'ischémie cérébrale. Cependant, le traitement des tissus peut influencer l'état d'activation et le nombre des différentes populations de cellules présentes dans le tissu ischémique fournir une caractérisation semi-quantitative.

Protocol

REMARQUE: Tous les protocoles expérimentaux adhéré aux directives du Comité de protection des animaux de l'Université Complutense (selon les directives de l'UE 86/609 / CEE et 2003/65 / CE).

1. ischémie cérébrale Modèle

NOTE: Le modèle d'ischémie cérébrale dans ce document implique une occlusion permanente ou transitoire des deux CCA (de l'artère carotide commune) et MCA (de l'artère cérébrale moyenne) par ligature avec une suture de nylon.

  1. Les préparatifs pré-chirurgicales
    1. Stériliser tous les instruments chirurgicaux à l'autoclave ou un stérilisateur à billes de verre. Désinfectez la zone chirurgicale avec 70% d'éthanol ainsi.
    2. Anesthésier la souris avec des anesthésiques appropriées. Assurer l'induction par l'isoflurane 2,5% et maintenir avec de l'isoflurane à 1,5% dans un mélange de 80% d'air / 20% d'oxygène en utilisant un vaporisateur. Appliquer des larmes artificielles pour les yeux de souris pour prévenir la sécheresse sous anesthésie.
    3. Placez la souris sur un coussin chauffant qui est lié à une taxedback dispositif avec une sonde de température placée dans le rectum et la température réglée à des niveaux physiologiques (36,5 ± 0,5 ° C) pendant l'intervention chirurgicale.
  2. Commune occlusion de l'artère carotide par ligature
    1. Placez la souris en décubitus dorsal et l'immobiliser avec du ruban adhésif. Désinfectez la peau avec 70% d'éthanol ou povidone-iodure et couper les cheveux de la partie supérieure ventrale.
    2. Sous un microscope chirurgical, faire une incision médiane 1 cm autour de la surface ventrale du cou.
    3. Tirez tissus mous (hormis toute tissu glandulaire y compris les sous-maxillaire, sublinguale et glandes parotides) et identifier la gauche artère carotide commune (CCA), qui est localisée en dehors de la trachée. Rétracter les muscles et d'exposer CCA gauche. Disséquer soigneusement de nerf vague.
    4. Une fois disséqué, obturer le CCA laissé par une ligature en utilisant une suture de nylon 6/0. Ligaturer avec un nœud ou un nœud coulant permanente (pour permettre la reperfusion si un modèle d'ischémie cérébrale transitoire est souhaitée).
    5. Placez le tissu glandulaire dans sa position initiale et fermer l'incision sur la peau du cou avec une suture de nylon 6/0.
      REMARQUE: les animaux de Sham sont soumis à la même procédure chirurgicale animaux MCAO mais le CCA ne est pas occlus.
  3. Distale occlusion de l'artère cérébrale moyenne par ligature
    1. Placez la souris sur le côté droit et l'immobiliser avec du ruban adhésif. Désinfecter la peau de tête avec 70% d'éthanol ou povidone-iodure et couper les cheveux de la tête de la souris (enlever les poils après la coupe).
    2. Sous un microscope chirurgical, faire une incision de la peau entre l'œil et l'oreille. Déplacez le peau loin et maintenez-le avec du ruban adhésif.
    3. Faire une incision horizontale sur le muscle temporal de la droite vers la gauche. Ensuite, faire une seconde incision verticale sur le côté droit du muscle temporal (être prudent pour éviter veine temporale coupe). Séparez muscle temporal du crâne et maintenez-le avec une suture pour maintenir une surface du crâne propre.
    4. Nettoyer la surface du crâneavec une solution saline stérile froide pour détecter la position exacte de l'artère cérébrale moyenne gauche (MCA) via transparence du crâne. Effectuer une craniotomie ronde (1 mm de diamètre) avec une fraise en acier inoxydable dans le lobe frontal entre l'arcade zygomatique et l'os squamosal. Retirer soigneusement le crâne et exposer le MCA.
    5. Appliquez une petite quantité de solution saline stérile à froid à la surface du cerveau et enlever les méninges (dure-mère et l'arachnoïde) en utilisant une pince.
    6. Effectuer la ligature de la ACM gauche dans le coffre distale juste avant la bifurcation entre le frontal et branches MCA postérieures. Obturer l'ACM gauche par une ligature en utilisant une suture de nylon 9/0. Ligaturer avec un nœud ou un nœud coulant permanente (pour permettre la reperfusion si un modèle d'ischémie cérébrale transitoire est souhaitée). La période de temps entre l'ACC et occlusion de la MCA est d'environ 10 à 20 minutes en fonction de l'expérience de l'opérateur.
    7. Placez le muscle temporal dans sa position initiale et fermez le incision sur la peau du cou avec une suture de nylon 6/0.
    8. Retour de la souris à la cage pour récupérer de l'anesthésie (généralement de 5 à 10 min) et injecter la souris avec la buprénorphine intrapéritonéale (IP) (0,3 mg / kg).
      1. Surveiller la souris pour plusieurs heures afin de détecter tout inconfort (ne pas laisser la souris sans surveillance tant qu'il a repris conscience suffisante pour maintenir décubitus sternal). Depuis poids post-chirurgicale perdu est généralement observé, placer les aliments en purée dans une boîte de Pétri pour faciliter l'alimentation.
    9. Lorsque l'animal est complètement rétabli, revenir à la compagnie d'autres animaux.
    10. Si un modèle MCAO transitoire est souhaitée, anesthésier la souris à nouveau et retirez le nœud coulant de la CCA et le MCA pour permettre la reperfusion (généralement entre 0,5 à 2 h (figure 1)).
      NOTE: les animaux de Sham sont soumis à la même procédure chirurgicale que les animaux MCAO mais la MCA est pas occlus.

2. Perfusion et Sectioning de tissu cérébral

  1. 24 ou 48 heures après la MCAO, sacrifier la souris avec une dose létale d'anesthésique (par exemple, le pentobarbital de sodium, IP 86 mg / kg ou un surdosage avec l'isoflurane).
  2. Perfuser la souris avec du tampon phosphate 0,1 M suivie de 4% de paraformaldehyde (PFA) dans du tampon phosphate (pH 7,4).
  3. Retirer le cerveau comme suit:
    1. Décapitez l'animal juste au-dessus de la moelle épinière.
    2. Faire une incision postéro-antérieure sur la peau de la tête pour exposer le crâne. Faites deux coupes latérales à la jonction des parois latérales et de la base du crâne et enlever le petit morceau d'os.
    3. Faire une coupe à travers le crâne le long de la suture sagittale.
    4. Retirer le crâne recouvrant chaque hémisphère en utilisant une pince pour exposer le cerveau. Utilisez une spatule pour séparer le cerveau du crâne et de la transférer dans une solution PFA 4%.
  4. Post-fix pendant 3 heures dans une solution PFA 4% à 4 ºC.
  5. Retirer solution PFA et Incubate le cerveau pendant 48 heures dans une solution de saccharose à 30% à cryoprotect le cerveau.
  6. Enlever la solution de saccharose et de geler le cerveau rapidement isopentane froid (-40 ° C). Magasin cerveau congelé à -80 ºC.
  7. Obtenir des coupes de cerveau coronale (30 um) avec un microtome à congélation. Recueillir dix ensembles de série dans une solution de cryoconservation. Chaque ensemble de série est composé d'environ 14-16 coupes coronales avec une distance intercoupe de 300 um quel échantillon suffisamment le cerveau de la souris entre 1,94 et -2,46 postérieure au bregma.

3. Nissl coloration et volume de l'infarctus Estimation

  1. La coloration de Nissl par du violet de crésyle
    1. Coupes de cerveau de montage dans une lame de microscope superfrost. Pour la détermination du volume de l'infarctus par la méthode Cavalieri dans les sections Nissl colorés, utiliser une fraction 1/20 tranche-échantillonnage (1/2 sections de l'un des dix ensembles série collectés à l'étape 2.7; environ, un nombre total de sections 7-8 avec une distance intercoupe de 600 μ; M sont utilisés). Attention à maintenir l'orientation antéro-postérieur bon (zone infarcie est placé sur le côté droit).
    2. Effectuer coloration Nissl conventionnelle comme suit:
      1. Permettre aux sections de diapositives montées à sécher pendant plusieurs heures.
      2. Réhydrater sections de diapositives montées et tacher avec une solution de 0,1% crésyl violet pendant 5 min.
      3. Déshydrater avec une série graduée de l'EtOH (70%, 90% et 100%; 5 min par changement). Nettoyez les sections de diapositives montées avec xylène, ajouter distrene-80 plastifiant xylène (DPX) un milieu de montage et couvrir avec une lamelle de verre.
  2. En utilisant le logiciel stéréologique pour estimer le volume de l'infarctus par le procédé Cavalieri à Nissl teinté coupes sériées
    1. Utiliser des paramètres indiqués dans le tableau 1 pour quantifier le volume de l'infarctus par le procédé Cavalieri 14 et un système de stéréologie, qui se compose d'un microscope équipé d'une caméra, d'un étage de XYZ motorisé ordinateur et un logiciel stéréologique (La principaleinstructions fournies ci-dessous sont liés à PC, mais les directions pourraient différer pour d'autres systèmes d'exploitation).
    2. Tournez sur PC, microscope, contrôleur de scène et la caméra dans l'ordre approprié. Démarrez le logiciel stéréologique.
    3. Déplacez l'objectif 10X en place et sélectionnez le 10X de la baisse objective menu déroulant.
    4. Déplacez-vous dans la première section de Nissl teinté et de trouver un point de référence approprié. Cliquez sur la souris pour établir le point de référence (de se déplacer, il est nécessaire pour activer le bouton sans joie).
    5. Estimer la "épaisseur de coupe monté" (l'épaisseur de la section effective en tenant compte de la contraction). Appuyez sur le bouton "Focus Position Meter" et de calculer l'épaisseur du bas vers le haut de la section.
    6. Créer un outil de contour pour le contralésionnel et les zones ipsilésionnelle et de la zone infarcie.
      1. Cliquez sur le menu "Affichage" et sélectionnez "Paramètres d'affichage". Cela ouvre til Affichez de dialogue Paramètres.
      2. Sélectionnez l'onglet "Contours" et cliquez sur le bouton "ajouter le type Contour".
      3. Créer un contour pour chaque région de quantifier et de les rendre visibles dans le contour dans le menu déroulant. Cliquez sur OK.
    7. Créer un outil de marqueur pour la contralésionnel et hémisphères ipsilésionnelle et la zone infarcie.
      1. Cliquez sur le menu "Affichage" et sélectionnez "Paramètres d'affichage" pour ouvrir la boîte de dialogue Paramètres d'affichage.
      2. Sélectionnez l'onglet "Marqueurs" et modifier les marqueurs nommer en double-cliquant sur les marqueurs disponibles. Les rendre visibles dans la barre de marqueurs. Cliquez sur OK.
    8. Activer le gestionnaire de section.
      1. Cliquez sur le menu "Outils / série Section Manager". Ajouter une nouvelle section avec le bouton "nouveau chapitre". Ce bouton ouvre la boîte de dialogue "Configuration de la section de série".
      2. Réglez le "Block Advance" 30 um. Réglez le"Épaisseur de coupe monté" à la valeur estimée à l'étape 3.2.5.
      3. Réglez le "évaluation Intervalle» que 20. Utilisez un taux d'échantillonnage 1/20 de tranche.
      4. Set "le numéro de section de départ», comme 1. Définissez la 'valeur de l'axe Z pour le haut de la première section "0. Cliquez sur OK.
    9. Tracez un contour de décrire l'hémisphère controlatéral.
      1. Sélectionnez l'outil de l'hémisphère contralésionnelle (précédemment créée dans l'étape 3.2.6) du contour dans le menu déroulant.
      2. Tracez un contour de décrire l'hémisphère controlatéral.
      3. Pour terminer le traçage de l'hémisphère contralésionnel, clic droit de la souris et sélectionnez "Fermer contour".
    10. Estimer l'hémisphère contralésionnel contour par Cavalieri.
      1. Cliquez sur le menu "Sondes" et sélectionnez estimateur Cavalieri. Réglez "Grid Spacing" 100 um. Réglez "Rotation de grille" 0. Réglez le "Bverrouiller Advance "30 um. Cliquez sur OK.
      2. Sélectionnez "L'hémisphère contralésionnel" bouton de la Marqueurs Bar. Faites un clic droit à l'intérieur du contour de l'hémisphère contralésionnelle.
      3. Sélectionnez "Paint Cavalieri mode marqueurs". Faites un clic droit à l'intérieur du contour de l'hémisphère contralésionnel nouveau et sélectionnez "Marqueurs de peinture dans Contour".
      4. Désactiver estimateur Cavalieri en cliquant sur les sondes et de prévision du Cavalieri et désactiver le bouton marqueur contralésionnel dans la barre de marqueur.
    11. Répétez la même procédure pour l'hémisphère ipsilésionnelle et de la zone infarcie (étapes 3.2.7 et 3.2.8). Enregistrer les données après l'estimation de la superficie de chaque section.
    12. Calculer les zones controlatérale, ipsilésionnelle et infarctus dans le reste de la section Nissl teinté.
      1. Créer une nouvelle section comme à l'étape 3.2.6. Ne pas modifier les valeurs entrées dans la section "Configuration de série" de dialogue. Cliquez sur OK.
      2. Répétez les étapes 3.2.7-3.2.8 dans la nouvelle section.
    13. Exporter les résultats de la quantification dans un fichier tableur.
      1. Cliquez sur "sondes" dans le Menu chercheur stéréo. Sélectionnez "Affichage Probe Run Liste". Cela ouvre la "Précédent stéréologique Runs Dialog".
      2. Sélectionnez toutes les sections en cliquant sur eux. Appuyez sur le bouton "Afficher les résultats". Cela ouvre "l'estimateur Cavalieri Résultats" où la zone et le volume estimé pour chaque région sont affichés.
      3. Pour exporter les résultats dans un fichier de feuille de calcul, cliquez sur le "Copier tous les résultats au Presse-papiers" et coller à un fichier excel avec les principaux résultats obtenus à partir de chaque région (tableau 2).
    14. Volume de l'infarctus Express mm 3 ou en% de l'hémisphère qui est atteint d'un infarctus (% IH) en utilisant la formule 15% IH = InfVol / ContrVol * 100, où
ove_content "> InfVol (Volume de tissu infarci) = ΣInfArea i,
ContrVol (contralésionnelle hémisphère Volume) = i ΣContrArea

4. Quantification stéréologique infiltrée neutrophiles après ischémie cérébrale par le fractionneur optique

  1. La coloration des coupes de cerveau:
    1. Pour estimer le nombre total de neutrophiles infiltrés après MCAO par le fractionnement optique 16, utiliser une fraction d'échantillonnage dixième tranche. Neutrophiles immunocoloration en utilisant des techniques classiques d'immunofluorescence avec l'anticorps de rat anti-Ly6G (1A8) et l'anticorps secondaire droit sur des coupes flottant librement. En outre, une contre-coloration nucléaire avec une machine comme DAPI ou TOPRO, même se il ne est pas nécessaire pour l'identification des neutrophiles, peut rendre plus facile de détecter la zone infarcie.
    2. Coupes de cerveau de montage dans une lame de microscope superfrost avec la zone infarcie placé dans le côté droit.
  2. Quantification de leucocytes infiltrés dans le cerveau ischémique par le fractionnement optique
    1. Utilisez les paramètres indiqués dans le tableau 3 pour quantifier leucocytes infiltrés dans le cerveau ischémique par l'approche de fractionnement optique avec un système de stéréologie. Répétez les étapes 3.2.1-3.2.5 de la section 3.
    2. Créer un outil de contour de la zone infarcie comme il a été décrit dans l'étape 3.2.6 de la section 3.
    3. Créer un outil de marqueur pour les neutrophiles comme il a été décrit dans l'étape 3.2.7 de la section 3.
    4. Activer le gestionnaire de la section et de créer une nouvelle section comme dans l'étape 3.2.8. Dans ce cas, réglez "Intervalle évaluation" de 10 (une fraction d'échantillonnage dixième tranche est utilisée pour estimer nombre de neutrophiles).
    5. Sélectionnez l'outil de contour "infarci Area" (précédemment créée dans l'étape 4.2.1) du contour dans le menu déroulant. Dessiner un contour à délimiter la zone infarcie au 10X objectif. Modifier l'objectif de 100X pour effectuer neutrophil quantification (ne oubliez pas de sélectionner le 100X de la baisse objective dans le menu déroulant).
    6. Cliquez sur le menu "Sondes" et sélectionnez le "fractionnement optique". Réglez le "XY Placement de compter Cadres» comme 230 pour X et Y taille de la grille. Réglez "Rotation de grille" 0. Set "Bloquer Advance" 30 um. Cliquez sur OK.
    7. Sélectionnez le bouton "neutrophile" dans la barre de Marker. Mark taché neutrophiles dans la zone infarcie. Une fois fini, désactiver la sonde de fractionnement optique en cliquant sur "Sondes" et "fractionnement optique". Désactivez le bouton de neutrophiles dans la barre de marqueur.
    8. Répétez la même procédure pour chaque section (4.2.4-4.2.9).
    9. Exporter les résultats de la quantification dans un fichier tableur.
      1. Cliquez sur "sondes" dans le Menu chercheur stéréo. Sélectionnez "Afficher Probe Liste Exécuter" pour ouvrir les «Runs stéréologiques précédentes»dialogue.
      2. Sélectionnez toutes les sections en cliquant sur eux. Appuyez sur le bouton "Afficher les résultats" pour ouvrir "les optiques Résultats de fractionnement» où le nombre estimé de neutrophiles est affiché.
      3. Exporter les résultats dans un fichier de tableur en cliquant sur le "Copier tous les résultats au Presse-papiers" et coller dans un fichier tableur.

Analyse 5. cerveau dissociation et cytométrie de flux

REMARQUE: myéloïde sous-population caractérisation par cytométrie de flux sur le tissu cérébral frais peut être utilisé comme une alternative à la caractérisation des neutrophiles précédente effectuée sur des sections fixes et immunocolorées cerveau.

  1. la dissociation du cerveau et seule préparation de suspension cellulaire
    1. Faire 10 ml / animaux d'un (RPMI) RPMI solution -Percoll contenant 8 ml de RPMI, 1 ml de 30% Percoll et 1 ml d'un 10x PBS (tampon phosphate salin).
    2. Rcerveau de souris après MCAO emove comme décrit dans l'étape 2.3.
    3. Sous un microscope, disséquer base et péri-infarctus zones du cortex ipsilatéral à partir du cerveau de souris ischémique (ou une région similaire pour imposture et animaux naïfs) du cerveau. Poids du tissu cérébral et le placer dans 5 ml de glace-froid RPMI-Percoll (l'étape de poids peut être effectuée pour la normalisation entre les groupes expérimentaux).
    4. Dissocier le tissu dans une suspension cellulaire unique en utilisant un broyeur de tissu de type Potter Elvehjem avec pilon en Téflon.
    5. Transfert des suspensions de cellules dans un tube d'ultracentrifugation 50 ml et ajouter 5 ml de plus de solution de RPMI-Percoll aux échantillons.
    6. Centrifuger les suspensions cellulaires à 7800 g pendant 30 min à 25 ° C. Après centrifugation, assurer une couche de couleur blanche correspondant à la myéline apparaît en haut de la solution.
    7. Retirer la couche de myéline soigneusement et filtrer l'ensemble des suspensions de cellules, y compris les cellules rassemblées en un culot, par l'intermédiaire de 40 um filet de nylon strainer.
    8. Ajouter 10 ml de RPMI sur la crépine afin de se assurer que toutes les cellules sont filtrées et placer la solution dans un tube de 50 ml. Ajouter 30 ml de RPMI et centrifuger les 50 ml de suspension de cellules à 600 xg pendant 10 min à température ambiante.
    9. Jeter le surnageant et remettre en suspension le culot de leucocytes avec 1 ml de PBS. Ajouter 4 ml de tampon de lyse (150 mM de NH 4 Cl, 10 mM de NaHCO 3 et 0,1 mM d'EDTA) et on incube les cellules pendant 2-3 min à température ambiante pour lyser les érythrocytes à partir de la suspension cellulaire. Centrifuger la solution à 600 g pendant 10 min à 4 ºC.
  2. Coloration des cellules et cytométrie de flux
    1. Préparer un cocktail de marquage pour cytométrie de flux, contenant 200 pi de PBS-BSA (1%) 1: 100 Fc-bloc, 1:40 anti-CD45-PerCP rat, 1:40 anti-rat Ly6G-APC, 1:40 anti- CD11b FITC-rat et 01h40 anti-Ly-6C-PE rat par échantillon.
    2. Resuspendre les cellules dans le cocktail de marquage et incuber les échantillons pendant 45 min dans la glace.
    3. Laver le cocktail d'étiquetageavec 1 ml de PBS froid et centrifuger les cellules à 600 xg pendant 10 min à 4 ° C. Remettre en suspension le culot avec 100 ul de flux FACS et acquérir la totalité de la suspension cellulaire par cytométrie de flux.
    4. Utilisez un cytométrie de flux logiciel d'analyse pour caractériser et quantifier les populations de cellules.
      1. Principaux sous-ensembles de leucocytes correspondant au cocktail d'étiquetage préparée dans ce protocole peuvent être caractérisés comme suit: CD45 lo CD11b +: cellules microgliales résidentes; CD45 salut CD11b + Ly-6G +: neutrophiles; CD45 salut CD11b + Ly-6G - Ly-6C salut: monocytes pro-inflammatoires.

Representative Results

Le modèle d'ischémie cérébrale représenté ici génère infarctus vus exclusivement dans le cortex sans affecter le tissu striatal lenticulostriatal depuis les branches de la MCA qui irriguent le striatum ne sont pas obstrués (figure 1). Par coloration de Nissl, la zone endommagée peut être identifié comme une zone corticale hypochrome (Figure 2). Ce modèle est caractérisé par des volumes d'infarctus hautement reproductibles 24 h après MCAO (% IH 15,89 ± 0,28) estimée par la méthode Cavalieri dans les sections Nissl colorées (Figure 2). Estimation du volume infarci par le procédé Cavalieri est une approche précise avec une erreur faible qui se traduit par le coefficient d'erreur (CE) de Gundersen dans les hémisphères contralésionnel et ipsilésionnelle ainsi que dans la zone infarcie (tableau 2). Volume de tissu endommagé peut être exprimé en mm 3, mais également en% selon la formule suivante: H dans la section 3.2.13. En outre, l'estimationdu volume total des régions ipsilésionnelle contralésionnel et permet le calcul de l'indice de l'oedème de corriger le volume infarci et pour éviter une surestimation du tissu endommagé (tableau 2).

Étant donné le traitement de sectionnement de série du tissu cérébral, ce qui peut être mis à profit pour effectuer une estimation précise du nombre total de sous-populations de cellules, comme les neutrophiles infiltrés, dans la zone ischémique, en utilisant l'approche de fractionnement optique (figure 3 et tableau 4) avec les paramètres indiqués dans le tableau 3. Ce protocole estime un nombre total de neutrophiles (cellules Ly6G-positifs) dans la zone infarcie de 23 328 ± 3623 à 24 h et de 82 856 ± 8143 à 48 h chez la souris après pMCAO (Figure 3D). En accord avec des études précédentes, l'infiltration des neutrophiles est directement corrélée avec la taille de l'infarctus (figure 3E). Estimation de la til nombre de neutrophiles par le procédé de fractionnement optique est une approche précise avec une erreur faible qui est réfléchie par le CE de Gundersen (tableau 4).

L'isolement des leucocytes et la cytométrie de flux de protocole de caractérisation permet l'isolement de 47 922 ± 23 174 cellules myéloïdes de la corticale de l'hémisphère ipsilésionnelle de souris ischémiques. Celui-ci comprend 10 à 30% du total des événements présents dans la suspension de cellules. La grande majorité des événements capturés à l'aide de ce protocole présente un paramètre FSC bas, associé à des débris cellulaires (figure 4). CD11b coloration montre que les cellules CD11b + ont une valeur FSC ultérieure (figure 4), ce qui suggère que les débris de cellule ne est pas marqué avec cette borne et, comme indiqué précédemment, qu'il ne peut être exclu d'une analyse complémentaire en définissant le seuil FSC à 200 9. Le montant variable de débris cellulaires obtenus avec cette méthode suggère que les différences sur le processus de l'échantillonING (calendrier, la conservation des tissus, la température de l'échantillon, une élimination efficace de la myéline, etc.) peut rendre compte. En outre, l'utilisation de filtres de cellules est également nécessaire pour éviter la présence de pinces dans les échantillons cellulaires; cette étape doit être fait avant la coloration de la cellule. En utilisant la stratégie de déclenchement représentée sur la figure 5 qui est basé sur l'expression de CD11b et CD45, on peut distinguer entre les cellules myéloïdes et résident infiltrées dans le tissu ischémique. Cette population CD11b + augmente dans l'hémisphère ischémique par rapport à la naïve et avec le groupe témoin, dans lequel ces cellules sont souvent associées à une faible expression de CD45 indiquant que la microglie prolifère après l'ischémie (Figure 4, Figure 5 et le Tableau 5) . Cette différence est probablement due à l'infiltration de cellules à partir de la périphérie, comme le montre l'apparition d'une sous-population de cellules CD45 + CD11b salut dans le cerveau ischémique (Figure 4, La figure 5 et le tableau 5), qui est en faible nombre et dans les cerveaux naïf fictives. La contribution des infiltrats à la population de cellules CD11b + dans l'ischémie cérébrale est un processus très dynamique 4. Dans le modèle MCAO par ligature, il peut varier de 30% à 60% des cellules CD11b + totaux en fonction de la taille de la lésion et du moment où la caractérisation a été effectuée. Les neutrophiles, caractérisé comme cellules Ly-6G + sont les plus nombreuses, la population de cellules infiltrées trouvé à 24 heures après la MCAO dans le cerveau de souris en utilisant ce modèle ischémique de l'ischémie cérébrale, car ils comprennent le 70-80% de la CD11b + CD45 salut. Le reste des cellules sont surtout une sous-population de CD11b + CD45 Ly-6G hi - monocytes pro-inflammatoires hi Ly-6C. Dans ce modèle, cette population augmente en nombre dans les zones ischémiques du cerveau de 24 à 48 heures après la MCAO.


Figure 1:. Procédure chirurgicale pour la ligature MCA (A) après la rétraction du muscle temporal, une petite craniotomie est effectuée dans le crâne de la souris. MCA est ligaturé par un nœud ou un nœud coulant en utilisant un fil de suture 9/0. (B) des images représentatives de la lésion corticale généré par le modèle MCAO. Se il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Figure 2
Figure 2: Quantification du volume de l'infarctus par Cavalieri. (A) des images représentatives de coupes de cerveau Nissl colorées 24 heures après la ligature MCA permanente. Le fort grossissement montre la zone hipocromatic après coloration de Nissl quiidentifie la zone endommagée (de base) après MCAO. La région Peri-infarctus (PI) est également indiquée. (B) Quantification du volume de l'infarctus représenté en% infarci hémisphère (% IH) en utilisant la méthode Cavalieri dans les sections de série Nissl colorées, 24 heures après la MCAO (n = 50 souris ).

Figure 3
Figure 3: stéréologique quantification des neutrophiles dans la zone infarcie 24 et 48 heures après la ligature, en utilisant la méthode de fractionnement optique. (A) Représentant l'image de neutrophiles (cellules infiltrées Ly6G-positifs) dans la zone ischémique à 24 heures après la MCAO. Délimitation montre la zone infarcie. (B, C) ​​Des exemples d'un dissecteur optique pour la quantification des neutrophiles par la colonne de fractionnement optique (D). La quantification de neutrophiles totaux dans la région infarcie à 24 et 48 h (n = 4 souris). (E)Corrélation entre le nombre de neutrophiles avec la taille de l'infarctus à 24 et 48 heures après la ligature MCA. Se il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Figure 4
Figure 4:. Représentant analyse dot-diagramme de dispersion des leucocytes du cerveau obtenue à partir hémisphères naïve, imposture et ischémique (24 h après MCAO) sur la base de paramètres physiques (SSC et FSC) Une population d'événements qui expriment CD11b (rouge) a été identifié dans tous les groupes. Cette population a été fermé et caractérisé, selon l'expression de CD45. Les cellules exprimant des niveaux faibles de CD45 (vert) étaient présents dans le cortex cérébral ischémique et non ischémique et correspondent à des cellules microgliales. En revanche, les cellules exprimant des niveaux élevés de CD45 (jaune) ne étaienttrouvé dans l'hémisphère ischémique et dans une moindre mesure dans le groupe imposture. Une analyse plus approfondie de la population salut CD11b + CD45 indique que les neutrophiles (Ly-6G + cellules, bleu) et pro-inflammatoires monocytes (cellules Ly-6C Bonjour, orange) sont les principaux sous-populations de cellules trouvées dans le cerveau infiltre 24 heures après un AVC. Se il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Figure 5
Figure 5:. Gating stratégies pour différencier résident de cellules myéloïdes infiltrées dans le tissu ischémique CD11b + ont été première cellule gated fonction de l'intensité de fluorescence d'isotype (A). Un tracé de points représentant de suspensions cellulaires du cerveau ischémique est affiché dans le coin en haut à droite du panneau. EnDe plus, des valeurs typiques pour le nombre total d'événements et pour le nombre de CD11b + événements acquis en utilisant cette technique est indiqué (pas de cellules / ischémique hémisphère du cerveau;. (A) CD45 fluorescence analyse de l'intensité des CD11b cellules + figure dans le panneau B. Une analyse de tracé de points représentant du CD45 et CD11b expression de la sous-population CD11b + fermée est affiché dans le coin en haut à droite du panneau. En outre, le nombre typique de CD45 lo CD45 cellules salut acquis par ischémique hémisphère du cerveau en utilisant cette technique est montré (B).

Les paramètres utilisés pour la méthode Cavalieri
Section épaisseur (t) 30 um
Objectif 10X
Fraction d'échantillonnage Slice (SSF) 1/ 20
Distance entre les sections 600 um
Grille Espacement 100 um

Tableau 1: Paramètres utilisés pour la quantification stéréologique du tissu infarci.

Résultats Contralésionnelle Ipsilésionnelle Infarctus
Zone (μm²) 151460000 155060000 22600000
Volume (μm³) 90876000000 93036000000 13560000000
Le volume corrigé pour
Au cours de projection (μm³)
89957100000 92046300000 <strong> 13416600000
Coefficient de Erreur (Gundersen),
m = 0
0,068 0,077 0,067
Coefficient de Erreur (Gundersen),
m = 1
0,015 0,017 0,015
Coefficient de Erreur (Gundersen),
alpha (q)
0,068 0,077 0,067
% Infarci hémisphère 14,90
Œdème cérébral (Ips Vol / Vol Cont) 1,02

Tableau 2: exemples représentatifs de volumes contralésionnel, ipsilésionnelle et infarctus par la méthode Cavalieri en utilisant le logiciel de chercheur stéréo.

paramètres utilisés pour la colonne de fractionnement optique
Section Epaisseur (TSF) 30 um
Objectif 100X
Fraction d'échantillonnage Slice (SSF) 1/10
Compter Cadre Hauteur 40 um
Compter Largeur du cadre 40 um
X taille de grille 230 um
X taille de grille 230 um
Safe Guard 2 pm
Optique disector Hauteur 14 pm

Tableau 3: Les paramètres utilisés pour la quantification stéréologique de neutrophiles infiltrés après ischémie cérébrale avec la sonde de fractionnement optique en utilisant le logiciel de chercheur stéréo.

Estimation des neutrophiles par le fractionneur optique
Nombre de sites d'échantillonnage 430
Facteur de forme 6,24
Total des marqueurs comptés 166
Les neutrophiles estimés par fractionnement optique 117,608.03
Coefficient de Erreur (Gundersen), m = 0 0,22
Coefficient de Erreur (Gundersen), m = 1 0,09

Tableau 4: un exemple représentatif des neutrophiles infiltrés estimés après ischémie cérébrale avec la sonde de fractionnement optique en utilisant le logiciel de chercheur stéréo.

CD11b + Neutrophiles Monocytes Microglie
Naïf 25 863 ± 4,575.8 473 ± 75,8 525 ± 191,4 19 012 ± 1523
Sham 24 h 24 563 ± 5263 873 ± 192,5 1124 ± 391,5 23 734 ± 2910
pMCAO 24 h 47 922 ± 23 174 4874 ± 748,7 4826 ± 1345 35 395 ± 10 833

Tableau 5: Résultats représentatifs des cellules myéloïdes estimés après ischémie cérébrale avec l'approche de cytométrie en flux.

Discussion

Le modèle d'ischémie cérébrale présenté ici donne volumes d'infarctus hautement reproductibles déterminées 24 à 48 h et 7 jours après la ligature MCA par différentes approches 8,15,17. Ce modèle MCAO a un faible taux de mortalité (moins de 1%) par rapport aux autres, en minimisant le nombre d'animaux utilisés dans les études. Une étape cruciale pour obtenir ce taux de mortalité est faible pour maintenir des conditions aseptiques appropriées pour éviter les infections qui pourraient nuire à la survie après un AVC induction. Ce modèle MCAO peut non seulement être utilisé comme un modèle MCAO permanente, qui est considéré comme un modèle pertinent clinique pour la recherche translationnelle 18, mais aussi comme un modèle transitoire par ligature transitoire de la CCA et le MCA avec un nœud coulant et la reperfusion postérieure à l'heure souhaitée 19. Cette méthode a été utilisée avec succès chez la souris et le rat 17,20. Toutes ces preuves indique que MCAO par ligature est un modèle polyvalent de haute de l'ischémie cérébrale avec de multiples applications. Un Critical étape de cette technique est qu'elle nécessite une intervention chirurgicale invasive sous un stéréomicroscope; la craniotomie doit être effectuée très soigneusement pour ne pas endommager l'os zygomatique ainsi que la MCA. Cependant, l'utilisation d'animaux fictifs (qui sont soumis à la procédure chirurgicale, mais CCA et MCA ligature ne est pas effectuée) fournit un outil utile pour distinguer les effets de la procédure dépendante chirurgicales. L'étendue de la lésion cérébrale suivant cette technique peut être quantifiée par plusieurs méthodes. Notre protocole de cerveau sectionnement, coloration de Nissl et estimation ultérieure du volume de Cavalieri permet une quantification précise de la zone endommagée et minimise le nombre de souris utilisées dans ce type d'études depuis des coupes de cerveau en série peuvent également être utilisés pour l'analyse immunohistochimique différente. Pour une meilleure performance de cette méthode, il est essentiel de choisir les paramètres appropriés utilisés dans le logiciel de stéréologie (tableau 1) qui sera nécessaire pour estimer evolume de e des différentes régions par la formule: V = 1 / ssf * a f * t * ΣP i (SSF est la fraction tranche d'échantillonnage, t est l'épaisseur moyenne des sections, un f est la zone de l'espacement de la grille et ΣP le nombre de points de frapper la structure).

Le MCAO distale par ligature peut être utile pour caractériser le leucocyte infiltré et sous-populations de cellules immunitaires 8,13 qui participent dans le processus inflammatoire qui suit une lésion cérébrale 1-4. Ici, nous proposons deux méthodes différentes pour la caractérisation des cellules immunitaires du cerveau, une approche stéréologique précis et une analyse de cytométrie en flux pour mieux caractériser plusieurs sous-populations de leucocytes.

Profitant de série cerveau sectionnement, la quantification du nombre total de neutrophiles peut être obtenue par le procédé de fractionnement optique 16, qui estime le nombre total de cellules à partir du nombre de cellules wit échantillonnéha systématique échantillonnés au hasard (SRS) ensemble de impartiales espaces de comptage virtuelles couvrant l'ensemble de la région d'intérêt, dans notre cas, la région de l'infarctus, avec une distance entre impartiales espaces de comptage virtuelles uniforme dans les directions X, Y et Z. Cette méthode fournit un outil précis pour estimer le nombre total de neutrophiles dans le cerveau ischémique à différents moments après la ligature. Même se il n'a pas été démontré dans cette étude, ce protocole peut également être utilisée pour l'estimation des différentes sous-populations de neutrophiles après une ischémie 21 et pour une quantification précise de toute autre population de cellules dans le cerveau ischémique comme les autres leucocytes infiltrés (monocytes / macrophages) et aussi pour estimer neurones survivants ou même pour la neurogenèse quantification après un AVC. L'étape la plus importante pour une estimation précise de la zone souhaitée est le choix des paramètres appropriés, comme ceux indiqués dans le tableau 3 pour la quantification des neutrophiles dans la zone ischémique.Ces paramètres seront utilisés pour le logiciel de stéréologie pour calculer le nombre total de cellules positives (N) en utilisant l'équation N = ΣQ- x 1 / ssf x 1 / asf x 1 / TSF (ΣQ- est le nombre total de cellules comptées avec la colonne de fractionnement, SSF est la fraction d'échantillonnage de la section, asf est la zone de fraction d'échantillonnage et TSF est l'épaisseur de la fraction d'échantillonnage) 5. Bien que cette méthodologie est plus lent que les autres techniques de quantification (par exemple, l'analyse de marqueurs de neutrophiles par mg de tissu, la densitométrie des images ou le nombre de neutrophiles par champ représentatives), il a l'avantage d'être un neutre et une technique solide qui fournit une précision quantification du nombre de cellules.

La méthode d'isolement des leucocytes cerveau permet une identification et quantification simultanée de plusieurs sous-types de cellules immunitaires sans avoir à solliciter le système de coloration in vivo ou manipulations génétiques. Après le tri cellulaire à partir de la p myéloïde caractériséopulations ou leur séparation immunomagnétique peuvent être utilisés pour de multiples applications en aval, tels que d'autres études sur expression génique ou protéique. La caractérisation précise de neutrophiles, monocytes et la microglie obtenus avec cette méthode fournit une grande spécificité par rapport aux méthodes existantes telles que les études immunohistochimiques, un avantage qui permet l'attribution des fonctions spécifiques aux différentes cellules myéloïdes qui interviennent dans le cerveau réponse immunitaire innée. En outre, il peut être étendu pour caractériser d'autres populations du cerveau avec l'étiquette appropriée, comme sanguins né macrophages (CD11b + CD45 + CD68 salut), et il peut être appliqué pour l'étude d'autres pathologies du système nerveux central ou des blessures. Par conséquent, cette technique fournit un outil essentiel d'explorer l'hétérogénéité de la réponse inflammatoire dans le cerveau. Une limitation principale de cette technique réside dans la préparation des suspensions de leucocytes à partir de tissu cérébral frais, ce qui peut altérer laétat d'activation des cellules ou leur modification antigène. Bien que cette technique permet une caractérisation qualitative plus détaillée par rapport à des études immunohistochimiques, il fournit une quantification moins précise basée sur l'isolement des cellules. Malgré cela, l'efficacité de notre protocole d'isolement des cellules est similaire à d'autres méthodes publiées 9 et il peut être efficacement utilisé pour détecter des différences dans le nombre de cellules immunitaires cérébrales entre les groupes témoins et MCAO ou même entre les groupes MCAO soumis à différents traitements 8.

Les étapes critiques de ce protocole sont la dissection des tissus, la procédure d'interruption de tissus, et la suppression de la myéline. En ce qui concerne le recueil de tissu, une étape de normalisation peut être inclus (en pesant le tissu collecté) pour éviter la variabilité due à différentes performances de dissection. En outre, la normalisation entre les différents groupes MCAO peut également se produire par volume de l'infarctus (préalablement déterminée par magnétique Resonance). Une autre façon de résoudre ce problème est d'utiliser l'ensemble de l'hémisphère ipsilatéral des deux groupes ischémiques et de contrôle, ou même utiliser l'hémisphère controlatéral de la souris ischémique comme un contrôle de minimiser le nombre d'animaux utilisés. Bien que cette approche permet d'éviter des différences entre chaque dissection, elle a un inconvénient majeur; un facteur de dilution est ajoutée en augmentant le nombre total de cellules, mais pas le nombre de cellules myéloïdes qui sont exclusivement situées dans la zone centrale et les zones péri-infarctus du cortex ipsilatéral. En ce qui concerne la perturbation des tissus, ce protocole illustre les étapes de la rupture mécanique des cellules du cerveau, en évitant les traitements enzymatiques et la prévention antigène de surface altération 9,22, une question essentielle pour la poursuite analyse qualitative et quantitative des sous-populations de cellules inflammatoires. En plus de la préparation de la suspension de cellules d'intérêt, l'enlèvement de la myéline à partir d'échantillons de cerveau est une étape très recommandée pour éviter les interférences avec downstapplications rame, comme la séparation immunomagnétique ou cytométrie de flux 23,24. Ceci peut être réalisé en utilisant différentes méthodes, comme le saccharose ou gradients de Percoll ou perles anti-myéline. Ici, et basée sur des études antérieures qui comparent différentes méthodes pour l'isolement de suspension des cellules du cerveau, une rupture mécanique en combinaison avec l'utilisation de Percoll pour enlever la myéline est utilisé pour améliorer les rendements et la viabilité cellulaire 25.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Photonic Led F1 WPI 571329-8 Equipment
Temp Controller  Panlab  HB 101/2 Equipment
Volvere GX NSK Ne22L Equipment
Microscope WPI PZMIII-BS Equipment
Stainless Steel Burrs FST 19007-14 Surgical material
Forceps Dumont #5/45  FST 11251-35 Surgical material
Forceps Dumont #5SF FST 11252-30 Surgical material
Suture 6/0 LorcaMarin 55108 Surgical material
Suture 9/0 LorcaMarin 61966 Surgical material
Nikon Eclipse  Nikon TE300 Equipment
Isoflurane Esteve 571329-8 Chemical
Sodium Pentobarbital Vetoquinol 570681 Chemical
Freezing microtome Leica Microsystems GmbH SM2000R Equipment
Superfrost slides Thermo Scientific  2014-07 Lab material
Cresyl violet acetate Sigma C5042 Chemical
Microscope  Nikon Nikon Eclipse TE300 Equipment
XYZ motorized computer stage and controller Ludl electronics Products Equipment
Stereo Investigator System Microbrightfield Version 7.003 software Software
5 ml Tissue Grinder, Potter-Elv with teflon pestle Thomas Scientific 0913X70 Lab Material
Polypropylene 50 ml Oak Ridge Centrifuge Tube Nalgene 3119-0050  Lab material
Percoll Sigma p1644-100 Chemical
RPMI 1640 Lonza BE12-702F Chemical
Beckman Ultracentrifugue Beckman Coulter Equipment
Beckman Coulter ultracentrifuge rotor 45 Ti Beckman Coulter Equipment
BD Sterile Cell Strainer, 40 Micron BD BD 352340 Lab Material
Bovine Serum Albumin Sigma A3733-500G Reagment
FcR Blocking Reagent, mouse Miltenyi 130-092-575 Antibody
CD11b-FITC, human and mouse Miltenyi 130-098-085 Antibody
CD45-PE, mouse Miltenyi 130-102-596 Antibody
Anti-Ly-6G-APC, mouse Miltenyi 130-102-936 Antibody
PerCP/Cy5.5 anti-mouse Ly-6C Biolegend 128012 Antibody
BD FACS Flow BD 342003 Reagment
BD FACSCalibur; 4-color BD 342975 Equipment
BD Cell Quest Pro Software BD Software
FlowJo software Treestar inc. Software

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References

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