녹농균 유발 폐 손상 모델

Immunology and Infection

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Suresh Kumar, V., Sadikot, R. T., Purcell, J. E., Malik, A. B., Liu, Y. Pseudomonas aeruginosa Induced Lung Injury Model. J. Vis. Exp. (92), e52044, doi:10.3791/52044 (2014).

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Abstract

인간 급성 폐 손상 및 폐렴을 연구하기 위해,이 질환의 다양한 병리학 적 특징을 모방하는 동물 모델을 개발하는 것이 중요하다. 여기에서 우리는 박테리아 녹농균 (P. aeruginosa의 또는 PA)의 내부 기관 주입에 의한 마우스 폐 손상 모델을 개발했다. 이 모델을 사용하여, 우리는 손상의 초기 단계에서의 폐 염증을 표시 할 수 있었다. 또한, 폐포 상피 장벽 leakiness는 기관지 폐포 세척액 (BAL)을 분석하여 관찰 하였다; 및 폐포 세포 사멸로부터 제조 부상 폐 조직을 사용 TUNEL 염색하여 관찰 하였다. 손상 후 이후의 단계에서, 우리는 복구 프로세스에 필요한 세포 증식을 관찰 하였다. 부상 7 일 P.의 시작에서 해결되었습니다 aeruginosa에 주입입니다. 이 모델은 폐렴 동안 폐 염증, 손상 및 수리의 순차적 과정을 모방. 이 임상 적으로 관련된 동물 모델에서 F, 수리 메커니즘을 병리학을 공부에 적합급성 폐 손상을 따르게하고,은이 질환의 잠재적 인 치료제를 시험하기 위해 사용될 수있다.

Introduction

폐는 환경 병원균에 노출 염증과 손상 1-3에 취약합니다. 폐렴 또는 성인 호흡 곤란 증후군 (ARDS)과 같은 병적 인 상황에서는 백혈구가 발표 한 병원균뿐만 아니라 염증 요인이 폐포 세포 1-3의 부상과 죽음을 유도한다. 이것은 수리 부상 병리학 연구뿐만 아니라기구를 용이 급성 폐 손상의 동물 모델을 개발하는 것이 중요하다.

현재, 대부분의 사람들은 고농도 산소 및 블레오 마이신 유도 마우스 폐 손상 모델 4를 사용합니다. 그러나 고농도 산소의 메커니즘은 부상이 폐렴이나 급성 호흡 곤란 증후군 5시에 가장 자주 발생하는 폐 손상과 동일하지 않습니다 일으켰습니다. 블레오 마이신에 의한 급성 손상은 임상 상황에 맞는 4 드물다. 여기에서 우리는 P.의 내부 기관 주사를 사용하여 마우스 폐 손상 모델을보고 aeruginosa의 6,7. 이 모델은 임상 적이며, 모방 P폐렴 8 다음과 같은 일이 rocesses.

면역 개인의 기회, 병원 내 병원균, P.로 녹농균은 일반적으로 폐, 요로, 화상, 상처 감염 및 다른 혈액 감염 (6)이 발생합니다. 박테리아 병원성 인자 외독소를 해제 곱하고 면역 반응 (6)를 발생시킨다. P.의 내 trachael 관리 녹농균 폐렴을 유발할 박테리아 인체 노출의 상황을 반영하고 병리 최근보고 된 인플루엔자 바이러스 H1N1 유도 폐 손상 모델 (9)로부터 상이 할 가능성이있다. P. 이후 aeruginosa에 그것이 더 악성 병원균 중 일부에 비하여 취급이 비교적 안전하다 기회 병원체이다. 우리가 관찰하기 때문에 여기에서 우리는이 방법에 비해 폐의 말초 폐포 지역에 더 많은 박테리아를 도입하는 박테리아를 관리하는 내부 기관 주사를 사용입소문을 통해 카테터를 사용하는 등 다른 절차.

다른 급성 폐 손상 모델에 비해 P. 여기에 설명 녹농균 모델은 박테리아에 의해 과도한 염증에 의해 유발 된 폐 손상을 연구하는데 적합하다. P.를 사용하는 다른 동물 모델과는 달리 녹농균은 여기에 우리가 현지화 된 급성 폐 손상을 유발하는 박테리아의 내부 기관 주사를 사용, 패혈증 (10, 11)을 유도한다.

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Protocol

동물 실험은 시카고 일리노이 대학의 동물 관리위원회와 기관 바이오 안전성위원회에 의해 승인되었다.

참고 : 마스크, 보안경, 가운 또는 점프 수트, 더블 장갑 : 녹농균을 포함한 모든 절차를 포함 하나 이에 한정되지 않는다 바이오 안전성 레벨 2 (BSL2) 방식으로 수행되어야한다. 인증 바이오 안전성 캐비닛에서 작동합니다. 표백제 또는 이산화 염소 소독제와 박테리아와 접촉 악기를 취급합니다. 전송 샘플 봉인 상자를 사용합니다.

1. P. aeruginosa의 문화와 성장

  1. 스토어 P. -80 ° C에서 cryovial 스크류 캡에 세균 재고로 aeruginosa의 PA103.
  2. 70 % 에탄올 젖은 종이 타월 상자에 랙에 유리 병을 놓고 바이오 안전성 레벨 2 (BSL2) 실험실에 걸릴.
  3. 킬 양 혈액 아가 플레이트 상에 박테리아가 인큐베이터에서 15 시간 ~ 37 ° C에서 성장한다. BSL2 후드, 5 ㎖ PBS에서 박테리아 루프 및 재현 탁과 접시에서 세균에 상처.
  4. 최대 3 개월 동안 4 ° C에서 재고를 보관합니다. 그러나, 역가에게 2 주마다 결정한다.
  5. 직렬 (1시 10분 7 1:10 (4)로부터 보통) PBS로 세균을 희석 양 혈액 아가 플레이트에 공지 된 희석액을 플레이트.
  6. ~ 15 시간 동안 번호판을 품어. 콜로니 카운트 박테리아 농도를 결정하기 위해 콜로니 형성 단위 (CFU)을 계산한다.
  7. 적절한 농도를 재현 탁 (~ 5 × 103 CFU / μL) 1.5 ml의 멸균 스크류 캡 크리오 바이알 (cryovial) 0.5 ml의 PBS에서. 크리오 바이알 (cryovial)를 밀봉 스냅 뚜껑 상자에 살균제 라덴 종이 타월에 cryovial 랙에 배치합니다.
  8. BSL2 동물 시설에있는 상자를 운반. 일단 거기, BSL2 캐비닛의 상자를 엽니 다.

2. P. aeruginosa에 떨어 뜨림

  1. 생존 수술 무균 (멸균 장갑, 멸균 악기를 수행및 무균 기술). 살균 (멸균) 수술기구에 대한 작업 표면을 제공하기 위해 무균 드레이프를 사용합니다. 각 기관 점안 절차 사이에 뜨거운 구슬 살균기를 사용하여 악기를 소독.
  2. 마취하기 전에 마우스의 무게를. , 케타민 (100 ㎎ / ㎏), 자일 라진 (xylazine) (5 ㎎ / ㎏)와 쥐를 마취 0.1 - 0.2 ml의 PBS 복강 내 (IP). 발가락 핀치에 비 대응하여 마취의 효과를 결정합니다. 마취하에 건조를 방지하기 위해 눈에 수의사 연고를 사용합니다.
  3. BSL2 캐비닛의 수술 보드에 마우스를 제지합니다.
  4. 절단 아래의 영역을 식별합니다. 이 영역을 면도하고 3 회 알코올과 포비돈 요오드 면봉을 교대로 사용하여 피부를 준비합니다.
  5. 이 마취 같은 기관에 액세스하기로 피부 절개 부 수술에 충분한로서 국소 마취제 (리도카인)와 절개 영역 치료.
  6. 목의 정중선 작은 절개 (약 5mm)를 확인하고 무딘 F를 사용orceps 부드럽게 기관에 액세스 근육을 이동합니다. 수술 절개하여 기관을 노출.
  7. 27 G 바늘 1 ml의 일회용 주사기로 세균 솔루션을 그립니다. 각 마우스의 경우, 적절한 농도 (105 CFU 각 마우스까지) 박테리아의 20 ~ 30 μl를 관리 할 수 있습니다.
  8. 기관에 바늘을 삽입합니다. 기관에 천천히 솔루션을 주입한다.
  9. 일반적으로 해당 솔루션을 나타내는 동물 헐떡 거림이 폐에 도달 한 것을 확인합니다.
  10. 무균 조건에서 멸균 봉합 (6-0 모노 필라멘트)와 상처를 닫습니다.
  11. 0.1 ㎎ / 수술 후 통증을 제어하기 위해 수술 후 진통제 등의 피하 주사에 의해 kg 프레 노르 핀을 사용합니다.
  12. 폐쇄를 절개하는 초기 마취 유도에 필요한 시간보다 15 분인지 확인합니다.
  13. 주입 한 후, 적절한 생물 학적 날카로운 물건 용기에 주사기와 주사 바늘 폐기하십시오.
  14. 이산화 염소를 기반으로 DISI와 수술 도구를 취급nfectant 15 분 동안 씻어 살균을 위해 실험실로 돌아가서 필요한 경우 다시 사용합니다.
  15. 단독으로 따뜻한 환경에서 깨끗한 케이지의 집은 마우스.
  16. 이 의식을 회복하고 이동하기 시작 때까지 동물에 매 30 분을 확인; 나중에 처음 3 일 수술 후 12 시간 간격으로.
  17. 실험을하는 동안 동물 BSL2 시설에 마우스를 유지합니다. 밀봉 된 상자에 포함 된 유일한 조직은 동물 BSL2 시설 나뭇잎 있는지 확인합니다. 쥐가 죽어가는 행동 중 하나를 표현하는 경우 연구에 어떤 시점에서 (호흡 곤란, 혼수, 부드러운 자극에 대한 응답으로 ambulate 실패로 정의), 자궁 경부 전위 다음에 병에 소스에서 CO 2 흡입 쥐를 안락사.
  18. 마취에서 일어난 과다 출혈에 의한 실험 주제를 안락사.
    1. 안락사 쥐에서 폐 조직을 수집합니다. BSL2 후드에서이 절차를 수행하십시오. 필요한 경우, 라 세미 배치 밀봉 된 튜브를 사용하여 샘​​플을 전송할추가 프로세스에 대한 스냅 뚜껑 상자에 살균제 라덴 종이 타월에 케이.

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Representative Results

72 시간 게시물 P. - 24 일부터 시작 녹농균 주입, 세포 수 증가는 (도 1a-D) 폐 섹션에서 관찰되었다. 폐는 96 시간 포스트 부상 (그림 1E)를 복구하기 시작했다. 칠일에 P.를 게시 녹농균, 정상 폐포 형태는 크게 (그림 1 층) 복원되었습니다. 터널 염색하여 폐 섹션은 24 시간 후 P.에서 준비 녹농균은 폐포 세포 (도 1G-I)에서 세포 사멸을 보였다. 이 손상 모델에서 복구 프로세스를 연구하기 위해, BrdU의 포스트는 P. 삼일에서 생쥐에 주입 녹농균. 폐는 5 시간 후 BrdU의 주입에 격리와 BrdU의 항체 염색법에 대한 처리되었습니다. 도 1JK에 도시 된 바와 같이, 상당히 72 시간 포스트 P.에서 BrdU의 혼입 세포의 수를 증가 과다 증식을 나타내는 녹농균 관리.

당 장벽의 변화를 연구하려면meability 및 염증 후 손상, 기관지 폐포 세척액은 (BAL) 유체는 P.을 게시 서로 다른 시간 지점에서 수집 된 aeruginosa에 주입입니다. BAL의 단백질 농도는 크게 48 시간 게시물 P.에 증가 상피 장벽 leakiness 나타내는 녹농균 주입 (도 2A). BAL의 세포 수는 48 시간 게시물 P.에서 크게 증가 염증 반응을 제안 녹농균 주입 (도 2B). P. 포스트 4-5일에서 aeruginosa에 주입, BAL의 단백질 수준과 세포 수 모두 제안 복구 (그림 2A, B)을 감소하기 시작했다. 또한, 폐 해물은 다른 지점에서 P.를 게시 수집 aeruginosa의 관리 및 대 식세포 염증성 단백질 2 (MIP2)의 레벨, 호중구 매력 12에 관련된 사이토 카인은 ELISA로 측정 하였다. BAL 분석 결과와 일치, MIP2 수준이 크게 increa 48 시간 게시물 P.에 나오지도 aeruginosa에 주입하고 96 시간 게시물 P.에서 기초 수준에 반환 녹농균 주입 (도 2c). 또한, BAL로부터 세포를 유리 슬라이드에 고정 및 혈액학 염색을 실시 하였다. P.없이 녹농균는 BAL 액 (도 2D)에서 단구 단지 소수 있었다. 반면, 호중구의 많은 양의 BAL에 참석했다 48 시간 게시물 P.에 고립 녹농균 주입 (도 2e). 96 시간 게시물 P.으로 aeruginosa에 주입, BAL의 셀 구성은 제어 레벨 (도 2F)로 복귀. 요약하면,도 2의 결과는 증가 폐포 장벽 투과성 및 급성 폐 손상 (13)의 모든 특징입니다 사이토킨 농도의 증가와 함께 호중구 급성 염증 반응을 나타내었다. 모든 실험에서, 생리 식염수의 주입은이를 대조군으로 사용 하였다.

ve_content "> H와 E 염색, BrdU의 라벨, TUNEL 분석, BAL 분석 및 MIP2 레벨 측정을 포함하여 데이터의 일부는 이전에. (7)을 발표 한이 글에서, 우리는 수리, FoxM1, 전사 인자의 역할을 연구 여기서도 7에 설명 P. aeruginosa의 폐 손상 모델을 사용 폐포 손상.

그림 1
그림 1. 조직학, P.의 세포 사멸 및 증식 aeruginosa의 매개 마우스 폐 손상 모델. (AF) 폐 격리는, 단면 및 H / E 염색은 비 P.를 사용하여 수행 하였다 녹농균은 주입 (비 PA) 24 시간 (B), 48 시간 (C), 72 시간 (D), 96 시간 (E), 칠일 (F) 포스트 P.에서 제어 폐 (A)뿐만 아니라 폐 에 루기 노사켜졌 (POST-PA). (GI) 폐 섹션이 제어 폐 (G) 및 24 시간 후 - P.에서 준비 하였다 녹농균은(H, I)를 주입하고 세포 사멸을 검출하는 TUNEL 분석 동안 진행. 폐 절편 형태를 보여 폐 상피 세포 마커 SP-C (블루), T1α (레드)에 대한 염색 및 TUNEL 또한 (녹색)에 대해 염색 하였다. (H)의 화살표는 TUNEL 양성 세포를 나타냅니다. (J, K)의 BrdU가 비 P.에 주입 하였다 녹농균은 마우스 (J) 및 72 시간 게시물 P.를 주입 녹농균은 IP로 마우스 (K)를, 폐는 5 시간 후 BrdU의 주입에 준비 BrdU의 (녹색 얼룩)에 대한 항체 염색을 위해 처리 된 주입. 스케일 바 AF 용 = 60 μm의, G와 H 50 μm의, 나는 20 μm의, 및 J와 K에 대한 100 ㎛. 이 수치는 리우에서 수정되었습니다 7. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 2
도 2 폐포 장벽 투과성 염증 P. 다음에 녹농균은 폐 손상을 유발. (A는 B) BAL은 제어 및 P.에서 수집 녹농균은 폐를 처리 하였다. BAL에서 (A) 단백질 농도가 48 시간 게시물 P. 증가 aeruginosa의 주입 및 96 시간에 감소, 오일은 P. 게시 BAL에서 aeruginosa의 주입. (B) 총 세포 수는 48 시간 게시물 P. 증가 96 시간 게시물 P. aeruginosa의에서 분사 (B)와 재곡 제어 수준 aeruginosa에 주입. MIP-2 수준은 우리를 측정 하였다 (C)48 시간 및 96 시간 게시물 P.에서 제어 마우스뿐만 아니라 생쥐에서 분리 보내고 폐 해물 aeruginosa에 주입입니다. 데이터는 평균 ± SE에서 발표되었다, N BAL에서 ≥ 3 (DF) 세포를 원심 분리 및 유리 슬라이드에 고정 HEMA3 염색을 실시 하였다. 단핵구의 소수 대조군 마우스의 BAL (D)에 존재 하였다. 호중구의 많은 양의 BAL의 존재에게 48 시간 게시물 P.에 고립 녹농균 주입 (E). 96 시간 게시물 P.으로 aeruginosa에 주입, BAL (F)에서의 단구 소수 있었다. 스케일 바 = 10 μm의 이러한 결과는 적어도 5 번의 독립된 실험의 대표 값이다. 이 그림은 리우 등. 7에서 수정되었습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

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Discussion

우리가 여기에서 설명하는 슈도모나스 마우스 폐 손상 모델은 급성 폐 손상이나 폐렴에 따라 발생하는 염증, 폐 손상, 수리 및 해상도의 전 과정을 모방. 그것은 임상 적으로 비교적 안전하고 취급이 용이 점에서 여러 가지 다른 부상 모델에 비해 독특한 장점을 가지고있다.

절차의 중요한 단계는 박테리아 용액의 주입이 매우 느리게 할 필요가 있다는 것이다. 주사가 너무 빠르다면, 마우스는 초크 의해 죽을 가능성이 높다. 성공적으로 주입 한 후, 마우스는 일반적으로 입자가 폐에 들어가 박테리아를 도움이 될 것입니다 몇 가지 깊은 숨 쉬고 헐떡 거림을 보여줍니다.

우리가 사용 된 균주는 PA103 6했다. 이 모델의 중요한 점 중 하나는 P.의 역가 녹농균이 엄격하게 제어 될 필요가있다. P.의 배치 다른 소스에서 녹농균은 다른 염증의 정도와 손상도 보여줄 수같은 CFU에서 사용. 따라서, 박테리아의 각 새로운 배치 (예 염증, 세포 증식 등과 같은) 그 원인에 미치는 영향을 평가하고 그에 따라 CFU의 수가 사용되도록 조정하는 것이 권장된다. 결과의 불일치가 냉장 박테리아 스톡을 사용하여 발생하는 경우, 하나는 각 실험에 대한 신선한 판에서 성장하는 박테리아에 의해 얻은 신선한 주식을 사용할 수 있습니다. 또한, 세균 및 매체 선택의 성장 단계는 호스트 응답에 미치는 효과에 영향을 미칠 수있다. 따라서, 치료는 세균 접종은 박테리아의 성장 사이클의 동일한 단계에서 발생하는 것을 보장하기 위해 취해 져야한다.

P.에 대한 반응의 차이가있을 수 있습니다 마우스의 다른 균주에 의한 녹농균. 우리가 사용한 균주는 C57BL / 6 및 FVB / N의 혼합물이었다. 적절한 P. 녹농균 역가 다른 생쥐 균주에 대해 결정되어야한다.

이 모델은 하나의 요인은 고려세균의 하나의 손상은 세포 유형에 한정되지 않는다. 예를 들어, 상피 세포, 내피를 들어, 섬유 아세포는 모든 손상되었을 수 있습니다. 따라서,이 모델은 세포 형 특이 폐 손상의 효과를 연구하기 위해 적합하지 않다. 박테리아는 염증 반응을 자극뿐만 아니라 조직 (6)에 독소를 분비하여 폐 세포 사멸을 야기한다. 라이브 박테리아는 일반적으로 48 시간 게시물 부상 7,14 내 폐에서 삭제됩니다. 죽은 박테리아의 높은 농도는 또한 염증 반응 (15)을 유도하여 손상 될 수 있습니다.

폐 손상 및 수리 메커니즘은 폐 손상의 다른 유형에 따라 다를 수 가능성이 있습니다. 따라서, 여러 손상 모델을 비교하는 것이 중요하다. P. 여기에 설명 aeruginosa의 모델은 다른 모델에 좋은 추가이다.

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Materials

Name Company Catalog Number Comments
Anesthetic: Ketamin, xylazine, lidocaine, buprenorphine pharmaceutical grade
27 G needle Fisher 1482648
syringe Fisher 14823434 1 ml
scissors Fine Science tools
forceps Fine Science tools
suture  Fisher 19-037-526
Eye gauge, glove, gown
Biosafety Cabinet
chlorine dioxide based disinfectant Clidox
sheep blood agar plates  Medex supply HL-1160

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References

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