Pseudomonas aeruginosa Induced Lung Injury Modello

Immunology and Infection

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Suresh Kumar, V., Sadikot, R. T., Purcell, J. E., Malik, A. B., Liu, Y. Pseudomonas aeruginosa Induced Lung Injury Model. J. Vis. Exp. (92), e52044, doi:10.3791/52044 (2014).

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Abstract

Per studiare danno polmonare acuto umana e la polmonite, è importante sviluppare modelli animali per simulare varie caratteristiche patologiche di questa malattia. Qui abbiamo sviluppato un modello di topo polmone lesioni da iniezione intra-tracheale di batteri Pseudomonas aeruginosa (P. aeruginosa o PA). Utilizzando questo modello, siamo stati in grado di mostrare l'infiammazione polmonare in fase precoce di lesioni. Inoltre, alveolare leakiness barriera epiteliale è stato osservato analizzando lavaggio broncoalveolare (BAL); e la morte delle cellule alveolari è stato osservato da Tunel test utilizzando il tessuto ottenuto da polmoni feriti. In una fase successiva dopo un trauma, abbiamo osservato proliferazione cellulare richiesto per il processo di riparazione. L'infortunio è stato risolto 7 giorni dalla apertura di P. aeruginosa iniezione. Questo modello riproduce il corso sequenziale di infiammazione polmonare, lesioni e di riparazione durante la polmonite. Questo modello animale clinicamente rilevante è adatto per studiare la patologia, il meccanismo di riparazione, fopo danno polmonare acuto, e può anche essere usato per testare potenziali agenti terapeutici per questa malattia.

Introduction

I polmoni sono esposti agli agenti patogeni ambientali e sono suscettibili di infiammazione e lesioni 1-3. In condizioni patologiche come la polmonite o sindrome da sofferenza respiratoria dell'adulto (ARDS), agenti patogeni e fattori infiammatori rilasciati dai leucociti inducono lesioni e la morte delle cellule alveolari 1-3. E 'importante sviluppare modelli animali di danno polmonare acuto per facilitare lo studio della patologia del pregiudizio, nonché il meccanismo di riparazione.

Attualmente, la maggior parte delle persone usano iperossia e bleomicina topo indotto modelli danno polmonare 4. Tuttavia, i meccanismi di iperossia causato lesioni non sono gli stessi come maggior parte delle lesioni polmonari comuni che si verificano durante polmonite o ARDS 5. Bleomicina indotta lesione acuta è rara in un contesto clinico 4. Qui riportiamo un polmone modello di lesione del mouse usando iniezione intra-tracheale di P. aeruginosa 6,7. Questo modello è clinicamente rilevante, e imita il processes che accadono dopo la polmonite 8.

Come un opportunista, agente patogeno nosocomiale di individui immunocompromessi, P. aeruginosa infetta in genere il tratto polmonare, delle vie urinarie, ustioni, ferite, e causa anche altre infezioni del sangue 6. Il batterio rilascia virulenza fattore esotossina A, si moltiplicano e si scatenano risposte immunitarie 6. Somministrazione intra-trachael di P. aeruginosa riflette la situazione di esposizione umana ai batteri che causano la polmonite e la patologia è probabile che sia diverso dal virus H1N1 dell'influenza polmonare indotta modello di lesione recentemente riportato 9. Dal momento che P. aeruginosa è un patogeno opportunista, è relativamente sicuro da maneggiare rispetto ad alcuni dei patogeni più virulenti. Qui abbiamo usato iniezione intra-tracheale per amministrare i batteri, perché abbiamo osservato che questo metodo ha introdotto più batteri nella regione distale alveoli del polmone rispetto aalcune altre procedure come l'utilizzo di un catetere attraverso la bocca.

Rispetto ad altri modelli di danno polmonare acuto, il P. aeruginosa modello qui descritto è adatto per studiare danno polmonare indotta da batteri e infiammazione eccessiva. A differenza di altri modelli animali che utilizzano P. aeruginosa per indurre la sepsi 10,11, qui si usa l'iniezione intra-tracheale di questi batteri di indurre localizzata danno polmonare acuto.

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Protocol

Gli esperimenti sugli animali sono stati approvati dal Comitato di cura degli animali e istituzionali biosicurezza Comitati della University of Illinois a Chicago.

NOTA: Tutte le procedure che coinvolgono Pseudomonas devono essere eseguite con il livello di biosicurezza 2 (BSL2) pratiche, che includono ma non sono limitate a: maschera, occhiali di protezione, abito o tuta, e due paia di guanti. Lavorare in sicurezza biologica certificata Gabinetto. Trattare gli strumenti in contatto con i batteri con candeggina o biossido di cloro disinfettante a base. Utilizzare una scatola sigillata per i campioni di trasporto.

1. P. aeruginosa cultura e di crescita

  1. Negozio P. aeruginosa PA103 come uno stock batterica in un tappo a vite esageratamente a -80 ° C.
  2. Posizionare la fiala in un rack in una scatola con etanolo al 70% bagnato asciugamani di carta e prendere al laboratorio livello di biosicurezza 2 (BSL2).
  3. Streak i batteri su piastre di agar sangue di pecora e crescono a 37 ° C per ~ 15 ore in un incubatore. In una cappa BSL2, graffiare i batteri dalla piastra con batteri loop e risospendere in 5 ml di PBS.
  4. Conservare il titolo a 4 ° C per un massimo di 3 mesi. Tuttavia, determinare il titolo ogni 2 settimane.
  5. Serialmente diluire i batteri in PBS (di solito da 1:10 a 1:10 4 7) e piastra fuori la diluizione noto su piastre di agar sangue di pecora.
  6. Incubare le piastre per ~ 15 ore. Contare le colonie e calcolare Colony Forming Unit (CFU) per determinare la concentrazione di batteri.
  7. Risospendere le concentrazioni appropriate (~ 5 x 10 3 UFC / ml) in 0,5 ml di PBS in 1,5 ml sterili cryovials con tappo a vite. Sigillare i cryovials e metterli in un rack esageratamente sul disinfettante salviette di carta a pieno carico in una scatola coperchio a scatto.
  8. Trasportare la casella di stabulario BSL2. Una volta lì, aprire la scatola nell'armadio BSL2.

2. P. aeruginosa instillazione

  1. Eseguire un intervento chirurgico di sopravvivenza in condizioni asettiche (guanti sterili, strumenti sterili, ed impiegare tecniche asettiche). Utilizzare un telino sterile per fornire un piano di lavoro per la (autoclave) gli strumenti chirurgici sterili. Sterilizzare gli strumenti utilizzando uno sterilizzatore tallone caldo tra ogni instillazione tracheale procedura.
  2. Pesare i topi prima di anestesia. Anestetizzare topi con ketamina (100 mg / kg), xilazina (5 mg / kg), in 0,1 - 0,2 ml di PBS per via intraperitoneale (ip). Determinare l'efficacia dell'anestetico dalla non rispondenza alle pinch punta. Usare una pomata veterinario sugli occhi per prevenire la secchezza sotto anestesia.
  3. Trattenere mouse su una scheda chirurgico in armadietto BSL2.
  4. Identificare l'area per il taglio verso il basso. Radere questo settore e preparare la pelle con alternanza di alcol e tamponi povidone iodio 3 volte.
  5. Trattare l'area di incisione con anestetico locale (lidocaina) poiché l'anestesia è sufficiente per un intervento chirurgico minore come un incisione cutanea per accedere alla trachea.
  6. Fai una piccola incisione (circa 5 mm) sulla linea mediana del collo, e l'uso schietto forceps per spostare delicatamente il muscolo per l'accesso alla trachea. Esporre la trachea da dissezione chirurgica.
  7. Disegna la soluzione di batteri in un 1 ml siringa monouso con ago 27 G. Per ogni mouse, somministrare 20-30 ml di batteri alla concentrazione adeguata (fino a 10 5 CFU ogni mouse).
  8. Inserire l'ago nella trachea. Iniettare la soluzione lentamente nel tracheale.
  9. Assicurarsi che i rantoli di animali, che di solito indica che la soluzione ha raggiunto nei polmoni.
  10. Chiudere la ferita con punti di sutura sterili (6-0 monofilamento) in condizioni asettiche.
  11. Utilizzare 0,1 mg / kg di buprenorfina per via sottocutanea come post-operatoria analgesia per controllare il dolore postoperatorio.
  12. Assicurarsi che il tempo richiesto dalla induzione di anestesia prima di incisione di chiusura è inferiore a 15 min.
  13. Dopo l'iniezione, gettare siringhe e aghi in un apposito contenitore per rischio biologico taglienti.
  14. Trattare gli strumenti chirurgici con disi a base di biossido di cloronfectant per 15 minuti, risciacquare e tornare al laboratorio per la sterilizzazione e il riutilizzo, se necessario.
  15. La casa dei topi singolarmente in gabbie pulite in ambiente caldo.
  16. Controllare sull'animale ogni 30 minuti fino a quando non riprende conoscenza e comincia a muoversi; e in seguito a intervalli di 12 h per i primi 3 giorni dopo l'intervento chirurgico.
  17. Tenere i topi nella struttura BSL2 animali tutto l'esperimento. Assicurarsi che solo il tessuto contenute in scatola sigillata lasciano l'impianto BSL2 animali. Se i topi esprimono uno dei comportamenti moribondi (definito come distress respiratorio, letargia, incapacità di deambulare in risposta alla stimolazione dolce) in qualsiasi punto dello studio, i topi eutanasia da CO 2 inalazione da una fonte in bottiglia seguita da dislocazione cervicale.
  18. Euthanize il soggetto sperimentale per dissanguamento in anestesia.
    1. Raccogliere tessuto polmonare di topi eutanasia. Eseguire queste procedure in un cappuccio BSL2. Se necessario, trasferire il campione utilizzando tubi sigillati posti in una rack su disinfettanti carta assorbente pieno carico in una scatola coperchio a scatto per un ulteriore processo.

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Representative Results

Partendo 24-72 ore dopo P. iniezione aeruginosa, aumentata cellularità è stata osservata in sezioni polmonari (Figura 1A-D). Il polmone ha iniziato a recuperare da infortuni 96 ore dopo (Figura 1E). A 7 giorni dopo il P. aeruginosa, normale morfologia alveoli è stato in gran parte restaurato (Figura 1F). Tunnel di colorazione sezioni grazie polmonari preparati in 24 ore di post P. aeruginosa ha mostrato la morte cellulare nelle cellule alveoli (Figura 1G-I). Al fine di studiare il processo di riparazione in questo modello infortunio, BrdU è stato iniettato in topi a 3 giorni dopo l'P. aeruginosa. I polmoni sono stati isolati a 5 ore dopo l'iniezione di BrdU e trattati per anticorpi BrdU colorazione. Come mostrato in Figura 1J e K, aumentato significativamente il numero di cellule BrdU incorporati a 72 ore dopo P. amministrazione aeruginosa indicando iperproliferazione.

Per studiare la variazione di barriera perpermeabilità e l'infiammazione dopo lesioni, lavaggio broncoalveolare (BAL) è stato raccolto in diversi momenti postare P. aeruginosa iniezione. La concentrazione delle proteine ​​nel BAL era notevolmente aumentata in 48 ore di post P. aeruginosa iniezione (Figura 2A), indicando epiteliale leakiness barriera. Il numero di cellule in BAL anche aumentato in modo significativo a 48 ore di post P. aeruginosa iniezione (Figura 2B), suggerendo una risposta infiammatoria. A 4 - 5 giorni Alberino P. iniezione aeruginosa, sia a livello proteico BAL e il numero di cellule iniziato a diminuire suggerendo di recupero (Figura 2A, B). Inoltre, lisato polmone sono stati raccolti in diversi punti L'alberino P. somministrazione aeruginosa e il livello di macrofagi proteine ​​infiammatorie 2 (MIP2), una citochina coinvolta nella neutrofili attrazione 12, è stata misurata mediante ELISA. In linea con i risultati delle analisi BAL, livello MIP2 Increa in modo significativo sed a 48 ore di post P. aeruginosa iniezione e tornò a livello basale a 96 ore di post P. aeruginosa iniezione (Figura 2C). Inoltre, le cellule di BAL sono stati fissati su vetrini e sottoposte a colorazione ematologico. Senza P. aeruginosa, c'erano solo un piccolo numero di monociti nel BAL (Figura 2D). Al contrario, la grande quantità di neutrofili erano presenti nel BAL isolato a 48 ore di post P. aeruginosa iniezione (Figura 2E). Con 96 ore di post P. iniezione aeruginosa, la composizione delle cellule di BAL restituito al livello di controllo (Figura 2F). Per riassumere, i risultati hanno indicato in figura 2 una risposta infiammatoria neutrofila acuta insieme ad una maggiore permeabilità di barriera alveoli e aumento delle concentrazioni di citochine, che sono tutte caratteristiche del danno polmonare acuto 13. In tutti gli esperimenti, è iniezione di soluzione salina è stata usata come controllo.

ve_content "> Parte dei dati, tra cui H e E colorazione, marcatura con BrdU, saggio TUNEL, BAL analisi e misurazione del livello MIP2, è stato precedentemente pubblicato con il 7. In questo articolo, abbiamo studiato il ruolo di FoxM1, un fattore di trascrizione, nella riparazione di danno alveolare utilizzando il modello di danno polmonare da P. aeruginosa qui 7 descritto.

Figura 1
Figura 1. Istologia, morte cellulare e la proliferazione in P. aeruginosa del mouse mediata modello di danno polmonare. Isolamento (AF) Lung, il sezionamento e H / E colorazione è stata realizzata utilizzando non P. aeruginosa-iniettato (non-PA) polmoni di controllo (A), così come i polmoni a 24 ore (B), 48 ore (C), 72 ore (D), 96 ore (E) 7 giorni (F) post P. aeruginosa ininiezione (post-PA). (GI) sezioni polmonari sono stati preparati dai polmoni di controllo (G) e 24 ore post-P. aeruginosa iniettato polmoni (H, I) e proseguire per il saggio TUNEL per rilevare la morte cellulare. Sezioni polmonari sono state colorate per marcatore delle cellule epiteliali del polmone Sp-C (blu), T1α (rosso) per mostrare la morfologia e anche colorate per TUNEL (verde). Frecce a (H) indicano cellule positive TUNEL. (J, K) BrdU è stato iniettato in non-P. aeruginosa iniettato topi (J) e 72 ore di post P. aeruginosa iniettato topi (K) per ip, i polmoni sono stati preparati a 5 ore dopo l'iniezione di BrdU e trattati per la colorazione degli anticorpi contro BrdU (colorazione verde). Scala bar = 60 micron per AF, 50 micron per G e H, 20 micron per I, e 100 micron per J e K. Questo dato è stato modificato da Liu 7. Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.

Figura 2
Figura 2. alveolare barriera di permeabilità e l'infiammazione in seguito in P. aeruginosa indotto danno polmonare. (A, B) BAL è stato raccolto dal controllo e P. aeruginosa trattato polmoni. (A) la concentrazione di proteine ​​nel BAL è aumentato a 48 ore di post P. aeruginosa iniezione e riduzione a 96 ore, a 5 giorni dopo P. aeruginosa iniezione. (B) il numero di cellule totali nel BAL aumentati a 48 ore di post P. aeruginosa iniezione (B) e il livello di controllo riaccordata a 96 ore di post P. aeruginosa iniezione. (C) MIP-2 livelli sono stati misurati noiing lisati polmonari isolati da topi di controllo e topi a 48 ore e 96 ore di post P. aeruginosa iniezione. I dati sono stati presentati in media ± SE, n ≥ 3. (DF) Le cellule di BAL sono stati centrifugati e fissati su vetrini e sottoposte a HEMA3 colorazione. Un piccolo numero di monociti erano presenti nel BAL di topi di controllo (D). Grande quantità di neutrofili erano presenti nel BAL isolato a 48 ore di post P. aeruginosa iniezione (E). Con 96 ore di post P. iniezione aeruginosa, c'erano un piccolo numero di monociti nel BAL (F). Scala bar = 10 micron, questi risultati sono rappresentativi di almeno 5 esperimenti indipendenti. Questo dato è stato modificato da Liu et al. 7. Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.

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Discussion

Il mouse polmone modello di lesioni Pseudomonas che descriviamo qui imita l'intero processo di infiammazione, danno polmonare, la riparazione e la risoluzione che si verificano a seguito di lesione polmonare acuta o polmonite. Ha vantaggi unici a confronto con diversi altri modelli di pregiudizio, in quanto è clinicamente rilevante e relativamente sicuro e facile da maneggiare.

La fase critica nella procedura è che l'iniezione della soluzione di batteri deve essere molto lenta. Se l'iniezione è troppo veloce, i topi sono probabilità di morire da starter. Dopo una iniezione di successo, i topi mostrano di solito diversi respira profondo e cuore in gola, che aiuteranno i batteri particelle entrano nei polmoni.

Il ceppo che abbiamo usato era PA103 6. Uno dei punti critici di questo modello è che il titolo di P. aeruginosa deve essere strettamente controllato. Lotto di P. aeruginosa da fonte diversa potrebbe mostrare diversi gradi di infiammazione e danni anche quandoutilizzato allo stesso CFU. Pertanto, si raccomanda che ogni nuovo lotto di batteri essere testati per i loro effetti causali (come infiammazione, proliferazione cellulare, ecc), e di conseguenza regolare il numero di CFU da utilizzare. Se inconsistenza dei risultati avviene utilizzando batteri refrigerati magazzino, si può utilizzare stock fresche ottenute da batteri che crescono da un piatto fresco per ogni esperimento. Inoltre, la fase di crescita dei batteri e scelta dei supporti può anche avere un impatto sulla effetto sulla risposta dell'ospite. Pertanto, occorre prestare attenzione a garantire che inoculazioni batteriche si verificano durante la stessa fase del ciclo di crescita batterica.

Ci potrebbe essere una differenza nella risposta a P. aeruginosa da diversi ceppi di topi. Il ceppo abbiamo usato era una miscela di C57BL / 6 e FVB / N. L'appropriata P. aeruginosa titolo deve essere determinato per i diversi ceppi di topi.

Un fattore da considerare per questo modello èche il danno dei batteri non è limitato a un tipo di cellula. Ad esempio, epiteliali, endoteliali, fibroblasti potrebbero tutti sono stati danneggiati. Pertanto, questo modello non è adatto per studiare gli effetti di cellule di tipo lesioni polmonari specifiche. I batteri causano la morte delle cellule del polmone, stimolando le risposte infiammatorie e secernendo tossine nel tessuto 6. Batteri vivi sono di solito cancellati dal polmone entro 48 ore dopo lesioni 7,14. Un'elevata concentrazione di batteri morti può anche causare danni inducendo risposte infiammatorie 15.

I meccanismi di danno polmonare e riparazione sono suscettibili di essere differente in risposta a diversi tipi di danno polmonare. Pertanto, è importante confrontare diversi modelli di pregiudizio. Il P. aeruginosa modello qui descritto è una bella aggiunta agli altri modelli.

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Materials

Name Company Catalog Number Comments
Anesthetic: Ketamin, xylazine, lidocaine, buprenorphine pharmaceutical grade
27 G needle Fisher 1482648
syringe Fisher 14823434 1 ml
scissors Fine Science tools
forceps Fine Science tools
suture  Fisher 19-037-526
Eye gauge, glove, gown
Biosafety Cabinet
chlorine dioxide based disinfectant Clidox
sheep blood agar plates  Medex supply HL-1160

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References

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