L'espressione di proteine ​​fluorescenti in

Developmental Biology

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Summary

Riportiamo qui l'espressione robusto ed efficiente di proteine ​​fluorescenti dopo l'iniezione di mRNA in oociti fecondati di Branchiostoma lanceolatum. Lo sviluppo della tecnica microiniezione in questo chordate basale aprirà la strada di una profonda innovazioni tecniche in questo sistema modello emergente, tra cui imaging in vivo e manipolazioni gene-specifici.

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Hirsinger, E., Carvalho, J. E., Chevalier, C., Lutfalla, G., Nicolas, J. F., Peyriéras, N., Schubert, M. Expression of Fluorescent Proteins in Branchiostoma lanceolatum by mRNA Injection into Unfertilized Oocytes. J. Vis. Exp. (95), e52042, doi:10.3791/52042 (2015).

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Abstract

Introduction

Durante lo sviluppo, una singola cellula dà origine ad un intero organismo in un processo altamente complesso che coinvolge entrambi divisioni e movimenti delle cellule. Per comprendere meglio i principi biologici alla base delle dinamiche del comportamento delle cellule, i biologi dello sviluppo hanno iniziato ad utilizzare in tecniche di imaging in vivo basato sulla fluorescenza. Compartimenti specifici di cellule, come le membrane cellulari, possono sia essere etichettati da trattamenti con coloranti fluorescenti, un approccio ostacolato dalla mancanza di specificità e di penetrazione del tessuto 1, o dall'introduzione specifica negli embrioni di mRNA esogeni codificanti proteine ​​fluorescenti 2. Diverse tecniche possono essere utilizzate per l'erogazione efficace dei composti esogeni, quali mRNA. Questi includono, ma non sono limitati a, microiniezione, elettroporazione, bombardamenti con microparticelle, lipofezione e trasduzione 3,4. Sebbene tutti questi approcci possono essere utilizzati per introdurre composti esogeni in unsviluppo dell'embrione, solo microiniezione consente l'applicazione di quantità predefinite e precisi in ogni cella 3. Tecniche di microiniezione sono stati descritti per tutti i principali sistemi di modelli di sviluppo 4 (ad esempio, i moscerini della frutta, vermi nematodi, zebrafish, rane, topi), oltre che per alcuni modelli alternativi di 4, compresi quelli utilizzati per gli studi comparativi volti a comprendere l'evoluzione dei meccanismi di sviluppo (ad esempio, anemoni di mare, vermi anellidi, ricci di mare, tunicati ascidie, l'anfiosso Cephalochordata).

Cephalochordates, che insieme con i tunicati e vertebrati stabiliscono il phylum cordati, particolarmente modelli adatto per studiare l'evoluzione dei Cordati e la diversificazione dei vertebrati da un antenato invertebrato 5-8. Il lignaggio Cephalochordata discostato molto presto durante l'evoluzione dei cordati; e cephalochordates esistenti, che si suddividono in tre generi (Branchiostoma, Asymmetron e Epigonichthys), assomigliano vertebrati sia in termini di anatomia generale e l'architettura del genoma 5-8. Delle circa 30 specie di cephalochordates che sono stati descritti finora, cinque sono disponibili per gli studi embriologici e sviluppo 6,9: Asymmetron lucayanum (il lancelet Bahama), Branchiostoma floridae (l'anfiosso Florida), Branchiostoma lanceolatum (l'anfiosso europeo), Branchiostoma belcheri (l'anfiosso cinese) e Branchiostoma japonicum (l'anfiosso giapponese). Adulti maturi di tre di queste specie (B. lanceolatum, B. belcheri e B. japonicum) possono essere indotti a deporre le uova su richiesta durante la stagione riproduttiva 10,11. Inoltre, almeno per B. lanceolatum, la deposizione delle uova efficiente può anche essere indotta in acqua di mare artificiale 12, rendendo in tal modo questa particolare specie Cephalochordata accessibile per laboratorIES che non hanno accesso ad acqua di mare naturale. La combinazione, in B. lanceolatum, di un accesso comodo e affidabile per gli embrioni con un metodo di consegna efficiente, come ad esempio la microiniezione, finora l'unica tecnica di consegna sviluppata in anfiosso (sia in B. floridae e B. belcheri) 13-15, consentirà lo sviluppo di un romanzo suite di tecniche manipolative, tra cui lignaggio tracing- e approcci basati sul comportamento di cellule dinamica.

Un protocollo per la microiniezione di mRNA efficace per esprimere le proteine ​​fluorescenti in B. lanceolatum embrione è stato sviluppato di conseguenza. Inoltre, per fornire un kit di strumenti di base per l'imaging dal vivo di B. embrioni lanceolatum, sistemi di vettori sono stati sviluppati che permettono associata alla membrana ed espressione nucleare di proteine ​​fluorescenti. Per membrane targeting, maggiore proteina fluorescente verde (eGFP) è stato fuso con la casella CAAX umana HRAS e localizzazione nucleare di mCherry e eGFP eraottenute per fusione alla esone zebrafish istone 2B (H2B) (Figura 1, File supplementare 1). Inoltre, con lo scopo di ottimizzare la traduzione della proteina, le sequenze Kozak e codoni dei costrutti sono stati modificati e adattati all'uso in B. lanceolatum. Nel loro insieme, il metodo di iniezione e di espressione vettori qui presentati serviranno da base per la generazione di nuovi approcci sperimentali per cephalochordates, in particolare analisi utilizzando la più recente a fluorescenza a base di tecniche di imaging in vivo.

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Protocol

1. Preparazione di strumenti e reagenti

  1. Trasferimento pipette Pasteur
    1. Generare una serie di pipette Pasteur transfer con diversi diametri di punta tirando 230 millimetri lunghi pipette Pasteur sopra una fiamma a velocità diverse. Assicurarsi che il cono è più a lungo possibile per un controllo più fini di aspirazione.
    2. Con un scrivano diamante, graffiare la pipetta lungo una linea perpendicolare alla lunghezza della pipetta. Con entrambe le mani estrarre la pipetta parallelamente alla sua lunghezza per generare un taglio smussato. Rapidamente fiamma lucidare la pipetta senza incollarsi la punta.
    3. Variare il diametro della punta con la fase degli ovociti / embrioni essere pipettati: 300-400 micron per ovociti non fecondati (circa 150 micron di diametro), 600 micron per le uova fecondate (circa 500 micron di diametro), 200-400 micron per neurulae tratteggiata. Utilizzare pipette con un tubo di aspirazione bocca monitorati per trasferire ovociti / embrioni da un piattoall'altro.
  2. Gli aghi da iniezione
    1. Manipolare i capillari con i guanti per garantire condizioni di assenza di RNasi. Utilizzare vetro borosilicato capillari filamento con dimensioni di 1,20 millimetri OD, ID 0,94 millimetri, lunghezza 10 mm.
    2. Se capillari sono tirati al tipo di riscaldamento-filamento ago estrattore descritto nella lista dei materiali, utilizzare le seguenti impostazioni: Heat 600, Pull 50, Velocity 80, Tempo 60, pressione 200 o 300. In caso contrario, assicurarsi che la forma, che è cruciale per iniezioni successo, è come mostrato in figura 2 con le seguenti proprietà: 4-8 micron di diametro punta esterna 2 cm lunghezza del cono.
      NOTA: aghi può essere tirato prima che la stagione riproduttiva e usato per tutta la stagione.
  3. Soluzione di fenolo Rosso stock 5% (4x)
    1. Preparare fresco prima di ogni stagione riproduttiva.
    2. In un tubo micron filtrazione 0.22, pesare 25 mg di fenolo polvere rossa.
    3. Aggiungere 0,5 ml di DNase- e RNase-free acquala provetta contenente la polvere.
    4. Spin per 3-5 min a 18.000 xg a temperatura ambiente per filtrare sterilizzare la soluzione e rimuovere i cristalli che potrebbero ostruire l'ago di iniezione.
    5. Conservare a 4 ° C o memorizzare 250 microlitri aliquote a -20 ° C.
  4. 0,25 mg soluzione di poli-lisina / ml
    1. Preparare fresco prima di ogni stagione riproduttiva.
    2. Disciogliere 5 mg di poli-L-lisina in 20 ml di acqua distillata. Conservare 5 ml aliquote a -20 ° C.
    3. Utilizzare un'aliquota scongelati immediatamente e solo una volta per assicurare l'adesione riproducibili e robusto degli ovociti al piatto poli-lisina rivestite.
  5. sintesi di mRNA
    1. Preparare fresco prima di ogni stagione riproduttiva.
    2. Linearizza 5 pg di DNA di interesse con l'enzima adeguata (di solito per 2 ore, a 37 ° C). Per controllare la completezza della digestione, eseguire 2% in volume della miscela di digestione su un 1% agarosio-TBE gel in tampone TBE a 150 W per 20 min.
    3. Estrarre la lineaDNA rized con 25: 24: 1 fenolo (pH 8.0): cloroformio: alcool isoamilico. Vortex per 20 sec, centrifugare 10 min a 18.000 xg e raccogliere la fase acquosa (superiore).
    4. Estrarre la fase acquosa nuovo con 24: 1 di cloroformio: alcool isoamilico. Vortex per 20 sec, centrifugare 10 min a 18.000 xg e raccogliere la fase acquosa.
    5. Precipitare il DNA linearizzato con 100: 10: 300 DNA linearizzato: 3 M acetato di sodio (pH 5.2): 100% di etanolo per una notte a -20 ° C.
    6. Centrifugare 20 min a 18.000 xga 4 ° C. Sciacquare in 70% di etanolo.
    7. Centrifugare 10 min a 18.000 xga 4 ° C. Lasciate asciugare e risospendere in acqua RNase-free ad una concentrazione finale di 0,5 mg / mL.
    8. Trascrivere 1 mg di DNA linearizzato utilizzando un kit di sintesi di mRNA con la polimerasi del caso, secondo le istruzioni del produttore.
    9. Estrarre il mRNA con 5: 1 fenolo (pH 4,7): soluzione di arresto cloroformio e acetato di ammonio fornito con il kit.
    10. Vortex per 20 secondi, centrifuge 10 min a 18.000 xg e raccogliere la fase acquosa.
    11. Estrarre la fase acquosa nuovo con 24: 1 di cloroformio: alcool isoamilico. Vortex per 20 sec, centrifugare 10 min a 18.000 xg e raccogliere la fase acquosa.
    12. Precipitare il mRNA con 100% di isopropanolo notte a -20 ° C.
    13. Centrifugare 20 min a 18.000 xga 4 ° C. Risciacquare in 80% di etanolo.
    14. Centrifugare 10 min a 18.000 xga 4 ° C. Lasciare pellet asciugare a temperatura ambiente per non più di 5-10 min come sarà poi difficile risospendere. Risospendere in DNase- e acqua RNase-free per una concentrazione finale di almeno 2 mg / mL per assicurare un dignitoso concentrazione mRNA finale nel mix di iniezione.
    15. Per controllare la qualità e le dimensioni del prodotto di trascrizione, eseguire 0,5 ml di mRNA su un 1% agarosio-TBE gel senza RNasi in tampone TBE a 150 W per 20 min. Negozio 2 aliquote microlitri a -80 ° C.
  6. Piatti Poly-lisina rivestite
    NOTA: Poly-lisina coapiatti ted sono utilizzati per immobilizzare gli oociti durante l'iniezione.
    1. Per ciascuna piastra di Petri coltura cellulare 35 mm (5 in totale), coprire il fondo del piatto Petri con 1 ml della / soluzione di poli-lisina ml 0,25 mg scongelati. Incubare a temperatura ambiente per 5 min.
    2. Per ogni piatto Petri coltura cellulare 35 mm (5 in totale), trasferire la soluzione 0,25 mg / ml di poli-lisina in un'altra cella-cultura piastra di Petri da 35 mm. Incubare a temperatura ambiente per 5 min.
    3. Eliminare il / soluzione poli-lisina ml 0,25 mg.
    4. Lasciare le piastre di Petri a secco, capovolto a temperatura ambiente per 2 ore.
    5. Memorizzare i piatti poli-lisina rivestite avvolto in un involucro di plastica a 4 ° C per evitare la contaminazione per una settimana massimo.
  7. Piatti agarosio rivestite
    NOTA: Sono usati per cultura iniettato embrioni. L'agarosio fornisce un ammortizzatore per gli embrioni iniettati e impedisce loro di attaccarsi al fondo del piatto.
    1. Fare acqua di mare artificiale (ASW) con 37-38 g / L commsali erciali + 0,25 NaHCO mm 3 in acqua ad osmosi inversa.
    2. Sciogliere agarosio ad una concentrazione 1% in 0,22 micron ASW filtrata riscaldando la soluzione in un forno a microonde.
    3. Rapidamente versare la soluzione di agarosio calda da una piastra da 35 mm Petri in un altro per assicurare un rivestimento molto sottile agarosio del piatto.
    4. Conservare i piatti agarosio rivestite avvolto in Saran avvolgono a 4 ° C per evitare la contaminazione per una settimana massimo.
  8. Mix iniezione e caricamento degli aghi di iniezione
    1. Circa 2 ore prima di iniziare le iniezioni, fare un mix di iniezione 2 ml in RNase e acqua priva di DNase con concentrazioni finali di 1-1,8 mg / mL di mRNA, 15% glicerolo, 1,25% rosso fenolo.
      NOTA: I colori rosso fenolo della soluzione, che consente il monitoraggio dell'efficienza di iniezione e l'identificazione degli embrioni iniettati con successo. Glicerolo favorisce mRNA diffusione all'interno dell'ovocita.
    2. Centrifugare 4 minuti a 18.000 xg percristalli pellet. Tenere in ghiaccio fino al momento dell'uso.
    3. Con una pipetta 10 microlitri, raccogliere 0,5 microlitri della miscela di iniezione, evitando il fondo del tubo, dove sono stati pellettato i cristalli.
    4. Backfill almeno due aghi da iniezione (in caso si rompe durante l'iniezione) pipettando il calo di 0,5 ml di miscela di iniezione alla grande apertura dell'ago.
    5. Installare gli aghi in un barattolo di archiviazione con liquido nella parte inferiore a 4 ° C per evitare l'evaporazione della miscela di iniezione. Che il mix iniezione lentamente viaggiare alla punta dell'ago di iniezione per almeno 1 ora per minimizzare la formazione di bolle.
    6. Conservare mix iniezione aggiuntiva a -80 ° C per un massimo di tre altri usi, dopo di che la qualità mRNA deteriora (dati non mostrati).

2. Raccolta di materiale biologico, microiniezione e Cultura Embrione

  1. Ovociti e spermatozoi collezione
    NOTA: Vedere Theodosiouet al. 12 per un protocollo dettagliato per indurre la deposizione delle uova e per la raccolta dei gameti.
    1. Shock maschi e femmine in ASW a 23 ° C per 24 ore.
    2. Una o due ore prima del tramonto, trasferire il numero di adulti in singoli tazze in ASW a 19 ° C, perché la maggior parte degli adulti si riproducono 1-2 ore dopo il tramonto.
    3. Risciacquare 35 millimetri piatti Petri in ASW filtrato e lasciarli asciugare capovolto per evitare gli ovociti di attaccarsi al fondo del piatto.
    4. Dopo la deposizione delle uova, raccogliere immediatamente spermatozoi e ovociti con una pipetta 1000 ml.
      1. Tenere spermatozoi e ovociti separato da anfiosso adulti perché il contatto è dannoso per la salute dei gameti (dati non riportati).
      2. Inoltre, evitare di sorprendente adulti, che porta a movimenti che dissipano, e quindi diluite, sia spermatozoi e ovociti. Per mantenere lo sperma attiva più a lungo possibile e ottimizzare tasso di fecondazione, raccogliere lo sperma come concentrato possibile.
    5. Manteneresperma su ghiaccio in una provetta da 1,5 ml.
    6. Trasferimento ovociti in filtrato ASW nelle 35 millimetri piatti pre-risciacquato Petri.
    7. Trasferimento 100-500 ovociti con una già tirato 300-400 micron trasferimento pipetta Pasteur a un altro 35 millimetri piastra di Petri per eseguire le iniezioni.
    8. Fertilizzare il resto della frizione come controllo per gli spermatozoi e qualità ovocita o per altri esperimenti.
  2. Iniezione di ovociti
    1. Installare l'ago di iniezione sulla micromanipolatore a 50 ° rispetto al piano orizzontale.
      NOTA: Angoli di meno di 50 ° spingeranno gli ovociti in tutto sul piatto, mentre gli angoli superiori a 50 °, non potrà esercitare un controllo adeguato della posizione dell'ago rispetto al ovocita.
    2. Sotto un ambito dissezione fluorescente con 25X oculari, trasferire 30 ovociti con il 300-400 micron trasferimento pipetta Pasteur su un piatto poli-lisina rivestite contenenti filtrata ASW.
    3. Depositare gli ovociti lungo una linea per trasportarefuori iniezioni in modo ordinato e per distinguere iniettati da ovociti non iniettato. Iniettare piccoli numeri (30 ovociti) per minimizzare il tempo di esposizione di ovociti a poli-lisina, che tende a deformare embrioni di sviluppo (dati non mostrati).
    4. Utilizzare l'illuminazione campo scuro per rendere gli ovociti quanto traslucido possibile.
    5. Con la manopola movimento grossolano del micromanipolatore, portare l'ago per l'iniezione vicino a un ovocita.
    6. Con una pinza sottile, tagliare aprire l'ago al livello in cui la punta comincia ad essere curvato. Con pulsante con l'iniettore, verificare che mix iniezione rosso è effettivamente defluisce dell'ago.
    7. A 200 ingrandimenti e con la manopola movimento fine del micromanipolatore, spostare delicatamente l'ago di iniezione all'interno del nucleo dell'ovocita.
      NOTA: Se è inserito troppo superficialmente, la soluzione iniettata non rimarrà all'interno dell'ovocita. Se inserita troppo lontano, l'ovocita sarà distrutto.
    8. Iniettare con 1-3 impulsi di 120 msec DURATion e 1-10 pressione psi. Se l'ago è abbastanza bene, iniettare con flusso continuo a pressione costante. Assicurarsi che il volume di iniezione corrisponde a 1/5 a 1/3 del volume di un singolo ovocita.
    9. Dopo l'iniezione, estrarre l'ago rapidamente per evitare perdite dell'ovocita.
    10. Verificare che la soluzione iniettata rimane all'interno dell'ovocita e che dopo un paio di secondi, la soluzione iniettata si diffonde in tutto l'ovocita.
    11. Passare al prossimo ovocita in linea.
    12. Mantenere alcuni embrioni uninjected di ogni serie come controllo negativo per stimare la fluorescenza di fondo durante la scansione per gli embrioni iniettati.
  3. Fecondazione, selezione degli embrioni iniettati e della cultura degli embrioni
    1. Fertilizzare gli ovociti non appena una serie è stata iniettata. Come qualità ovocitaria diminuisce con il tempo, l'iniezione e fecondare ovociti entro 1 ora dopo la deposizione delle uova 12.
    2. A seconda della concentrazione degli spermatozoi, aggiungere 1-5 gocce di sperma di ovociti eagitare il piatto.
      NOTA: La busta concimazione dovrebbe risulteranno sulle embrioni dopo circa 1 min.
    3. Lasciare gli embrioni di staccarsi dal piatto poli-lisina rivestite, mentre l'iniezione di un'altra serie di ovociti.
    4. Trasferire gli embrioni con il micron trasferimento pipetta Pasteur 600 in una piastra di Petri agarosio rivestite. Rimuovere gli embrioni dal piatto poli-lisina rivestite appena possibile, se possibile prima della fase 2 cellule.
      NOTA: In caso di prolungata esposizione al poli-lisina, gli embrioni tendono a diventare blastulae densamente imballato, appiattita sul lato toccare il fondo del piatto.
    5. Al 2-cell a 4 celle stage, selezionate con un ambito dissezione fluorescenza con filtro DSR embrioni successo-iniettati, vale a dire, quelli con una morfologia normale che presentano un segnale rosso fluorescente rosso fenolo-derivato.
    6. Mantenere gli embrioni in cultura in filtrato ASW in piastre di Petri agarosio rivestite a 19 ° C fino allo stadio desiderato perimaging in vivo.

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Representative Results

Il protocollo descritto sopra fornisce la base per la microiniezione di B. ovociti lanceolatum e quindi per l'introduzione nella sviluppare B. embrioni lanceolatum di mRNA che codificano proteine ​​fluorescenti per l'imaging in vivo. Sebbene la tecnica è certamente robusto ed affidabile, il tasso di successo di iniezioni utilizzando questo protocollo rimane variabile (Tabella 1). La spiegazione molto probabile per questo fatto interessante è l'estrema variabilità delle frizioni ovociti: diversi lotti uovo effettivamente si comportano in modo molto diverso, quando sottoposto alla pressione di iniezione. Alcuni ovociti sono piuttosto elastici e tendono ad appiattirsi sul fondo del piatto, mentre altri sono abbastanza rigido e rimangono rotondo a seguito di iniezione. Inoltre, alcune partite ovocita tendono a gonfiare i loro membrane Chorion su iniezione, mentre altri semplicemente Lyse (dati non riportati). Nessuna correlazione evidente potesse essere stabilita tra il comportamento degli ovociti dopo l'iniezione e embrionalesviluppo dopo la fecondazione. È quindi difficile prevedere quale categoria di ovociti è più adatto per microiniezione. Tuttavia dopo la fecondazione, gli embrioni in sviluppo normale possono essere individuati prima fasi scissione: 2-cell a 4-celle embrioni stadio può essere considerato normale quando la superficie di contatto tra blastomeri è piccolo, mentre un compattato embrione scissione-stadio, in cui le singole cellule sono difficili da discernere, è sicuramente anomala.

Nelle nostre mani, circa la metà degli ovociti non sopravvive il trauma causato dall'iniezione e circa la metà degli embrioni che fanno sopravvivere alla mostra iniezione un'etichetta fluorescente specifico. Così, si stima che con questo protocollo di iniezione, tra 50 e 120 embrioni possono essere iniettati con successo in un dato giorno di deposizione delle uova rendimento tra i 15 ei 60 embrioni etichettati.

La fluorescenza rossa del rosso fenolo in 2-cella 4 cellule embrioni stadio segna molto affidabile embrioni che hannostato correttamente iniettato, come 100% degli embrioni selezionati in questo modo successivamente produrre le proteine ​​fluorescenti codificate dal mRNA iniettato. Inoltre, vi è una netta correlazione positiva tra l'intensità di fluorescenza rossa fenolo a 2 cellule di 4 celle fase e il tempo di insorgenza della fluorescenza prodotta dalle proteine ​​codificate dal mRNA iniettato. Questa correlazione permette quindi l'identificazione di quegli embrioni che hanno ricevuto la più alta quantità di mRNA durante il processo di iniezione.

Se il segnale della proteina fluorescente codificata dal mRNA iniettato non viene rilevata dopo la selezione di fenolo embrioni Red-positivi, si consiglia di eseguire il mix iniezione su un gel senza RNAse per verificare la degradazione dell'mRNA o trapping (Figura 3) . In corsia 1, viene rilevata una banda di mRNA intatto. Iniezione di questo mix ha portato alla forte segnale fluorescente nell'embrione. Al contrario, in corsia 2 che corrisponde ad un altro speriment dove rosso fenolo è stato sostituito con destrano colorante nel mix (vedere discussione per ulteriori dettagli), l'mRNA sembra essere stato intrappolato dal colorante destrano e iniezione di questa miscela mai portato al segnale fluorescente nell'embrione.

Utilizzando questa tecnica microiniezione e nostri costrutti (Tabelle 2 e 3, File supplementare 1) (si veda la discussione), possiamo dunque riproducibile produrre marcatura fluorescente omogenea in tutto l'embrione con mCherry o eGFP nel nucleo e con eGFP sulla membrana (Figura 4) . Il protocollo di imaging utilizzata per generare la figura 4 sarà descritto altrove (Faure et al., In preparazione). A seconda della quantità di mRNA iniettata, l'espressione della proteina fluorescente diventa tipicamente rilevabile tra 16 celle (Figura 4A) e modulazione 64-cellula e rimane rilevabile almeno fino alla fase tardiva neurula (dati non mostrati). Tappe successive non sono stati testati. Segnale nuclearetipicamente appare prima del segnale di membrana, potenzialmente causa della natura intrinsecamente diffuso della membrana rispetto alla natura compatta del nucleo (dati non mostrati). Anche se non è stata monitorata sistematicamente, embrioni iniettati sia con un nucleare e un'etichetta membrana sembrano essere meno sani embrioni iniettati esclusivamente con un'etichetta eGFP nucleare. Curiosamente, questo effetto sembra essere indipendente dalla quantità totale di mRNA iniettato come la quantità totale di iniettato mRNA è la stessa, sia uno o due specie di mRNA sono inclusi nella miscela (dati non mostrati).

Figura 1
Figura 1: Costruire dettagli. Schizzi di (A) la membrana mirati eGFP (eGFP: scatola CAAX), (B) il nucleare targeting eGFP (H2B: eGFP) e (C) il nucleare targeting mCherry (H2B: mCherry) costruisce are mostrato.

Figura 2
Figura 2: Forma di un ago per iniezione rappresentante. (A) La conicità è di circa 2 cm di lunghezza e le curve ago sulla punta. Barra di scala = 2 mm. (B) ingrandimento della zona in scatola in A. La posizione di clipping dell'ago (freccia) è nella curva dell'ago. La punta dell'ago è indicata dalla freccia. Scala bar = 500 micron. Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.

Figura 3
Figura 3:. Interazioni di mRNA e coloranti fluorescenti selezionati (A) Risultato della migrazione di una miscela contenente mRNA e rosso fenolo in corsia 1 edi mRNA e destrano Texas Red (ad una concentrazione finale di 3,3 mg / ml) in corsia 2 (B) Risultato della migrazione di una miscela contenente destrano mRNA e Oregon Green (ad una concentrazione finale di 3,3 mg / ml) in corsia 3, di mRNA e destrano FITC (ad una concentrazione finale di 3,3 mg / ml) in corsia 4 e di mRNA e rodamina destrano (ad una concentrazione finale di 3,3 mg / ml) in corsia 5. Gel tempo di migrazione in A e B era diverso. Per motivi di chiarezza, il rettangolo nero in una maschera di una riflessione della luce e le linee tratteggiate delimitano le corsie di migrazione. Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.

Figura 4
Figura 4: Rappresentazione 3D (software Amira) di embrioni anfiosso iniettati con mRNA codificanti per proteine ​​fluorescenti immagini sono.estratto dal time-decade 3D ​​acquisiti su un Leica SP5 2 fotoni microscopio a scansione laser ottimizzato stadio (A) 16-cellule embrionali esprimono H2B nucleare:.. eGFP (B) Gastrula fase embrionale esprime H2B nucleare: mCherry e mirata membrana eGFP:. box CAAX (C) Gastrula fase embrionale esprime H2B nucleare: mCherry e il eGFP membrana mirati: scatola CAAX. La sezione ottica mostra cellule interne con mCherry nucleare e segnali eGFP associate alla membrana. Bar Scala = 50 micron.

Numero Experiment Iniettato mRNA costrutto Numero di embrioni iniettati Numero di embrioni etichettati
1 H2B: eGFP 53 23
2 H2B: eGFP 50 31
3 H2B: eGFP 48 20
4 H2B: eGFP 54 24
5 H2B: eGFP 114 47
6 H2B: eGFP 80 46
7 H2B: eGFP o 62 24
H2B: mCherry + eGFP: scatola CAAX
8 H2B: eGFP 87 60
9 H2B: eGFP 77 45
10 eGFP: scatola CAAX o 110 51
H2B: mCherry + eGFP: scatola CAAX
11 H2B: mCherry + eGFP: scatola CAAX 45 26
12 H2B: mCherry + eGFP: CAScatola AX 52 16
13 eGFP: scatola CAAX o 74 35
H2B: mCherry + eGFP: scatola CAAX
Totale 906 448
Tasso di successo 49%

Tabella 1:. Percentuali di successo iniezione I costrutti iniettati, il numero di embrioni iniettati sopravvissuti l'iniezione e il numero di etichetta (o iniettati con successo) embrioni sono indicati, in quanto è la percentuale complessiva di iniezioni di successo.

Costruire Posizione in pCS2 + vector Sequenza originale Sequenza Mutato
pCS2 + eGFP: scatola CAAX 79..87 GGA TCC ACC ACC GT C A A C
pCS2 + H2B: eGFP 82..90 TCC GAC ACG A CC G T C A AC
pCS2 + H2B: mCherry 82..90 TCC GAC ACG A CC G T C A AC

Tabella 2:. Ottimizzazione Tentativo di sequenze Kozak originale e sequenze Kozak mutate sono indicati per ogni costrutto. Le mutazioni introdotte recuperare la sequenza Kozak della B. lanceolatum gene actina, che ricorda molto da vicino quella del dedotto teorica preferito sequenza di Kozak anfiosso (A / CGA / CG / TTC A / GAC ATG TG / CT).

pCS2 + eGFP: scatola CAAX
Codone originale Mutato codone Posizione in pCS2 + vector
(Livello di utilizzo) (Livello di utilizzo)
GTA GT G 154..156 sequenza eGFP
(0,08) (0.43)
AGA AG G 814..816 Linker
(0,09) (0,27)
pCS2 + H2B: eGFP
Codone originale Mutato codone Posizione inil pCS2 + vector
(Livello di utilizzo) (Livello di utilizzo)
GTA GT G 223..225 Sequenza H2B
(0,08) (0.43)
289..291 Sequenza H2B
469..471 Linker
568..570 sequenza eGFP
CTA CT G 226..228 Sequenza H2B
(0.06) (0.51)
pCS2 + H2B: mCherry
Codone originale Mutato codone Posizione in pCS2 + vettore
(Livello di utilizzo) (Livello di utilizzo)
GTA GT G 223..225 Sequenza H2B
(0,08) (0.43)
289..291 Sequenza H2B
469..471 Linker
913..915 Sequenza mCherry
CTA CT G 226..228 Sequenza H2B
(0.06) (0.51)

Tabella 3: ottimizzazione provvisoria di utilizzo codone. Codoni originali e mutate sono indicati per ogni costrutto. Anche se questo non è stato sperimentalmente testato, il mutati introdottoons sono pensati per ottimizzare la traduzione mRNA in anfiosso.

File supplementare 1: Costruire sequenze Le sequenze nucleotidiche di (A) la membrana mirati eGFP. (EGFP: scatola CAAX), (B) il nucleare targeting eGFP (H2B: eGFP) e (C) il mCherry nucleare targeting (H2B : mCherry) costrutti sono riportati nel contesto del backbone pCS2 + vettoriale. I principali domini codificati da ciascuno dei costrutti sono indicati in colore: eGFP (verde), mCherry (rosso), segnale di localizzazione membrana da HRAS (box CAAX) umano (ciano), zebrafish esone istone 2B (H2B) (giallo).

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Discussion

In questo articolo, presentiamo, per la prima volta, un protocollo dettagliato e riproducibile per l'iniezione di B. ovociti lanceolatum, che, dopo il B. floridae 13,14 e B. belcheri 15, è quindi la terza specie anfiosso, per cui tale tecnica è stata descritta. È importante sottolineare che il protocollo qui descritto comprende inoltre la descrizione di sistemi vettore adatto per la produzione di proteine ​​fluorescenti in B. lanceolatum da mRNA iniettati prodotti in vitro (descritto di seguito). Insieme, questi nuovi strumenti consentono imaging in vivo dello sviluppo iniziale di anfiosso e l'analisi dei comportamenti cellulari dinamiche che stanno alla base dei primi eventi morfogenetici nell'embrione, come scissione e gastrulazione.

In generale, la tecnica microiniezione ha il vantaggio di consentire l'erogazione, in una cellula bersaglio, di un volume predefinito di un composto specifico. Con questo essere saiuto, uno principale limitazione di questa tecnica è il numero limitato di cellule che possono essere iniettati in un dato esperimento. Ad esempio, il protocollo qui descritto per B. lanceolatum consente l'iniezione di 100 a 120 uova per sessione iniezione, di cui sarà identificato circa la metà (Tabella 3). Per B. floridae, i numeri sono molto simili con 500 o più uova che possono essere iniettati al giorno, di cui più del 50% sarà sopravvivere l'iniezione 13,14. Mentre i protocolli di iniezione B. lanceolatum e B. uova floridae molto simili tra di loro, la B. tecnica belcheri è leggermente diversa: le uova vengono immessi sul poli-lisina rivestite coprioggetto e le iniezioni vengono effettuate sotto un microscopio rovesciato con un microinjector di una marca diversa. Questo approccio consente evidentemente l'iniezione di tra 200 e 300 B. uova belcheri per sessione di iniezione con un tasso di sopravvivenza, dopo la schiusa in fase neurula, of 89.39% al 95.83% 15. Considerando le differenze di protocolli, è difficile sapere se le differenze nei tassi di successo sono dovute a differenze di specie legate o relative al protocollo. Bisognerebbe testare le diverse specie in parallelo con i diversi protocolli di rispondere a questa domanda. Tuttavia, per aumentare ulteriormente il numero di ovociti mirati per la consegna di composti esogeni, altri protocolli dovranno essere sviluppato per anfiosso. Tecniche candidati comprendono elettroporazione, bombardamenti con microparticelle, lipofezione, e trasduzione 4. Da segnalare, elettroporazione è già stato stabilito come una tecnica standard per l'introduzione di materiale esogeno in fecondati uova ascidia tunicato, un altro modello chordate invertebrato usato per studiare l'evoluzione dei meccanismi di sviluppo 8.

Per microiniezione successo e successiva di imaging in vivo di proteine ​​fluorescenti, adattovettori di espressione sono un prerequisito obbligatorio. A tal fine, tre plasmidi sono stati sviluppati e validati sperimentalmente (Figura 1, supplementare File 1): per membrane targeting, il gene eGFP è stata fusa nella sua 'estremità 3 al box HRAS CAAX umano (con un conseguente eGFP: scatola CAAX costrutto ) 16 e, per il targeting nucleare, sia il eGFP ei geni mCherry state fuse al loro 5 'estremità alla esone zebrafish istone 2B (H2B) (risultanti, rispettivamente, in un H2B: eGFP e H2B: costrutto mCherry) 17. Ognuno di questi costrutti è stato clonato nel plasmide pCS2 + contenente un sito ritardo poliadenilazione SV40 e un promotore SP6 consentendo in vitro ridotta sintesi di mRNA 18,19. Inoltre, con lo scopo di ottimizzare traduzione dei costrutti in B. lanceolatum, entrambe le sequenze Kozak e codoni sono stati adattati con singolo nucleotide mutagenesi (tabelle 2 e 3, del file supplementare 1). Bascato sull'approccio da Nakagawa 20, una piccola piscina di B. geni lanceolatum stati analizzati per identificare una sequenza di Kozak preferito in questa specie. Il noto sequenza presenti naturalmente più vicino a questa sequenza teorica preferita è quella del B. lanceolatum gene actina. Le sequenze Kozak dei tre costrutti sono stati quindi modificati per corrispondere a questo sequenza genica actina. Inoltre, il codon usage di B. lanceolatum è stato analizzato utilizzando il database di utilizzo codone 21 e codoni in costrutti con una bassa probabilità di utilizzo in B. lanceolatum (<10%) sono stati sostituiti, ove possibile, da codoni equivalenti con una probabilità più elevata di utilizzazione.

I risultati delle iniezioni mostrano che il livello di espressione della proteina da questi vettori è adatto per analisi in vivo imaging. Dato che l'uscita espressione dei vettori modificati non è stata confrontata con quella di costrutti modificati, non possiamo Conclude sull'efficienza delle modifiche introdotte nel consenso Kozak e le sequenze codificanti. Sarebbe certamente interessante per verificare se tali modifiche, infatti, hanno un impatto sui livelli di espressione della proteina. Lungo queste linee, una recente analisi basata su microiniezioni in B. belcheri suggerisce che altri, vettori non modificate possono essere utilizzate anche per la sintesi di mRNA per la produzione di proteina fluorescente in anfiosso 15.

Anfiosso contiene proteine ​​fluorescenti verdi endogene 22. Gli embrioni presentano quindi bassi livelli di verde nonché fluorescenza rossa (nostre osservazioni non pubblicate). Tuttavia, questi livelli endogeni sono trascurabili rispetto ai livelli di fluorescenza risultanti dalla iniezione dei nostri costrutti mRNA. Pertanto, la fluorescenza endogena di embrioni anfiosso non disturba le osservazioni sperimentali utilizzando un binocolo fluorescenti o multi-laser microscopi a scansione. In aggiunta, Gli esperimenti di iniezione rivelano che l'intensità della fluorescenza esogeno generato mediante iniezione mRNA dipende dalla quantità effettiva di materiale iniettato, che è direttamente correlata alla concentrazione finale di mRNA utilizzato nella miscela di iniezione. B. embrioni lanceolatum tendono a tollerare una concentrazione di 1,8 mg / mL mRNA, anche se, indipendente dalla concentrazione effettiva mRNA, alcune combinazioni mRNA sembrano essere meno tollerati da B. lanceolatum embrioni di altri. Così, la combinazione di mCherry membrana nucleare e eGFP mRNA sembrava essere più tossico l'iniezione di eGFP nucleare solo.

Texas Red destrano è stata precedentemente utilizzata come tracciante per le iniezioni di successo in ovociti anfiosso 13-15. Curiosamente, un segnale fluorescente derivato dal mRNA iniettato stata mai ottenuta dopo l'iniezione di soluzioni contenenti Texas Red destrano e questo sia in ovociti anfiosso (n = 4 esperimenti) e zebrafiembrioni sh (n = 3 esperimenti). Quando viene caricato un mix iniettabile contenente mRNA trascritto in vitro e Texas Red destrano su un gel di agarosio RNase-free (Figura 3, corsia 2), la banda corrispondente al mRNA è assente. Al contrario, in vitro trascritto mRNA è rilevabile su un gel di agarosio senza RNasi in presenza di rosso fenolo (Figura 3, corsia 1). Dato che non vi è alcuna prova di degradazione dell'mRNA sul gel, questi risultati suggeriscono che Texas Red destrano tende a intrappolare mRNA. Quando utilizzato in una soluzione iniettabile, Texas Red destrano può quindi impedire la traduzione del mRNA iniettato. Seguendo questa osservazione, le interazioni di altri coloranti (FITC destrano, rodamina destrano e Oregon verde destrano) con mRNA sono stati testati, sia RNase-free gel di agarosio e mediante iniezione in B. lanceolatum o pesce zebra (Figura 3). Le analisi indicano che FITC destrano non trattenga mRNA su gel (Figura 3, lane 4) e conduce all'espressione della proteina fluorescente in zebrafish (n = 1 esperimento), ma non in embrioni di B. lanceolatum (n = 1 esperimento) (dati non mostrati). Rodamina destrano non trattenga mRNA su gel (Figura 3, corsia 5) e conduce all'espressione proteina fluorescente negli embrioni di zebrafish (n = 1 esperimento) (dati non mostrati), ma la sua attività non poteva purtroppo essere testato in B. embrioni lanceolatum. Infine, come destrano Oregon verde migra allo stesso livello del mRNA, mRNA trapping potrebbe non essere valutata mediante gel di agarosio (Figura 3, corsia 3). Quest'ultimo colorante impedito espressione della proteina fluorescente in anfiosso (n = 1 esperimento), ma embrioni non zebrafish (n = 1 esperimento) (dati non mostrati). In sintesi, questi dati suggeriscono che alcuni destrani possono inibire efficacemente la traduzione di mRNA iniettato. Dato che gli esperimenti dose-risposta, non sono state effettuate, i dati sono di tipo qualitativo. Curiosamente, questo effetto inibitorio sembra essere dipendentele specie animali (pesce zebra contro anfiosso), che evidenzia la necessità di ulteriori studi per comprendere i meccanismi alla base di questo effetto. Inoltre, questi risultati richiedono analisi preparatorie, se destrani devono essere utilizzati come traccianti di colore per iniezioni.

Lo sviluppo della tecnica microiniezione per un determinato modello apre la porta per manipolazioni gene-specifici. In anfiosso, per esempio, la prima descrizione di microiniezioni (in B. floridae) è seguita la knockdown successo di un gene, hox1, utilizzando iniezioni morfolino oligonucleotidi 23,24. Il numero di B. embrioni lanceolatum che possono essere iniettati con successo ogni giorno utilizzando il protocollo presentato qui è certamente compatibile con questo tipo di studio. Inoltre, con questi metodi e le nuove costruzioni a portata di mano, si può ora anche progettare e realizzare studi iperespressione e atterramento da iniezione di mRNA di interesse (nativo o dominante negforme ative) o utilizzare altre strategie per interrompere l'espressione genica (ad esempio microRNA- o strategie basate shRNA). Finora, le iniezioni anfiosso possono essere eseguite solo in fase di ovocita, semplicemente perché questa è l'unica fase che può efficacemente essere immobilizzato. Dopo l'iniezione in fase di ovociti, la molecola di interesse è ubiquitariamente espresso nell'embrione. Così, se l'espressione genica deve essere modificato o monitorato solo in un sottogruppo di cellule, costrutti di DNA devono essere iniettato, in quanto questi sono espressi mosaically nel amphioxus sviluppo dell'embrione 15,25-27. Iniezioni costrutto di DNA possono anche essere usati per testare l'attività di regioni regolatorie durante lo sviluppo amphioxus in saggi transgenici transitori, con il suddetto inconveniente di espressione mosaico 15,25-27.

In ultima analisi, la tecnica di microiniezione anfiosso apre anche la porta per transgenesi stabile, tra cui il knock-out mirati o knock-in di loci genetici specifici. Sistemas per l'inserimento stabile di DNA esogeno già esistenti, per esempio con il sistema di Tol2 base di pesce trasposone-che sembra funzionare in entrambi insetti e vertebrati amniote 28. Inoltre, approcci basati sulla nucleasi modificati zinc-finger (ZFNs) o di trascrizione attivatore simili nucleasi effettrici (Talens) o strumenti di editing genoma RNA-guida (CRISPR / system Cas) può essere utilizzato per generare mutazioni puntiformi e knock-in modifiche specifiche regioni del genoma 29. Questi sforzi richiedono l'allevamento per tutto l'anno di anfiosso in cattività, che è già stato impostato per B. belcheri 11,30 e B. japonicum 30,31 ed è attualmente in fase di sviluppo per la A. lucayanum, B. floridae e le specie anfiosso presenti qui, B. lanceolatum 32.

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Acknowledgments

Gli autori vorrebbero riconoscere il sostegno da parte del "Animalerie Centrale de Gif-sur-Yvette" per la zootecnia. Questo lavoro è stato sostenuto da fondi da ANR (ANR-09-BLAN-0262-02 e ANR-11-JSV2-002-01) a Michael Schubert, dalla sovvenzione dell'Unione Europea FP6 "Embryomics" e dalla concessione ANR "ANR- 10-BLAN-121801 Dev-Process "di Jean-François Nicolas e Nadine Peyrieras. João Emanuel Carvalho è finanziato da una borsa di studio di dottorato FCT (SFRH / BD / 86878/2012).

Le richieste di vettori qui descritte possono essere indirizzate direttamente agli autori.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Consumables
35 mm Petri dishes Falcon 353001 Culture-treated
Filtration unit (Stericup 1 L) Fisher W21719 0.22 μm
Spin-X tubes Costar 8160 0.22 μm
Needle storage jar for 1.2 mm diameter capillaries WPI E212
Pasteur pipettes 230 mm long
Aspiration tube Dutscher 75056
Capillaries for injection needles Sutter BF 120-94-10 Borosilicate glass with filament, OD 1.20 mm, ID 0.94 mm, length 10 mm
Reagents
Low-melting agarose Sigma A9414
Phenol Red Sigma 114537
Glycerol Sigma G2025
Poly-L-lysine hydrobromide Sigma P9155
H2O, DNase/RNase-free Gibco 10977-035
mMessage mMachine SP6 Transcription kit Ambion AM1340 mRNA synthesis kit
Phenol pH 8 Sigma P4557
24:1 chloroform:isoamylic alcohol Sigma C0549
5:1 phenol pH 4.7:chloroform Sigma P1944
Reef Crystal salts (200 kg) Europrix  Commercial salts
NaHCO3 Sigma S6014
Equipment
Fluorescent dissecting scope with 200X magnification Leica MZ16F 25X oculars, DSR and GFP2 filters
Micromanipulator Marzhauzer M-33
Injector Picospritzer model II or III
Needle puller Sutter P97 Heating-filament needle puller
Fine forceps Fine Science Tools GmbH 11252-30 Dumont #5

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References

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