Pseudomonas aeruginosa lésion pulmonaire induite par modèle

Immunology and Infection

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Suresh Kumar, V., Sadikot, R. T., Purcell, J. E., Malik, A. B., Liu, Y. Pseudomonas aeruginosa Induced Lung Injury Model. J. Vis. Exp. (92), e52044, doi:10.3791/52044 (2014).

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Abstract

Afin d'étudier les lésions pulmonaires aiguës humaine et la pneumonie, il est important de développer des modèles animaux pour imiter différentes caractéristiques pathologiques de cette maladie. Ici, nous avons développé un modèle de lésion pulmonaire de la souris par injection intra-trachéale de bactéries Pseudomonas aeruginosa (P. aeruginosa ou PA). En utilisant ce modèle, nous avons pu montrer une inflammation des poumons à la phase précoce de la lésion. En outre, alvéolaire perméabilité de la barrière epitheliale a été observée par analyse de lavage broncho-alvéolaire (BAL); et la mort cellulaire alvéolaire a été observé par essai TUNEL en utilisant un tissu préparé à partir de poumons blessés. Lors d'une étape ultérieure après la lésion, on a observé une prolifération cellulaire requis pour le processus de réparation. La blessure a été résolue 7 jours à compter de l'ouverture de P. injection aeruginosa. Ce modèle imite le parcours séquentiel de l'inflammation pulmonaire, une lésion et de réparation pendant une pneumonie. Ce modèle animal cliniquement pertinente est adapté pour l'étude de la pathologie, le mécanisme de réparation, fuite une lésion pulmonaire aiguë, et peut également être utilisé pour tester des agents thérapeutiques potentiels pour cette maladie.

Introduction

Poumons sont exposés à des agents pathogènes environnementaux et sont sensibles à l'inflammation et les lésions 1-3. Dans des conditions pathologiques telles que la pneumonie ou syndrome de détresse respiratoire adulte (SDRA), les agents pathogènes ainsi que les facteurs inflammatoires libérés par les leucocytes provoquent des blessures et la mort des cellules alvéolaires 1-3. Il est important de développer des modèles animaux de lésion pulmonaire aiguë de faciliter l'étude de la pathologie de la blessure ainsi que le mécanisme de réparation.

Actuellement, la plupart des gens utilisent des modèles de lésions pulmonaires hyperoxie et la bléomycine souris induit 4. Cependant, les mécanismes d'hyperoxie blessures causées ne sont pas les mêmes que la plupart des lésions pulmonaires courantes qui se produisent au cours de la pneumonie ou de l'ARDS 5. La bléomycine blessure aiguë induite est rare dans un contexte clinique 4. Nous rapportons ici un modèle de lésion pulmonaire de la souris par injection intra-trachéale de P. aeruginosa 6,7. Ce modèle est cliniquement pertinente, et imite la processus qui se produisent suite à une pneumonie 8.

Comme, un pathogène nosocomial opportuniste des individus immunodéprimés, P. aeruginosa infecte habituellement les voies pulmonaires, des voies urinaires, des brûlures, des plaies, et provoque également d'autres infections du sang 6. La bactérie produit virulence facteur exotoxine A, se multiplient et déclenchent des réactions immunitaires 6. L'administration intra-trachael de P. aeruginosa correspond à la situation dans l'exposition des humains à des bactéries qui provoquent la pneumonie et à la pathologie est susceptible d'être différente de la grippe H1N1 du virus de la grippe pulmonaire induite modèle de lésion récemment rapporté 9. Depuis P. aeruginosa est un agent pathogène opportuniste, il est relativement sûr à manipuler par rapport à certains des agents pathogènes les plus virulentes. Ici, nous avons utilisé l'injection intra-trachéale à administrer les bactéries, car nous avons constaté que cette méthode introduit plus de bactéries dans la région distale alvéoles du poumon par rapport àd'autres procédures telles que l'utilisation d'un cathéter par la bouche.

Comparé à d'autres modèles de lésion pulmonaire aiguë, le P. aeruginosa modèle décrit ici est adapté à l'étude des lésions pulmonaires induites par les bactéries et par une inflammation excessive. Contrairement à d'autres modèles animaux qui utilisent P. aeruginosa pour induire une septicémie 10,11, ici nous utilisons injection intra-trachéale de ces bactéries à induire des lésions pulmonaires aiguës localisées.

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Protocol

Les expériences sur les animaux ont été approuvés par le Comité de protection des animaux et des comités institutionnels sur la biosécurité de l'Université de l'Illinois à Chicago.

NOTE: Toutes les procédures impliquant des pseudomonas doivent être effectuées avec le niveau de biosécurité 2 (BSL2) pratiques, qui comprennent, mais ne sont pas limités à: masque, protection oculaire, blouse ou combinaison, gants et doubles. Travailler dans le cabinet de biosécurité certifié. Traiter les instruments en contact avec des bactéries avec l'eau de Javel ou de dioxyde de chlore désinfectant à base. Utilisez une boîte étanche pour transporter les échantillons.

1. P. aeruginosa Culture et de croissance

  1. Magasin P. aeruginosa PA103 comme un stock de bactéries dans un bouchon à vis cryovial à -80 ° C.
  2. Placer le flacon dans un rack dans une boîte avec 70% d'éthanol mouillé des serviettes en papier et prendre au laboratoire de biosécurité de niveau 2 (niveau L2).
  3. Streak les bactéries sur des plaques de gélose au sang de mouton et se développent à 37 ° C pendant environ 15 heures dans un incubateur. Dans une hotte BSL2, rayer les bactéries de la plaque avec des bactéries boucle et remettre en suspension dans 5 ml de PBS.
  4. Conservez le stock à 4 ° C pendant 3 mois. Toutefois, déterminer le titre toutes les 2 semaines.
  5. Diluer en série les bactéries dans du PBS (en général de 01:10 à 01:10 4 7) et la plaque à la dilution connue sur des plaques de gélose au sang de mouton.
  6. Incuber les plaques pour ~ 15 heures. Compter les colonies et calculer unités formant colonie (UFC) pour déterminer la concentration de bactéries.
  7. Remettre en suspension les concentrations appropriées (~ 5 x 10 3 UFC / ul) dans 0,5 ml de PBS dans des cryotubes de 1,5 ml à bouchon à vis stériles. Sceller les cryotubes et les placer dans un rack cryovial sur des serviettes en papier chargés désinfectant dans une boîte de couvercle à pression.
  8. Transporter la boîte à l'animalerie BSL2. Une fois là, ouvrir la boîte dans l'armoire de BSL2.

2. P. aeruginosa instillation

  1. Effectuer la chirurgie de survie de façon aseptique (gants stériles, des instruments stérileset les techniques aseptiques). Utilisez un champ stérile pour fournir une surface de travail pour (autoclave) instruments chirurgicaux stériles. Stériliser les instruments à l'aide d'un stérilisateur de perles chaud entre chaque instillation trachéale procédure.
  2. Peser souris avant l'anesthésie. Anesthésier les souris avec de la kétamine (100 mg / kg), de xylazine (5 mg / kg), en 0.1 - 0.2 ml de PBS par voie intrapéritonéale (ip). Déterminer l'efficacité de l'anesthésique par des non-réactivité de pincement de l'orteil. Utilisez une pommade vétérinaire sur les yeux pour prévenir la sécheresse sous anesthésie.
  3. Retenez souris sur un bord chirurgicale dans BSL2 armoire.
  4. Identifier la zone de la coupe vers le bas. Rasez ce domaine et préparer la peau à l'aide alternance alcool et povidone prélèvements d'iode 3 fois.
  5. Traiter la zone d'incision avec un anesthésique local (lidocaïne) que cette anesthésie est suffisante pour une chirurgie mineure comme une incision de la peau pour accéder à la trachée.
  6. Faire une petite incision (environ 5 mm) sur la ligne médiane du cou, et utiliser émoussé forceps de se déplacer doucement sur le muscle pour l'accès à la trachée. Exposer la trachée par dissection chirurgicale.
  7. Dessinez solution de bactéries dans une seringue de 1 ml à usage unique avec aiguille 27 G. Pour chaque souris, l'administration de 20 à 30 pl de bactéries à la concentration appropriée (jusqu'à 10 5 CFU chaque souris).
  8. Insérer l'aiguille dans la trachée. Injecter la solution lentement dans la trachée.
  9. Veiller à ce que les halètements des animaux, ce qui indique généralement que la solution a atteint dans les poumons.
  10. Fermer la plaie avec des sutures stériles (6-0 monofilament) dans des conditions aseptiques.
  11. Utilisez 0,1 mg / kg de buprénorphine par injection sous-cutanée post-op analgésie pour contrôler la douleur post-chirurgicale.
  12. Assurez-vous que le temps nécessaire à l'induction de l'anesthésie initiale de fermeture de l'incision est inférieure à 15 min.
  13. Après l'injection, jeter les seringues et aiguilles dans un container approprié approprié.
  14. Traiter les instruments chirurgicaux avec Disi base de dioxyde de chlorenfectant pendant 15 minutes, rincer et retourner au laboratoire pour la stérilisation et de réutiliser au besoin.
  15. Maison des souris individuellement dans des cages propres au cadre chaleureux.
  16. Vérifiez sur l'animal toutes les 30 min jusqu'à ce qu'elle reprenne conscience et commence à se déplacer; et plus tard, à des intervalles de 12 h pour les 3 premiers jours après la chirurgie.
  17. Conserver les souris dans le centre de BSL2 animal tout au long de l'expérience. Assurez-vous que seul tissu contenu dans la boîte scellée de quitter l'établissement BSL2 animale. Si les souris expriment l'un des comportements moribonds (définie comme la détresse respiratoire, léthargie, absence de déambuler en réponse à une stimulation douce) à tout moment de l'étude, euthanasier les souris par inhalation de CO 2 provenant d'une source en bouteille suivie par dislocation cervicale.
  18. Euthanasier le sujet expérimental par exsanguination sous anesthésie.
    1. Recueillir les tissus pulmonaires de souris euthanasiées. Effectuer ces procédures dans une hotte de BSL2. Si nécessaire, transférer l'échantillon en utilisant des tubes étanches placées dans un rack sur des serviettes en papier chargés désinfectant dans une boîte de couvercle à pression pour plus de processus.

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Representative Results

A partir de 24 à 72 heures après P. injection aeruginosa, cellularité accrue a été observée dans les coupes pulmonaires (figure 1A-D). Le poumon a commencé à récupérer à partir de 96 h après la lésion (figure 1E). 7 jours après P. aeruginosa, morphologie alvéoles normale a été en grande partie restaurée (figure 1F). Sections à l'aide du poumon tunnel de coloration préparés à 24 heures après P. aeruginosa a montré la mort cellulaire dans les cellules alvéolaires (figure 1G-I). Afin d'étudier le processus de réparation dans ce modèle de lésion, BrdU a été injecté à des souris à 3 jours après P. aeruginosa. Les poumons ont été isolés à post-injection de BrdU 5 h et traitées pour l'anticorps de BrdU coloration. Comme le montre la figure 1J et K, le nombre de cellules BrdU incorporé augmenté de façon significative à 72 heures après P. administration aeruginosa indiquant hyperprolifération.

Pour étudier l'évolution barrière parperméabilité et l'inflammation après blessure, lavage broncho-alvéolaire (LBA) ont été recueillis à différents moments poster P. injection aeruginosa. La concentration en protéines dans le BAL a été augmenté de façon significative à 48 heures après P. aeruginosa injection (Figure 2A), indiquant perméabilité de la barrière épithéliale. Les numéros de cellulaires dans le BAL a également augmenté de façon significative à 48 heures après P. aeruginosa injection (figure 2B), ce qui suggère une réponse inflammatoire. A 4 - 5 jours après P. aeruginosa injection, à la fois le niveau de la protéine BAL et le numéro de cellule a commencé à diminuer suggérant récupération (figure 2A, B). En outre, lysat du poumon ont été recueillis à différents points postera P. aeruginosa administration et le niveau de protéine inflammatoire macrophage 2 (MIP2), une cytokine impliquée dans l'attraction neutrophile 12, a été mesurée par ELISA. En accord avec les résultats de l'analyse de BAL, le niveau de MIP2 INCREA significative sed à 48 heures après P. injection aeruginosa et retourné à niveau de base de 96 heures après P. aeruginosa injection (figure 2C). En outre, les cellules de BAL ont été fixées sur des lames de verre et on les soumet à une coloration hématologie. Sans P. aeruginosa, il y avait seulement un petit nombre de monocytes dans le BAL fluide (figure 2D). En revanche, une grande quantité de neutrophiles étaient présents dans BAL isolé à 48 heures après P. injection aeruginosa (figure 2E). En 96 heures après P. aeruginosa injection, la composition de la cellule de BAL est revenu à un niveau de contrôle (Figure 2F). Pour résumer, les résultats de la figure 2 indiquent une réponse inflammatoire neutrophile aiguë avec augmentation de la perméabilité de la barrière alvéoles et augmentation des concentrations de cytokines, qui sont toutes des caractéristiques de lésion pulmonaire aiguë 13. Dans toutes les expériences, il injection de solution saline a été utilisée comme contrôle.

ve_content "> Une partie des données, y compris H et E coloration, le marquage BrdU, essai TUNEL, analyse BAL et MIP2 mesure de niveau, ont déjà été publiés 7. Dans cet article, nous avons étudié le rôle de FoxM1, un facteur de transcription, à la réparation d'une lésion alvéolaire en utilisant le modèle de lésion pulmonaire à P. aeruginosa 7 décrit ici.

Figure 1
Figure 1. L'histologie, la mort cellulaire et la prolifération de P. aeruginosa souris médiation modèle de lésion pulmonaire. Isolement (AF) du poumon, la coupe et H / E coloration ont été réalisées à l'aide non-P. aeruginosa-injecté (non-PA) poumons de contrôle (A) ainsi que les poumons à 24 h (B), 48 h (C), 72 h (D), 96 h (E), 7 jours (F) après P. aeruginosa chezprojection (post-PA). (GI) sections pulmonaires ont été préparés à partir de poumons de commande (G) et 24 h post-P. aeruginosa injecté poumons (H, I) et de procéder pour le dosage TUNEL pour détecter la mort cellulaire. Sections du poumon ont été colorées pour marqueur de cellules épithéliales du poumon Sp-C (bleu), T1α (rouge) pour montrer la morphologie et aussi colorées pour TUNEL (vert). Les flèches en (H) indiquent les cellules positives TUNEL. (J, K) BrdU a été injecté dans la non-P. aeruginosa souris injectées (J) et 72 heures après P. aeruginosa souris injectées (K) par ip, les poumons ont été préparés à post-injection de BrdU 5 h et traitées pour la coloration des anticorps contre BrdU (coloration verte). Barre d'échelle = 60 um pour AF, 50 um G et H, 20 um pour moi, et 100 um J et K. Ce chiffre a été modifié depuis Liu 7. Se il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Figure 2
Figure 2. alvéolaire perméabilité de la barrière et l'inflammation qui suit en P. aeruginosa a induit des lésions pulmonaires. (A, B) BAL été recueillies auprès de contrôle et P. aeruginosa traité poumons. (A) La concentration en protéines dans le BAL a augmenté à 48 heures après P. injection aeruginosa, et diminué à 96 h, 5 jours après P. aeruginosa injection. (B) Le nombre total de cellules dans le BAL a augmenté à 48 heures après P. injection aeruginosa (B) et le niveau de contrôle recalibrée à 96 heures après P. injection aeruginosa. (C) MIP-2 niveaux ont été mesurés nousING pulmonaires lysats isolées de souris de contrôle ainsi que des souris à 48 h et 96 h après P. injection aeruginosa. Les données ont été présentées en moyenne ± SE, n ≥ 3. (DF) à partir de cellules BAL ont été centrifugés et fixées sur des lames de verre et on les soumet à une coloration HEMA3. Un petit nombre de monocytes étaient présents dans le BAL de souris de contrôle (D). Une grande quantité de neutrophiles étaient présents dans BAL isolé à 48 heures après P. aeruginosa injection (E). En 96 heures après P. aeruginosa injection, il y avait un petit nombre de monocytes dans le BAL (F). Barre d'échelle = 10 um, ces résultats sont représentatifs d'au moins 5 expériences indépendantes. Ce chiffre a été modifié depuis Liu et al. 7. Se il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

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Discussion

Le poumon de la souris modèle de lésion Pseudomonas que nous décrivons ici imite l'ensemble du processus de l'inflammation, des lésions pulmonaires, la réparation, et la résolution qui se produisent suite à une lésion pulmonaire aiguë ou la pneumonie. Il a des avantages uniques comparaison avec plusieurs autres modèles de lésion en ce qu'il est cliniquement pertinent et relativement sûr et facile à manipuler.

L'étape critique dans la procédure est que l'injection de la solution de bactéries doit être très lente. Si l'injection est trop rapide, les souris sont susceptibles de mourir par étranglement. Après une injection réussie, les souris présentent généralement plusieurs respire et souffle profondes, ce qui aidera les bactéries particules pénètrent dans le poumon.

La souche utilisée était PA103 6. L'un des points essentiels de ce modèle est que le titre de P. aeruginosa doit être étroitement contrôlée. Lot de P. aeruginosa de source différente pourrait présenter des degrés de l'inflammation et des dommages, même lorsqueutilisé en même CFU. Par conséquent, il est recommandé que chaque nouveau lot de bactéries pour tester les effets pathogènes (tels que l'inflammation, la prolifération cellulaire, etc.), et en conséquence de régler le nombre de CFU à être utilisé. Si l'incohérence des résultats se produit à l'aide de bactéries réfrigérés actions, on peut utiliser des stocks frais obtenu par la croissance des bactéries à partir d'une plaque fraîche pour chaque expérience. En outre, la phase de la bactérie et le choix des supports de croissance peut également avoir un impact sur l'effet sur la réponse de l'hôte. Par conséquent, des précautions doivent être prises pour que les inoculations bactériennes se produisent au cours de la même phase du cycle de la croissance bactérienne.

Il pourrait y avoir une différence dans la réponse à P. aeruginosa par différentes souches de souris. La souche utilisée était un mélange de souris C57BL / 6 et FVB / N. Le P. approprié aeruginosa titre doit être déterminée de différentes souches de souris.

Un facteur à considérer pour ce modèle estque les dommages des bactéries ne se limite pas à un type de cellule. Par exemple, les cellules épithéliales, endothéliales, les fibroblastes peuvent tous ont été endommagés. Par conséquent, ce modèle ne convient pas pour l'étude des effets de type cellulaire spécifique lésions pulmonaires. Les bactéries provoquent la mort des cellules du poumon, en stimulant des réponses inflammatoires, ainsi que par la sécrétion de toxines dans le tissu 6. Des bactéries vivantes sont généralement éliminées des poumons dans les 48 heures après la lésion 7,14. Une concentration élevée de bactéries mortes peut aussi causer des dommages par induire des réponses inflammatoires 15.

Les mécanismes de la lésion pulmonaire et la réparation sont susceptibles de varier en réponse à différents types de lésions pulmonaires. Par conséquent, il est important de comparer plusieurs modèles de lésion. Le P. aeruginosa modèle décrit ici est une belle addition à d'autres modèles.

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Materials

Name Company Catalog Number Comments
Anesthetic: Ketamin, xylazine, lidocaine, buprenorphine pharmaceutical grade
27 G needle Fisher 1482648
syringe Fisher 14823434 1 ml
scissors Fine Science tools
forceps Fine Science tools
suture  Fisher 19-037-526
Eye gauge, glove, gown
Biosafety Cabinet
chlorine dioxide based disinfectant Clidox
sheep blood agar plates  Medex supply HL-1160

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References

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