通过胞内细菌,研究内溶酶体系统的改造荧光纳米粒子中的应用

Immunology and Infection

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Summary

本文介绍了合成和纳米粒子的荧光标记(NPS)的方法。所述纳米颗粒是在脉冲追踪实验施加标记的真核细胞的内溶酶体系统。内溶酶体系统的细胞内病原体沙门氏菌的活动操纵其次是活细胞成像和量化。

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Zhang, Y., Krieger, V., Hensel, M. Application of Fluorescent Nanoparticles to Study Remodeling of the Endo-lysosomal System by Intracellular Bacteria. J. Vis. Exp. (95), e52058, doi:10.3791/52058 (2015).

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Abstract

荧光纳米粒子(纳米粒子)具有理想的化学,光学和机械性能是有希望的工具来标记胞内细胞器。在这里,我们介绍利用金-牛血清白蛋白-若丹明纳米粒标记的真核细胞的内溶酶体系统以及由细胞内病原体沙门氏菌监测的宿主细胞途径的操纵的方法。该纳米粒子易于被HeLa细胞内化和本地化下旬内涵体/溶酶体。 沙门氏菌感染引起的沙门氏菌中引起膜结构的囊泡和纳米颗粒的积累重排。我们部署的共聚焦显微镜图像定量分析的了Imaris软件包。对象的数目和在非感染细胞的大小分布是从那些在沙门氏菌 -感染细胞明显,指示由WT 沙门氏菌极其重塑内溶酶体系统。

Introduction

荧光纳米粒子(纳米粒子),包括金属纳米粒子,量子点,聚合物纳米颗粒,二氧化硅纳米颗粒,碳圆点, 等等 ,都在过去几十年1,2-引起了相当的重视。相比传统的有机染料,荧光纳米颗粒显示出理想的化学,光学和机械性质,如强的信号强度,耐漂白和高生物相容性3,4。这些优势使他们的首选细胞内检测和活细胞成像的方法。此外,各种电子致密纳米粒子是通过电子显微镜(EM)可见,促进它们的使用为相关显微分析,这使得活细胞在光学显微镜(LM)和更高的分辨率跟踪在超微结构水平使用EM 5的组合。例如金纳米粒已经有效地用作生物传感器在活细胞中对敏感的诊断,以及在免疫标记6的字段长的时间。近期s案例研究表明,金纳米粒具有不同的尺寸和形状可容易地通过大量的各种细胞系摄取并通过内体途径常规输送,因此有很大的潜力被施加于细胞内囊泡运输跟踪和内溶酶体系统贴标7,8-

微生物病原体,如沙门氏菌志贺氏菌李斯特菌 ,开发不同的机制侵入非吞噬宿主细胞9。被内化后,病原体,无论是定位于细胞质或螯合在膜结合隔间,广泛的互动与他们的主机环境和调节这些有利于自己的生存10。例如, 沙门氏菌驻留并复制感染11后,在细胞内的吞噬体舱称为含沙门氏菌的空泡(SCV)。成熟SCV贩卖朝向高尔基体,进行与内吞途径连续的相互作用,并诱导形成广泛的管状结构,例如沙门氏菌诱导长丝(SIF),分拣连接蛋白肾小管, 沙门氏菌诱导分泌载体膜蛋白3(SCAMP3)小管12-14。研究这些细菌病原体如何操纵宿主细胞途径是必不可少的理解传染病。

这里,金-牛血清白蛋白-若丹明纳米粒被用作流体示踪剂标记的宿主细胞内溶酶体系统,以及人体胃肠病原体沙门鼠伤寒( 沙门氏菌 )用作模型细菌来研究所述病原体与相互作用主机内吞途径。在非感染细胞和感染的细胞与WT 沙门氏菌或突变株细胞内的金-牛血清白蛋白-若丹明纳米粒通过共焦激光扫描显微镜(CLSM)成像。然后了Imaris软件用于定量纳米粒的分布,表明沙门氏菌感染引起的内涵体/溶酶体极端重排。下面该方法的描述中,类似的实验,可以设计成跟踪内在化纳米颗粒的长期命运,并调查各外源物质或内源性因子对真核细胞的内吞途径的影响。

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Protocol

1.合成10nm的纳米金(金纳米粒)15

  1. 准备解决方案答:加2毫升1%水溶液氯化金成160毫升的Milli-Q,或双蒸水。
  2. 制备溶液B:加入8毫升1%柠檬酸三钠×2的H 2 O和160微升1%的单宁酸成32毫升的Milli-Q,或双蒸水。
  3. 热身方案A和B到60°C和混合他们同时进行搅拌。立即观察到深蓝色。约15分钟后,观察到红色。然后升温至95℃,保持5分钟,冷却溶液至室温。
  4. 添加一滴的NP悬浮到碳包覆的网格并允许在空气中干燥。检查纳米粒的通过透射电子显微镜的大小和形态。

2.涂料黄金纳米粒子与BSA和标签罗丹明N-羟基酯(NHS)16

  1. 添加900微升金纳米粒到1.5ml的Eppendorf管中,离心机以15000×g离心30分钟。欧普倚重,准备多个管可以一次。
  2. 弃去上清液,重新悬浮沉淀在900微升灭菌的Milli-Q水,并添加100微升2毫克/毫升BSA / PBS中,混合在Vortex以800rpm进行30分钟。
  3. 以除去过量的BSA,离心制备以15,000×g离心60分钟。
  4. 弃去上清液,并重新暂停金纳米粒BSA在125微升PBS,加入12.5微升1M的碳酸氢盐。
  5. 在即将使用前,制备10毫克/毫升的溶液罗丹明NHS / DMSO中,加入30微升罗丹明NHS / DMSO溶液至1ml金 - 牛血清白蛋白纳米粒混悬液。孵育2小时(或O / N)在室温时800转混合反应,避免暴露在光线下。
  6. 通过净化透析对PBS的黄金BSA罗丹明纳米粒在4ºC超过36期5缓冲变化 - 48小时。
  7. 为了稳定纳米颗粒,加10微升的200毫克/毫升BSA / PBS到每个1毫升金 - 牛血清白蛋白 - 若丹明纳米粒。以除去游离的或释放BSA的若丹明,离心机15,000 XG 60分钟。重悬沉淀在2毫克/毫升BSA / PBS,测量OD 520,并储存在4℃下,以避免暴露于光。
  8. 稀释的纳米颗粒10次用Milli-Q或双蒸水,加一滴到碳包覆的网格,并允许在空气中干燥。检查纳米粒的大小和形态由透射电子显微镜(TEM)。
    注意:用于NP制剂的所有材料进行灭菌和操作被在细胞培养罩或在火焰旁长凳进行。

3.文化HeLa细胞

  1. HeLa细胞永久表达LAMP1-GFP在DMEM中培养,用10%胎牛血清(FCS),在37℃下在含有5%的CO 2的气氛中生长。
  2. 种子细胞在50000每孔的密度在8孔室滑动(Ibidi)和孵化O / N。

细菌4.文化

  1. 使用沙门伤寒NCTC 12023 WILd型(WT)菌株。为了便于比较,使用突变株ΔSSAV缺陷在SPI2-T3SS和Δ 西法缺乏关键效应西法为SIF。使用的菌株窝藏质粒pFPV25.1增强GFP的组成型表达。
    注:细菌菌株是常规培养在LB肉汤(LB)并加入50微克/毫升羧苄青霉素(WT)和LB并加入50微克/毫升羧苄青霉素和/或50微克/毫升卡那霉素(ΔSSAV,ΔSIFA )的要求保持质粒。
  2. 接种细菌的单个菌落3毫升的LB用适当的抗生素和摇动的条件下进行曝气,在37ºC生长的O / N,则稀释1点31分在新鲜LB,并继续生长3.5小时。在这个时间点,将培养达到晚期对数期和细菌是高度侵入。 A'辊筒'方便孵化试管培养与通风。

5.通过感染HeLa细胞沙门氏菌和金BSA-罗丹明纳米粒脉冲大通标签(见图1计划)

  1. 测量子培养细菌的OD 600,并稀释至OD 600 = 0.2的1ml的PBS(〜3×10 8 CFU / ml)的,在8孔室玻片中添加细菌HeLa细胞的适当的量来实现的多个感染的100(MOI)。
  2. 孵育在细胞培养箱30分钟,洗3次,用PBS以除去未内在化的细菌(该时间点被设定为0小时后的感染,或0小时圆周率)。加入300微升新鲜培养基含有100μg/ ml庆大霉素和维持1小时。然后用含10微克/毫升庆大霉素的温育时间,其余的新鲜培养基更换培养基。
  3. 孵育与含有100微克/毫升庆大霉素1小时培养基后,将培养基替换为成像介质(鹰MEM不含FCS,L-谷氨酰胺,酚红和碳酸氢钠,用30毫米的HEPES,pH值7.4)共ntaining 10微克/毫升庆大霉素。金-牛血清白蛋白-若丹明纳米粒加入到HeLa细胞中,以获得外径520 = 0.1的终浓度。
    注:金 - 牛血清白蛋白 - 若丹明纳米粒也可加入到细胞中感染之前,或在不同的时间点PI
  4. 经过1小时温育后,除去介质,洗3次,用PBS中,并加入300微升含有10%FCS和10μg/ ml的庆大霉素的温育时间的其余部分新鲜成像介质。
    注:温育持续时间可以根据所用NP和细胞系的浓度而变化。对于RAW264.7巨噬细胞,我们观察到,30分钟孵化与纳米粒子在OD 520 = 0.05的允许浓度足够的内在。

6.成像

  1. 使用共焦成像系统,例如共焦激光扫描(CLSM)或旋转式圆盘(SD)的显微镜用的潮湿环境室,用于高分辨率成像在不同的时间点。
  2. 开关上的温度下ONTROL系统和等待,直到它是稳定的。优化成像设置,例如放大,扫描速度,分辨率,Z-栈等使用适当的激发/发射设置GFP和金BSA-罗丹明纳米粒。对于这个协议,使用400 Hz的扫描速度,分辨率为512×512像素和0.25微米的Z-步长。激发GFP和使用Ar激光(488纳米)和氦氖激光器(543纳米),分别金 - 牛血清白蛋白 - 若丹明。包括一个亮场(BF)信道用于观察细胞的形状。对于其他显微镜系统和感染的条件下,设置有作相应的调整。
    注:使用相同的Ar激光作为高炉信道和信号的光源与光电倍增(PMT)检测器进行检测。
  3. 在指定的时间点PI,包含安装在显微镜舞台和影像记录受感染的细胞的8孔玻片。

图像7.分析

  1. 采用显微图像分析软件(见沙门氏菌分析内溶酶体系统的重塑。通过点击“打开”,然后选择文件打开数据。
    注:另外,开源软件如ImageJ的或FIJI可用于定量图像分析。
  2. 在图标上超越视图中点击工具栏上的物体图标以添加新的表面项目。点击图标 (下一个)。
  3. 为了分析的感兴趣区域(ROI)的区域,选择一个细分的投资回报率。在一个可视面积,覆盖在图像矩形边框部分代表的投资回报率。在相应的X轴输入值,y-和z-域,或者直接点击箭头在预览矩形来修改大小和ROI的位置。然后点击图标 =“/文件/ ftp_upload / 52058 / 52058icon2.jpg”/>(下一个)。
  4. 作为源通道,选择频道3(信号金BSA-罗丹明NPS)。检查平滑选项来设置所得到的区域的平滑度。手动定义的值或接受自动生成的值。对于阈值,选择绝对强度的选项。
  5. 对于阈值的调整,选择手动选项,并设置一个值。在可视面积,表面门槛预览显示为灰色。
  6. 上的标签分类曲面所得表面可通过各种标准来过滤。默认过滤器是,和其他过滤器“体素> 10号”也可以包括通过点击“添加”。如果一个过滤是没有必要的,然后通过点击删除按钮删除所有过滤器。点击图标 (下一个)。
  7. 要完成表面创建,点击/files/ftp_upload/52058/52058icon3.jpg“/>(完成)。在对象列表,目前未检查的项目量和新创建面框显示在可视面积。
  8. 出口统计数据。现在,在超越视图根据其区域中物体的颜色变化从紫色到红色。和“情节数字区”表显示的统计信息( 身份证号码和对象的面积)。出口由点击Excel文件表面1所有统计图标 (保存)。

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Representative Results

通过完善的通过由柠檬酸和鞣酸减少氯金酸的方法生成的黄金纳米粒子。 如图2A所示 ,合成的金纳米粒是准球形的形状具有大约10nm的尺寸。 BSA的涂层和罗丹明-标记不影响它们的形态或尺寸( 图2B)。

已经报道了金纳米粒可容易地采取了由各种哺乳动物细胞和内吞系统7结束了。按照以前的作品,明亮的红色荧光信号,观察在HeLa细胞后1小时孵化与金BSA-罗丹明纳米粒( 图3,WT 5小时PI),说明纳米颗粒被细胞有效内部化。大多数红色信号被发现共定位与绿色信号,显示出纳米粒子被局限在后期内涵体和溶酶体。然而,与纳米颗粒在后期内涵体/溶酶体均匀分布在非感染的细胞( 图3,模拟),它们的位置在很大程度上重新排列在WT 沙门氏菌 -感染的细胞。在感染的早期阶段( 图3,WT 5小时PI), 沙门氏菌在SCV内复制和SIF经受快速伸展或收缩运动。在这个时间点,所述纳米颗粒的一小部分被发现在SCV和SIF,而另一个级分仍然位于自由晚期内涵体/溶酶体。在8小时的PI( 图3,WT 8小时圆周率)时,形成的SIF的一个稳定的网络,并且发现大多数纳米粒管状结构内积累,而只有一小部分仍位于自由晚期内涵体/溶酶体。突变菌株ΔSSAVΔSIFA表现明显的行为。 如图3(ΔSSAV)中,在8小时的圆周率,ΔSSAV被限制内的SCV同时没有SIF结构形成。一些纳米粒子,观察周围的鲑鱼埃在SCV内,但大多数的NP的仍然位于自由晚期内涵体/溶酶体。为ΔSIFA菌株( 图3中 ,ΔSIFA),逃逸沙门氏菌入细胞质发生,并观察到纳米粒子和细菌之间没有任何关联。

在我们以前的研究后发现,SIF显示高动态特性在感染的早期阶段(3 - 5小时PI),但成为稳定在后期(> 8小时PI)12。因此,我们想知道沙门氏菌感染的早期和晚期阶段是否有类似的能力,重新排列纳米颗粒细胞内的分布。 如图4,金纳米粒孵育HeLa细胞O / N感染之前,或在感染后的不同时间点(1 - 7小时PI)1小时,在所有情况下大部分的内在化纳米颗粒的观察中积累SCV或SIF。

微观observations表明感染沙门氏菌的结果在宿主细胞中的内溶酶体系统的大规模重排。作为下一个步骤中,我们所用的了Imaris软件包分析沙门氏菌诱导的宿主细胞的表型以定量方式。使用1感染的HeLa细胞的图像在8小时pi作为一个例子,一步一步的指令进行定量分析示于图5,通过对15的强度的阈值和“体素的数量> 10'滤波器,3D对象被提取的原始图像文件。这些对象被认为是细胞内的结构,其中金BSA-罗丹明纳米粒位于与。在这个例子中,67的对象提取总共用求和面积为1,974.64μm2以下。最大对象,这与SIF网络共定位,具有1,836.23微米2的面积,而其它的是小于50μm2。为了比较,一个例子示出了定量非感染的细胞的权威的分析结果中给出,这里,431对象提取总共,在其中区域的平均值为5μm2和最大对象具有34微米2的面积。对象的求和面积为2252μm2以下,这相当于图4中的受感染的细胞(1975微米2)。但是,对象的数目是比另一个(431和67的对象,分别),这表明囊泡与沙门氏菌诱导管状结构很大程度上融合大得多。

图1
图1.方案制备HeLa细胞的活细胞成像。将HeLa细胞接种在腔室玻片,模拟感染或感染各种沙门氏菌菌株进行30分钟,洗涤3次,用PBS,然后incubat版用含有100微克/毫升庆大霉素1小时介质。接着,将培养基换成含有成像介质为10nm金-牛血清白蛋白-若丹明纳米粒(OD 520 = 0.1)和10微克/毫升庆大霉素,温育1小时,然后追逐的NP的培养基用于实验的其余部分。在不同的时间点进行活细胞成像后感染(PI)。 请点击此处查看该图的放大版本。

图2
图胶体金纳米粒子的前2 TEM照片(a)和标签(B)后, 请点击此处查看该图的放大版本。

方法“> 图3
图3.改造的宿主细胞内溶酶体系统细胞内沙门氏菌 。HeLa细胞进行假感染,或感染了沙门氏菌WT,ΔSSAV或Δ 西法突变株和脉冲/追逐与10纳米的黄金BSA-罗丹明纳米粒( OD 520 = 0.1)中的作为图1中所描述进行。的CLSM的Z堆叠极大强度突起被示出。比例尺,10微米。 请点击此处查看该图的放大版本。

图4
图4.辅助内溶酶体系统在沙门氏菌感染的各个阶段。海拉细胞用10纳米的金-牛血清白蛋白-若丹明纳米粒(OD 520 = 0.1)O / N之前感染,或1小时,在不同的时间点PI所指示的。 9小时PI最大强度的激光共聚焦显微镜Z-堆栈的预测显示 - 8进行活细胞成像。比例尺,10微米。 请点击此处查看该图的放大版本。

图5
图5.一步一步指令通过了Imaris定量分析用感染的HeLa细胞的图像,在8小时pi作为一个例子。(A)通过点击“打开”,然后选择文件打开数据。 (B)在超越视图的对象的工具栏添加一个新的表面项目。 (C)为了分析投资回报率,然后选择一个细分的投资回报率。 (D)在相应的x输入值,y和z场或(E)直接点击箭头在预览矩形来修改大小和ROI的位置。在这个例子中,一个ROI没有需要与整个图像进行了分析。 (F)作为源通道选择通道3(金BSA-罗丹明纳米粒的信号)。检查平滑选项来设置所得到的区域的平滑度。手动定义的值或接受自动生成的值。这里,为0.1μm,使用。对于“门槛”选择“绝对强度”选项。 (G),对于该阈值调整选择手动选项,并设置一个值(在本实施例15中使用)。在可视面积的表面门槛预览显示为灰色。 (H),在标签“分类曲面'所得表面可通过各种标准来过滤。默认筛选器是“体素> 10号”。该过滤器可以通过输入新的值来调整和其它的过滤器可以被添加。在这个例子中,我们保留了过滤器“素数> 10”。 (I)完成表面创建,点击“完成”。在对象列表现在未检查的项目量和新创建面框显示在红色的可视面积。 (J)在超越视图的对象的颜色由紫色变化到红色,根据它们的面积。 (K)的“情节数字区”表显示的统计信息。出口统计到Excel文件。 请点击此处查看该图的放大版本。

图6
图6.定量分析的非感染的细胞的结果。( (B)新创建的表面。 (C)在超越视图中的新的表面。 ( 四)“情节的数字区”表显示的统计信息。 请点击此处查看该图的放大版本。

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Discussion

哺乳动物细胞内溶酶体系统控制重要的生理过程,包括营养吸收,激素介导的信号转导,免疫监视和抗原呈递17。到现在为止,各种标记已经用于内吞途径和跟踪研究的标记。例如,LysoTracker探针是由Molecular Probes公司(Life Technologies公司,美国)为溶酶体标记开发荧光acidotropic探针,其可以选择性地积聚在细胞区室与低内pH和有效地在纳摩尔浓度18标记的活细胞。然而,LysoTracker探针细胞的很长一段时间潜伏期可能诱发增加溶酶体pH值并导致溶酶体19的潜在的生理变化。一些大的生物分子,如荧光团标记的葡聚糖,也经常被用于核内体/溶酶体标记。然而,低耐光,短循环寿命,和对固定在OOR滞留阻碍其应用在长期活细胞成像及相关研究显微镜16,19。这里,金 - 牛血清白蛋白 - 若丹明纳米粒被用作流体示踪剂标记的宿主细胞内溶酶体系统。摄取高效率和强大的细胞内的荧光信号进行观察。纳米颗粒与溶酶体糖蛋白LAMP1,这是高度富集于晚期内涵体/溶酶体膜上的几乎完全的共定位,由纳米颗粒证实了内溶酶体系统的正确标签。结合使用的荧光纳米颗粒与其他标记物如Lysotracker可能提供有关宿主细胞囊泡运输和成熟的补充信息。

值得一提的是纳米颗粒的细胞内化是高度依赖于它们的物理尺寸和化学成分。我们已经测试了金 - 牛血清白蛋白 - 若丹明纳米粒具有的尺寸为5纳米,10纳米,15纳米和30纳米,和类似的细胞内分布侧HeLa细胞进行观察(结果未示出)。我们使用的HeLa细胞作为方便的细胞系沙门氏菌感染的研究。然而,金 - 牛血清白蛋白 - 若丹明纳米粒也可以容易地通过各种其他细胞系中内化和初级细胞是适合。例如,我们观察到沙门氏菌诱导管状结构和标签由NP在CHO,COS-7,CACO2,或3T3细胞,以及在干扰素γ刺激的RAW264.7巨噬细胞样细胞系的细胞或原代鼠巨噬细胞和树突状细胞。然而,每个细胞系都需要调整感染和脉冲/追逐协议。

据报道,染料截留二氧化硅纳米粒可以用作生物相容的,长寿命的,并且高度耐光溶酶体标记物19,并且我们也比较了罗丹明掺杂的二氧化硅纳米颗粒具有不同大小的行为(30 - 1000纳米)。通过在S中未感染细胞的纳米粒和积累二氧化硅纳米粒正确标签晚期内涵体/溶酶体CV和SIF 沙门氏菌 -感染细胞进行了观察。然而,由于纳米颗粒或单纳米颗粒的二氧化硅的大尺寸,连同沙门氏菌诱导管状结构分布纳米粒的聚集体的形成是不统一的(数据未示出)。

SCV的以及SIF一个特征是高度丰富溶酶体糖蛋白如LAMP1 12的存在。这里,一个HeLa细胞稳定表达LAMP1-GFP被用于的内溶酶体系统和活细胞成像的方便在SCV和SIF结构。 沙门氏菌株组成性表达增强的GFP被用来在感染实验来指示细菌的位置。由于细胞内细菌的均一尺寸和形状,在一般的细菌的GFP荧光是从内溶酶体膜的绿色荧光蛋白标签容易区分。然而,对于将来的实验,其中的荧光信号来自细菌和膜PRoteins需要精确地分化,其他荧光融合蛋白, 例如,mTurquoise,建议将被集成。然而,这将导致额外的几轮照明和图像采集的,轴承的高光损伤在活细胞实验中的风险。

要找出必需基因和机制细菌病原体操纵宿主细胞的途径,无数的突变体需要创建和他们的表演需要仔细比较。例如, 沙门氏菌突变株ΔSSAVΔSIFA是高度减毒的全身毒性和细胞内复制20,21。ΔSSAVΔSIFA菌株不能诱导SIF,并且另外ΔSIFA沙门氏菌感染12的过程中失去了SCV膜。比较WT的表型和突变株是有助于了解沙门氏菌到R的能力emodel宿主细胞囊泡运输。基于显微镜检查,很明显,WT 沙门氏菌颠覆宿主细胞内吞途径的高得多的程度相比,ΔSSAVΔSIFA突变株。该功能可以使细胞内的沙门氏菌 ,以获得更多的营养物质为他们的生存细胞和复制。

共焦显微镜的图像清楚地表明宿主细胞内溶酶体系统的重塑由细胞内细菌。然而,需要精确的比较图像的定量分析。在这里所描述的方法中,了Imaris软件用于提取具有在通道3> 15荧光强度和体素> 10.这些对象被认为是含有金BSA的罗丹明纳米粒细胞内的膜结构的数量的3D对象。荧光强度阈值,并且滤波器可以根据图像的质量来定义,但建议立即进行删除ð保持恒定,用于比较不同条件或菌株。这里示出的是一个非感染的细胞和野生型沙门氏菌 -感染细胞在8小时pi,其萃取,分别431和67的对象的例子。尽管明显的差异,这是不理性的,比较的对象的唯一的号码,由于细胞的大小是不一样的。一种解决方案是归一化的对象到求和区域的数量(在这个例子中,2252微米2和1,975微米2,分别地)或在细胞内的对象的荧光强度之和。或者,它也有可能以纳米颗粒的分布,在感染的不同阶段比较跟踪感染前一个单元,并在不同的时间点PI。

总之,在该方法中金的BSA-罗丹明纳米粒施加标记的真核细胞的内溶酶体系统。主机蜂窝内溶酶体系统由一个intracellula操纵ř病原体下观察活细胞CLSM分析和定量分析的结果表明晚期内涵体的极端重排/溶酶体由WT 沙门氏菌沙门氏菌被用作模型病原体在这项研究中,但其他的细菌病原体,如志贺氏菌李斯特菌的细胞内行为也可以使用这种方法的影响。原则上,金 - 牛血清白蛋白 - 若丹明纳米粒可通过大量的各种细胞系中内化,因此是有希望的研究中调查的内吞途径具有发散内源或外源物质的相互作用被广泛采用。

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Materials

Name Company Catalog Number Comments
Gold chloride Sigma-Aldrich 520918
Tannic acid Sigma-Aldrich 403040
Tri-sodium citrate Sigma C8532
Bovine serum albumin Sigma A2153
NHS-Rhodamine Pierce 46406
DMSO Sigma D8418
HEPES Sigma H3375
Gentamicin Applichem A1492
Kanamcyin Roth T832
Carbenicillin Roth 6344
8-well chamber slides Ibidi 80826 tissue culture treated, sterile
Imaris Software Bitplane version 7.6 various configurations available

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References

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