快速荧光 * These authors contributed equally

Biology

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Yue, M., Charles Richard, J. L., Yamada, N., Ogawa, A., Ogawa, Y. Quick Fluorescent In Situ Hybridization Protocol for Xist RNA Combined with Immunofluorescence of Histone Modification in X-chromosome Inactivation. J. Vis. Exp. (93), e52053, doi:10.3791/52053 (2014).

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Abstract

原位杂交(FISH)用免疫荧光(免疫FISH)结合的RNA的荧光创建可以在单细胞水平被用于检测RNA的定位与同步洞察的空间动态成 ​​蛋白质,表观遗传修饰和其他细节的定位技术这可以通过免疫荧光被突出显示。 X染色体失活是一个范例长非编码RNA(lncRNA)介导的基因沉默。的X不活动的特定转录物(Xist的)lncRNA积累(称为Xist的云)上的两个X染色体在哺乳动物雌性之一是启动的X染色体失活的一个关键步骤。 Xist的核糖核酸直接或间接地与各种染色质修饰酶相互作用并引入不同的后生景观的失活的X染色体(十一)。在西安一个已知的后生特点是组蛋白H3三甲基赖氨酸27(H3K27me3)修改。在这里,我们描述了一个简单而快速的免疫FISH协议利用RNA FISH配上H3K27me3的免疫多个寡核苷酸探针检查Xist的RNA的定位及相关表观遗传修饰检测Xist的RNA。使用寡核苷酸探针的结果在较短的培养时间和更灵敏的检测Xist的核糖核酸的相比在体外转录的RNA探针(核糖探针)。这个协议提供了一个有力的工具用于理解lncRNAs的动力学和其相关联的表观遗传修饰,染色质结构,核组织和转录调控。

Introduction

哺乳动物的X染色体失活(XCI)是一种策略,以补偿在XX和XY,其中两个X染色体在女性中的一个是转录失活的1之间的X连锁的基因剂量的不平衡。 X染色体失活的长非编码RNA(lncRNA)的研究有很大的模型系统。的X染色体失活是由多个lncRNAs调节,并且已被广泛研究,在过去的几十年中,以揭开lncRNAs,转录,染色质结构和核组织2,3之间的串扰的机制。

位于X染色体的X染色体失活中心(XIC)是一个复杂的遗传基因座由多个基因产生的非编码RNA 4。的X不活动的特定转录物(Xist的)lncRNA在真哺乳亚纲哺乳动物是一个这样的lncRNA起着在X-染色体失活-5,6-了至关重要的作用。 Xist的成绩单环绕夫的位置TURE习近平启动X染色体失活,而当使用RNA FISH可视化显示为云;此形成被称为“Xist的云”7。由于Xist的RNA与各种染色质修饰酶相互作用,共同定位的Xist的云与沉默染色质和镇压转录不同的表观遗传修饰的是在X染色体失活8观察。例如,Xist的RNA相互作用的Polycomb镇压复杂2(PRC2)负责H3K27me3和诱导镇压染色质状态9。在Xist的云兮其共定位与密集的H3K27me3修饰的发生表示曦10,11的兼异的风景线。

细胞遗传学技术,如DNA / RNA FISH用放射性标记探针12最近的和先进的技术,具有增强的灵敏度,已经走过了漫长的道路,从传统的方法荧光成像使用多个寡核苷酸探针13,14。的DNA / RNA的FISH加上免疫已被常规地用作细胞学工具理解时空核组织的RNA定位,染色质结构和修改。最标准的探针制备用于RNA FISH涉及使用质粒或细菌人工染色体(BAC)克隆并随后将其标识或者与切口平移或随机引物15的。然而,近70%的基因在小鼠和基因在人类中的40%的显示的正义和反义转录物16的重叠,因此需要一个链特异的FISH方法以区分义和反义转录物, 在体外转录的RNA探针(核糖探针)通常用于链特异的RNA原位杂交17,18;然而,这涉及到一种制备质粒克隆或PCR产物用T7,SP6中,或T3启动子和合成的核糖核酸探针。此外,核糖探针从GENOM派生IC DNA或cDNA常含有非特定区域和重复的元素,这导致高的背景噪声。另一个问题是,核糖核酸探针,它们是几百个核苷酸的长度,并包含多个荧光团,不能有效地渗透到细胞核中。为了规避这一点,标有在末端的单个荧光多个较短的寡核苷酸探针已经开发出具有良好的灵敏度,均匀的信号强度,并且易于纯化和处理14。此外,DNA寡核苷酸通常比核糖核酸更稳定。我们应用使用Xist的RNA FISH 19寡核苷酸与免疫,了解西安的X染色体失活的过程中诱导Xist的lncRNA的后生动态类似的策略。这个协议描述的创建的寡核苷酸探针和细胞的适当的准备,以及利用免疫荧光和RNA原位杂交的。 Xist的RNA FISH使用多oligonucleotides是在长期成本效益的方法,如果Xist的RNA FISH在自己的实验室常规进行。该技术可用于识别lncRNAs在细胞中同时映射其共定位与表观遗传修饰或因素。该协议的一个主要优点是可以轻松地修改它以满足自己的研究兴趣的能力。

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Protocol

1.探针制备

  1. 获得在Xist的多个独特的寡核苷酸(20-30核苷酸长度的寡核苷酸,63-65ºC熔化温度, 表1)与5'-氨基修饰和悬浮在水中。
  2. 具有5'-氨基修饰(总4.5微克),并与胺反应性荧光染料按照制造商的指示标记池等摩尔量的寡核苷酸。
    1. 溶解在最后5微升不含核酸酶的水将合并的寡核苷酸并加入3微升的1M碳酸氢钠的寡核苷酸溶液中。
    2. 添加2微升DMSO中的胺 - 反应性染料和涡流小瓶简要介绍。
    3. 混合使用在DMSO中的活性染料的寡核苷酸溶液中,在室温下孵育混合物1小时,在黑暗中。
  3. 净化的荧光标记的寡核苷酸探针通过G-25柱,然后用乙醇沉淀。
    1. 添加40微升不含核酸酶的水,以在步骤1.2.3中产生的标记混合物中并应用到G-25柱。离心,在750×g离心2分钟。
    2. 添加50μl的无核酸酶水,10微升3M醋酸钠(pH5.2)和250微升乙醇的纯化的探针从步骤1.3.2。商店在21,000×g离心15分钟,-80℃下30分钟,并离心在4℃下。
    3. 用1ml的70%乙醇洗一次沉淀的寡核苷酸。
    4. 重悬在50μl无核酸酶水或TE中(10mM的Tris-HCl,pH为7.5; 1mM EDTA)中为大约10微米的最终浓度。
  4. 稀释的荧光标记的寡核苷酸探针以250nm的带杂交缓冲液的终浓度(10%甲酰胺; 2×SSC [300mM NaCl的30 mM柠檬酸钠]; 2毫克/毫升牛血清白蛋白; 10%硫酸葡聚糖)。
    注:有了这个快速FISH协议,寡核苷酸P在Xist的长袍,设计并在更高的浓度比使用寡核苷酸探针,以缩短培养时间为杂交正常FISH协议使用。

2.将准备

注:幻灯片可使用小鼠胚胎干(ES)或胚状体(EB)来制备用于免疫的FISH通过直接在多聚赖氨酸处理过的载玻片要么生长它们或使用细胞离心涂片与细胞悬液分化细胞20,21。这里,示出了滑动制备由细胞离心涂片。

  1. 吸在6孔培养皿的培养基。用PBS(室温),并吸彻底清洗。
  2. 加入0.5 ml胰蛋白酶到6孔培养皿,孵育在37℃下5-10分钟。
  3. 加入5毫升培养基,并轻轻吹打上下数次分散细胞。
  4. 在200×g离心转移细胞到一个15毫升的管中,离心5分钟,在室温下进行。
  5. 丢弃培养基的d轻轻悬浮细胞在2毫升PBS。
  6. 计数使用血球细胞,并稀释细胞悬浮液,在4×10 5个细胞/ ml用PBS中。
  7. 组装幻灯片,过滤器卡和剪辑室,并把它们变成了离心涂片转子适当的插槽。添加制备步骤2.6到在细胞离心涂片器的组装单元中的每个腔室各样品的250微升。离心以1500rpm在室温下10分钟。
  8. 填在冰上3科普林罐用40ml各冰冷PBS,CSK缓冲液(10mM PIPES,pH值6.8; 100mM NaCl的300毫蔗糖; 3毫的MgCl 2)中,并CSKT缓冲液(CSK缓冲液含0.5%的Triton X-100),分别为。
  9. 后的细胞离心涂片完成时,滑动迅速转移到冰冷的PBS并孵育5分钟。
  10. 转移滑入冰冷CSK缓冲液孵育1分钟。
  11. 转移滑入冰冷CSKT缓冲孵育5分钟。
  12. 传送滑回冰冷CSK BUFFER孵育1分钟。
  13. 转移滑入4%多聚甲醛的PBS中孵育10分钟,在室温下进行。

3.免疫

  1. 将载玻片在科普林缸用PBST(1×PBS中具有0.1%Tween-20)为几秒钟。
  2. 将幻灯片的倾斜使剩余的缓冲区流下来的幻灯片。小心擦拭过量液体离开滑动,并将其放置在与水的空吸管尖框。覆盖所述滑动用40微升封闭溶液(1×PBS,1%BSA,0.1%吐温-20),轻轻地放在一个盖玻片,并孵育在室温下10分钟。
  3. 除去盖玻片,除去封闭溶液,并加入40微升稀释到浓度为1的组蛋白H3K27me3初级抗体:在阻断溶液500。放置盖玻片背面上的滑动,并孵育在室温下30分钟。
    注:在封闭液核糖核酸酶抑制剂可能有助于维持RNA的RNA这一FIS当使用多克隆抗体ħ协议。
  4. 洗科普林罐子装满PBST滑动2次,每次5分钟,轻轻晃动边洗。
  5. 将幻灯片的倾斜使剩余的缓冲区流下来的幻灯片。仔细擦拭多余的液体,然后将滑入提示框。覆盖与40微升第二抗体(1:500)的稀释于封闭溶液中,放置盖玻片,并孵育在黑暗中15分钟。用于以下步骤中,保持在黑暗中的幻灯片在任何时候。
  6. 在科普林罐子用PBST如在步骤3.4洗涤2次。

4. RNA FISH与寡核苷酸探针

  1. 预温热的水的空吸移管尖箱在底部,以防止从在37℃下,在步骤4.3干燥的RNA原位杂交的幻灯片。
  2. 将幻灯片的倾斜使剩余的缓冲区流下来的幻灯片。小心地从3.6步擦去多余的液体关闭幻灯片,并将幻灯片与笏吸管,提示框呃在底部。加入500微升的FISH洗涤缓冲液(在2×SSC 10%甲酰胺)上滑动,并孵育5分钟,在室温下进行。
  3. 除去FISH洗涤溶液中,添加8微升的寡核苷酸探针上的滑动,放置盖玻片,并且滑动与水在底部转移到预热的吸管尖盒;孵育在37℃进行1-2小时。
  4. 放置在水浴中3预热科普林罐,在37℃用FISH洗涤缓冲液,用DAPI FISH洗涤缓冲液,和2×SSC。
  5. 后1-2小​​时孵育的RNA原位杂交,将滑动到预温热的FISH洗涤缓冲液。
  6. 孵育滑动几分钟直到盖玻片滑落的幻灯片。
  7. 将滑动放回洗涤缓冲液,并继续孵育5分钟。
  8. 幻灯片转移到另一科普林罐预热FISH洗涤缓冲液,用0.5毫微克/毫升的DAPI孵育5分钟。
  9. 幻灯片转移到另一个科普林罐预热2X SSC孵育5英里ñ。
  10. 将幻灯片的倾斜使剩余的缓冲区流下来的幻灯片。仔细擦拭多余的液体,然后将重新陷入干燥的提示框。加入4微升抗褪色与DAPI的幻灯片上,并放置盖玻片。
  11. 密封指甲油盖玻片,并在显微镜下观察。滑动可以储存于4℃在黑暗中为几个月。

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Representative Results

快速免疫FISH代表性图像示于图1A。在鉴别女性细胞中检测共定位在熙Xist的RNA云和H3K27me3信号。在第12天时分化,超过90%的EB细胞的有一个Xist的云( 图1B)。短寡核苷酸探针高效地渗透到了核,导致几乎所有H3K27me3信号共定位与Xist的核糖核酸可视化( 图1C; 97%,N = 150)。

图1
图1:Xist的RNA和H3K27me3在熙在鉴别鼠标EB(A)免疫FISH检测Xist的RNA与H3K27me3修改在12日向分化分化女性EB细胞共定位。 Xist的探针进行标记的Alexa Fluor 488,和抗H3K27me3初级抗体进行脱通过抗小鼠IgG的Alexa Fluor 555缀合的二抗tected。细胞核进行复用DAPI。盒装区域被放大在底部面板。比例尺:10微米(B)的 Xist的云的和H3K27me3阳性细胞的EB在第12天时的分化的频率(C)的共定位Xist的云H3K27me3信号中的EB在第12天时的分化的频率请点击此处查看该图的放大版本。

表1:Xist的核糖核酸的FISH荧光标记的寡核苷酸的序列 。合成与5'-氨基修饰,制备荧光标记的寡核苷酸探针的RNA Xist的鱼48的寡核苷酸。

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Discussion

在本文中,我们提出了一个快速的免疫FISH协议,只需不到5小时即可完成幻灯片的准备,Xist的RNA FISH,和H3K27me3免疫。在与Xist的RNA检测,这通常需要过夜孵育的RNA原位杂交的一般性免疫FISH方法相比,该协议不仅显著降低所花费的时间,而且,提高了使用的寡核苷酸探针的免疫-FISH的灵敏度。

因为Xist的期间的X染色体失活高度转录和其转录被发现强烈聚积在希在顺式 ,很容易检测Xist的核糖核酸信号在鉴别和分化的细胞,通过RNA原位杂交利用一个相对短暂温育时间。此免疫FISH协议可应用于用于感兴趣和丰富的RNA其他蛋白质,虽然可能需要在免疫荧光和RNA原位杂交的优化。为了该协议适用于其他的RNA,所述NUM可能的寡核苷酸探针的误码率将需要被考虑,然后探针的浓度的试验和错误的优化,孵育时间,和用于RNA FISH温度。其他应用程序的一个例子是我们以前的成功使用单一LNA探头22检测端粒RNA。为探针的设计和准备的低丰度的RNA的检测指标,参考文章由拉吉和特亚吉23。必须考虑的另一个问题是通透的一步。对于不同的通透条件慎重考虑需要;例如,比什么是在我们的协议描述温和效果可以定影15后发生透。各种透化过程还需要进行时免疫FISH使用不同的细胞类型被考虑。免疫荧光和RNA原位杂交的顺序也可影响靶蛋白,修改,和RNA的由免疫FISH检测。如果RNA FISH是执行ED之前免疫荧光,该RNA FISH段期间1小时温育足以检测Xist的核糖核酸信号。然而,由于包含在杂交缓冲液和FISH洗涤缓冲液中甲酰胺负面影响H3K27me3免疫,我们始终贯彻这一协议之前,Xist的RNA FISH H3K27me3免疫。对于其它应用,以免疫荧光观察程序的顺序将取决于靶蛋白和表观遗传修饰。由于我们使用免疫荧光H3K27me3第一抗体具有高的效价和特异性H3K27me3 24,我们能够使用较短的温育时间对于免疫荧光。然而,反应时间和温度对免疫染色是取决于所使用的抗体,从而优化所需的各抗体。

使用寡核苷酸探针,Xist的RNA检测,通过RNA原位杂交物显著改善。在我们以往的研究中,我们发现,DIF的一个子集ferentiating细胞在熙H3K27me3染色不与Xist的RNA信号25相关联。由于在僖H3K27me3修改与PRC2招募Xist的核糖核酸9相关联- 11,26,我们推测,这是由于核糖核酸探针的低效渗入细胞核相比所述抗体为免疫荧光。通过使用寡核苷酸探针在这个协议中,我们在鉴别雌性细胞几乎总是共定位与Xist的RNA( 图1)观察到H3K27me3信号。

这种快速的免疫FISH协议允许我们获得的动态变化Xist的左右旋转lncRNA的快照,并提供了一​​个新的工具,以帮助更好地理解lncRNA的工作方式。 IncRNAs影响多种细胞功能,如基因组印记,基因调控,RNA翻译,和RNA的成熟27。开发的各种角色的理解增加š发挥lncRNA有助于向前推动字段,并允许在重要的细胞过程的人体内的调节未来发现,以及向潜在目标开发用于疾病治疗。由于该协议可以很容易地优化,相对于其他标记和利益lncRNAs,这是一个伟大的工具,以帮助解决各种lncRNAs的奥秘细胞。

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Materials

XP1 ggtaagtatccaaaaccccgttgg
XP2 cgatcagcagcaacagtacacg
XP3 gcaattggttgcttttatccagtcc
XP4 cgcaacaccgcacactaatacg
XP5 gccatcttagacacattcaagagcat
XP6 cacacgtgaagtaccaagcgaaac
XP7 gccacgtatagagcactgtaagagactatg
XP8 caaagcacactatcagacgtgtcg
XP9 ggagaatctagatgccataaaggcaag
XP10 tgatggacactgcattttagcactg
XP11 ggacactgcattttagcaatacgattc
Xp12 gtgatgggcactgcattttagc
Xp13 agatgggctatctcagtcttataggct
Xp14 ggaagtcagtatggagggggtatg
XP15 tgggactgtgactactacagcaatga
Xp16 aagactcaattcctagtcaggattatccac
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Xp18 gtcttcaccagatgcagattactacagtg
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XP20 gctgttcaggtttccttctgtagtga
Xp21 gcaagagatacaatggtccgaaaagt
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Xp31 ggaagaaatagatgtaacaaagaattagacaca
XP32 cacttcagagccacttgaatcctg
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Xp35 ggcacatctgcatattgcttgtcta
Xp36 gcaactaagaccatgaacccacaa
Xp37 aaacacactggccttaagtatatggactg
Xp38 cattcatttgcacacatggaacaat
Xp39 tgggagacaatatttagcctccaggt
XP40 cctagcaagggcactgttttgtaataa
Xp41 taacatttagcacactgccttgcac
Xp42 cagtgatctacactaggtccacctcaca
Xp43 ttatgttgaaggaatcttggccttg
Xp44 aagtgagagctgtagtctcaaggtgtga
Xp45 gtattcaacctctgaggcaaactgtg
Xp46 agattgtggaacttagatggctgtca
Xp47 tggaactgcattaaagtcccaacttag
Xp48 gaactcccagacctcttcaacctg
Name Company Catalog Number Comments
oligonucleotides with 5’-amino modification IDT
Alexa Fluor 488 Reactive Dye Life Technologies A32750
MicroSpin G-25 columns GE Healthcare 27-5325-01
Cytospin 2 Shandon 59900102
Bovine Serum Albumin, Molecular Biology Grade (for hybridization buffer) Roche 10715859103
Histone H3K27me3 antibody Active Motif 61017
Alexa Fluor 555 Goat Anti-Mouse, highly cross-adsorbed Life Technologies A21424
ProLong Gold antifade reagent Life Technologies P36931

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References

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