फ्लोरोसेंट नैनोकणों के अनुप्रयोग Intracellular जीवाणुओं द्वारा इंडो-लाइसोसोमल प्रणाली के पुनर्गठन का अध्ययन करने के लिए

Immunology and Infection

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Summary

यह लेख संश्लेषण और नैनोकणों के फ्लोरोसेंट लेबलिंग (एनपीएस) के लिए तरीकों का वर्णन है। एनपीएस यूकेरियोटिक कोशिकाओं के एंडो-लाइसोसोमल प्रणाली लेबल करने के लिए पल्स-पीछा प्रयोगों में लागू किया गया। इंट्रासेल्युलर रोगज़नक़ सैल्मोनेला एन्ट्रिका की गतिविधियों से एंडो-लाइसोसोमल प्रणाली का हेरफेर लाइव सेल इमेजिंग और मात्रा द्वारा पीछा किया गया था।

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Zhang, Y., Krieger, V., Hensel, M. Application of Fluorescent Nanoparticles to Study Remodeling of the Endo-lysosomal System by Intracellular Bacteria. J. Vis. Exp. (95), e52058, doi:10.3791/52058 (2015).

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Abstract

वांछनीय रासायनिक, ऑप्टिकल और यांत्रिक गुणों के साथ फ्लोरोसेंट नैनोकणों (एनपीएस) के intracellular organelles के लेबल करने के लिए होनहार उपकरण हैं। यहाँ, हम कोशिकाओं के एंडो-लाइसोसोमल सिस्टम लेबल और intracellular रोगज़नक़ सैल्मोनेला एन्ट्रिका द्वारा मेजबान सेलुलर रास्ते में से जोड़तोड़ की निगरानी के लिए सोने-बीएसए-rhodamine एनपीएस का उपयोग कर एक विधि परिचय। एनपीएस आसानी देर endosomes / लाइसोसोम में हेला कोशिकाओं द्वारा भली भाँति और स्थानीय थे। साल्मोनेला संक्रमण Salmonella- प्रेरित झिल्ली संरचनाओं में vesicles और एनपीएस के संचय की पुनर्व्यवस्था प्रेरित किया। हम confocal माइक्रोस्कोपी छवियों के मात्रात्मक विश्लेषण के लिए Imaris सॉफ्टवेयर पैकेज को तैनात किया। वस्तुओं की संख्या और गैर संक्रमित कोशिकाओं में उनके आकार के वितरण अत्यंत गुम्मट साल्मोनेला से एंडो-लाइसोसोमल प्रणाली के पुनर्गठन का संकेत है, साल्मोनेला -infected कोशिकाओं में लोगों से अलग थे।

Introduction

आदि धातु एनपीएस, क्वांटम डॉट्स, बहुलक एनपीएस, सिलिका एनपीएस, कार्बन डॉट्स, सहित फ्लोरोसेंट नैनोकणों (एनपीएस), पिछले दशकों 1,2 के दौरान काफी ध्यान आकर्षित किया है। परंपरागत जैविक रंगों की तुलना में, फ्लोरोसेंट एनपीएस ऐसी मजबूत सिग्नल की शक्ति, प्रतिरोध photobleaching करने और उच्च biocompatibility के 3,4 के रूप में वांछनीय रासायनिक, ऑप्टिकल और यांत्रिक गुणों, दिखाते हैं। ये लाभ उन्हें इंट्रासेल्युलर संवेदन और लाइव सेल इमेजिंग के लिए पसंद की विधि बनाते हैं। इसके अलावा, इलेक्ट्रॉन घने एनपीएस की एक किस्म ईएम 5 के साथ ultrastructural स्तर पर प्रकाश माइक्रोस्कोपी (एल एम) और उच्च संकल्प के साथ नज़र रखने के जीवित कोशिका के संयोजन की अनुमति देता है जो सहसंबद्ध सूक्ष्म विश्लेषण के लिए उनके उपयोग को सुविधाजनक बनाने, इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी (ईएम) द्वारा दिखाई दे रहे हैं। उदाहरण के लिए, सोने एनपीएस कुशलता से संवेदनशील निदान के लिए जीवित कोशिकाओं में के रूप में अच्छी तरह से इम्युनो-लेबलिंग 6 के क्षेत्र में biosensors के रूप में इस्तेमाल लंबे समय के लिए किया गया है। हाल ही में एसtudies अलग आकार और आकार के साथ सोने एनपीएस सेल लाइनों की एक बड़ी विविधता से तेज और नियमित endosomal मार्ग के माध्यम से परिवहन, इसलिए महान क्षमता से किया जा रहा इंट्रासेल्युलर पुटिका परिवहन ट्रैकिंग और एंडो-लाइसोसोमल प्रणाली लेबलिंग के लिए आवेदन किया है आसानी से किया जा सकता है संकेत मिलता है कि 7,8

ऐसे सैल्मोनेला एन्ट्रिका, शिगेला flexneri और लिस्टेरिया monocytogenes के रूप में माइक्रोबियल रोगज़नक़ों, गैर phagocytic मेजबान कोशिकाओं 9 आक्रमण करने के लिए अलग तंत्र विकसित किया है। भली भाँति किया जा रहा है के बाद, रोगज़नक़ों, या तो cytosol में स्थानीयकृत या झिल्ली ही सीमित डिब्बों में तनहा, उनके मेजबान वातावरण के साथ बड़े पैमाने पर बातचीत करने और अपने स्वयं के अस्तित्व के 10 एहसान करने के लिए इन मिलाना। उदाहरण के लिए, सैल्मोनेला एन्ट्रिका रहता है और एक intracellular phagosomal डिब्बे संक्रमण 11 पर साल्मोनेला युक्त रिक्तिका (SCV) करार दिया भीतर replicates। परिपक्व SCV, गॉल्जीकाय की ओर traffics endocytic मार्ग के साथ निरंतर बातचीत के दौर से गुजर, और ऐसे साल्मोनेला -induced तंतु के रूप में व्यापक ट्यूबलर संरचनाओं, (SIF), nexin नलिकाओं छँटाई, साल्मोनेला -induced स्रावी वाहक झिल्ली प्रोटीन 3 (SCAMP3) नलिकाओं, आदि के गठन लाती 12-14। इन बैक्टीरियल रोगज़नक़ों मेजबान सेल रास्ते में हेरफेर अध्ययन कैसे समझ संक्रामक रोग के लिए आवश्यक है।

इधर, सोना-बीएसए-rhodamine एनपीएस मेजबान सेलुलर एंडो-लाइसोसोमल प्रणाली लेबल करने के लिए तरल पदार्थ ट्रेसर के रूप में इस्तेमाल किया गया है, और मानव जठरांत्र रोगज़नक़ सैल्मोनेला एन्ट्रिका serovar ताकि (साल्मोनेला) के साथ रोगज़नक़ की बातचीत का अध्ययन करने के लिए एक मॉडल के जीवाणु के रूप में इस्तेमाल किया गया था endocytic मार्ग की मेजबानी। गुम्मट साल्मोनेला या उत्परिवर्ती उपभेदों से संक्रमित गैर संक्रमित कोशिकाओं और कोशिकाओं में intracellular सोने-बीएसए-rhodamine एनपीएस एक confocal लेजर स्कैनिंग माइक्रोस्कोप (CLSM) ने उतारी थे।तब Imaris सॉफ्टवेयर साल्मोनेला संक्रमण endosomes / लाइसोसोम के चरम पुनर्व्यवस्था प्रेरित यह दर्शाता है कि एनपीएस के वितरण यों के लिए इस्तेमाल किया गया था। इस विधि का वर्णन के बाद, अनुरूप प्रयोगों भाँति एनपीएस की लंबी अवधि के भाग्य को ट्रैक करने और कोशिकाओं के endocytic मार्ग पर विभिन्न बहिर्जात पदार्थ या अंतर्जात कारकों के प्रभाव की जांच के लिए तैयार किया जा सकता है।

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Protocol

10 एनएम सोने के नैनोकणों (गोल्ड एनपीएस) 15 1. संश्लेषण

  1. समाधान के लिए एक तैयार: 160 मिलीलीटर मिल्ली क्यू, या डबल आसुत पानी में 2 मिलीलीटर 1% जलीय सोने क्लोराइड जोड़ें।
  2. समाधान बी तैयार: 32 मिलीलीटर मिल्ली क्यू, या डबल आसुत पानी में 8 मिलीलीटर 1% त्रिकोणीय सोडियम साइट्रेट एक्स 2 एच 2 हे और 160 μl 1% tannic एसिड जोड़ें।
  3. 60 डिग्री सेल्सियस का हल ए और बी वार्म अप और क्रियाशीलता जबकि उन्हें मिश्रण। तुरंत एक गहरे नीले रंग का पालन। लगभग 15 मिनट के बाद लाल रंग का पालन। फिर, 95 डिग्री सेल्सियस तक गर्मी 5 मिनट के रखने के लिए और आर टी का हल शांत करते हैं।
  4. एक कार्बन लेपित ग्रिड पर एनपी निलंबन की एक बूंद जोड़ें और हवा में सुखाने के लिए अनुमति देते हैं। संचरण इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी द्वारा एनपीएस के आकार और आकृति विज्ञान की जाँच करें।

Rhodamine एन hydroxysuccinimidyl एस्टर (एनएचएस) के साथ बीएसए और लेबलिंग के साथ गोल्ड एनपीएस 2. कोटिंग 16

  1. 30 मिनट के लिए 15,000 XG पर, एक 1.5 मिलीलीटर Eppendorf ट्यूब में 900 μl सेंट्रीफ्यूज सोने एनपीएस जोड़ें। विपक्षtionally, हो सकता है एक ही बार में कई ट्यूबों तैयार करते हैं।
  2. 900 μl में गोली निष्फल मिल्ली क्यू पानी फिर से निलंबित और 100 μl 2 मिलीग्राम / एमएल बीएसए / पीबीएस जोड़ने के लिए, सतह पर तैरनेवाला त्यागें 30 मिनट के लिए 800 rpm पर एक भंवर पर मिश्रण।
  3. अतिरिक्त बीएसए को दूर करने के लिए, 60 मिनट के लिए 15,000 XG पर तैयारी अपकेंद्रित्र।
  4. सतह पर तैरनेवाला त्यागें, और 125 μl पीबीएस में सोने-बीएसए एनपीएस फिर से निलंबित, 1 एम बाइकार्बोनेट की 12.5 μl जोड़ें।
  5. तुरंत उपयोग करने से पहले, rhodamine एनएचएस / DMSO के एक 10 मिलीग्राम / एमएल समाधान तैयार सोना-बीएसए एनपीएस निलंबन के 1ml को rhodamine एनएचएस / DMSO के समाधान के 30 μl जोड़ें। प्रकाश के संपर्क से परहेज, 800 आरपीएम मिश्रण के दौरान आरटी पर 2 घंटा (या हे / एन) के लिए प्रतिक्रिया सेते हैं।
  6. 48 घंटा - 36 की अवधि में 5 बफर परिवर्तन के साथ 4 डिग्री सेल्सियस पर पीबीएस के खिलाफ डायलिसिस के माध्यम से सोने-बीएसए-rhodamine एनपीएस शुद्ध।
  7. एनपीएस को स्थिर प्रत्येक 1 मिलीग्राम सोना-बीएसए-rhodamine एनपीएस में 200 मिलीग्राम / एमएल बीएसए / पीबीएस के 10 μl जोड़ें। 15 में, नि: शुल्क या बीएसए-rhodamine जारी किया सेंट्रीफ्यूज को दूर करने के लिए,60 मिनट के लिए 000 XG। प्रकाश के संपर्क से परहेज, 4 डिग्री सेल्सियस पर आयुध डिपो 520, और दुकान के उपाय, 2 मिलीग्राम / एमएल बीएसए / पीबीएस में गोली resuspend।
  8. मिल्ली क्यू या डबल आसुत जल के साथ एनपीएस 10 गुना पतला, एक कार्बन-लेपित ग्रिड पर एक बूंद जोड़ने के लिए, और हवा में सुखाने के लिए अनुमति देते हैं। संचरण इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी (मंदिर) द्वारा एनपीएस के आकार और आकृति विज्ञान की जाँच करें।
    नोट: एनपी तैयारी के लिए सभी सामग्री का इस्तेमाल निष्फल रहे थे और ऑपरेशन के लिए एक सेल संस्कृति हुड में या एक लौ के बगल में एक बेंच पर आयोजित किया गया।

HELA कोशिकाओं 3. संस्कृति

  1. स्थायी रूप से LAMP1-GFP व्यक्त HELA कोशिकाओं 10% भ्रूण बछड़ा सीरम (एफसीएस) के साथ DMEM में सुसंस्कृत और 5% सीओ 2 से युक्त वातावरण में 37 डिग्री सेल्सियस पर उगाए जाते हैं।
  2. एक 8 अच्छी तरह चैम्बर स्लाइड (Ibidi) में अच्छी तरह से प्रति 50,000 के घनत्व पर कोशिकाओं बीज और / एन ओ सेते हैं।

जीवाणुओं की 4. संस्कृति

  1. इस्तेमाल की सैल्मोनेला एन्ट्रिका serovar ताकि NCTC 12,023 wilडी-प्रकार (डब्ल्यूटी) तनाव। तुलना के लिए, SIF के लिए प्रमुख प्रेरक Sifa कमी SPI2-T3SS और Δ Sifa में Δ ssaV दोषपूर्ण उत्परिवर्ती उपभेदों का उपयोग करें। बढ़ाया GFP के विधान अभिव्यक्ति के लिए प्लाज्मिड pFPV25.1 शरण उपभेदों का प्रयोग करें।
    नोट: जीवाणु उपभेदों 50 माइक्रोग्राम प्रति मिलीग्राम / कार्बेनिसिलिन और / या 50 माइक्रोग्राम प्रति मिलीग्राम / केनामाइसिन (Δ ssaV, Δ Sifa के अलावा के साथ 50 माइक्रोग्राम प्रति मिलीग्राम / कार्बेनिसिलिन (डब्ल्यूटी) और लेग के अलावा के साथ (पौंड) Luria-Bertani शोरबा में नियमित तौर पर संवर्धित कर रहे हैं ) की प्लास्मिड बनाए रखने के लिए आवश्यक है।
  2. फिर ताजा पौंड में 01:31 पतला और 3.5 घंटे के लिए वृद्धि जारी है, उचित एंटीबायोटिक दवाओं के साथ 3 मिलीलीटर लेग में जीवाणुओं की एक कॉलोनी टीका लगाना और वेंटिलेशन के लिए झटकों की शर्तों के तहत 37 डिग्री सेल्सियस पर / एन ओ हो जाना। इस समय बिंदु पर, संस्कृतियों देर लॉग चरण तक पहुंचने और बैक्टीरिया बेहद आक्रामक हैं। ए 'रोलर ड्रम' वातन के साथ टेस्ट ट्यूब संस्कृतियों सेते के लिए सुविधाजनक है।

हेला कोशिकाओं के 5. संक्रमण सेसाल्मोनेला और सोने-बीएसए-Rhodamine एनपीएस चेस लेबलिंग (योजना के लिए चित्रा 1 देखें) पल्स

  1. उप-सुसंस्कृत बैक्टीरिया के 600 आयुध डिपो उपाय और 1 मिलीलीटर पीबीएस (~ 3 × 10 8 CFU / एमएल) में 600 = 0.2 ओवर ड्राफ्ट के लिए पतला, की बहुलता को प्राप्त करने के लिए 8 अच्छी तरह चैम्बर स्लाइड्स में हेला कोशिकाओं को बैक्टीरिया का उचित मात्रा में जोड़ने संक्रमण 100 के (MOI)।
  2. गैर-भाँति बैक्टीरिया को दूर करने के लिए पीबीएस के साथ 3 बार, सेल इनक्यूबेटर में 30 मिनट के लिए सेते धोने (इस समय बिंदु 0 घंटा बाद संक्रमण, या 0 घंटा गड़बड़ी के रूप में स्थापित किया गया था)। 100 माइक्रोग्राम प्रति मिलीग्राम / जेंटामाइसिन युक्त ताजा संस्कृति के माध्यम से 300 μl जोड़ें और 1 घंटे के लिए बनाए रखें। तब ऊष्मायन समय के आराम के लिए 10 माइक्रोग्राम प्रति मिलीग्राम / जेंटामाइसिन युक्त ताजा माध्यम के साथ मध्यम बदलें।
  3. 1 घंटे के लिए 100 माइक्रोग्राम प्रति मिलीग्राम / जेंटामाइसिन युक्त मध्यम संस्कृति के साथ ऊष्मायन के बाद, मध्यम सह (30 मिमी HEPES, पीएच 7.4 के साथ, एफसीएस, एल glutamine, फिनोल लाल और सोडियम बाइकार्बोनेट बिना ईगल्स सदस्य) मध्यम इमेजिंग द्वारा बदल दिया है10 माइक्रोग्राम प्रति मिलीग्राम / जेंटामाइसिन ntaining। सोने-बीएसए-rhodamine एनपीएस आयुध डिपो 520 = 0.1 के अंतिम एकाग्रता प्राप्त करने के लिए HELA कोशिकाओं को जोड़ रहे हैं।
    नोट: सोने-बीएसए-rhodamine एनपीएस भी संक्रमण से पहले, या विभिन्न समय अंक गड़बड़ी पर कोशिकाओं को जोड़ा जा सकता है
  4. 1 घंटे ऊष्मायन के बाद, मध्यम हटाने पीबीएस के साथ तीन बार धो लो, और ऊष्मायन समय के आराम के लिए 10% एफसीएस और 10 माइक्रोग्राम प्रति मिलीग्राम / जेंटामाइसिन युक्त ताजा इमेजिंग माध्यम के 300 μl जोड़ें।
    नोट: ऊष्मायन की अवधि का इस्तेमाल किया एनपीएस और सेल लाइनों की एकाग्रता के आधार पर भिन्न हो सकते हैं। RAW264.7 मैक्रोफेज के लिए, हम पर्याप्त internalization के लिए अनुमति दी आयुध डिपो 520 = 0.05 की एकाग्रता में एनपीएस के साथ कि 30 मिनट ऊष्मायन मनाया।

6. इमेजिंग

  1. इस तरह के अलग अलग समय अंक पर उच्च संकल्प इमेजिंग के लिए एक humidified पर्यावरण कक्ष के साथ एक confocal लेजर स्कैनिंग (CLSM) या कताई डिस्क (एसडी) खुर्दबीन के रूप में एक confocal इमेजिंग प्रणाली का प्रयोग करें।
  2. तापमान सी पर स्विच करेंयह स्थिर है और जब तक इस प्रणाली ontrol प्रतीक्षा करें। ऐसे बढ़ाई, स्कैनिंग गति, संकल्प, z ढेर आदि GFP के लिए उपयुक्त / उत्तेजना उत्सर्जन सेटिंग्स का उपयोग करें और सोने-बीएसए-rhodamine एनपीएस के रूप में इमेजिंग सेटिंग्स को अनुकूलित। इस प्रोटोकॉल के लिए, एक 512 x 512 पिक्सल के 400 हर्ट्ज स्कैनिंग गति, संकल्प और 0.25 माइक्रोन के Z-कदम आकार का उपयोग करें। GFP और क्रमश: एक की गिरफ्तारी लेजर (488 एनएम) और एक HeNe लेजर (543 एनएम), का उपयोग करते हुए सोना-बीएसए-rhodamine उत्तेजित। कोशिकाओं के आकार के अवलोकन के लिए एक उज्ज्वल क्षेत्र (बीएफ) चैनल को शामिल करें। माइक्रोस्कोपी प्रणालियों और संक्रमण शर्तों अन्य के लिए, सेटिंग के अनुसार समायोजित किया जाना है।
    नोट: एक तस्वीर गुणक (पीएमटी) डिटेक्टर के साथ पकड़ा गया था बीएफ चैनल और संकेत के प्रकाश स्रोत के रूप में एक ही एर लेजर का उपयोग करें।
  3. संकेत समय-अंक गड़बड़ी पर, खुर्दबीन मंच और रिकॉर्ड छवियों पर संक्रमित कोशिकाओं से युक्त 8 अच्छी तरह चैम्बर स्लाइड्स माउंट।

छवियाँ 7. विश्लेषण

  1. माइक्रोस्कोपी छवि विश्लेषण सॉफ्टवेयर का प्रयोग करें (देखें साल्मोनेला से एंडो-लाइसोसोमल प्रणाली के पुनर्गठन का विश्लेषण करने के लिए। 'ओपन' पर क्लिक करें और फ़ाइल का चयन करके डेटा खोलें।
    नोट: वैकल्पिक रूप से, इस तरह के ImageJ या फिजी के रूप में खुला स्रोत सॉफ्टवेयर संकुल मात्रात्मक छवि के लिए इस्तेमाल किया जा सकता का विश्लेषण करती है।
  2. आइकन पर देखें पार क्लिक की वस्तुओं टूलबार में चिह्न एक नई सतह आइटम जोड़ने के लिए। पर क्लिक करें चिह्न (बगल)।
  3. ब्याज (आरओआई) के एक क्षेत्र में, का चयन खंड एक रॉय का विश्लेषण करने के लिए। एक क्षेत्र को देखने में, छवि पर मढ़ा एक आयत-bordered खंड आरओआई प्रतिनिधित्व कर रहा है। Y-, इसी एक्स में मान दर्ज करें, और Z-क्षेत्रों, या सीधे आकार और लागत पर लाभ की स्थिति को संशोधित करने के लिए पूर्वावलोकन आयत में तीर पर क्लिक करें। तो फिर क्लिक करें चिह्न = "/ फ़ाइलें / ftp_upload / 52,058 / 52058icon2.jpg" /> (अगला)।
  4. एक स्रोत चैनल के रूप में, का चयन चैनल 3 (गोल्ड-बीएसए-Rhodamine एनपीएस के लिए संकेत)। जिसके परिणामस्वरूप क्षेत्र की चिकनाई स्थापित करने के लिए चिकनी विकल्प की जाँच करें। स्वयं एक मूल्य परिभाषित या स्वतः उत्पन्न मूल्य स्वीकार करते हैं। सीमा के लिए, निरपेक्ष तीव्रता विकल्प चुनें।
  5. दहलीज समायोजन के लिए, मैनुअल विकल्प का चयन करें और एक मूल्य निर्धारित किया है। देखने के क्षेत्र में, एक सतह दहलीज पूर्वावलोकन ग्रे में प्रदर्शित किया जाता है।
  6. टैब को वर्गीकृत सतहों पर जिसके परिणामस्वरूप सतह विभिन्न मापदंडों के आधार पर फ़िल्टर किया जा सकता है। एक डिफ़ॉल्ट फिल्टर, और अन्य फिल्टर 'voxels> 10 की संख्या' भी 'जोड़ें' पर क्लिक करके शामिल किया जा सकता है। एक छानने के लिए आवश्यक नहीं है, तो हटाएँ बटन पर क्लिक करके सभी फिल्टर हटा दें। क्लिक चिह्न (बगल)।
  7. भूतल निर्माण को पूरा करने के लिए, पर क्लिक करें/files/ftp_upload/52058/52058icon3.jpg "/> (समाप्त)। ऑब्जेक्ट सूची में, अब जाँच संयुक्त राष्ट्र के मद वॉल्यूम और नए बनाया सतह के लिए बॉक्स क्षेत्र को देखने में प्रदर्शित किया जाता है।
  8. आँकड़ों के निर्यात करें। अब, पार ध्यान में रखते हुए विषयों का रंग अपने क्षेत्र के अनुसार बैंगनी से लाल करने के लिए बदलती हैं। और 'प्लॉट नंबर एरिया' तालिका आँकड़े जानकारी (जैसे, आईडी नंबर और वस्तुओं के क्षेत्र) से पता चलता है। क्लिक करके एक एक्सेल फाइल करने के लिए सतह एक के सभी आँकड़ों का निर्यात चिह्न (सेव)।

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Representative Results

गोल्ड एनपीएस साइट्रेट और tannic एसिड से chloroauric एसिड की कमी के माध्यम से एक अच्छी तरह से स्थापित विधि के माध्यम से उत्पन्न किया गया। 2A चित्रा में दिखाया गया है, संश्लेषित सोने एनपीएस लगभग 10 एनएम के आकार के साथ आकार में अर्ध गोलाकार थे। बीएसए कोटिंग और rhodamine-लेबलिंग उनकी आकृति विज्ञान या आकार (चित्रा 2 बी) को प्रभावित नहीं किया।

यह सोने एनपीएस आसानी से विभिन्न स्तनधारी कोशिकाओं द्वारा लिया और endocytic सिस्टम 7 में समाप्त किया जा सकता है कि सूचना दी गई है। पिछले कार्यों के अनुसार, चमकदार लाल प्रतिदीप्ति संकेतों कोशिकाओं द्वारा एनपीएस के प्रभावी internalization के संकेत है, सोने-बीएसए-rhodamine एनपीएस (चित्रा 3, गुम्मट 5 घंटा पीआई) के साथ एक घंटा ऊष्मायन के बाद HELA कोशिकाओं में मनाया गया। लाल संकेतों के अधिकांश एनपीएस देर endosomes या लाइसोसोम में ही सीमित थे दिखा रहा है कि, हरी संकेतों के साथ colocalized पाए गए। हालांकि, देर endosomes / लाइसोसोम में एनपीएस के समान वितरण के विपरीतगैर संक्रमित कोशिकाओं (चित्रा 3, नकली) में, अपने स्थानों को काफी हद तक गुम्मट साल्मोनेला -infected कोशिकाओं में पुन: व्यवस्थित किया गया। (चित्रा 3, गुम्मट 5 घंटा पीआई) संक्रमण के प्रारंभिक चरण में, साल्मोनेला SCV भीतर replicates और SIF तेजी से विस्तार या संकुचन आंदोलन से गुजरना। एक और अंश अभी भी मुक्त देर endosomes / लाइसोसोम में स्थित था, जबकि इस समय बिंदु पर, एनपीएस का एक अंश, SCV और SIF में पाया गया था। 8 घण्टे की गड़बड़ी पर (चित्रा 3, गुम्मट 8 घंटा पीआई), SIF की एक स्थिर नेटवर्क का गठन किया गया था, और केवल एक बहुत छोटे से हिस्से को मुक्त देर endosomes / लाइसोसोम में स्थित बने रहे, जबकि सबसे एनपीएस, ट्यूबलर संरचनाओं के भीतर जमा हुए पाए गए। उत्परिवर्ती उपभेदों Δ ssaV और Δ Sifa अलग व्यवहार का प्रदर्शन किया। चित्रा 3ssaV) में दिखाया गया के रूप में कोई SIF संरचनाओं का गठन किया गया है, जबकि 8 घण्टे की गड़बड़ी पर, Δ ssaV SCV के अंदर ही सीमित था। कुछ एनपीएस सामन आसपास के मनाया गयाSCV अंदर एला, लेकिन एनपीएस का बहुमत अभी भी मुक्त देर endosomes / लाइसोसोम में स्थित थे। Δ Sifa तनाव (चित्रा 3, Δ Sifa) के लिए, कोशिका द्रव्य में साल्मोनेला के भागने हुई, और एनपीएस और बैक्टीरिया के बीच कोई संबंध नहीं मनाया गया।

हमारे पिछले अध्ययन में यह पाया गया कि SIF प्रदर्शन अत्यधिक गतिशील संक्रमण के शुरुआती चरण में गुण (3-5 घंटा पीआई), लेकिन बाद की अवधि (> 8 घंटा पीआई) 12 में स्थिर हो जाते हैं। संक्रमण के जल्दी और देर चरणों में साल्मोनेला इंट्रासेल्युलर एनपीएस के वितरण को पुनर्व्यवस्थित करने के लिए तुलनीय क्षमता है कि क्या इसलिए, हम सोच रहे हैं। भाँति एनपीएस के अधिकांश में संचित मनाया गया सभी मामलों में एक घंटे के लिए - (7 घंटा गड़बड़ी 1), चित्रा 4 में दिखाया गया है, सोने एनपीएस HELA कोशिकाओं हे / एन संक्रमण से पहले, या संक्रमण के बाद अलग-अलग समय अंक पर साथ incubated रहे थे SCV या SIF।

सूक्ष्म observations मेजबान कोशिकाओं के एंडो-लाइसोसोमल प्रणाली की भारी पुनर्व्यवस्था में साल्मोनेला परिणामों से कि संक्रमण का पता चला। एक अगले कदम के रूप में, हम एक मात्रात्मक तरीके से साल्मोनेला -induced मेजबान सेल phenotypes का विश्लेषण करने के Imaris सॉफ्टवेयर पैकेज का इस्तेमाल किया। एक उदाहरण के रूप में 8 घंटा गड़बड़ी पर एक संक्रमित हेला सेल की छवि का उपयोग करना, मात्रात्मक विश्लेषण के लिए एक कदम दर कदम निर्देश चित्रा 5 में दिखाया गया है। 15 के एक तीव्रता दहलीज और एक 'voxels की संख्या> 10' फिल्टर, 3 डी के माध्यम से वस्तुओं मूल छवि फ़ाइल से निकाले गए थे। वस्तुओं सोने-बीएसए-rhodamine एनपीएस के साथ स्थित है जिसमें intracellular संरचना होने वाले थे। इस उदाहरण में, 67 वस्तुओं 1,974.64 माइक्रोन 2 के रूप में एक माथुर क्षेत्र के साथ, कुल में निकाले गए थे। दूसरों के छोटे से 50 माइक्रोन 2 रहे हैं, जबकि SIF नेटवर्क के साथ colocalized जो सबसे बड़ी वस्तु, 1,836.23 माइक्रोन 2 का एक क्षेत्र है। तुलना के लिए, एक उदाहरण क्वांट दिखाएक गैर-संक्रमित कोशिका की itative विश्लेषण परिणाम में दिया गया था। यहाँ, 431 वस्तुओं में कुल निकाले गए थे, जिसके भीतर क्षेत्र के औसत मूल्य के 5 माइक्रोन 2 और सबसे बड़ी वस्तु 34 माइक्रोन 2 का एक क्षेत्र है। वस्तुओं की अभिव्यक्त क्षेत्र चित्रा 4 में संक्रमित कोशिका (1975 माइक्रोन 2) के बराबर है जो 2252 माइक्रोन 2, है। हालांकि, वस्तुओं की संख्या साल्मोनेला -induced ट्यूबलर संरचनाओं के साथ vesicles की बड़ी हद संलयन इंगित करता है जो एक दूसरे को (431 और 67 वस्तुओं, क्रमशः), की तुलना में बहुत बड़ा है।

चित्रा 1
लाइव सेल इमेजिंग के लिए HELA कोशिकाओं की तैयारी के लिए चित्रा 1. योजना। HELA कोशिकाओं, चैम्बर स्लाइड्स में वरीयता प्राप्त नकली संक्रमित, या 30 मिनट के लिए विभिन्न साल्मोनेला उपभेदों से संक्रमित थे, तो incubat, पीबीएस के साथ तीन बार धोया मध्यम 1 घंटे के लिए 100 माइक्रोग्राम प्रति मिलीग्राम / जेंटामाइसिन को रोकने के साथ एड। बाद में, मध्यम युक्त मध्यम इमेजिंग द्वारा बदल दिया गया था प्रयोग के आराम के लिए एनपी मुक्त माध्यम से 1 घंटे के लिए incubated, और फिर पीछा 10 एनएम सोने-बीएसए-rhodamine एनपीएस (आयुध डिपो 520 = 0.1) और 10 माइक्रोग्राम प्रति मिलीग्राम / जेंटामाइसिन, । लाइव सेल इमेजिंग अलग समय बिंदुओं पर प्रदर्शन किया गया था संक्रमण (पीआई) के बाद। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्रा 2
चित्रा से पहले कोलाइडयन सोने एनपीएस के 2. मंदिर छवियों (क) और लेबलिंग (ख) के बाद। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

तरीके "> चित्रा 3
इंट्रासेल्युलर साल्मोनेला। हेला कोशिकाओं द्वारा मेजबान सेलुलर एंडो-लाइसोसोमल प्रणाली चित्रा 3. Remodeling के नकली संक्रमित 10 एनएम सोने-बीएसए-rhodamine एनपीएस के साथ उत्परिवर्ती उपभेदों और नाड़ी / चेस, या साल्मोनेला गुम्मट, Δ ssaV या Δ Sifa से संक्रमित थे ( चित्रा 1 में वर्णित के रूप में आयुध डिपो = 0.1 520) प्रदर्शन किया था। CLSM जेड के ढेर के अधिक से अधिक तीव्रता के अनुमानों से पता चला रहे हैं। स्केल सलाखों, 10 माइक्रोन। इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्रा 4
चित्रा साल्मोनेला संक्रमण के विभिन्न चरणों में एंडो-लाइसोसोमल प्रणाली 4. अभिगम्यता। हेलाकोशिकाओं 10 एनएम सोने-बीएसए-rhodamine एनपीएस के साथ स्पंदित कर रहे थे (आयुध डिपो 520 = 0.1) हे / एन पूर्व संक्रमण, या संकेत के रूप में विभिन्न समय अंक गड़बड़ी पर 1 घंटे के लिए। दिखाए जाते हैं CLSM जेड के ढेर के 9 घंटा गड़बड़ी अधिक से अधिक तीव्रता के अनुमानों - लाइव सेल इमेजिंग 8 पर प्रदर्शन किया गया था। स्केल सलाखों, 10 माइक्रोन। इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्रा 5
एक उदाहरण के रूप में 8 घंटा गड़बड़ी पर एक संक्रमित हेला सेल की एक छवि का उपयोग करते हुए Imaris द्वारा मात्रात्मक विश्लेषण के लिए कदम अनुदेश द्वारा चित्रा 5. कदम। (ए) 'ओपन' पर क्लिक करें और फ़ाइल का चयन करके डेटा खोलें। पार देखने की वस्तुओं उपकरण पट्टी (ख) एक नई सतह आइटम जोड़ें। (सी) तो खंड एक रॉय का चयन करें, एक रॉय का विश्लेषण करने के लिए। (डी) y-, इसी एक्स में मान दर्ज करें, और जेड क्षेत्रों या (ई) सीधे आकार और लागत पर लाभ की स्थिति को संशोधित करने के लिए पूर्वावलोकन आयत में तीर पर क्लिक करें। इस उदाहरण में, एक रॉय की जरूरत नहीं किया गया था और पूरी छवि विश्लेषण किया गया था। एक स्रोत चैनल के रूप में (एफ) चैनल 3 (गोल्ड-बीएसए-Rhodamine एनपीएस के संकेत) का चयन करें। जिसके परिणामस्वरूप क्षेत्र की चिकनाई स्थापित करने के लिए चिकनी विकल्प की जाँच करें। स्वयं एक मूल्य परिभाषित या स्वतः उत्पन्न मूल्य स्वीकार करते हैं। इधर, 0.1 माइक्रोन इस्तेमाल किया गया था। 'दहलीज' के लिए 'निरपेक्ष तीव्रता' विकल्प का चयन करें। दहलीज समायोजन के लिए (जी) के मैनुअल विकल्प का चयन करें और एक मूल्य निर्धारित (इस उदाहरण में 15 में इस्तेमाल किया गया था)। देखने के क्षेत्र में एक सतह दहलीज पूर्वावलोकन ग्रे में प्रदर्शित किया जाता है। टैब 'वर्गीकृत सतहों' जिसके परिणामस्वरूप सतह पर (एच) के विभिन्न मापदंडों के आधार पर फ़िल्टर किया जा सकता है। एक डिफ़ॉल्ट फिल्टर 'voxels> 10 की संख्या' है।फिल्टर एक नया मान दर्ज द्वारा समायोजित किया जा सकता है और अन्य फिल्टर जोड़ा जा सकता है। इस उदाहरण में, हम फिल्टर 'voxels> 10 की संख्या' रखा है। (मैं) 'समाप्त' पर भूतल सृजन क्लिक पूरा करने के लिए। वस्तु सूची में अब संयुक्त राष्ट्र की जांच मद वॉल्यूम और नए बनाया सतह के लिए बॉक्स लाल रंग में क्षेत्र को देखने में प्रदर्शित किया जाता है। विषयों का रंग अपने क्षेत्र के अनुसार लाल बैंगनी से भिन्न पार ध्यान में रखते हुए (जे)। (कश्मीर) 'प्लॉट नंबर एरिया' तालिका आँकड़े जानकारी से पता चलता है। एक एक्सेल फाइल करने के लिए निर्यात के आंकड़े। इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्रा 6
एक गैर-संक्रमित कोशिका की चित्रा 6 मात्रात्मक विश्लेषण नतीजा है। ( (बी) के नए बनाया सतह। (सी) पार ध्यान में रखते हुए नई सतह। (डी) 'प्लॉट नंबर एरिया' तालिका आँकड़े जानकारी से पता चलता है। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

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Discussion

स्तनधारी कोशिकाओं के एंडो-लाइसोसोमल प्रणाली पोषक तत्व अवशोषण, हार्मोन की मध्यस्थता संकेत पारगमन, प्रतिरक्षा निगरानी, ​​और प्रतिजन प्रस्तुति 17 सहित महत्वपूर्ण शारीरिक प्रक्रियाओं, नियंत्रित करता है। अब, मार्कर की एक किस्म endocytic मार्ग और ट्रैकिंग पढ़ाई की लेबलिंग के लिए इस्तेमाल किया गया है। उदाहरण के लिए, LysoTracker जांच चुनिंदा कम आंतरिक पीएच के साथ सेलुलर डिब्बों में जमा और प्रभावी ढंग से nanomolar सांद्रता 18 में जीवित कोशिकाओं लेबल कर सकते हैं जो लाइसोसोम लेबलिंग के लिए आण्विक जांच (जीवन टेक्नोलॉजीज, संयुक्त राज्य अमरीका) द्वारा विकसित फ्लोरोसेंट acidotropic जांच कर रहे हैं। हालांकि, कोशिकाओं के साथ LysoTracker जांच के लंबे समय ऊष्मायन लाइसोसोमल पीएच में वृद्धि को प्रेरित और लाइसोसोम 19 के संभावित शारीरिक परिवर्तन करने के लिए नेतृत्व कर सकते हैं। ऐसे फ्लोरोफोरे लेबल dextrans के रूप में कुछ बड़े biomolecules, यह भी अक्सर endosome / लाइसोसोम लेबलिंग के लिए उपयोग किया जाता है। हालांकि, कम photostability, छोटी-परिसंचारी जीवन, और पीनियतन के दौरान oor प्रतिधारण लंबे समय तक जीवित कोशिका इमेजिंग में अपने आवेदन में बाधा और correlative खुर्दबीन 16,19 अध्ययन करता है। इधर, सोना-बीएसए-rhodamine एनपीएस मेजबान सेलुलर एंडो-लाइसोसोमल प्रणाली लेबल करने के लिए तरल पदार्थ ट्रेसर के रूप में इस्तेमाल किया गया। उच्च तेज दक्षता और मजबूत इंट्रासेल्युलर प्रतिदीप्ति संकेतों मनाया गया। अत्यधिक देर endosomes / लाइसोसोम की झिल्ली पर समृद्ध है जो लाइसोसोमल ग्लाइकोप्रोटीन LAMP1, साथ एनपीएस के लगभग पूर्ण colocalization, एनपीएस द्वारा एंडो-लाइसोसोमल प्रणाली के उचित लेबलिंग सत्यापित। ऐसे Lysotracker के रूप में अन्य मार्कर के साथ फ्लोरोसेंट एनपीएस के उपयोग के संयोजन मेजबान सेल vesicular तस्करी और परिपक्वता के बारे में पूरक जानकारी उपलब्ध करा सकता है।

यह एनपीएस के सेलुलर internalization उनकी शारीरिक आयाम और रासायनिक घटकों पर निर्भर है कि उल्लेख करने लायक है। हम एक 5 एनएम, 10 एनएम, 15 एनएम और 30 एनएम के आकार, और इसी तरह के intracellular वितरण में साथ सोने-बीएसए-rhodamine एनपीएस का परीक्षण कियापक्ष हेला कोशिकाओं (परिणाम) नहीं दिखाया मनाया गया। हम साल्मोनेला संक्रमण के अध्ययन के लिए सुविधाजनक सेल लाइन के रूप में HELA कोशिकाओं का इस्तेमाल किया। हालांकि, सोने-बीएसए-rhodamine एनपीएस भी आसानी से विभिन्न अन्य सेल लाइनों से भली भाँति और प्राथमिक कोशिकाओं उत्तरदायी हैं किया जा सकता है। उदाहरण के लिए, हम साल्मोनेला चो में एनपी, भंडार नियंत्रक-7, CaCo2, या 3T3 कोशिकाओं द्वारा ट्यूबलर संरचनाओं और लेबलिंग -induced, साथ ही इंटरफेरॉन γ उत्तेजित RAW264.7 मैक्रोफेज की तरह सेल लाइन कोशिकाओं या प्राथमिक murine मैक्रोफेज और में मनाया वृक्ष के समान कोशिकाओं। हालांकि, प्रत्येक कोशिका लाइन संक्रमण और नाड़ी / पीछा प्रोटोकॉल के समायोजन की आवश्यकता होगी।

यह डाई फँस सिलिका एनपीएस एक biocompatible, लंबे समय से रहते हैं, और अत्यधिक photostable लाइसोसोम मार्कर 19 के रूप में इस्तेमाल किया जा सकता है कि सूचना दी, और हम भी अलग-अलग आकार के साथ rhodamine-डाल दिया गया सिलिका एनपीएस के व्यवहार की तुलना की गई है (30 - 1000 एनएम)। एस में एनपीएस की गैर संक्रमित कोशिकाओं और संचय में सिलिका एनपीएस द्वारा देर endosomes / लाइसोसोम के समुचित लेबलिंगसाल्मोनेला -infected कोशिकाओं में CV और SIF मनाया गया। हालांकि, एनपीएस या एकल सिलिका एनपीएस के बड़े आकार, साल्मोनेला -induced ट्यूबलर संरचनाओं के साथ साथ एनपीएस के वितरण के समुच्चय के गठन की वजह से (नहीं दिखाया डेटा) एक समान नहीं था।

के रूप में अच्छी तरह से SIF के रूप में SCV की एक विशेषता ऐसी LAMP1 12 के रूप में अत्यधिक प्रचुर मात्रा में लाइसोसोमल ग्लाइकोप्रोटीन की उपस्थिति है। इधर, stably LAMP1-GFP व्यक्त एक हेला सेल लाइन एंडो-लाइसोसोमल प्रणाली और का जीना सेल इमेजिंग की सुविधा के लिए SCV और SIF संरचनाओं इस्तेमाल किया गया था। अनिवार्यता से बढ़ाया GFP व्यक्त साल्मोनेला उपभेदों बैक्टीरिया के स्थान इंगित करने के लिए संक्रमण प्रयोगों में इस्तेमाल किया गया । कारण इंट्रासेल्युलर बैक्टीरिया के समान आकार और आकार के लिए, सामान्य रूप में बैक्टीरियल GFP प्रतिदीप्ति एंडो-लाइसोसोमल झिल्ली पर GFP के लेबल से आसानी से अलग पहचाना है। हालांकि, भविष्य के प्रयोगों के लिए बैक्टीरिया और झिल्ली जनसंपर्क से फ्लोरोसेंट जो संकेत मेंoteins ठीक अंतर है, अन्य फ्लोरोसेंट संलयन प्रोटीन, जैसे, mTurquoise होने की जरूरत है, एकीकृत किया जा करने के लिए सिफारिश की है। यह, हालांकि, जीवित कोशिका के प्रयोगों में उच्च फोटो-नुकसान के जोखिम असर, रोशनी और छवि अधिग्रहण के अतिरिक्त राउंड में यह परिणाम है।

बैक्टीरियल रोगज़नक़ों मेजबान सेल रास्ते में हेरफेर करने के लिए आवश्यक जीन और तंत्र पता लगाने के लिए, कई म्यूटेंट पैदा किए जाने की जरूरत है और उनके प्रदर्शन को ध्यान से तुलना करने की जरूरत है। उदाहरण के लिए, साल्मोनेला उत्परिवर्ती उपभेदों Δ ssaV और Δ Sifa अत्यधिक प्रणालीगत डाह और intracellular प्रतिकृति 20,21 में तनु कर रहे हैं। दोनों Δ ssaV और Δ Sifa उपभेदों SIF प्रेरित करने में विफल रहते हैं, और इसके साथ ही Δ Sifa साल्मोनेला संक्रमण 12 के दौरान SCV झिल्ली खो देते हैं। गुम्मट के phenotypes और उत्परिवर्ती उपभेदों मुकाबले अनुसंधान करने के लिए साल्मोनेला की क्षमता को समझने में महत्वपूर्ण भूमिका निभाई हैemodel मेजबान सेल vesicular यातायात। सूक्ष्म परीक्षा के आधार पर यह गुम्मट साल्मोनेला Δ ssaV और Δ Sifa उत्परिवर्ती उपभेदों की तुलना में एक बहुत अधिक हद तक मेजबान सेलुलर endocytic रास्ते पलट कि स्पष्ट है। इस समारोह में उनके intracellular अस्तित्व और नकल के लिए अधिक पोषक तत्व प्राप्त करने के लिए इंट्रासेल्युलर साल्मोनेला सक्षम हो सकता है।

Confocal माइक्रोस्कोपी छवियों को स्पष्ट रूप से intracellular जीवाणुओं द्वारा मेजबान सेलुलर एंडो-लाइसोसोमल प्रणाली के पुनर्गठन प्रदर्शित करता है। हालांकि, छवियों के मात्रात्मक विश्लेषण सटीक तुलना के लिए आवश्यक है। यहाँ वर्णित विधि में, Imaris सॉफ्टवेयर प्रतिदीप्ति चैनल 3> 15 में तीव्रता और इन वस्तुओं को सोने-बीएसए-Rhodamine एनपीएस युक्त इंट्रासेल्युलर झिल्ली संरचनाओं होना चाहिए रहे हैं voxels> 10 की संख्या है जो 3 डी वस्तुओं निकालने के लिए प्रयोग किया जाता है। प्रतिदीप्ति तीव्रता दहलीज और फिल्टर छवियों की गुणवत्ता के हिसाब से परिभाषित किया है, लेकिन shoul किया जा सकता हैविभिन्न स्थितियों या उपभेदों की तुलना के लिए स्थिर रखा जा चाहते हैं। एक गैर-संक्रमित कोशिका और क्रमशः, निकाले 431 और 67 वस्तुओं के साथ 8 घण्टे की गड़बड़ी पर एक गुम्मट साल्मोनेला -infected सेल, के उदाहरण यहाँ हैं दिखाया गया है। कोशिकाओं के आकार में ही नहीं हैं, क्योंकि स्पष्ट अंतर के बावजूद, यह वस्तुओं की ही संख्या की तुलना करने के लिए तर्कसंगत नहीं है। एक समाधान (इस उदाहरण में 2252 माइक्रोन 2 और माइक्रोन 2 1975, क्रमशः) माथुर क्षेत्र के लिए वस्तुओं की संख्या को सामान्य करने के लिए या कोशिकाओं के अंदर की वस्तुओं के फ्लोरोसेंट तीव्रता का योग है। वैकल्पिक रूप से, यह संक्रमण के विभिन्न चरणों में एनपीएस के वितरण की तुलना करने के क्रम में एक संक्रमण से पहले सेल और अलग अलग समय अंक गड़बड़ी पर नज़र रखने के लिए भी संभव है।

अंत में, इस विधि में सोने-बीएसए-rhodamine एनपीएस यूकेरियोटिक कोशिकाओं के एंडो-लाइसोसोमल प्रणाली लेबल करने के लिए लागू किया गया। एक intracellula द्वारा मेजबान सेलुलर एंडो-लाइसोसोमल प्रणाली के हेरफेरआर रोगज़नक़ लाइव सेल CLSM और मात्रात्मक विश्लेषण परिणामों से मनाया गया देर endosomes के चरम rearrangements संकेत दिया / गुम्मट साल्मोनेला। साल्मोनेला से लाइसोसोम एक मॉडल के इस अध्ययन में रोगज़नक़, लेकिन इस तरह के शिगेला flexneri और लिस्टेरिया monocytogenes के रूप में अन्य बैक्टीरियल रोगज़नक़ों, के intracellular व्यवहार के रूप में इस्तेमाल किया गया था इस दृष्टिकोण का उपयोग कर जांच की जा सकती है। सिद्धांत रूप में, सोने-बीएसए-rhodamine एनपीएस इसलिए मोटे तौर पर अलग-अलग अंतर्जात या बहिर्जात पदार्थों के साथ endocytic मार्ग की बातचीत की जांच के अध्ययन में लागू किया जा रहा वादा कर रहे हैं, सेल लाइनों की एक बड़ी विविधता से भली भाँति किया जा सकता है।

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Materials

Name Company Catalog Number Comments
Gold chloride Sigma-Aldrich 520918
Tannic acid Sigma-Aldrich 403040
Tri-sodium citrate Sigma C8532
Bovine serum albumin Sigma A2153
NHS-Rhodamine Pierce 46406
DMSO Sigma D8418
HEPES Sigma H3375
Gentamicin Applichem A1492
Kanamcyin Roth T832
Carbenicillin Roth 6344
8-well chamber slides Ibidi 80826 tissue culture treated, sterile
Imaris Software Bitplane version 7.6 various configurations available

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References

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