Application de nanoparticules fluorescentes pour étudier Rénovation du système Endo-lysosomale par des bactéries intracellulaires

Immunology and Infection

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Summary

Cet article décrit les méthodes pour la synthèse et le marquage fluorescent de nanoparticules (NP). Les IP ont été appliquées dans des expériences pulse-chase d'étiqueter le système endo-lysosomale des cellules eucaryotes. La manipulation du système d'endo-lysosomal par les activités de l'agent pathogène intracellulaire Salmonella enterica ont été suivis par imagerie des cellules vivantes et quantifiée.

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Zhang, Y., Krieger, V., Hensel, M. Application of Fluorescent Nanoparticles to Study Remodeling of the Endo-lysosomal System by Intracellular Bacteria. J. Vis. Exp. (95), e52058, doi:10.3791/52058 (2015).

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Abstract

Nanoparticules fluorescentes (IP) avec des propriétés optiques et mécaniques et chimiques souhaitables, sont des outils prometteurs pour étiqueter organites intracellulaires. Ici, nous introduisons une méthode utilisant or-BSA-rhodamine IP d'étiqueter le système de cellules eucaryotes endo-lysosomale et surveiller manipulations des voies cellulaires de l'hôte par le pathogène intracellulaire Salmonella enterica. Les IP ont été facilement internalisées par les cellules HeLa et localisées à la fin des endosomes / lysosomes. Infection à Salmonella réarrangement des vésicules et l'accumulation des IP dans les structures membranaires Salmonelle induites induit. Nous avons déployé le progiciel Imaris pour des analyses quantitatives des images de microscopie confocale. Le nombre d'objets et de leur distribution de taille dans les cellules non infectées étaient distinctes de celles dans les cellules infectées par Salmonella, indique une très remodelage du système endo-lysosomale par WT Salmonella.

Introduction

Nanoparticules fluorescentes (IP), y compris IP métalliques, points quantiques, IP, IP polymères de silice, des points de carbone, etc., ont attiré une attention considérable au cours des dernières décennies 1,2. Par rapport à des colorants organiques traditionnels, les IP fluorescents montrent chimiques, des propriétés optiques et mécaniques souhaitables, telles que la résistance forte du signal, la résistance au photoblanchiment et haut de 3,4 biocompatibilité. Ces avantages en font la méthode de choix pour la détection intracellulaire et imagerie des cellules vivantes. En outre, une variété de IP denses aux électrons sont visibles en microscopie électronique (EM), ce qui facilite leur utilisation pour l'analyse microscopique corrélée, qui permet combinaison de suivi en microscopie optique (LM) et une résolution supérieure au niveau ultrastructural avec EM 5 cellules vivantes. Par exemple, les IP or ont été longtemps utilisé efficacement comme biocapteurs pour le diagnostic dans les cellules sensibles vie ainsi que dans le domaine de l'immuno-marquage 6. S récentses études indiquent que les IP or avec la taille et de forme différentes peuvent être facilement absorption par une grande variété de lignées de cellules et de transporter régulièrement par la voie endosomale, ont donc grand potentiel étant appliquée pour le suivi du transport des vésicules intracellulaires et l'étiquetage du système endo-lysosomale 7,8 .

Les pathogènes microbiens, tels que Salmonella enterica, Shigella flexneri et Listeria monocytogenes, ont développé des mécanismes différents pour envahir les cellules hôtes non-phagocytaires neuf. Après avoir été intériorisé, les agents pathogènes, soit localisées dans le cytosol ou séquestrés dans les compartiments membranaires, interagissent beaucoup avec leur environnement d'accueil et les moduler pour favoriser leur propre survie 10. Par exemple, Salmonella enterica réside et se multiplie dans un phagosome intracellulaire appelé la vacuole contenant Salmonella (SCV) lors de l'infection 11. Le SCV maturationtrafics vers l'appareil de Golgi, subissant interactions continues avec la voie d'endocytose, et induit la formation de vastes structures tubulaires, tels que Salmonella filaments induites (SIF), le tri tubules nexine, Salmonella induite porteuses de sécrétion des protéines de la membrane 3 (SCAMP3) tubules, etc. . 12-14. Étudier comment ces agents pathogènes bactériens manipuler voies cellule hôte est essentielle pour comprendre les maladies infectieuses.

Ici, NP or-BSA-rhodamine ont été utilisés comme marqueurs de fluide pour marquer le système endo-lysosomal cellulaire hôte et l'agent pathogène gastro-intestinal Salmonella enterica sérovar Typhimurium humain (Salmonella) a été utilisé comme une bactérie modèle pour étudier les interactions de l'agent pathogène avec le accueillir voie d'endocytose. Intracellulaires IP or BSA-rhodamine dans les cellules et les cellules non infectées infectés par Salmonella WT ou souches mutantes ont été imagées par un microscope confocal à balayage laser (CLSM).Puis logiciels Imaris a été utilisée pour quantifier la distribution des IP, ce qui indique que l'infection à Salmonella induit extrême réarrangement des endosomes / lysosomes. Après la description de cette méthode, des expériences analogues peuvent être conçus pour suivre devenir à long terme des IP intériorisés et d'étudier l'influence de diverses substances exogènes ou facteurs endogènes sur la voie d'endocytose des cellules eucaryotes.

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Protocol

1. Synthèse de 10 nm nanoparticules d'or (Gold IP) 15

  1. Préparer la solution A: ajouter 2 ml aqueuse à 1% de chlorure d'or dans 160 ml Milli-Q, ou double distillée, eau.
  2. Préparer la solution B: ajouter 8 ml 1% de tri-citrate de sodium x 2 H 2 O et l'acide tannique 160 pi de 1% dans 32 ml Milli-Q, ou double distillée, eau.
  3. Réchauffer la solution A et B à 60 ° C et les mélanger en remuant. Observez immédiatement une couleur bleu foncé. Observez la couleur rouge après environ 15 min. Ensuite, la chaleur jusqu'à 95 ° C, 5 min et maintenir la solution refroidir à température ambiante.
  4. Ajouter une goutte de la suspension sur une grille NP revêtu de carbone et laisser sécher à l'air. Vérifier la taille et la morphologie des IP par microscopie électronique à transmission.

2. couche d'or IP avec de la BSA et d'étiquetage avec la rhodamine N-hydroxysuccinimidyle Ester (NHS) 16

  1. Ajouter 900 pi IP or dans un tube Eppendorf de 1,5 ml, centrifuger à 15 000 g pendant 30 min. Opnellement, préparer tubes multiples peuvent à la fois.
  2. Jeter le surnageant, remettre en suspension le culot dans 900 pi d'eau stérilisée Milli-Q et ajouter 100 pi 2 mg / ml de BSA / PBS, mélanger au vortex à 800 tours par minute pendant 30 min.
  3. Pour enlever l'excès de BSA, centrifuger la préparation à 15 000 g pendant 60 min.
  4. Jeter le surnageant et remettre en suspension les IP or BSA dans 125 pi de PBS, ajouter 12,5 pi de 1 M bicarbonate.
  5. Immédiatement avant utilisation, préparer une solution à 10 mg / ml de rhodamine NHS / DMSO, ajouter 30 ul de solution rhodamine / DMSO NHS à 1 ml de la suspension or BSA IP. Incuber le mélange réactionnel pendant 2 heures (ou O / N) à la température ambiante pendant 800 tours par minute de mélange, en évitant l'exposition à la lumière.
  6. Purifier les IP d'or-BSA-rhodamine par dialyse contre PBS à 4 ° C avec 5 changements de tampon sur la période de 36 à 48 h.
  7. Pour stabiliser les IP, ajouter 10 ul de 200 mg / ml de BSA / PBS dans chacun 1 ml IP or BSA-rhodamine. Pour supprimer la centrifugeuse libre ou libéré BSA-rhodamine, à 15,000 xg pendant 60 min. Reprendre le culot dans 2 mg / ml de BSA / PBS, mesurer 520 OD, et conserver à 4 ° C, évitant l'exposition à la lumière.
  8. Diluer les IP 10 fois avec Milli-Q ou de l'eau doublement distillée, ajouter une goutte sur une grille recouverte de carbone, et laisser sécher à l'air. Vérifier la taille et la morphologie des IP par microscopie électronique à transmission (MET).
    NOTE: Tous les matériaux utilisés pour la préparation NP ont été stérilisés et l'opération a été réalisée dans une hotte de culture cellulaire ou sur un banc à côté d'une flamme.

3. Culture de cellules HeLa

  1. Des cellules HeLa exprimant de façon permanente LAMP1-GFP sont cultivées dans du DMEM avec 10% de sérum de veau foetal (FCS) et cultivées à 37 ° C dans une atmosphère contenant 5% de CO 2.
  2. Ensemencer les cellules à une densité de 50 000 par puits dans une chambre diapositive 8 de puits (Ibidi) et incuber O / N.

4. culture de bactéries

  1. Utilisez Salmonella enterica sérotype Typhimurium NCTC 12023 wilD-Type (WT) souche. A titre de comparaison, utiliser des souches mutantes Δ ssaV défectueux dans le SPI2-SST3 et Δ SIFA manquant effecteur clé SIFA pour SIF. Utilisez les souches portant le plasmide pFPV25.1 pour l'expression constitutive de la GFP améliorée.
    REMARQUE: Les souches bactériennes sont cultivées en routine dans du bouillon de Luria-Bertani (LB) avec addition de 50 ug / ml de carbénicilline (WT) et LB avec addition de 50 ug / ml de carbénicilline et / ou 50 pg / ml de kanamycine (ssa V Δ, Δ SIFA ) nécessaire au maintien de plasmides.
  2. Inoculer une seule colonie de bactéries dans 3 ml de LB avec les antibiotiques appropriés et grandir O / N à 37 ° C dans des conditions secousse pour l'aération, puis diluer 01h31 dans LB frais et continuer la croissance pendant 3,5 heures. A ce moment-là, les cultures atteignent la phase logarithmique tardive et les bactéries sont très envahissantes. A 'rouleau tambour »est pratique pour incuber des cultures de tube à essai avec l'aération.

5. L'infection des cellules HeLa parSalmonella et Gold-BSA-rhodamine IP Pulse Chase-étiquetage (voir la figure 1 pour le régime)

  1. Mesurer la DO 600 de la bactérie de la sous-culture et diluer à DO600 = 0,2 dans 1 ml de PBS (~ 3 x 10 8 ufc / ml), ajouter des quantités appropriées de bactéries à des cellules HeLa dans des lames à chambres 8 puits pour parvenir à une multiplicité de infection (MOI) de 100.
  2. Incuber pendant 30 min dans l'incubateur de cellules, laver 3 fois avec du PBS pour éliminer les bactéries non-internalisés (ce point de temps a été défini comme post-infection 0 h, ou 0 h pi). Ajouter 300 ul de milieu de culture frais contenant 100 ug / ml de gentamicine et maintenir pendant 1 heure. Remplacer ensuite le milieu par du milieu frais contenant 10 ug / ml de gentamicine pendant le reste du temps d'incubation.
  3. Après incubation avec le milieu de culture contenant 100 ug / ml de gentamicine pendant 1 h, le milieu est remplacé par imagerie milieu (Eagles MEM sans FCS, de L-glutamine, le phénol rouge et bicarbonate de sodium, avec 30 mM de HEPES, pH 7,4) containing 10 ug / ml de gentamicine. NP or-rhodamine-BSA sont ajoutés à des cellules HeLa pour obtenir une concentration finale de OD 520 = 0,1.
    REMARQUE: NP-BSA-or rhodamine peut également être ajouté aux cellules avant l'infection, ou à divers points de temps pi
  4. Après 1 h d'incubation, éliminer le milieu, laver trois fois avec du PBS, et ajouter 300 ul de milieu de formation d'image fraîche contenant 10% de FCS et 10 ug / ml de gentamicine pendant le reste du temps d'incubation.
    NOTE: Durée d'incubation peut varier en fonction de la concentration des IP et des lignées cellulaires utilisées. Pour les macrophages RAW264.7, nous avons observé que 30 minutes d'incubation avec des IP à une concentration de OD 520 = 0,05 permis internalisation suffisante.

6. Imaging

  1. Utilisation d'un système d'imagerie confocale, tel qu'un laser à balayage confocal (CLSM) ou disque de filage (SD) microscope avec une chambre à environnement humidifié pour imagerie à haute résolution à différents points de temps.
  2. Allumez la température control système et attendez jusqu'à ce qu'il soit stable. Optimiser les paramètres d'imagerie telles que l'agrandissement, la vitesse de numérisation, résolution, Z-pile, etc. Utiliser les paramètres d'excitation / émission appropriées pour la GFP et IP or BSA-rhodamine. Pour ce protocole, utiliser un 400 Hz vitesse de numérisation, résolution de 512 x 512 pixels et la taille Z-étape de 0,25 um. Exciter et GFP-BSA-or rhodamine utilisant un laser Ar (488 nm) et un laser HeNe (543 nm), respectivement. Inclure un (BF) canal lumineux sur le terrain pour observer la forme des cellules. Pour les autres systèmes de microscopie et des conditions d'infection, le réglage doivent être ajustées en conséquence.
    REMARQUE: Utilisez le même laser Ar comme la source de canal de BF et signal lumineux a été détectée avec un détecteur photomultiplicateur (PMT).
  3. Au temps indiqué points pi, monter les diapositives de la chambre 8 puits contenant les cellules infectées sur la platine du microscope et enregistrer des images.

7. Analyse des Images

  1. Utilisez la microscopie logiciel d'analyse d'image (voir Salmonella intracellulaire. Ouvrez les données en cliquant sur 'Ouvrir' et en choisissant le fichier.
    NOTE: Vous pouvez également ouvrir les paquets de logiciels libres tels que ImageJ ou FIDJI peuvent être utilisés pour l'image des analyses quantitatives.
  2. Dans la barre d'outils des objets du clic Surpass vue sur l'icône Icône pour ajouter un nouvel élément de surface. Cliquez sur Icône (Suivant).
  3. Pour analyser une région d'intérêt (ROI), sélectionnez le segment un retour sur investissement. Dans une zone de visualisation, une section de rectangle bordé superposée sur l'image représente le retour sur investissement. Entrez les valeurs dans la direction x correspondant, y et champs Z-, ou cliquez directement sur les flèches dans le rectangle d'aperçu de modifier la taille et la position de la ROI. Puis cliquez sur Icône = "/ Files / ftp_upload / 52058 / 52058icon2.jpg" /> (Suivant).
  4. Comme un canal source, sélectionnez le canal 3 (signal pour l'or-BSA-rhodamine IP). Cochez l'option lisse de mettre en place la douceur de la zone résultant. Définir une valeur manuellement ou accepter la valeur générée automatiquement. Pour Seuil, sélectionnez l'option absolue de l'intensité.
  5. Pour le réglage de seuil, sélectionnez l'option manuelle et définir une valeur. Dans la zone de visualisation, un aperçu de seuil de surface se affiche en gris.
  6. Dans l'onglet Classer Surfaces la surface résultante peut être filtrée par divers critères. Un filtre par défaut est «nombre de voxels> 10 ', et d'autres filtres peuvent également être inclus en cliquant sur' Ajouter '. Si un filtrage ne est pas nécessaire, puis supprimez tous les filtres en cliquant sur le bouton Supprimer. Cliquez Icône (Suivant).
  7. Pour terminer la création de surface, cliquez sur/files/ftp_upload/52058/52058icon3.jpg "/> (Terminer). Dans la liste d'objets, maintenant décochez la case pour le volume et la nouvelle surface créée élément se affiche dans la zone de visualisation.
  8. Exporter les statistiques. Maintenant, dans la vue Surpass la couleur des sujets varient du violet au rouge en fonction de leur région. Et la table 'Numéros de courbe de surface' affiche les informations (par exemple, numéro d'identification et la zone d'objets) des statistiques. Export de toutes les statistiques de surface 1 à un fichier Excel par clic Icône (Save).

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Representative Results

IP or ont été générés par une méthode bien établie par la réduction de l'acide chloroaurique par le citrate et l'acide tannique. Comme le montre la Figure 2A, les PN synthétisés or étaient quasi-sphérique avec une taille d'environ 10 nm. BSA-revêtement et de la rhodamine-étiquetage ne ​​ont pas d'influence sur la morphologie ou la taille (figure 2B).

Il a été rapporté que les IP or peuvent être facilement absorbés par diverses cellules de mammifères et a fini dans les systèmes d'endocytose 7. Conformément aux travaux antérieurs, les signaux de fluorescence rouge vif ont été observés dans les cellules HeLa après 1 h d'incubation avec les IP-BSA-or rhodamine (Figure 3, WT 5 h pi), ce qui indique une internalisation efficace de PN par les cellules. La plupart des signaux rouges ont été trouvés colocalisés avec des signaux verts, montrant que les IP ont été confinés dans des endosomes tardifs ou lysosomes. Cependant, contrairement à une distribution uniforme des IP dans endosomes tardifs / lysosomesdans les cellules non infectées (Figure 3, maquette), leurs emplacements ont été largement réorganisés dans les cellules infectées par le WT Salmonella. Dans la phase précoce de l'infection (Figure 3, WT 5 h pi), Salmonella reproduit dans le SCV et SIF subir l'extension rapide ou mouvement de contraction. A ce point de temps, une fraction des IP a été trouvée dans SCV et SIF, tandis qu'une autre fraction est toujours situé à la fin des endosomes / lysosomes gratuits. À 8 h pi (Figure 3, WT 8 h pi), un réseau stabilisée de SIF a été formé, et la plupart des IP ont été trouvés accumulée dans les structures tubulaires, tandis que seulement une très petite partie est restée situé dans endosomes tardifs / lysosomes gratuits. Les souches mutantes Δ et Δ ssaV SIFA exposées comportements distincts. Comme le montre la figure 3 (ssa V Δ), à 8 h pi, Δ ssa V a été confiné à l'intérieur du distributeur auxiliaire tandis que aucune structure de SIF ont été formés. Certains IP ont été observés Salmon environnanteella l'intérieur de la SCV, mais la majorité des IP sont toujours situés dans endosomes tardifs / lysosomes gratuits. Pour la souche Δ SIFA (Figure 3, Δ SIFA), fuite de Salmonella dans le cytoplasme se est produite, et aucune association entre les IP et les bactéries a été observée.

Dans notre étude précédente, il a été constaté que l'affichage SIF propriétés hautement dynamiques dans la phase précoce de l'infection (3-5 h pi), mais se est stabilisée dans la dernière période (> 8 h pi) 12. Par conséquent, nous nous demandons si Salmonella dans les phases précoces et tardives de l'infection ont la capacité comparable à réorganiser la distribution des IP intracellulaires. Comme le montre la Figure 4, les IP or ont été incubées avec des cellules HeLa O / N avant l'infection, ou à différents points de temps après l'infection (1-7 pi h) pendant 1 heure, dans tous les cas, la plupart des internalisés IP ont été observés dans cumulées SCV ou SIF.

Observ microscopiqueations révélé que l'infection par Salmonella dans les résultats réarrangement massive du système de cellules hôtes endo-lysosomale. Dans une prochaine étape, nous avons utilisé le logiciel Imaris d'analyser les phénotypes de la cellule hôte Salmonella de manière quantitative. Utilisation de l'image d'une cellule HeLa infectées à 8 h pi, par exemple, une instruction étape par étape pour l'analyse quantitative est représenté sur la figure 5. Grâce à un seuil d'intensité de 15 et un 'certain nombre de voxels> 10' filtre, 3D les objets ont été extraits à partir du fichier d'image d'origine. Les objets étaient censés être des structures intracellulaires dans lequel l'or-BSA-rhodamine IP situé à. Dans cet exemple, 67 objets ont été extraits au total, avec une zone résumé que 1,974.64 2 um. Le plus grand objet, qui colocalisé avec le réseau SIF, a une superficie de 1,836.23 um 2, tandis que les autres sont plus petits que 50 um 2. A titre de comparaison, un exemple montrant le quantlitatifs résultat d'analyse d'une cellule non infectée a été donnée. Ici, 431 objets ont été extraits au total, dans lequel la valeur moyenne de la zone 2 est 5 um et le plus grand objet a une superficie de 34 pm 2. La zone résumé des objets est 2,252 um 2, qui est comparable à la cellule infectée sur la figure 4 (1975 pm2). Cependant, le nombre d'objets est beaucoup plus grande que l'autre (431 et 67 objets, respectivement), ce qui indique large mesure fusion des vésicules avec les structures tubulaires induites par Salmonella.

Figure 1
Figure 1. Schéma pour la préparation de cellules HeLa pour l'imagerie de cellules vivantes. Cellules HeLa ont été ensemencées dans des diapositives de chambre, maquette infectés ou infectés par différentes souches de Salmonella pour 30 min, lavé trois fois avec du PBS, puis Incubat ed avec un milieu contenant 100 ug / ml de gentamicine pendant 1 heure. Par la suite, le milieu a été remplacé par imagerie milieu contenant 10 nm des IP or BSA-rhodamine (DO 520 = 0,1) et 10 ug / ml de gentamicine, incubées pendant 1 heure, puis poursuivi par support NP-libre pour le reste de l'expérience . Imagerie des cellules vivantes a été réalisée à différents moments après l'infection (pi). Se il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Figure 2
Figure 2. images TEM de colloïdales IP or avant (a) et après marquage (b). Se il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

moyens "> Figure 3
Figure 3. Rénovation de l'hôte système d'endo-lysosomale cellulaire par les cellules Salmonella. HeLa intracellulaires étaient faussement infectées ou infectées par la bactérie Salmonella WT, Δ ou Δ ssaV SIFA souches mutantes et impulsions / chasse avec 10 nm IP or BSA-rhodamine ( DO 520 = 0,1) a été réalisée comme décrit sur ​​la figure 1. projections d'intensité maximale de CLSM Z-piles sont affichés. Barres d'échelle, 10 um. Se il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Figure 4
Figure 4. Accessibilité du système endo-lysosomale à diverses phases de l'infection à Salmonella. HeLales cellules ont été puisées avec 10 nm d'or NP-BSA-rhodamine (DO 520 = 0,1) O / N avant l'infection, ou pendant 1 heure à divers points de temps pi comme indiqué. Imagerie des cellules vivantes a été réalisée à 8-9 h pi projections d'intensité maximale de CLSM Z-piles sont indiqués. Barres d'échelle, 10 um. Se il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Figure 5
Figure 5. instructions étape par étape pour l'analyse quantitative par Imaris utilisant une image d'une cellule HeLa infectées à 8 h pi comme un exemple. (A) Ouvrez les données en cliquant sur ​​'Ouvrir' et en choisissant le fichier. (B) Dans la barre d'outils des objets de la vue Surpass ajouter un nouvel élément de surface. (C) Pour analyser un ROI, puis sélectionnez le segment un retour sur investissement. (D) Entrez les valeurs dans la direction x correspondant, y et z-champs ou (E) cliquer directement sur ​​les flèches dans le rectangle d'aperçu de modifier la taille et la position de la ROI. Dans cet exemple, un retour sur investissement n'a pas besoin et l'ensemble de l'image a été analysée. (F) Comme un canal source sélectionner le (signal or BSA-rhodamine IP) Channel 3. Cochez l'option lisse de mettre en place la douceur de la zone résultant. Définir une valeur manuellement ou accepter la valeur générée automatiquement. Ici, on a utilisé 0,1 um. Pour «seuil» sélectionnez l'option 'intensité absolue'. (G) Pour l'ajustement de seuil sélectionner l'option manuelle et définir une valeur (dans cet exemple 15 a été utilisé). Dans la zone d'affichage d'un seuil aperçu de surface se affiche en gris. (H) sur l'onglet «Surfaces Classifier 'la surface résultante peut être filtrée par divers critères. Un filtre par défaut est «nombre de voxels> 10 '. Lefiltre peut être réglé en entrant une nouvelle valeur et d'autres filtres peuvent être ajoutés. Dans cet exemple, nous avons gardé le filtre «nombre de voxels> 10 '. (I) pour terminer la création de surface, cliquez sur "Terminer". Dans la liste d'objets désormais décochez la case pour le volume et la nouvelle surface créée élément se affiche dans la zone d'affichage en rouge. (J) De l'avis Surpass la couleur des sujets varient du violet au rouge en fonction de leur région. (K) Le «Numéros de Surface 'tableau montre les informations statistiques. Les statistiques d'exportation vers un fichier Excel. Se il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Figure 6
Figure 6. résultat de l'analyse quantitative d'une cellule non infectée. ( (B) La nouvelle surface créée. (C) La nouvelle surface dans la vue surpasser. (D) Le «Numéros de Surface 'tableau montre les informations statistiques. Se il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

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Discussion

Le système endo-lysosomal de cellules de mammifère contrôle les processus physiologiques importants, y compris l'absorption des nutriments, l'hormone de la transduction du signal à médiation par, la surveillance immunitaire et la présentation de l'antigène 17. Jusqu'à présent, divers marqueurs ont été utilisés pour le marquage des études de la voie d'endocytose et de suivi. Par exemple, les sondes sont des sondes d'Lysotracker acidotropic fluorescents mis au point par Molecular Probes (Life Technologies, Etats-Unis) pour le marquage de lysosome, ce qui peut se accumuler de manière sélective dans des compartiments cellulaires à faible pH interne et efficacement étiqueter des cellules vivantes à des concentrations nanomolaires 18. Cependant, à long temps d'incubation des cellules avec des sondes Lysotracker peut induire une augmentation du pH lysosomal et conduire à des changements physiologiques potentiels des lysosomes 19. Certaines grandes biomolécules, comme dextranes fluorophores marqué, sont également fréquemment utilisés pour endosome / étiquetage des lysosomes. Cependant, à faible photostabilité, la vie court circulation, et prétention de plancher lors de la fixation entraver leurs applications dans l'imagerie des cellules vivantes à long terme et étudie microscope corrélative 16,19. Ici, IP or BSA-rhodamine ont été utilisés comme traceurs liquides pour étiqueter le système endo-lysosomale cellulaire hôte. L'efficacité d'absorption haut et fort des signaux de fluorescence intracellulaires ont été observés. La colocalisation presque complète des IP avec lysosomale LAMP1 glycoprotéine, qui est fortement enrichie sur la membrane des endosomes tardifs / lysosomes, vérifiée étiquetage adéquat du système endo-lysosomale par le NPS. Combinant l'utilisation des IP fluorescentes avec les autres marqueurs tels que Lysotracker peut fournir des informations complémentaires à propos de cellule hôte trafic vésiculaire et la maturation.

Il est intéressant de mentionner que l'internalisation cellulaire de IP est fortement tributaires de leurs dimensions physiques et des composants chimiques. Nous avons testé NP-BSA-or rhodamine avec une taille de 5 nm, 10 nm, 15 nm et 30 nm, et la distribution intracellulaire similaireDes cellules HeLa ont été observés latérales (résultats non montrés). Nous avons utilisé des cellules HeLa que lignée cellulaire pratique pour des études d'infection à Salmonella. Cependant, les IP d'or-BSA-rhodamine peuvent aussi être facilement internalisées par plusieurs autres lignées cellulaires et les cellules primaires sont justiciables. Par exemple, nous avons observé Salmonella induite par des structures tubulaires et l'étiquetage de NP dans des cellules CHO, COS-7, CaCo2, ou des cellules 3T3, ainsi que dans des cellules d'interféron-γ stimulée par RAW264.7 macrophage lignées cellulaires ou de macrophages murins primaires et cellules dendritiques. Cependant, chaque lignée cellulaire sera nécessiter un ajustement de l'infection et les protocoles impulsion / Chase.

Il a été rapporté que les IP de silice colorant piégé peuvent être utilisés comme une biocompatible, longue durée de vie, et hautement photostable lysosome marqueur 19, et nous avons également comparé le comportement des IP de silice rhodamine dopé de taille variable (30 - 1000 nm). Étiquetage approprié des endosomes tardifs / lysosomes par silice IP dans les cellules et l'accumulation non infectés des IP en SCV et SIF dans les cellules de Salmonella de a été observée. Toutefois, en raison de la formation d'agrégats de IP ou la grande taille des IP de silice simples, la distribution des IP ainsi que des structures tubulaires induites par Salmonella ne était pas uniforme (données non présentées).

Un trait caractéristique de SCV, ainsi que SIF est la présence de glycoprotéines lysosomales hautement abondantes telles que LAMP1 12. Ici, une lignée de cellules HeLa exprimant de manière stable LAMP1-GFP a été utilisée pour la commodité de l'imagerie des cellules vivantes du système endo-lysosomal et les SCV et SIF structures. Souches de Salmonella qui expriment constitutivement la GFP améliorée ont été utilisés dans les expériences d'infection pour indiquer l'emplacement de bactéries . En raison de la taille et de forme des bactéries intracellulaires, la fluorescence de la GFP bactérienne est en général facile à distinguer de l'étiquette de la GFP sur des membranes d'endo-lysosomal. Cependant, pour de futures expériences dans laquelle fluorescente signal provenant de bactéries et de la membrane proteins doivent être précisément différencier, d'autres protéines de fusion fluorescente, par exemple, mTurquoise, sont recommandés pour être intégré. Ceci, cependant, les résultats dans les tours supplémentaires d'éclairage et d'acquisition d'image, portant le risque de plus photo-dommages dans des expériences de cellules vivantes.

Pour en savoir gènes et des mécanismes essentiels pour les bactéries pathogènes de manipuler les voies de la cellule hôte, de nombreux mutants doivent être créés et leurs performances doivent être comparés avec soin. Par exemple, Salmonella souches mutantes Δ et Δ ssaV SIFA sont fortement atténuées dans la virulence et la réplication intracellulaire systémique 20,21. Les deux souches Δ et Δ ssaV Sifa ne parviennent pas à induire des SIF, et en outre Δ SIFA Salmonella perdent la membrane SCV au cours de l'infection 12. En comparant les phénotypes de souches mutantes WT et contribue à la compréhension de la capacité des salmonelles à remodel cellule hôte du trafic vésiculaire. Sur la base de l'examen microscopique, il est évident que Salmonella WT renverser hôtes voies d'endocytose cellulaire à un degré beaucoup plus élevé par rapport à Δ et Δ ssaV SIFA souches mutantes. Cette fonction pourrait permettre Salmonella intracellulaire pour obtenir plus de nutriments pour leur survie intracellulaire et la réplication.

Images de microscopie confocale montrent clairement le remodelage du système hôte endo-lysosomale cellulaire par des bactéries intracellulaires. Cependant, l'analyse quantitative des images est requis pour comparaison précise. Dans la méthode décrite ici, logiciels Imaris est utilisé pour extraire des objets 3D qui ont l'intensité de fluorescence dans le canal 3> 15 et le nombre de voxels> 10. Ces objets sont censés être des structures membranaires intracellulaires contenant de l'or-BSA-rhodamine IP. Le seuil d'intensité et les filtres de fluorescence peuvent être définis en fonction de la qualité des images, mais shoulD être maintenue constante pour comparer différentes conditions ou des souches. Voici les exemples d'une cellule non infectée et une cellule infectée par Salmonella WT à 8 h pi, avec 431 et 67 objets extraits, respectivement. En dépit de la différence apparente, il ne est pas raisonnable de comparer uniquement le nombre des objets, étant donné que la taille des cellules ne sont pas les mêmes. Une solution consiste à normaliser le nombre des objets de la région de sommé (dans cet exemple, 2 252 pm et 1975 pm 2 2, respectivement) ou la somme des intensités de fluorescence des objets à l'intérieur des cellules. Alternativement, il est également possible de suivre une cellule avant l'infection et à différents points de temps pi afin de comparer la répartition des IP à différents stades de l'infection.

En conclusion, dans ce procédé NP-BSA-or rhodamine ont été appliqués à étiqueter le système endo-lysosomal des cellules eucaryotes. La manipulation du système endo-lysosomal hôte cellulaire par un intracellular pathogène a été observé par CLSM de cellules vivantes et les résultats d'analyse quantitative indiqué réarrangements extrêmes de endosomes tardifs / lysosomes par WT Salmonella. Salmonella a été utilisé comme un agent pathogène de modèle dans cette étude, mais le comportement intracellulaire d'autres bactéries pathogènes, tels que Shigella flexneri et Listeria monocytogenes pourrait également être étudiée en utilisant cette approche. En principe, l'or-BSA-rhodamine IP pourraient être internalisés par une grande variété de lignées cellulaires, sont donc prometteurs étant largement appliquée dans les études portant sur l'interaction de la voie d'endocytose avec des substances endogènes ou exogènes divergentes.

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Materials

Name Company Catalog Number Comments
Gold chloride Sigma-Aldrich 520918
Tannic acid Sigma-Aldrich 403040
Tri-sodium citrate Sigma C8532
Bovine serum albumin Sigma A2153
NHS-Rhodamine Pierce 46406
DMSO Sigma D8418
HEPES Sigma H3375
Gentamicin Applichem A1492
Kanamcyin Roth T832
Carbenicillin Roth 6344
8-well chamber slides Ibidi 80826 tissue culture treated, sterile
Imaris Software Bitplane version 7.6 various configurations available

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References

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