लाल आटा बीटल में लार्वा आरएनए हस्तक्षेप, * These authors contributed equally

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Summary

शाही सेना हस्तक्षेप (आरएनएआई) आधारित जीन पछाड़ना तकनीक Tribolium अनुसंधान के मूल में हैं. यहाँ, हम Tribolium castaneum में हमारे लार्वा आरएनएआई तकनीक का अवलोकन प्रदान. लार्वा आरएनएआई शोधकर्ताओं विविध संदर्भों में जीन कार्यों का अध्ययन करने के लिए अनुमति हानि के समारोह phenotypes के लिए त्वरित पहुँच प्रदान करता है एक सरल, लेकिन शक्तिशाली तकनीक है.

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Linz, D. M., Clark-Hachtel, C. M., Borràs-Castells, F., Tomoyasu, Y. Larval RNA Interference in the Red Flour Beetle, Tribolium castaneum. J. Vis. Exp. (92), e52059, doi:10.3791/52059 (2014).

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Abstract

लाल आटा बीटल, Tribolium castaneum, एक पूरी तरह से एनोटेट जीनोम अनुक्रम, transposon आधारित transgenesis, और प्रभावी शाही सेना हस्तक्षेप (आरएनएआई) सहित आनुवंशिक और विकास अध्ययन के लिए प्रयोगात्मक उपकरणों की एक सूची प्रदान करता है. इन फायदों के अलावा, आरएनएआई आधारित जीन पछाड़ना तकनीक Tribolium अनुसंधान के मूल में हैं. टी castaneum यह संभव बस बीटल के शरीर गुहा में डबल असहाय शाही सेना (dsRNA) इंजेक्शन लगाने के द्वारा किसी भी जीवन स्तर पर आरएनएआई प्रदर्शन करने के लिए कर रही है, एक मजबूत प्रणालीगत आरएनएआई प्रतिक्रिया दिखाते हैं.

इस रिपोर्ट में, हम टी में हमारे लार्वा आरएनएआई तकनीक का अवलोकन प्रदान castaneum. प्रोटोकॉल टी का उचित मंच (i) अलगाव शामिल इंजेक्शन के लिए castaneum लार्वा, इंजेक्शन स्थापित करने के लिए (द्वितीय) तैयार करने, और (iii) dsRNA इंजेक्शन. लार्वा आरएनएआई नुकसान के समारोह phenotyp के लिए त्वरित पहुँच के साथ प्रदान करता है कि एक सरल, लेकिन शक्तिशाली तकनीक हैकई जीन पछाड़ना phenotypes के साथ ही hypomorphic phenotypes की एक श्रृंखला सहित तों. लगभग सभी टी के बाद से castaneum ऊतकों कोशिकी dsRNA लिए अतिसंवेदनशील होते हैं, लार्वा आरएनएआई तकनीक शोधकर्ताओं बाहर के वातावरण को जीवधारी प्रतिक्रियाओं के आनुवंशिक आधार सहित विभिन्न संदर्भों में ऊतकों की एक विस्तृत विविधता का अध्ययन करने के लिए अनुमति देता है. इसके अलावा, इस तकनीक की सादगी टी, जिससे अनुसंधान में अधिक छात्र की भागीदारी को बढ़ावा देने एक कक्षा में स्थापित करने में इस्तेमाल के लिए एक आदर्श आनुवंशिक प्रणाली castaneum.

Introduction

लाल आटा बीटल, Tribolium castaneum, कारण शाही सेना हस्तक्षेप (आरएनएआई) 1-3 प्रदर्शन में आसानी से भाग में जीव विज्ञान के विभिन्न क्षेत्रों में लोकप्रिय हो रहा है. आरएनएआई आधारित जीन पछाड़ना तकनीक वैज्ञानिकों नुकसान के समारोह जटिल आनुवंशिक विधियों के उपयोग के बिना विश्लेषण प्रदर्शन करने के लिए अनुमति देते हैं. टी castaneum यह संभव बीटल के शरीर गुहा 4-6 में डबल असहाय शाही सेना (dsRNA) के सरल इंजेक्शन के माध्यम से किसी भी स्तर पर आरएनएआई प्रदर्शन करने के लिए कर रही है, एक मजबूत प्रणालीगत आरएनएआई प्रतिक्रिया दिखाते हैं. कई जीनों के एक साथ पछाड़ना भी टी में संभव है एक ही समय 7,8 में दो या दो से अधिक अलग dsRNA अणुओं इंजेक्शन द्वारा castaneum. इसके अलावा, hypomorphic phenotypes की एक श्रृंखला dsRNA 8 इंजेक्शन की एकाग्रता कम करने से उत्पन्न किया जा सकता. इन सुविधाओं टी में पारंपरिक आगे आनुवंशिकी के लिए आरएनएआई आधारित रिवर्स आनुवंशिक तकनीक आकर्षक विकल्प बना castaneum. चूंकि लगभगसभी टी castaneum ऊतकों इस तकनीक शोधकर्ताओं विविध संदर्भों में ऊतकों की एक विस्तृत विविधता का अध्ययन करने के लिए अनुमति देता है, कोशिकी dsRNA अणुओं 9 के लिए अतिसंवेदनशील होते हैं. इसके अलावा, इस रिपोर्ट टी में आरएनएआई प्रदर्शन पर केंद्रित है, हालांकि castaneum, यहाँ वर्णित कई प्रक्रियाओं अन्य कीड़ों के लिए लागू कर रहे हैं. इच्छा के नुकसान के समारोह टी में उनके हित के संदर्भों में विश्लेषण प्रदर्शन करने के लिए इसलिए, इस प्रोटोकॉल उपयोगी है castaneum, साथ ही अन्य कीड़ों के लिए एक आरएनएआई आधारित तकनीक को लागू करने के इच्छुक शोधकर्ताओं के लिए.

लार्वा में dsRNA इंजेक्शन लार्वा, पोटा संबंधी सहित बीटल जीवन चरणों की एक किस्म पर कार्य विश्लेषण की अनुमति देता है, और वयस्क 4,5,10 चरणों. हम पहले से आणविक जीव विज्ञान प्रक्रियाओं 11 सहित हमारी समग्र लार्वा आरएनएआई प्रोटोकॉल की सूचना दी है. वर्तमान रिपोर्ट में, हम सबसे अच्छा दृश्य सहयोगियों के साथ व्याख्या कर रहे हैं जो dsRNA इंजेक्शन प्रक्रियाओं का वर्णन पर ध्यान केंद्रित. हम प्रदान करते हैंविस्तृत कदम दर कदम इंजेक्शन प्रक्रियाओं के साथ ही अच्छे और बुरे इंजेक्शन उदाहरण हैं. इस दृश्य प्रोटोकॉल हमारे पिछले प्रोटोकॉल का पूरक है, और जब संयुक्त, वे टी में लार्वा आरएनएआई प्रक्रियाओं के एक अधिक व्यापक दृष्टिकोण प्रदान castaneum. इसके अलावा, हम आरएनएआई, शारीरिक अनुसंधान के लिए आरएनएआई आधारित assays के आवेदन की सफलता के साथ ही एक शिक्षण प्रयोगशाला में लार्वा आरएनएआई प्रोटोकॉल की प्रयोज्यता प्रभावित हो सकता है कि dsRNA अणुओं के लिए मानकों पर चर्चा की.

Protocol

1 टी castaneum स्टॉक और संवर्धन

  1. एक टी पर फैसला castaneum तनाव प्रयोग के लिए उपयोग करने के लिए.
    नोट: कई प्रयोगशाला की स्थापना की टी castaneum उपभेदों उपलब्ध हैं. गा -1 (जॉर्जिया -1) जीनोम अनुक्रमण 3 के लिए इस्तेमाल किया गया था कि गा -2 के माता पिता का तनाव है. गा -1 (जैसे एकल nucleotide बहुरूपताओं के रूप में, SNPs) के शेयर सबसे डीएनए बहुरूपताओं गा -2, के साथ और कारण कम प्रजनन के लिए गा -2 से स्वस्थ है, यह आरएनएआई प्रयोगों के लिए आदर्श है. पु-11 उपयोग करने के लिए एक और सुविधाजनक तनाव है भविष्य विंग primordia में अपनी अनूठी बढ़ाया पीले फ्लोरोसेंट प्रोटीन (EYFP) अभिव्यक्ति अन्य instars से पिछले लार्वा instar भेद करने के लिए हमें की अनुमति देता है, के रूप में (क्लार्क-HACHTEL एट अल. 2013 12 चित्रा S4 देखें). आनुवंशिक पृष्ठभूमि काफी एएफएफ दिखाई देते हैं, क्योंकि यह प्रयोग में इस्तेमाल किया गया था जो बीटल तनाव दस्तावेज़ करने के लिए महत्वपूर्ण हैect आरएनएआई 13 phenotypes.
  2. टी तैयार (मिश्रण के बाद, -20 डिग्री सेल्सियस पर संस्कृति आटा स्टोर) कार्बनिक पूरे गेहूं का आटा पूर्व sieved शराब बनानेवाला है खमीर के (वजन) के द्वारा 5% जोड़कर castaneum संस्कृति आटा. 6 औंस प्लास्टिक ड्रोसोफिला स्टॉक बोतलों (लगभग 40 ग्राम / बोतल) में (कमरे के तापमान पर) संस्कृति आटा विभाज्य.
  3. संस्कृति टी 70% नमी के साथ 30 डिग्री सेल्सियस पर castaneum. एक नमी नियंत्रित इनक्यूबेटर यदि संभव हो तो उपयोग करें. संस्कृति प्रति बोतल 30-40 वयस्कों जोड़ें (पुरुष: स्त्री अनुपात 1: 1) संस्कृति शुरू करने के लिए.
    नोट: ढालना मुश्किल से ही संस्कृति के आटे में ढालना विकास हो सकता है 30 डिग्री सेल्सियस से 70% नमी के साथ, कम तापमान (जैसे 25 डिग्री सेल्सियस) पर एक मुद्दा है. यदि ऐसा होता है नमी कम.
  4. Subculturing (संस्कृति के आटे से वयस्कों को अलग करने के लिए कैसे कदम 5.2-5.5 देखें) के लिए हर दो हफ्ते एक नई संस्कृति की बोतल के लिए वयस्कों के स्थानांतरण.
    नोट: यह अंतिम instar लार्वा को प्राप्त करने के बारे में तीन सप्ताह लग जाते हैं. Alternatively, टी castaneum संस्कृतियों एक लंबी संवर्धन अवधि के साथ यद्यपि, एक कम तापमान (20-25 डिग्री सेल्सियस) में रखा जा सकता है (25 डिग्री सेल्सियस पर विकासात्मक समय लगभग दोगुनी है कि 30 डिग्री सेल्सियस पर है).

लारवल dsRNA इंजेक्शन के लिए समाधान और उपकरणों के 2. तैयारी

  1. इन विट्रो प्रतिलेखन द्वारा लक्ष्य जीन को मुताबिक़ dsRNA अणुओं synthesize. -80 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर. विस्तृत आणविक जीव विज्ञान प्रक्रियाओं के लिए फिलिप और Tomoyasu 2011 11 देखें. इसके अलावा dsRNA अणुओं जब डिजाइनिंग विचार करने की आवश्यकता है कि मानकों के एक नंबर के लिए चर्चा देखें.
  2. 1.5 एमएल 1 एम नाह के 2 पीओ 4 के साथ 8.5 एमएल 1 एम ना 2 का 4 HPO मिश्रण से (25 डिग्री सेल्सियस पर पीएच 7.6) 0.1 एम सोडियम फॉस्फेट बफर के 10 एमएल बनाओ. एक पीएच मीटर के साथ पीएच की जाँच करें और तदनुसार समायोजित.
  3. 100 _, (25 डिग्री सेल्सियस पर पीएच 7.6) 0.1 एम सोडियम फॉस्फेट बफर के 10 μl मिश्रण से 10x इंजेक्शन बफर के 1 मिलीलीटर बनाओ6, एल 0.5 एम KCl की, हरी भोजन डाई के 100 μl, और डबल आसुत जल के 790 μl (DDH 2 हे). 2x इंजेक्शन बफर (200 μl 10x इंजेक्शन बफर 800 μl DDH 2 हे) बनाने के लिए 10x इंजेक्शन बफर पतला. जब तक जरूरत 4 डिग्री सेल्सियस पर दोनों 10x और 2x इंजेक्शन बफ़र्स स्टोर.
  4. स्टिकी गिलास स्लाइड तैयार करें.
    1. लार्वा इंजेक्शन के लिए repositionable गोंद का एक फार्म के साथ एक पूरा गिलास स्लाइड कवर. वयस्क या पोटा संबंधी इंजेक्शन के लिए, स्लाइड की लंबी किनारों के साथ गोंद की दो पतली स्ट्रिप्स बनाने.
    2. भी इंजेक्शन के बाद उनके हटाने की सुविधा के लिए पर्याप्त कोमल जबकि शेष गोंद, गोंद स्लाइड को भृंग पालन करने के लिए पर्याप्त कठिन बनी हुई है कि जो यह सुनिश्चित करता है कई दिनों के लिए शुष्क करने की अनुमति दें.
      नोट: गोंद भी अवरुद्ध रहता है, एक उंगली का उपयोग करें और tackiness कम हो जाएगा, जो गोंद पर नल. प्रत्येक स्लाइड 40 या 50 भृंग को पकड़ कर सकते हैं, और यह सुरक्षित जानवरों पकड़ में विफल रहता है जब तक पुन: उपयोग किया जा सकता है. Alternटेप कभी कभी लार्वा पकड़ करने के लिए पर्याप्त चिपकने वाला नहीं है atively, डबल पक्षीय टेप भी इस्तेमाल किया जा सकता है.
  5. एक ईथर का प्रयोग टोकरी बनाना.
    1. एक 10 मिलीलीटर डिस्पोजेबल सिरिंज से सवार निकालें, और 6 मिलीलीटर रेखा के आसपास आधे में सिरिंज काटा.
    2. सिरिंज के नीचे आधा त्यागें. संक्षेप में एक गैस बर्नर के साथ सिरिंज के शीर्ष भाग की कटौती की सतह गर्मी, और जल्दी से सिरिंज पर जाल गोंद नायलॉन जाल के एक टुकड़े पर पिघला प्लास्टिक धक्का. प्लास्टिक और मज़बूत बनाता है एक बार किसी भी अतिरिक्त जाल दूर ट्रिम.
  6. आकाश बोतल तैयार करें. एक संकीर्ण मुंह 100 या 250 मिलीलीटर कांच की बोतल में ईथर के 30 मिलीलीटर जोड़ें. ईथर के वाष्पीकरण को बढ़ाने के लिए टिशू पेपर के कई टुकड़े जोड़ें.
    नोट: व्योम एक आग खतरा प्रस्तुत करता है और भी हानिकारक है. हमेशा एक धूआं हुड के तहत आकाश संभाल. उपयोग में कसकर नहीं, जबकि ढक्कन बंद करें.
    नोट: बर्फ sedatio हालांकि, (जैसे कि एक कक्षा में स्थापित करने के रूप में) एक सुरक्षित विकल्प के रूप में इस्तेमाल किया जा सकता हैn कम प्रभावी है.

लारवल इंजेक्शन उपकरण के 3 तैयारी

  1. एक विदारक माइक्रोस्कोप पर एक XY यांत्रिक मंच रखें.
    नोट: XY यांत्रिक चरणों प्रमुख माइक्रोस्कोप कंपनियों से उपलब्ध हैं. वैकल्पिक रूप से, सस्ती खुर्दबीन चरणों भी कुछ संशोधनों के साथ सबसे विदारक माइक्रोस्कोप के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है (उदाहरण के लिए सामग्री तालिका देखें).
  2. XY यांत्रिक मंच के पास एक यांत्रिक सुई जोड़तोड़ रखें.
  3. एक इंजेक्शन सिरिंज इकट्ठे. इंजेक्शन सुई में दबाव को प्रभावित किए बिना इंजेक्शन सिरिंज के हेरफेर की अनुमति, एक गिलास सुई धारक को एक 30 मिलीलीटर डिस्पोजेबल सिरिंज कनेक्ट करने के लिए (Luer कनेक्शन) के साथ एक चार रास्ता पानी निकलने की टोंटी का प्रयोग करें (विस्तृत इंजेक्शन सिरिंज के लिए फिलिप और Tomoyasu 2011 11 देखना विधानसभा).

4 पुलिंग इंजेक्शन सुई

  1. एक से borosilicate ग्लास सुई (0.5 मिमी, 15 सेमी लंबाई: 1 मिमी, आईडी B100-50-15, ओवर ड्राफ्ट) खींचोसुई खींचने.
    नोट: Sutter पी 87 या पी -97, सेटिंग का उपयोग के लिए "हीट = 70 = 45, वेल = 75, समय = 90 खींचो" या पिपेट रसोई की किताब के अध्याय 2 का पालन करें: पक्षपाती सेल, सी एलिगेंस, ड्रोसोफिला, और Zebrafish - कार्यक्रम की सिफारिश की. इष्टतम सेटिंग्स सुई खींचने के मॉडल के आधार पर भिन्न. एक सामान्य ड्रोसोफिला इंजेक्शन सुई के लिए सेटिंग एक अच्छा प्रारंभिक बिंदु है.
  2. स्टोर एक प्लास्टिक के मामले (जैसे, एक प्लास्टिक सीडी मामले) में सुई खींच लिया और हटाने योग्य बढ़ते पोटीन के साथ सुरक्षित है.

5 अलगाव और लार्वा का चयन

  1. एक चलनी रिसीवर पर एक # 25 चलनी रखें.
  2. चलनी पर संस्कृति बोतल (भृंग और संस्कृति का आटा) की सामग्री रखें, और तुरंत सामग्री झारना. लार्वा जल्दी चलनी के माध्यम से बिल और अटक प्राप्त करने की कोशिश करेगा, sifting बिना चलनी पर सामग्री न छोड़ें. आक्रामक तरीके से आटा गिर जाने के लिए सामग्री झारनाके माध्यम से और बड़े लार्वा छोड़ (आमतौर पर 6 वीं और 7 वीं instar लार्वा), चलनी के शीर्ष पर पीछे (उनके डाली बंद cuticles, exuviae के साथ) pupae, और वयस्कों.
  3. बीज पैन को चलनी (भृंग और exuviae) पर शेष सामग्री स्थानांतरण. भागने से भृंग को रोकने के लिए पैन दोहन रखें.
  4. Exuviae और धीरे बीज पैन के ऊपर बहने से भृंग की सतह पर शेष आटा कणों को दूर.
  5. पैन के नीचे करने के लिए सामग्री ले जाने के लिए बीज पैन टैप करें. फिर, कई सेकंड के लिए अप्रयुक्त पैन छोड़ दें. ढेर से बाहर आने के लिए, दूसरे चरण की तुलना में अधिक मोबाइल हैं जो वयस्कों के लिए प्रतीक्षा करें. एक कला तूलिका (जैसे, 1 सेमी चौड़ाई) का उपयोग करके वयस्कों निकालें.
  6. Pupae के रूप में, थोड़ा नीचे पैन के मुंह रखते हुए धीरे बीज पैन दस्तक से अलग pupae तेजी से मुंह की ओर रोल करने के लिए करते हैं. बीज तवे पर ही लार्वा छोड़ने, pupae हटाने के लिए एक तूलिका का प्रयोग करें.
  7. Plएक साफ पेट्री डिश में पृथक लार्वा इक्का. इंजेक्शन के लिए लार्वा का एक उपयुक्त मंच का चयन करें और एक अलग पेट्री डिश में उन्हें जगह है.
    नोट: वयस्क morphologies पर और साथ ही कायापलट पर आरएनएआई प्रभाव का विश्लेषण करते समय जल्दी पिछले instar लार्वा (अंतिम लार्वा गिरना के बाद 1-2 दिन) अक्सर उपयुक्त हैं. यह, हालांकि, कभी कभी आवश्यक (जैसे, 3E-3H आंकड़े. इसके अलावा क्लार्क-HACHTEL एट अल. 2013 12 देखें) जल्दी जीन समारोह का मूल्यांकन करने के अंत से पहले में (या पहले भी) चरण आरएनएआई प्रदर्शन करना है. लार्वा के instar की पहचान करने के लिए एक आकार संदर्भ के रूप में pupae का प्रयोग करें. पिछले instar लार्वा अब थोड़ा pupae से कर रहे हैं. वैकल्पिक रूप से, पु-11 पिछले instar लार्वा की पहचान करने के साथ ही पिछले instar लार्वा के विकास (क्लार्क-HACHTEL चित्रा S4 एट अल. 2013 12) के समय के पाठ्यक्रम का निर्धारण करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है.
  8. ईथर का प्रयोग जब तक एक पेट्री डिश में चयनित लार्वा रखें. बाकी जगहवापस आटे के साथ एक संस्कृति बोतल में और इनक्यूबेटर के लिए यह वापसी लार्वा और (जैसे pupae और वयस्कों के रूप में) भृंग के अन्य चरणों की.

इंजेक्शन सुई के 6 तैयारी

  1. चिपचिपा कील या दो तरफा टेप का उपयोग कर एक गिलास खुर्दबीन स्लाइड पर एक पहले से खींच लिया गिलास सुई रखें. जहां टिप झुकता देखने के लिए विदारक माइक्रोस्कोप के माध्यम से देख रहे हैं, जबकि संदंश का प्रयोग, सुई का निकाला अंत परीक्षण. संदंश और मोड़ के साथ सुई झुकता तोड़ने के लिए जहां की नोक पक्ष की ओर से थोड़ा क्षेत्र पकड़ो.
  2. अच्छा सुई रखें और दूसरों को त्यागें. एक कि न तो बहुत बड़ी है और न ही बहुत छोटा है खोलने वाले के रूप में एक अच्छा सुई गौर (लगभग 0.05 मिमी व्यास. 1 ए आंकड़े और 1 बी), और लार्वा छल्ली आसान (आंकड़े 1 बी और 2A-2 बी) की पैठ बनाने के लिए angled है. मुश्किल सुई में dsRNA समाधान की तेज बनाने के रूप में एक बुरा सुई (मैं) बहुत छोटा करने पर विचारपंथ (चरण 7) (आंकड़े -1 डी और 2 डी), (द्वितीय) बहुत बड़ी है, इंजेक्शन पर लार्वा चोट और संभव पैदा मारक (आंकड़े 1C और 2 एफ), छल्ली मुश्किल और बढ़ती चोट (iii) कुंद, बनाने पैठ.
  3. सुई धारक में सुई डालने.
    1. सबसे पहले, सुई धारक की नोक खोलना और धारक टिप में सुई के पीछे के अंत जगह है. फिर, धारक टिप के तहत (कांच सुई के पीछे के अंत से कम से कम 1 सेमी) रबर गैसकेट जगह है.
    2. पूरी तरह से सुई धारक के उद्घाटन में डाला रबर गैसकेट के साथ धारक में सुई के पीछे, डालें. वापस धारक पर टिप भाड़ में.
  4. सुई जोड़तोड़ पर इकट्ठे सुई धारक रखें. क्षैतिज के करीब सुई धारक रखें. माइकर के माध्यम से देख जब जोड़तोड़ की स्थिति को समायोजित, तो सुई की नोक देखने के केंद्र में स्थित हैoscope.

सुई में 7 frontloading dsRNA समाधान

  1. DDH 2 ओ के साथ एकाग्रता का समायोजन और 2x इंजेक्शन बफर (2.3 कदम) के बराबर मात्रा के साथ dsRNA समाधान मिश्रण द्वारा इंजेक्शन के लिए सिर्फ पूर्व dsRNA इंजेक्शन समाधान तैयार है. बर्फ पर मिश्रित समाधान रखें. DsRNA एकाग्रता के बारे में चर्चा देखें.
  2. एक 20 μl डिस्पोजेबल विंदुक टिप टिप कट. पिपेट छंटनी पिपेट टिप में समाधान के 10 μl. Backpressure प्रदान करके नोक पर तरल पदार्थ रखते हुए सावधानी पिपेट से पिपेट टिप को हटा दें. वैकल्पिक रूप से, ध्यान से टिप को हटाने और फिर एक उंगली का उपयोग दबाव प्रदान करके टिप के अंत करने के लिए समाधान के लिए कदम.
  3. सुई की नोक का सामना करना पड़ खोलने के साथ चिपचिपा कील का उपयोग कर खुर्दबीन मंच पर dsRNA समाधान के साथ विंदुक टिप रखें.
  4. माइक्रोस्कोप के माध्यम से देख रहे हैं, धीरे धीरे की टिप जब तक सुई की ओर लोड टिप चालसुई सिर्फ लोड पिपेट टिप के अंदर और समाधान में है.
  5. माइक्रोस्कोप के माध्यम से देख रहे हैं, धीरे धीरे से सुई में dsRNA हल खींचने के लिए इंजेक्शन सिरिंज के सवार पर वापस खींच.
    नोट: सुई अधिभार मत करो. DsRNA समाधान के अंत सुई की नोक दृष्टिकोण, खींच की दर धीमी और हवा तक पहुंच जाएगा सुई की नोक से पहले समाधान को लोड करना रोकें. हवा टिप तक पहुँच जाता है, समाधान तेजी से गंभीर संक्रमण के मुद्दों में जिसके परिणामस्वरूप, सुई धारक में तैयार हो जाएगा. सुई धारक की विस्तृत सफाई प्रक्रियाओं फिलिप और Tomoyasu 2011 11 में वर्णित हैं.
  6. पानी निकलने की टोंटी खोलकर इंजेक्शन सिरिंज और सुई धारक से दबाव हटा दें. फिर, सुई की नोक से दूर पिपेट टिप चाल है. मंच पर लार्वा रखकर जबकि गलती से सुई को नुकसान पहुँचाए को रोकने के लिए मंच से सुई ऊपर उठाएँ. मंच से खाली पिपेट टिप निकालें.
  7. 8 dsRNA इंजेक्शन

    1. ईथर का प्रयोग टोकरी में लार्वा रखें. तकनीक सीखने अगर कम से कम 10 लार्वा का प्रयोग करें. तकनीक के साथ एक बार आराम से एक दौर में 30-40 लार्वा का प्रयोग करें.
    2. आकाश बोतल में लार्वा के साथ टोकरी प्लेस और ढक्कन बंद कर दें.
      नोट: व्योम एक आग खतरा प्रस्तुत करता है और भी हानिकारक है. एक धूआं हुड के तहत यह कदम प्रदर्शन.
    3. के बारे में 3 मिनट के लिए Etherize लार्वा. 3 मिनट के बाद आंदोलन के लिए लार्वा की जांच करें. वे अभी भी बढ़ रहे हैं तो एक और 30 सेकंड के लिए आकाश बोतल में उन्हें वापस जगह है. इस मारक वृद्धि हो सकती है के रूप में अधिक से अधिक 5 मिनट के लिए etherize न करें.
      नोट: इष्टतम ईथरीकरण समय तापमान और नमी के आधार पर भिन्न हो सकते हैं.
    4. एक गिलास चिपचिपा स्लाइड की गैर छड़ी किनारे करने के लिए टोकरी से etherized लार्वा स्थानांतरण. संदंश का प्रयोग और माइक्रोस्कोप के माध्यम से देख रहे हैं, जबकि एक करके प्रत्येक लार्वा से एक उठाओ और स्लाइड पर उन्हें जगह है. एफ अपने शरीर नीचे नल धीरे पार्श्व उन्हें करना औरतुम जाओ के रूप में संदंश के साथ पूंछ को ROM सिर, थोड़ा वे स्लाइड पर सुरक्षित हैं सुनिश्चित करने के लिए, उन्हें खींच.
    5. खुर्दबीन मंच पर लार्वा साथ चिपचिपा स्लाइड रखें.
    6. सीएनएस हानिकारक से बचने के लार्वा की पृष्ठीय पक्ष में धीरे dsRNA लोड सुई डालें. लार्वा दिल यहाँ स्थित है के रूप में इसके अलावा, पृष्ठीय midline से बचें. इस और बाद के चरणों में, हमेशा (बजाय सुई ले जाने के लिए सुई जोड़तोड़ का उपयोग करने का) सुई के लिए लार्वा को स्थानांतरित करने के लिए मंच का उपयोग करें.
      नोट: विशिष्ट इंजेक्शन साइट टी में आरएनएआई के रूप में कोई फर्क नहीं पड़ता castaneum प्रणालीगत प्रतीत होता है. हालांकि, यह वक्ष या पेट क्षेत्रों के पृष्ठीय पक्ष में डालने के लिए आमतौर पर सबसे आसान है.
    7. लार्वा में सुई डालने के बाद, dsRNA लार्वा शरीर गुहा में प्रवेश करने के लिए कमरे की अनुमति के लिए थोड़ा वापस सुई खींच.
    8. लार्वा बारी हरे (या इंजेक्शन बफर का रंग) जब तक इंजेक्शन सिरिंज पर धीरे पुश और एस देखोtretched और पूर्ण.
      नोट: तकनीक सीखने है, महत्वपूर्ण मारक के बिना एक लार्वा में इंजेक्ट किया जा सकता है कि समाधान की राशि का निर्धारण करने के लिए जितना संभव हो उतना इंजेक्षन करने की कोशिश. यह आमतौर पर के बारे में 0.5-0.7 μl है.
    9. लार्वा से सुई निकालें. सुई हटाए जाने के दौरान, थोड़ा वापस dsRNA नुकसान से बचने के लिए इंजेक्शन सिरिंज पर खींच (भी हवा में खींचने के लिए नहीं सावधान रहना).
    10. स्लाइड पर सभी लार्वा इंजेक्षन. सफलतापूर्वक इंजेक्शन नहीं थे कि लार्वा को दूर करने के लिए सुनिश्चित करें. लार्वा से पहले पूरा इंजेक्शन (लगभग 10 मिनट में) जगा.
    11. इंजेक्शन खुर्दबीन से इंजेक्शन लार्वा साथ स्लाइड निकालें और सब लार्वा ईथरीकरण से उबरने तक 5 और अधिक मिनट के लिए स्लाइड छोड़ दें.
    12. संदंश के साथ और एक विदारक खुर्दबीन के नीचे, धीरे चिपचिपा स्लाइड से उन्हें रिहा करने के लिए सिर से पूंछ के लार्वा उठा. एक साफ पेट्री डिश में हाल में जारी लार्वा रखें. डब्ल्यू इंजेक्शन अनुमति देने के लिए 10-15 मिनट के लिए पेट्री डिश पर लार्वा छोड़ दोथक्का को ound.
    13. उचित तनाव नाम सहित स्वच्छ आटा और लेबल के साथ एक नई बोतल में लार्वा प्लेस, dsRNA के प्रकार, dsRNA की एकाग्रता, इंजेक्शन लार्वा की संख्या, और तारीख इंजेक्शन.
    14. संस्कृति 70% नमी के साथ 30 डिग्री सेल्सियस पर इंजेक्शन लार्वा. नियमित रूप से आरएनएआई phenotypes के लिए लार्वा का निरीक्षण करें.
      नोट: 7 दिनों के भीतर अंतिम instar लार्वा कोषस्थ कीट धारण करना. (आरएनएआई की वजह से समय में कोई असामान्यता नहीं है तो) फिर, pupae 7 दिनों के बाद वयस्कों में eclose जाएगा.

    पछाड़ना और प्ररूपी विश्लेषण के 9 पुष्टि

    1. ऐसे मात्रात्मक रिवर्स प्रतिलेखन पीसीआर (QRT पीसीआर) और पश्चिमी सोख्ता के रूप में कई अलग अलग आणविक जीव विज्ञान, तकनीक से नीचे दस्तक आरएनएआई के आकलन दक्षता पर विचार करें. क्रमशः, मिलर एट अल. 2012 7 और फिलिप और विस्तृत qPCR के लिए Tomoyasu 2011 11 और वेस्टर्न ब्लाट प्रोटोकॉल देखें.
    2. आरएनएआई संबंधित phenotypes का विश्लेषण करें.
      नोट: संबंधित आरएनएआईphenotypes निशाना बनाया गया है कि जीन पर निर्भर करता है, कई विभिन्न चरणों में हैं और अलग संस्कृति परिस्थितियों में देखा जा सकता है. आरएनएआई बीटल आकृति विज्ञान, कायापलट, शरीर क्रिया विज्ञान, और व्यवहार को प्रभावित कर सकते हैं. कितनी बार phenotype की उपस्थिति की जाँच की है और बीटल पाला रहे स्थितियां विशिष्ट सवालों के अनुरूप होना चाहिए क्या तहत आरएनएआई के माध्यम से जांच की जा रही.

Representative Results

सफल इंजेक्शन के लिए महत्वपूर्ण कदमों में से एक एक अच्छा सुई बनाने के लिए है. चरण 6 में वर्णित है, सुई की नोक से पहले टी इंजेक्शन लगाने के लिए टूट जाने की आवश्यकता castaneum. अच्छे और बुरे सुइयों के उदाहरण चित्र 1 में दिखाया जाता है. एक अच्छा सुई एक लगभग 0.05 मिमी व्यास खोलने (चित्रा 1 बी) के साथ, एक तेज और कड़ी टिप है.

चित्रा 2 एक सफल इंजेक्शन (आंकड़े 2A और 2 बी) के रूप में अच्छी तरह से असफल इंजेक्शन (आंकड़े -2 सी-2 एफ) के कई मामलों प्रस्तुत करता है. एक ठीक से आकार के इंजेक्शन सुई के साथ, सुई टिप न्यूनतम प्रतिरोध (2A चित्रा) के साथ लार्वा छल्ली प्रवेश, और dsRNA समाधान (हरा) किसी भी रिसाव (चित्रा 2 बी) के बिना लार्वा में बहती है. अधिक इंजेक्षन, के रूप में यह भी एक ठीक से आकार के इंजेक्शन सुई (चित्रा के साथ dsRNA समाधान की बाढ़ के कारण होगा न करें-2 सी). सुई की नोक भी पतली है, तो सुई टिप अक्सर मुश्किल इंजेक्शन (चित्रा 2 डी) बनाने, लार्वा छल्ली और झुकता घुसना करने में विफल रहता. यदि ऐसा होता है, trimming सुई टिप कभी कभी मदद मिलती है. बड़ी सुइयों लार्वा छल्ली (चित्रा 2 ई) मर्मज्ञ में कुछ कठिनाइयों के साथ यद्यपि, अक्सर अभी भी उपयोगी हैं. हालांकि, dsRNA समाधान की एक बड़ी राशि आसानी से अक्सर dsRNA समाधान (चित्रा 2 एफ) की एक बाढ़ में जिसके परिणामस्वरूप भी इंजेक्शन सिरिंज पर थोड़ा दबाव के साथ सुई से बाहर धकेल दिया है.

आरएनएआई प्रदर्शन करते हैं, तो यह आरएनएआई ठीक से काम कर रहा है, और एक नकारात्मक नियंत्रण मनाया प्रभाव dsRNA के एक गैर विशिष्ट प्रभाव या वजह से इस तरह के चोट के रूप में इंजेक्शन प्रक्रियाओं (का परिणाम नहीं है कि सत्यापित करने के लिए कि आकलन करने के लिए एक सकारात्मक नियंत्रण के लिए महत्वपूर्ण है ) ईथरीकरण से इंजेक्शन, या विषमता से. DsRNA को लक्षित EYFP इंजेक्शन एक के रूप में सेवा कर सकते हैंसकारात्मक नियंत्रण अच्छा पु-11 तनाव 5,7 का उपयोग करते समय. EYFP dsRNA पिछले लार्वा चरण में इंजेक्ट किया जाता है, तो भविष्य विंग primordia में EYFP संकेत में एक महत्वपूर्ण कमी के रूप में जल्दी एक दिन पोस्ट इंजेक्शन (चित्रा 3) के रूप में देखा जा सकता है. EYFP की पछाड़ना दो दिनों EYFP dsRNA (3B चित्रा) के इंजेक्शन के बाद पूरा हो गया है और इस पछाड़ना dsRNA एकाग्रता काफी (जैसे 1 उच्च अगर पोटा संबंधी मंच (आंकड़े -3 सी और 3 डी) के माध्यम से और बीटल के जीवन भर बनी रहती है माइक्रोग्राम / μl) 7. EYFP dsRNA यह एक गैर अंतर्जात जीन अनुक्रम के रूप में भी एक नकारात्मक नियंत्रण के रूप में इस्तेमाल किया जा सकता है और रूपात्मक या शारीरिक अवरोधों (आंकड़े 3A-3D) कारण नहीं होना चाहिए.

हम कैसे एफई का एक और उदाहरण के रूप में, बाक़ी (वीजी) के लिए लार्वा आरएनएआई की छवियों, एक महत्वपूर्ण विंग जीन 12 प्रदान कीइस इंजेक्शन आधारित आरएनएआई तकनीक टी में है fective castaneum. वी.जी. के लिए dsRNA अंत से पहले चरण लार्वा (पिछले लार्वा चरण से पहले एक चरण) में इंजेक्ट किया जाता है, पंख संरचनाओं का एक पूरा नुकसान पोटा संबंधी मंच (आंकड़े 3E और 3F) में देखा जा सकता है. परिणामस्वरूप प्रौढ़ भी पूरी तरह दक्षिणपंथी संरचनाओं (आंकड़े 3 जी और 3H) का अभाव है. वी.जी. के लिए आरएनएआई परिणाम मजबूती और टी में आरएनएआई की प्रणालीगत प्रकृति दोनों मिसाल castaneum.

चित्रा 1
चित्रा 1:, अटूट अच्छा, और बुरे सुई (ए) उदाहरण (बी) एक अच्छी तरह से टूट अच्छा सुई की नोक (सी) बहुत बड़ा और कुंद है कि एक टूटी हुई सुई की नोक (डी) टिप... एक तोड़ दिया की बहुत पतली है कि n सुई. स्केल सलाखों (लाल) 0.05 मिमी. यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें.

चित्रा 2
चित्रा 2:... (ए) एक ठीक से आकार के इंजेक्शन सुई पिछले instar लार्वा में डाला (बी) के लार्वा उचित हरी dsRNA समाधान के साथ इंजेक्शन (सी) पर इंजेक्शन की वजह से इंजेक्शन बिंदु पर dsRNA समाधान की बाढ़ (डी ) लार्वा छल्ली घुसना करने में नाकाम रहने के लिए एक पतली सुई. (ई) पिछले instar लार्वा में डाला बड़े इंजेक्शन सुई. (एफ) के लार्वा dsRNA समाधान की बाढ़ और रिसाव में जिसके परिणामस्वरूप एक बड़ी सुई के साथ इंजेक्शन. तीर सुइयों से संकेत मिलता है.ove.com/files/ftp_upload/52059/52059fig2highres.jpg "लक्ष्य =" _blank "> इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें.

चित्रा 3
चित्रा 3: टी में सफल आरएनएआई के उदाहरण castaneum. (ई) EYFP अभिव्यक्ति की कमी में EYFP dsRNA परिणामों की अंतिम लार्वा इंजेक्शन. से उत्पन्न (ए) लार्वा इंजेक्शन के बाद एक दिन. (बी) के लार्वा दो दिनों इंजेक्शन के बाद. (सी) नियंत्रण pupae. (डी) pupae लार्वा EYFP dsRNA इंजेक्शन. नकारात्मक नियंत्रण बफर इंजेक्शन (ए, बी) और dsRed dsRNA इंजेक्शन (सी, डी) हैं. तीर और तीर EYFP अभिव्यक्ति से संकेत मिलता है या क्रमशः विंग primordia और आँखों में उसके अभाव. (एह) कलमवी.जी. के लिए परम लार्वा आरएनएआई. (ई) जंगली प्रकार प्यूपा. (एफ) वी.जी. आरएनएआई प्यूपा. विंग संरचनाओं की कमी पोटा संबंधी मंच (तीर). जी) जंगली प्रकार वयस्क. (एच) वी.जी. आरएनएआई वयस्क में पहले से ही दिख रहा है. विंग संबंधित संरचनाओं पूरी तरह से (तीर) लापता हैं. इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें.

Discussion

वहाँ (नीचे दस्तक कई प्रयास करते समय) अलग dsRNA अणुओं के बीच की लंबाई और एकाग्रता dsRNA अणुओं की, प्रतियोगिता सहित आरएनएआई की सफलता की गारंटी करने के लिए विचार किया जाना चाहिए कि महत्वपूर्ण मुद्दों के एक नंबर रहे हैं, और बंद लक्ष्य प्रभाव की संभावना (OTE).

dsRNA की लंबाई

dsRNA अणुओं की लंबाई एक लंबी dsRNA (dsRNA की लंबी सीमा वर्तमान में अज्ञात है, हालांकि) आरएनएआई 7,14,15 ट्रिगर करने के लिए और अधिक कुशल होने के साथ, प्रणालीगत आरएनएआई प्रतिक्रिया की दक्षता प्रभावित करता है. dsRNA लंबाई टी में प्रभावी आरएनएआई प्रेरित करने के लिए 50 बीपी से अधिक समय होने की जरूरत castaneum 7. 150 बीपी और 500 बीपी के बीच dsRNA आरएनएआई प्रयोगों के लिए आदर्श होना प्रतीत होता है. अब dsRNA अणुओं का भी इस्तेमाल किया जा सकता है, वे तेजी से मुश्किल हो जाएगा OTE का एक बढ़ा मौका और जीन क्लोनिंग कदम होगा.

dsRNA एकाग्रता

ve_content "> जीन पछाड़ना के विभिन्न डिग्री dsRNA की एकाग्रता के आधार पर प्राप्त किया जा सकता है. 1 माइक्रोग्राम / μl (ब्याज की जीन (एस) के आधार पर भिन्न हो सकते हैं अक्सर एक के पास शून्य phenotype पैदा करता है जो एक उचित प्रारंभिक एकाग्रता, प्रतीत होता है ). आरएनएआई कभी कभी hypomorphic phenotypes (Tomoyasu के पूरक डेटा की एक श्रृंखला का उत्पादन करने के लिए फायदेमंद हो सकता है dsRNA के एक धारावाहिक कमजोर पड़ने के साथ एक मजबूत आरएनएआई फेनोटाइप. आरएनएआई प्राप्त करने के लिए एक उच्च एकाग्रता (जैसे, 7-8 माइक्रोग्राम / μl) के साथ किया जा सकता है एट अल. 2009 8, और BORRAS-Castells अप्रकाशित डेटा).

आरएनएआई प्रतियोगिता

एकाधिक जीन पछाड़ना टी में पूरा किया जा सकता है एक साथ कई अलग dsRNA अणुओं इंजेक्शन द्वारा castaneum. हालांकि, यह भी जीव के भीतर मौजूद कई अलग dsRNA अणुओं वाले अक्सर आरएनएआई घटकों के लिए उपयोग के लिए dsRNAs के बीच प्रतियोगिता में यह परिणाम है कि जाना जाता है (जैसे, Tomoyasu एट अल. 2005 16, Tomoyasu एट अल. 2009 17, और यांग एट अल. 2009 18) दोहरे और तिहरे पछाड़ना प्रदर्शन किया है. यह सभी चार लक्ष्य जीन के लिए आरएनएआई दक्षता का महत्वपूर्ण कमी के कारण होने की संभावना के रूप में होगा, चौगुनी आरएनएआई संभव (या अधिक) है, चुनौतीपूर्ण हो सकता है.

बंद को लक्षित

OTE आरएनएआई आधारित दृष्टिकोण के लिए एक अंतर्निहित चिंता का विषय है. OTE कम करने के लिए एक तरह से dsRNA डिजाइनिंग जब इन क्षेत्रों अन्य जीन के साथ इसी तरह के दृश्यों का हिस्सा है कि लक्ष्य जीन में क्षेत्रों की पहचान और बचने के लिए है. टी के खिलाफ एक साधारण ब्लास्ट विश्लेषण castaneum भविष्यवाणी जीन सेट ऐसे क्षेत्रों की पहचान कर सकते हैं. कई ऑनलाइन उपकरण भी संभावित OTE (जैसे, ई आरएनएआई 19) के मूल्यांकन की अनुमति. लक्ष्य जीन के दो गैर अतिव्यापी क्षेत्रों के लिए आरएनएआई प्रदर्शन phenotypes OTE की वजह से कर रहे हैं मनाया कि संभावना को खत्म करने के लिए एक आसान और कारगर तरीका है. आरएनएआई दो गैर अतिव्यापी क्षेत्रों में एक ही phenotypes उत्पादन के लिए अगर (दो गैर अतिव्यापी क्षेत्रों में एक समान अनुक्रम साझा जब तक) OTE की संभावना कम से कम है.

विश्लेषण करती प्ररूपी के अलावा अन्य माध्यम से पछाड़ना जीन का मूल्यांकन प्रभावी रूप से उपस्थित आरएनएआई से संबंधित डेटा को अक्सर महत्वपूर्ण है. जीन पछाड़ना का मूल्यांकन करने के लिए दो प्रमुख तरीके QRT- पीसीआर और पश्चिमी धब्बा विश्लेषण कर रहे हैं. QRT- पीसीआर लक्ष्य mRNA के स्तर को मापने के लिए एक सुविधाजनक तरीका है, और टी में उन सहित कई आरएनएआई से संबंधित अध्ययनों में इस्तेमाल किया गया है castaneum (मिलर एट अल देखें. उदाहरण के लिए 2012 7). Howevहम हाल ही में (प्रोटीन उत्पाद नीचे विनियमित है, हालांकि) लक्ष्य mRNA स्तर (BORRAS-Castells अप्रकाशित डेटा) को विनियमित आरएनएआई द्वारा होता है जिसमें कुछ मामलों को देखा है के रूप में एर, सावधानी, लिया जाना चाहिए. ऊपर विनियमन इस आरएनएआई प्रेरित mRNA व्यापक या कुछ जीनों के लिए अद्वितीय हो सकता है अगर यह वर्तमान में अज्ञात है. पश्चिमी धब्बा विश्लेषण जीन पछाड़ना पुष्टि करने के लिए एक और तरीका है. यह अंतिम प्रोटीन उत्पाद की राशि के उपाय के रूप में यह विधि काफी विश्वसनीय है. लक्ष्य जीन के प्रोटीन उत्पाद के खिलाफ एक विशिष्ट एंटीबॉडी की आवश्यकता इस दृष्टिकोण के लिए एक नकारात्मक पहलू है. प्ररूपी विश्लेषण के अलावा कई स्वतंत्र माप का उपयोग आरएनएआई आधारित विश्लेषण द्वारा प्राप्त प्ररूपी डेटा के आत्मविश्वास में वृद्धि होगी.

टी में अपनी अवधारणा के बाद castaneum, आरएनएआई मुख्य रूप से विकास और पैटर्न गठन में जीन समारोह का अध्ययन करने के लिए इस्तेमाल किया गया है. ये टी castaneum विकास अध्ययन चरित्र में अत्यधिक सफल रहे हैंजीन की evolutionarily संरक्षित और भिन्न कार्यों terizing (Denell 2008 1 और Klingler 2004 2 में समीक्षा). टी में हालांकि, आरएनएआई आधारित पढ़ाई castaneum विकासात्मक जीव विज्ञान तक सीमित नहीं हैं. उदाहरण के लिए, आरएनएआई तनाव सहिष्णुता, लूटमार, आक्रामकता, दोस्त विकल्प, गतिविधि पैटर्न, और सुरक्षा तंत्र सहित शारीरिक और व्यवहार प्रतिक्रियाओं, की एक विस्तृत श्रृंखला में जीन समारोह का अध्ययन करने के लिए उपयोग किया जा सकता है.

इन संदर्भों को आरएनएआई आवेदन करने के एक कठिनाई pleiotropic प्रभाव की संभावना है. अक्सर, ब्याज की जीन टी भर में भूमिकाओं की एक किस्म होगा castaneum जीवन चक्र, इस प्रकार कठिन अनायास ही प्ररूपी प्रभाव के बिना जीन को हटाने बना रही है. हालांकि, आसानी चरणों की एक किस्म पर आरएनएआई प्रदर्शन करने की क्षमता अक्सर इन pleiotropic प्रभाव से बचने के लिए एक प्रभावी रणनीति हो सकती है. उदाहरण के लिए, बजाय लार्वा या pupae के वयस्कों में आरएनएआई प्रदर्शन कर हमें unin नाकाम करने के लिए अनुमति दे सकते हैंप्रारंभिक विकास के दौरान जीन पछाड़ना के कारण मारक हो जाती थी. टी में आरएनएआई प्रतिक्रिया के लचीलेपन castaneum इस प्रकार शारीरिक और व्यवहार प्रतिक्रियाओं में जीन समारोह के प्रयोगों के लिए आरएनएआई आदत डाल के लिए इस मॉडल एक आकर्षक विकल्प बनाता है.

टी castaneum प्रणाली भी एक शिक्षण प्रयोगशाला में प्रयोग के लिए आदर्श है. टी castaneum टी में आरएनएआई तकनीक लगातार subculturing बिना कमरे के तापमान (25 डिग्री सेल्सियस) पर एक आटा / खमीर मिश्रण पर आसानी से संवर्धित किया जा सकता है, और castaneum काफी सरल युवा, सीखने वैज्ञानिकों के साथ एक प्रयोगशाला के लिए अनुकूलित किया जाना है. आरएनएआई जैविक क्षेत्र की एक किस्म में एक आवश्यक तकनीक होता जा रहा है के रूप में, यह छात्रों को इस तकनीक को उजागर कर रहे हैं कि महत्वपूर्ण है. टी में लार्वा आरएनएआई तकनीक का सीधा आगे प्रकृति castaneum भी टी, जिससे अनुसंधान में शामिल होने के लिए और अधिक छात्रों को प्रोत्साहित करती है आनुवंशिक प्रणाली उन्मुख एक कक्षा के लिए एक प्रमुख उम्मीदवार castaneum. </ P>

Disclosures

लेखकों का खुलासा करने के लिए कुछ भी नहीं है.

Acknowledgments

हम तकनीकी समर्थन के लिए मियामी विश्वविद्यालय में जैव सूचना विज्ञान और कार्यात्मक जीनोमिक्स के लिए केंद्र (CBFG) धन्यवाद. इस काम के मियामी विश्वविद्यालय शुरू हुआ अनुदान (YT), और राष्ट्रीय विज्ञान फाउंडेशन (: IOS 0950964 YT) द्वारा समर्थित किया गया.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Organic whole wheat flour  Heartland Mill Inc. Kansas G1
Brewer’s yeast MP Biomedicals 2903312 Sift yeast with #35 stainless sieve before use. Wear protective mask and cover the sieve with plastic wrap, as the sifted yeast is a fine particle and respiratory hazardus.
6 oz plastic Drosophila stock bottles Fisher Scientific 11-888
Sieve Fisher Scientific  04-881N 8 in. dia. x 2 in.D. Use #25 (Nominal opening 710 µm) for larvae, pupae, and adults. 
Sieve Fisher Scientific  04 881 10P 8 in. diameter #35 (Nominal seive opening: 600 µm)  Stainless Steel Sieves, 8 in. dia. x 2 in.D. This sieve is ideal to remove clumps from yeast powder.
Sieve receiver Fisher Scientific  04-866B 8 in. diameter
1.5 Quart spouted sample pan  Seedburo Equipment Co. Model 33 collection pan
Incubator BioCold Environmental Inc BC26-IN Keep it 30 °C with 70% humidity.
Na2HPO4 Fisher Scientific  S374500
NaH2PO4 Fisher Scientific S397-500
KCl Fisher Scientific  P217-500
Food dye  Kroger green, blue, or red preferable
Microscope glass slide  Fisher Scientific  22-038-103
Tack-It Over&Over Aleene's Repositionable glue for sticky slides. Double sided tape can be used as an alternative, however, we found that the adhesiveness varies.
Plastic CD case Amazon
Boroslilicate glass capillary Sutter Instrument BF100-50-15 O.D. 1 mm, I.D. 0.5 mm, 15 cm. Without filament
Needle puller Sutter Instrument P-87 or P-97 
Removable mounting putty  Loctite Fun-Tak
Compressed gas duster OfficeMax OM96091
Forceps Fine Science Tool 11231-30 Dumoxel #3 (to manipulate beetles)
Forceps Fine Science Tool 11252-20 INOX #5 (to break needle tips)
Ethyl ether, anhydrous  Fisher Scientific  E138-500
Nylon mesh Flystuff/Genessee Scientific 57-102 120 µm pore size/49% open area
Media bottle, 100 ml VWR 89000-926
Stereomicroscope Zeiss SteREO Discovery V12. Injection microscope.
Stereomicroscope Fisher/Zeiss 12-070-513  Stemi2000. Use to break the needle and place larvae onto the sticky slide.
X-Y mechanical stage  Zeiss 4354600000000000
X-Y mechanical stage  Microscopenet.com A512 Inexpensive alternative
Manipulator Narishige M-152
Magnetic stand Narishige GJ-1 
Glass capillary holder Narishige IM-H1 
30 ml Disposable syringe BD syringe 309650 BD Luer-Lok Tip
Four-way stopcock  Cole-Parmer Instrument Co. EW-30600-03 Stopcocks with Luer connections; 4-way; male slip
Art paint brush Amazon Art Advantage Oil and Acrylic Brush Set, 24-Piece Any general paint brush will work.

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References

  1. Denell, R. Establishment of Tribolium as a genetic model system and its early contributions to evo-devo. Genetics. 180, 1779-1786 (2008).
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Erratum

Formal Correction: Erratum: Larval RNA Interference in the Red Flour Beetle, Tribolium castaneum
Posted by JoVE Editors on 10/01/2015. Citeable Link.

An erratum was issued for Larval RNA Interference in the Red Flour Beetle, Tribolium castaneum. There was a typo in the settings for Sutter P-87 in step 4.1.

Step 4.1 was updated from:

Pull borosilicate glass needles (B100-50-15, O.D.: 1 mm, I.D.: 0.5 mm, 15 cm length) by a needle puller.
NOTE: For Sutter P-87 or P-97, use the setting “Heat = 70, Pull = 45, Vel = 75, Time = 90” or follow Chapter 2 of the Pipette Cookbook: Adherent Cell, C. elegans, Drosophila, & Zebrafish– Recommended Programs. The optimal settings vary depending on the model of the needle puller. The setting for a generic Drosophila injection needle is a good starting point.

to

Pull borosilicate glass needles (B100-50-15, O.D.: 1 mm, I.D.: 0.5 mm, 15 cm length) by a needle puller.
NOTE: For Sutter P-87 or P-97, use the setting “Heat = 770, Pull = 45, Vel = 75, Time = 90” or follow Chapter 2 of the Pipette Cookbook: Adherent Cell, C. elegans, Drosophila, & Zebrafish– Recommended Programs. The optimal settings vary depending on the model of the needle puller. The setting for a generic Drosophila injection needle is a good starting point.

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