구강 안면 표현형의 정량화에

Biology

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Summary

아프리카 발톱 개구리 laevis의 배아의 구강 안면 크기 및 형상을 정량화하는 방법이 개발되었다. 이 프로토콜에서, 기존의 크기 측정은 구강 안면 현상 결함의보다 정교한 분석을 허용하기 위해 기하학적 morphometrics과 결합된다.

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Kennedy, A. E., Dickinson, A. J. Quantification of Orofacial Phenotypes in Xenopus. J. Vis. Exp. (93), e52062, doi:10.3791/52062 (2014).

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Abstract

Xenopus의 개발은 두개 안면 결함을 관리하는 메커니즘을 해부위한 중요한 도구가되었다. 구강 안면 현상을 정량화하는 방법은 유전자 또는 분자 유전자 발현 또는 단백질의 기능을 조작 할 수있는 물질과 폐기시 구강 안면 표현형보다 엄격한 분석을 허용 할 것이다. 배아 머리의 두 차원 이미지를 사용하여, 기존 사이즈의 치수를-같은 구강 안면 폭, 높이 등 및 지역 - 측정한다. 또한, 배아 입 개구의 진원도 측정 입의 형상을 설명하는 데 사용된다. 이러한 이차원 영상의 기하학적 morphometrics 또한 구강 안면 영역의 형상의 변화에​​보다 정교한 뷰를 제공하기 위해 수행된다. 랜드 마크는 구강 안면 영역의 특정 지점에 할당 및 좌표가 생성됩니다. 주성분 분석은 치료를 판별 원리 성분 표식 좌표를 줄이기 위해 사용되는그룹. 이러한 결과는 비슷한 구강 안면 형태와 개인이 함께 클러스터링하는 산포도로 표시됩니다. 또한 통계적 두 치료군 간의 랜드 마크의 위치를​​ 비교 판별 함수 분석을 수행하는 것이 유용하다. 이 분석은 랜드 마크의 위치 변화가 벡터로 볼 수 있습니다 변환 그리드에 표시됩니다. 그리드는 왜곡 패턴이 중요한 랜드 마크 위치가 변경된 위치를 표시하는 표시되도록이 벡터에 놓이게됩니다. 판별 함수 분석 형상 변화는 통계적 측정치에 기초하며, 따라서 p- 값에 의해 평가 될 수있다. 이 분석은 입체경 프리웨어 소프트웨어를 필요로하는, 단순하며, 따라서 귀중한 연구 및 교육 자료가 될 것이다.

Introduction

인간의 출생 결함의 가장 흔하고 치명적인 유형 중 같은 구강 안면 쪼개진 조각 1로 입과 얼굴에 영향을 미치는 것들이다. 잘못된 구강 안면 구조와 아이들은 평생 동안 여러 수술을 받아야 얼굴 disfigurements, 언어, 청각 먹는 문제를 투쟁. 따라서, cranio- 및 구강 안면 개발의 새로운 연구를 촉진하는 것은 인간의 출생 결함의 이러한 유형의 예방 및 치료에 중요합니다. 아프리카 발톱 개구리 laevis의는 두개 안면 개발을 관리하는 메커니즘을 해부를위한 새로운 도구로 떠오르고있다 (몇 가지 예 2,3,4 포함 -11). 따라서,이 종류의 헤드의 개발 및 얼굴 중 크기 및 형상 변화를 정량적으로 분석하는 방법은 매우 강력 할 수있다.

여기서, 우리는 이러한 방법을 제시한다; Xenopus의 연구 (12)에서 적응 기하학적 morphometrics 전통적인 크기 측정을 결합 13-15을 분석하는 연구의 SUP>를 찾을 수있다. 이 프로토콜의 목표는 연구자가 정상 및 비정상 개발하는 동안 다른 구강 안면 표현형을 구별하는 얼굴 크기와 모양을 정량화 할 수 있도록하는 것입니다. 이 분석은 유전자 및 / 또는 환경 적 요인의 시너지 효과에서 발생하는 것과 같은 미묘한 두개 안면 결함 사이의 더 나은 차별화 수 있습니다. 또한, 이러한 정량화 방법은 또한 구강 안면 결함에도 약간 개선 또는 구조를 밝힐 수있다. 이것은 따라서 잠재적 인 치료제 분석에 유용한 가이드한다.

여기 제시 안면 측정 및 기하학적 morphometrics의 조합은 대체로 하나 또는 다른 15-18 활용 크기 및 현재의 프로토콜보다 구강 안면 영역의 형상 모두 포괄적 통계 분석을 허용한다. 또한, 우리는 내측과 외측의 양쪽면을 평가할 수있는 간단한 방법을 제시현재 연구 13, 19에서 사용 된 복잡한 3 차원 화상 장비 없이도 얼굴.

우리는 아프리카 발톱 개구리에이 프로토콜은 비정상적인 구강 안면 개발 및 중간 구개열 2,3를 유도하는 레티노 산 수용체 억제제로 치료 배아를 laevis의 보여줍니다. 이러한 배아의 구강 안면 영역의 크기와 모양의 정량화 비슷한 구개 쪼개진 조각 및 마우스 모델 (20, 21)와 인간과 유사하다 midface의 변화를 공개했다. 그러나이 프로토콜은 예컨대 성장 인자와 같은 천연 물질, 제초제, 또는 단백질과 같은 구강 안면 발달에 다른 화합물의 효과를 평가하는데 이용 될 수있다. 또한, 손실 또는 함수 실험의 이득을 통해 유전자 발현을 교란으로부터 발생하는 구강 안면 크기 및 형태의 변화 (안티센스 morpholinos 또는 Crispers를 사용하여이 / Talens)도이 프로토콜을 이용하여 정량화 할 수있다. 마지막으로, 우리는이 방법의 사양보다 개발에서야 Xenopus의 형태를 평가하기 위해; 그러나, 용이하게 임의의 척추 동물의 분석을 위해 수정된다. 다른 응용 프로그램도 진화 또는 생태 연구에 밀접하게 관련 종을 비교하는이 프로토콜을 사용하여 포함 할 수있다. 우리가 여기에서 제공하는 예는 구강 안면 영역의 분석을 설명하는이 프로토콜을 사용하지만, 쉽게 다른 지역, 기관, 또는 구조의 분석을 위해 수정할 수 있습니다.

이 구강 안면 정량화 프로토콜은 연구 지역 사회를위한 귀중한 자원뿐만 아니라, 비디오 데모와 같은 학부 학생들을위한 훌륭한 교육 도구가 될 것이다.

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Protocol

아프리카 발톱 개구리 laevis의를 사용하여 수행 모든 실험은 IACUC (프로토콜 # 1 AD20261)에 의해 승인되었습니다.

1. 준비 시약 및 필요한 재료

  1. 시약 :
    1. 10 배 MBS (수정 바스의 생리 식염수) 솔루션 (22)의 1 L를 확인합니다. 증류수로 1 L의 NaCl (880 mM)을의 KCl (10 mM)을 황산 (10 mM)을 HEPES (50 mM의, pH를 7.8) 및의 NaHCO3 (25 mm)를 추가한다. NaOH로 7.8의 pH를 조정합니다.
    2. 증류수 900 ml의 10 배 MBS 용액 100 ml에 희석하여 1 배속 MBS 1 L합니다. 1 M CaCl2를 솔루션의 0.7 ML을 추가합니다.
    3. 증류수 900 ㎖ 중의 1X MBS 용액 100 ml에 희석시켜 0.1X MBS 1 L합니다. 0.1X MBS 용액의 1 L에, 배아 배양에 사용하기 위해 10 ㎎ / ㎖ 젠타 마이신 액 1ml를 추가한다.
    4. 10 배 MBS 100ml에 5 M NaCl을 4 ml에 용해하여 높은 소금 MBS를 확인합니다. 전체 볼륨이 1 L. 될 때까지 증류수를 추가
    5. 100 % 전자 희석하여 70 % 에탄올을 만들기70 % 에탄올에 thanol는 증류수를 사용.
    6. 디메틸 설폭 사이드 (DMSO)의 10 mM 스톡 용액을 준비하여 BMS-543을 확인.
    7. 증류수 50 ㎖에 파라 포름 알데히드 분말 4g을 첨가하여 4 % 파라 포름 알데히드 (PFA)를 확인. 솔루션을 넘을 때까지 핫 플레이트에 열이 약 지적하는 65 ° C는, 5 M NaOH를 드롭 현명한 추가 할 수 있습니다.
      1. 이 솔루션은 클리어하면, PBS 배 50 ㎖ 및 100 μL 트윈-20 열에서 제거하고 추가 할 수 있습니다. 얼음에 실온으로 냉각 할 수 있습니다. 염산을 사용하여 7.2 사이 pH를 7.5로 조정합니다.
    8. 8g의 NaCl, 0.2 g의 KCl, 나 2 HPO 4 1.44 g 및 증류수 800 ㎖ 중의 KH 2 PO 4 0.24 g을 용해시켜 트윈 (PBT)와 인산염 완충 생리 식염수합니다. 염산을 사용하여 7.4로 pH를 조정합니다. 트윈 (20) 2 ㎖를 추가합니다. 동일한 1 L. 증류수로 최종 볼륨을 조절합니다
    9. 50 ml의 증류수 또는 0.1X MBS에서 시스테인의 1g을 용해하여 시스테인 솔루션을합니다. 5 M의 NaOH의 1.5 ML을 추가ND 7.8 pH를 조정합니다.
    10. 100 ml의 100 %의 EtOH에 벤조 카인 분말 10g을 첨가하여 10 %의 벤조 카인 스톡 용액을 만든다. 성인 남성과 고정을위한 준비 배아의 안락사를 들어, 0.05 % 용액에 희석.
    11. L15 버퍼 9 ml의 혈청 1 ㎖를 첨가하여 정소 저장 솔루션을 확인.
  2. 필요한 도구 및 장비 :
    1. 재료 및 장비의 표에 나와있는 장비를 확보, 그림 1.
    2. 피펫 도구를 수정합니다. 분젠 버너의 불꽃에 유리 파스퇴르 피펫의 끝을 놓습니다. 그것이 녹아 둥근 밀봉 끝을 형성 할 때까지 피펫 팁을 돌립니다.
    3. 전체 판을 충당하기 위해 부드럽게, 플라스틱 배양 접시의 바닥에 점토를 평평하게 (어떤 크기를 사용할 수 있습니다) (그림 1Aiv).
      1. 가볍게 45도 각도로 점토 늘어선 접시에 직선 괴롭 히고 바늘을 누릅니다. 페트리 이동 천천히가 바늘을 잡고우울 라인 (그림 1Bi)을 만들 수평 요리. 원하는 행 번호를 반복합니다.
      2. 촬영하는 동안 배아 조직에서 배아 헤드 (그림 1Bii)과 원조를 배치 점토 늘어선 접시의 각 행에 얕은 원형 함몰을 만들기 위해 유리 피펫 도구의 끝을 사용합니다.
      3. 사진의 경우, PBT (그림 1Biii)와 접시를 채운다. 사용하는 사이에, 철저하게 70 % 에탄올 다음 멸균 수로 요리와 점토 표면을 씻어.

2. 아프리카 발톱 개구리 laevis의 배아 문화 억제제 치료

  1. 아프리카 발톱 개구리 계란의 체외 수정 및 문화 :
    1. 확보 및 문화 Xenopus의 표준 게시 방법 (22, 23)를 사용하여 배아를 laevis의.
    2. 간단히 말해서, 0.05 % 벤조 용액에 침수에 의해 성인 남성을 안락사. 고환 저장 버퍼에 저장 고환 해부. 주사인간 융모 성 성선 자극 호르몬 (HCG)와 성인 여성은, 높은 소금 MBS에서 계란을 수집하고 (그림 2A, B) 해부 고환과 함께 체외에서 비옥.
    3. 15 ° C에서 0.1X MBS 문화 배아 원하는 단계 (Nieuwkoop 및 페이버 (24, 25)에 의한 아프리카 발톱 개구리 laevis의의 일반 테이블에 따라 단계의 배아)에 도달 할 때까지.
      1. 여기에, 단계 (22) (24 시간 게시물 수정 (HPF)), 그리고 날카롭게 포셉 두 쌍을 사용하여 입체 현미경 난황 막 제거 할 때까지 문화의 배아. 0.1X MBS의 30 ~ 40 ml를 포함하는 깨끗한 페트리 접시 (직경 100mm)에 대한 표준, 일회용 전송 피펫으로 배아를 전송.
  2. (그림 2) Xenopus의 배아의 억제제 치료 :
    1. 보정 된 피펫 남자를 사용 0.1X MBS의 1 mL를 24 웰 배양 접시의 필요한 우물을 입력합니다. 좋은 점 표시가 아니라 외부의 경계를ER (그림 2D, 삽입). 또한 콘텐츠를 24- 웰 배양 접시 뚜껑에 각 웰에 첨가 할 라벨 마커를 사용한다. 실험실 노트북에서 24도 설정 페이지에이 정보를 복사합니다.
    2. 물론 표준, 일회용 전송 피펫 (그림 2C)를 사용하여 각각에 5 ~ 10 배아를 전송합니다. 물론 각 배아의 동일한 수를 놓습니다.
    3. 최대 최고하거나 1 ml의 표시 줄 (그림 2D)와 수평이되도록 0.1X의 MBS를 제거합니다. DMSO의 적절한 부피 추가 (DMSO의 최종 부피가되도록 1 %)와 부드럽게 소용돌이 친다. 배아에 너무 가까이 DMSO를 추가하지 않도록주의하고, 버퍼의 표면에 배아의 접촉을 피하십시오.
    4. 지정된 우물에 화학 물질의 적절한 볼륨을 추가하고 부드럽게 다시 소용돌이 친다. 여기에, 1 ml의 0.1X의 MBS에 10 mM의 BMS-453 (레티노 산 수용체 길항제) 및 DMSO 9 μL의 1 μl를 추가합니다.
    5. 화학 물질은 빛에 민감한 경우, 느슨하게 막 다른 포장알루미늄 호일에 진짜야 요리. 원하는 단계까지 15 ° C 배양기에서 배양 배아. 이 예에서, 16​​ ~ 18 시간 동안 배아를 취급합니다.
  3. 치료에서 배아를 세척 및 올챙이 단계까지 양육 :
    1. 일회용 전송 피펫으로 용액의 4 분의 3에 절반을 제거합니다. 배아를 방해하지 않도록주의하십시오. 새 전송 피펫을 사용하여, 0.1X MBS와 잘 리필. 이 3-6 번 반복합니다.
    2. 겐타 마이신과 0.1X MBS 100 ㎖ (1 ㎖ / L)를 포함하는 큰 페트리 접시 (직경 150mm)로 전송 배아. 그들은 단계를 42-45 (28-38 HPF)에 도달 할 때까지 15 ° C에서 배아를 품어.
    3. 매일 0.1X의 MBS 솔루션을 포함하는 겐타 마이신을 변경하고 다른 배아의 오염 또는 사망을 방지하기 위해 신속하게 죽은 배아를 제거합니다. 연구실 노트북에서 죽은 배아의 수를 기록한다.
  4. 파라 포름 알데히드에 고정 배아 (PFA) :
    1. 단계 (42) 45 (82에서 100 사이의 배아를 수정0.1X의 MBS의 1-2 ml를 포함하는 새로운 24 웰 배양 접시에 그들을 전송하여 각각 HPF). 처리 설정은 전술 한 바와 같이 동일한 정보 (섹션 2.2.1)와 뚜껑 레이블.
    2. 여전히 덮여 배아를 떠나 부상을 방지하기 위해 최소한의 접촉을 유지하면서, 각 웰로부터 가능하면 많은 0.1X의 MBS를 제거합니다. 0.1X MBS에서 0.05 % 벤조 솔루션의 1-2 ML을 추가하고 배아가 더 이상 자극에 반응 할 때까지 배양 없습니다.
    3. 4 % PFA의 1-2 ML을 추가합니다. 선호하는 경우 또는, 고정 표지 마이크로 원심 튜브에 배아를 놓습니다.
    4. 회전 진탕 기에서 4 ° C에서 24 시간 동안 PFA에서 배아를 품어. 3-5 시간에 걸쳐 PBT 3-4 세척을 수행하여 PFA를 제거합니다.

3. 아프리카 발톱 개구리 올챙이의 구강 안면 영역을 사진 촬영

  1. 전 촬영 준비 (이것은도 3에 도시되어있다) :
    1. (150 큰 페트리 접시에 고정 된 배아를 놓습니다PBT의 약 100 ㎖에 함유하는 직경 mm).
    2. (그림 3A, 검은 색 라인)에서 머리를 절단하는 두 개의 절개를합니다. 첫째, 집게 한 쌍의 배아를 보유하고 멸균 메스 (그림 3B)과 창자의 후방 측의 절개를합니다. 완전히 머리 (그림 3C)를 제거하기 위해, 심장 근처 창자의 전방 측에 두 번째 절개를합니다.
    3. 피펫은 표준, 일회용 전송 피펫을 사용하여 점토 늘어선 접시 (부분 1.2.2)에 배아의 머리를 절단.
      1. 정면 뷰의 원형 오목 내부 다운 배아 헤드 후방 측에 위치하는 두 쌍의 집게를 사용한다. 집게를 사용하면 태아의 머리와 주변 점토, 그들은 카메라에 직면하고 뒤로 또는 양쪽 (그림 3D)에 경사되지 않도록 위치 배아를 모두 조작 할 수 있습니다. 부드럽게 겸자 및 / 또는 유리를 사용 머리 주위 주변 점토 밀어피펫 도구 위치에 헤드를 고정한다.
      2. 측면도를 들어, 동일한 방향으로 향하게하는, 그들의 측면에 있으며, 점토에 평평하게되도록 상기 원형 오목 내부 배아 헤드를 위치 시키도록 집게를 사용한다. 배아 헤드와 모든 배아 시멘트 땀샘은 동일한 각도 (도 3E)에 하방 위치하도록 주변 점토를 조작. 측면 측정을 할 때 정확성을 기하기 위해 가이드로 놀리는 바늘로 그려 행을 사용합니다.
  2. 올챙이 헤드의 이미지를 캡처 :
    1. 부착 된 디지털 카메라와 해당 카메라 소프트웨어 어떠한 해부 현미경을 사용하여 올챙이 머리 사진. 모든 배아에 대해 일정하게 유지 될 수있는 가장 높은 배율을 사용합니다.
    2. 배아를 중심과 같은 방향 모두에 직면한다. 구강 안면 영역의 가장 정확한 화상을 허용 최상의 조명 조건을 사용하여 이미지를 캡쳐. 위치빛은 과도한 그림자를 방지 할 수 있습니다. .TIFF 가능한 가장 높은 해상도를 가진 파일로 이미지를 저장합니다.

4. 측정 및 아프리카 발톱 개구리 올챙이의 얼굴 크기 치수를 분석

  1. (그림 4에 요약) 구강 안면 치수를 측정한다 :
    1. 얼굴의 폭을 결정합니다. 각 눈의 복부 부분면 (도 4a, 화살표)의 주위에 부합하는 점을 식별하고이 지점 (도 4a, 적색 선) 사이의 거리를 측정한다.
    2. 얼굴 높이를 결정합니다. 먼저, 각각의 눈 사이의 거리를 측정하고, 중도에서 마크를 계산함으로써 중간 선을 결정한다. 다음, 눈의 등 대부분의 가장자리와 지느러미 시멘트 선 (그림 4B, 흰색 선) 대부분의 지점을 표시 수평 라인을 그립니다. 정중선에서, 수평 라인 (도 4B, 적색 선) 사이의 거리를 측정한다.
    3. T를 결정그는 구강 안면 영역입니다. 지역 측정을 안내하는 눈과 시멘트 동맥의 지느러미 가장자리 (그림 4C, 흰색 선)을 표시 동일한 수평 라인을 사용합니다. 시멘트 동맥의 상부 마킹 수평선면 (도 4Ca)의 좌측의 주위를 충족시키는 시점에서 시작한다.
      1. 눈의 상부 마킹 수평선면 (도 4Cb)의 주위를 충족시키는 지점까지 눈 포괄면의 가장자리를 따라 추적. 이면 (도 4Cc)의 우측의 주위를 충족 포인트까지이 등쪽 가장 선상 추적 계속.
      2. 시멘트 동맥의 상부 마킹 복부 가장 수평선면 (도 4CD)의 우측의 주위를 충족시키는 지점까지 눈 포괄면의 가장자리를 따라 아래쪽으로 추적. 이 바닥 수평 라인 UNT를 따라 추적 계속일리노이는 추적이 시작 포인트를 충족합니다. 추적 내부의 면적을 계산하는 사진 편집 소프트웨어를 사용합니다.
    4. 주둥이의 길이를 결정합니다. 측면 이미지에서 눈의 앞쪽을 표시하는 수직선을합니다. 다음으로, 얼굴이 눈 (그림 4D)의 전방을 표시하는 수직선에 시멘트 글 랜드의 지느러미 가장자리를 충족 전방 대부분의 지점에서 수평 거리를 측정한다.
    5. 입 폭을 결정합니다. 좌측 및 우측 포인트 사이의 수평 거리를 측정 여기서 입을 열고 대회 (도 4E)의 상부 및 하부 "입술". 이들은 입술 commissures의 개구리 동등한 것으로 간주 될 수있다.
    6. 입 원형을 결정합니다. (여기서 역 가로 세로 비율로 4 입 원형을 계산 × [영역]) / (π × [주요 축] 2 >).
      1. 도 4F에 도시 한 바와 같이 입 개구의 에지를 추적 사진 편집기에서 올가미 도구를 사용한다. 기본 도구 모음에서 분석을 선택하고 측정을 선택합니다. 대안 적으로, 영역과 입 개구의 직경의 측정에서 진원도를 계산.
  2. 안면 크기의 데이터 분석 :
    1. 입력 데이터 분석 프로그램으로 안면 크기의 측정치가 제​​어 처리 그룹과 비교한다. 막대 그래프를 만들 수있는 실험 군과 대조군 모두 각 측정의 평균을 결정합니다. 오차 막대를 생성하기 위해 표준 편차를 결정합니다. 통계적으로 그룹을 비교하기 위해 학생의 t- 테스트를 수행합니다.
      참고 :이 데이터로 인해 배아 중 개발의 약간 다른 속도로 매우 변수가 될 수 있습니다.

구강 안면 모양과 Morphometrics 5. 정량 분석

  1. 장소의 랜드 마크와 CREA(그림 5A에서 도시) 테 랜드 마크 좌표 파일.
    1. 이들이 대상 화상의 형상을 포착하고, 분석되는 모든 샘플에 반복적으로 동일한 상대 위치에 배치 될 수있는 랜드 마크를 선택한다. 구조는 모든 샘플에 존재하지 않는 경우,이 구조에 랜드 마크를 설치하지 마십시오.
      1. 여기에, 같은 눈, 콧 구멍, 입으로 구별 부호로 midface을 대표하는 랜드 마크 (24)를 배치합니다. 일관성을 위해, 장소는 이전 배치 (예를 들어, 입 랜드 마크, 그림 5Ai) 랜드 마크의 중간 랜드 마크.
    2. 랜드 마크의 좌표를 캡처하고 "랜드 마크 파일 좌표"만듭니다. 올챙이면 (예를 들면, 제 1 제어 배아)의 첫 번째 이미지를 연다.
      1. 기본 도구 모음의 플러그인 탭을 선택하고 드롭 다운 메뉴에서 Pointpicker을 선택합니다. 랜드 마크는 여러 가지 빛깔의 십자가로 나타납니다으로 (원하는 위치에 추가 포인트 탭과 장소의 랜드 마크를 선택
      2. 이동 십자가 도구를 선택하여 배치 한 후 랜드 마크의 위치를​​ 이동합니다. 모든 랜드 마크가 이미지에 배치 된 경우, 기본 도구 모음의 결과 표시 탭을 선택하고 랜드 마크의 좌표를 표시하고 스프레드 시트 프로그램 (그림 5Aiii)에 복사 표시 (그림 5Aii)을 선택합니다.
      3. 스프레드 시트 프로그램에 첫 번째 배아에서 이러한 좌표를 붙여 넣을 때 데이터 위에 빈 행을 둡니다. 샘플의 랜드 마크의 수와이 빈 행 (1 행), 유형 "LM ="의 열 B에서. 24 랜드 마크가 (그림 5Aiii, 빨간색 상자)을 만든 이후 여기에, "LM = 24"를 입력합니다.
      4. 샘플을 식별하는 이름을 가진 데이터 포인트를 입력 아래 행 "ID ="합니다. 이 랜드 마크는 제 1 제어 배아 (그림 5Aiii, 빨간색 화살표)의 좌표 데이터이기 때문에 여기에 그림 5Aiii에서, "ID = CON1"를 입력합니다.
      5. 참고 : 각 배아는 "ID ="행의 고유 한 이름을 부여하는 것이 중요합니다. 이 대조군 배아 번째 이후 여기서 예를 들면, 랜드 마크의 다음 좌표 세트 "는 CON2"의 ID를 부여한다.
      6. 텍스트 문서로 전체 2 번째 및 3 번째의 열이 복사 .txt 파일로 저장합니다.
  2. (도 5b에 도시 된) 데이터 분석에 대한 형태 학적 소프트웨어 프로그램을 설정한다.
    1. 여기에, 형태 계측 학적 소프트웨어 프로그램의 메인 메뉴에서 새 데이터 세트 만들기를 선택합니다. 파일 및 해당 상자에 데이터 세트의 이름 (예를 들어, "레티노 산 억제"와 "얼굴의 랜드 마크", 각각) 팝업 화면에서 (그림 5Bi). TPS 및 셀프로 파일을 가져옵니다요법 데이터 세트 (그림 5Bi, 빨간색 화살표)를 만들 수있는 좌표의 텍스트 파일.
    2. 데이터 정렬 및 프로크루스테스 맞게 :
      1. 프로크루스테스의 착용감과 정렬을 수행합니다. 프로젝트 트리 탭에서 설정 한 데이터를 강조 기본 도구 모음에서 예선을 선택하고 드롭 다운 메뉴에서 새로운 프로크루스테스 맞습니다.
      2. 주요 축으로 정렬을 선택하고 상자 (그림 5Bii, 빨간색 화살표)의 하단에 프로크루스테스 피팅을 수행 선택합니다. 드롭 다운 메뉴에서 사전 준비로 돌아 공분산 행렬 (그림 5Biii를) 생성을 선택하고 실행을 선택합니다.
      3. 결과 탭에서 공분산 행렬의 상관 관계를 볼 수 있습니다.
    3. 은 실험군 또는 대조군에 속하는지 여부를 구별하기 위해 적절한 분급 변수 데이터 세트의 각 샘플을 할당하여 "분류기 파일"을 만든다.
      1. 스프레드 시트에 두 개의 열 레이블. 처음이 칼럼의 헤더 레이블n은 "ID"및 입력과 동일한 ID의 각 샘플에 대해 소정의 (예를 들어, CON1, RARINHIB1 등도 5Biv). 각각의 셀에 인접하는 셀 ID에 나열된 샘플에 대응하는 처리 그룹을 "TREATMENT"입력 갖는 제 2 열의 헤더 레이블.
      2. 여기에, 분류 (그림 5Biv)와 같은 "CONTROL 및 RAR INHIBITOR"레이블을 사용합니다. 텍스트 파일에 복사하고 .txt 파일로 저장합니다. 형태 계측 학적 소프트웨어 프로그램으로 가져 분류 변수. 식별자에 의해 상대를 선택하고 텍스트 파일 (그림 5Bv)을 엽니 다.
  3. 변주 드롭 다운 메뉴를 선택하고 주성분 분석 (그림 6Ai)를 선택하여 주성분 분석 (PCA) 산포도를 작성합니다. PC 모양 변경, 고유 및 PC ​​점수 (그림 6Aii) : 다음, 세 개의 추가 탭을 볼 수있는 그래픽 탭을 선택합니다. PC 점수 탭 B를 표시합니다프로크루스테스 맞는 랜드 마크 데이터 (그림 6Aii)의 주성분 산점도를 ivariate.
    1. 주요 구성 요소가 플롯되는 변경하려면, 플롯 공간에서 팝업 메뉴가 나타납니다 (그림 6Aiii, 빨간색 화살표)을 변경하기 원하는 축을 선택합니다.
    2. 색상 데이터 포인트 도구 (그림 6Aiii)을 선택합니다. 선택 분류 이전에 각 카테고리 (그림 6Aiv)의 색상을 결정하기 위해 나타나는 두 번째 팝업 메뉴에서 (5.2.2)을 수입했다.
    3. 결과 탭 (그림 6Av)의 각 주요 구성 요소에 의해 캡처 된 분산의 양을 확인합니다. 이 .bmp 파일로 내보내기 그래프.
  4. 비교 탭 (그림 6Bi)에서 판별 기능 분석을 선택하여 형태 계측 학적 소프트웨어 프로그램의 판별 기능 분석 (DFA) 변환 그리드를 만듭니다. 팝업 메뉴에서 해당 데이터 집합 SEL인지 확인반사 된 데이터의 유형 프로크루스테스 맞는 좌표입니다.
    1. 그룹의 쌍을 비교하는 강조, 1000 순열 테스트 (그림 6Bii)를 실행합니다.
    2. 그래픽에서, 모양 차이 탭 (그림 6Biii)에서 좌표의 벡터지도를 볼 수 있습니다. 이미지가 반전되어있는 경우, 올바른 방향으로 (그림 6Biii)에서 다이어그램을 뒤집어 플롯 공간에서 팝업 메뉴가 나타납니다.
    3. 벡터의 방향은 이전의 분석 (도 6Bii) 실행으로 판별 기능 메뉴에 표시되는 제 2에 비해 첫 번째 그룹의 형상 차이를 반영한다. 상기 벡터의 방향을 반전 플롯 공간에서 팝업 메뉴를 표시하고 네거티브되도록 스케일 인자의 부호를 변경하려면 (도 6Biii를, ⅳ). 스케일 값의 값은 최고의 betwee 랜드 마크의 위치의 통계적인 차이를 나타내는 계수 10로 설정N 왜곡없이 두 그룹은 일반적으로 기본 (그림 6Biv)에 남아 있습니다.
    4. 또한 팝업 메뉴에서 그리드에 벡터를 중첩 변환 그리드 그래프를 변경 (그림 6Biii, V).
    5. 팝업 메뉴에서 그리드의 수평 및 수직 라인의 수를 지정합니다 (그림 6Biii를, V).
    6. .BMP 파일로 그래프를 내 보냅니다.
    7. 결과 탭 (그림 6Bvi)에서 프로크루스테스과 Mahalinobis 거리와 P-값을 볼 수 있습니다.
  5. 더 이상의 치료 그룹의 평가에 유용 추가 형태 계측 학적 분석
    1. 주성분 분석 변환 그리드를 만듭니다. PC 모양 탭은 각각의 샘플 그룹 내 변화를 차지 형상 변경의 벡터지도를 표시 변경합니다. 변환 그리드에 벡터를 제대로 이미지의 방향과 중첩 플롯 영역에서 팝업 메뉴를 사용합니다. 축척 비율을 설정합니다대조군의 예상 중심에 해당 PC 점수 그래프의 x 축에 대한 값. .BMP 파일로 이미지를 내 보냅니다.
    2. CVA의 산점도를 작성합니다. 기본 도구 모음의 비교 탭에서 캐 노니 컬 (Canonical) 변량 분석을 선택하고 이전에 (5.2.3 절 참조) 가져온 분류 변수 세트를 강조 표시합니다. 순열 테스트를위한 1000 반복을 선택하고 실행을 선택합니다. 이변 량 CVA의 산점도를 보려면 CV 점수 탭을 선택합니다. 이 업로드 된 분류에 따라 색상 코딩된다. 플롯 공간에서 팝업 메뉴를 가져 와서 색상을 변경합니다 (5.3.3 항 참조). .BMP 파일로 내보내기.
    3. CVA 변환 그리드를 만듭니다. 두 개 이상의 그룹을 비교할 때 CVA 결과 변형 그리드가 생성 될 수있다. 그래픽 탭에서 랜드 마크 좌표의 변환 표를 시각화 CV 모양 변경을 선택합니다. 변경 플롯 공간에서 팝업 메뉴를벡터의 방향은 변형 격자 상으로 결과를 중첩하고, 눈금의 수를 지정. .BMP 파일로 그래프를 내 보냅니다.

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Representative Results

여기서, 구강 안면 크기 및 형상의 정량 분석​​ 미처리 컨트롤 레티노 산 수용체 억제제 (RAR 억제제)로 처리 배아를 비교하는 것으로 입증되었다. 배아, 30 (26 ~ 35 HPF)로 단계 24에서이 화학 물질 억제제의 1 μM 농도로 처리 세척하고, 단계 (42) (82 HPF)로 고정되었다. 그런 다음 처리 프로토콜에 기술 된 바와 같이 분석 하였다. 결과는 원본 데이터,하지만 이전의 출판물 2,3 관측과 일치한다. 제어 배아 비히클, DMSO로 처리하고, (도 7Ai, ⅱ) 정상 개발되었다. (그림 7Aiii, IV) 더 삼각형 모양을 RAR 억제제의 1 μM 농도로 처리 태아의 얼굴, 눈의 이상에 약간의 협착을 보였으며, 그 열기, 잘못된 배아 입이었다.

첫째, 기존의 구강 안면 사이즈 측정하고,도 7b에 나타내었다. 에스 tatistical 의미는 각각의 측정에 대한 억제제 치료 배아와 컨트롤 사이의 불평등 한 분산을 가정 학생의 t- 테스트를 수행하여 결정 하였다. 우리는 주둥이의 길이와 얼굴 폭이 모두 크게 컨트롤에 비해 RAR 억제제 치료 배아 감소 것을 발견했다 (각각 P-값 = 0.0062과 0.0058; 그림 7BI을, II). 얼굴 높이와 입의 원형이 크게 증가하고있는 동안 (P-값을 = × 10 -6 3.7772은 1.4812 × 10 -7)이, 입의 폭이 현저하게 감소 하였다 (p 값 = 2.5175 × 10 -10, 그림 7Biii-V) 국지적 인 (도 7Bvi p- 값 = 0.3754) 결과 두 그룹 사이의 전체 구강 안면 영역에서 유의 한 차이를 보이지 않았다. 이러한 데이터는 배아 입 개구의 짧은 주둥이의 개발 결과에 특정 시간 레티노 산 신호 손실, midface 영역의 약간 좁아 및 기형을 나타낸다.

NT는 "> 감소 레티노 산 신호에 응답하여 상기 배아 구강 안면 영역의 형상 변화의 정교한 모습을 제공하기 위해, 우리는 다음의 기하학적 형태 계측이. 식별 및 형태 계측 학적 분석 소프트웨어를 사용하여 구강 안면 랜드 마크를 정렬 한 후, 우리는 각 내에 분산을 조사 분석 활용 처음 두 개의 주요 구성 요소가 서로 RAR 억제제 치료 배아에 대해 도시 하였을 때 주성분 분석 (PCA)을 통해 기. PC1 축 (도 7C)을 따라 대조군 명확히 구별되었다.이 테스트는 또한 샘플 세트 -에서 특이점을 보였다 그룹 (그림 7 (c), 화살표)의 나머지 부분과 클러스터되지 않은 두 억제제 치료 배아에 의해 설명.

다음에, RAR 억제제 치료 배아 및 컨트롤 간의 구강 안면 영역의 형상에 통계적 차이는 평가하고 판별 함수 분석 (DFA)를 수행하여 가시화 하였다. 프로크루스테스 거리 Between 두 그룹은 유의 한 차이가 있었다 (거리 = 0.2665, P 값 <0.0001, 그림 7D), 레티노 산 신호가 중단 될 때 구강 안면 모양의 변화를 나타내는. 실제로, 구강 안면 영역의 측면 랜드 마크의 위치에 극적인 변화는 억제제 치료 배아 (그림 7D)의 높이에 각각의 얼굴 모양의 축소를 나타냅니다. 또한, 코 랜드 (도 7D, 화살표)의 위치에 약간 외향 이동은 주둥이의 감소 파생물과 일관성이 배아 콧 구멍 위치의 이상을 알 수있다. 그 개방 삼각형 모양의 입의 형성을 반영 입 개구 표시 위치 변경의 가장자리를 둘러싸 랜드 마크의 변화는 우리의 이전 연구에보고 된 2,3- 중앙값 분열과 일치한다. 벡터 시프트에 더하여, 변환 그리드의 휘어짐 패턴도의 형상 변화를 도시 또는ofacial 지역. midface 지역에서 워프은 감소 레티노 산 신호 (그림 7D)와 배아에서 볼 수있는 midface 형성 부전과 전체 얼굴 축소와 일치한다.

판별 함수 분석 결과 (DFA)를 적절하게 단독으로 전통적인 크기 측정에 의해 포착되지 않은 일부 변경을 드러내는 형상 우리의 정성 분석과 일치 하였다 변화뿐만 아니라를 나타낸다. 구강 안면 영역 컨트롤 사이에 유의 한 차이가 있었다 배아 (그림 7Bvi)를 처리 억제제 동안 예를 들어, DFA 변환 그리드 억제제 치료 배아 (그림 7A, D)에서 볼 수있는 얼굴 축소와 일치하는이 지역의 극적인 변화를 한 것으로 밝혀졌습니다. 또한, 우리가 입 원형에서 본 중요한 변화와 결합 입 개방의 왜곡 패턴과 랜드 마크의 변화는 억제제 치료 엠브리에 모양을 열기 입의 기형을 설명OS. 레티노 산 신호가 중단 될 때 요약하면, 얼굴 치수 및 기하학적 형태 계측 분석 전통적인 측정의 조합 형상 및 구강 안면 영역의 크기의 변화를 도시한다.

그림 1
1. 필요한 자료를 그림. 데이터 분석 (A) 도구. (I) 24 웰 플레이트, (II) 표준 일회용 전송 피펫, (III) 뒤몽 # 5 이녹스 집게, (IV) 점토 늘어선 페트리 접시, (V) 직선 놀리는 바늘, (VI) 유리 피펫 도구 (VII ) 멸균 일회용 메스. 점토 늘어선 접시의 (B) 준비. (I) 직선 놀리는 바늘은 점토의 수평 라인을 그리는 데 사용됩니다. (ⅱ) 유리 피펫 도구는 각 행을 따라 원형의 함몰을 확인하는 데 사용된다. (III) 요리는 이미징 PBT으로 가득합니다.

페이지 = "항상"> 그림 2
아프리카 발톱 개구리 계란의 체외 수정 및 문화 그림 2. HCG 주입 후 (A)는, 성인 아프리카 발톱 개구리는 암컷이 알을 낳기 위해 유도 laevis의. (B) 계란 표준 방법을 사용하여, 높은 소금 MBS에서 수집 된 남성에서 추출 고환과 수정 된 배양한다. (C) 배아로 전송 표준 일회용 전달 피펫을 사용하여 0.1X MBS를 함유하는 24- 웰 접시. (D) 교정 피펫 - 남자 빈 우물에 1ml를 측정하는 데 사용되며, 마커 모든 웰의 외부에 레벨을 구별하는 데 사용 포함하는 배아 (삽입). 0.1X MBS를 첨가하거나이 마크가 붙어있는 수준이되도록 박탈된다.

highres.jpg "폭 ="500 "/>
이미징을위한 배아 헤드 3. 준비 그림. 머리, 검은 색 라인을 제거하는 데 필요한 두 개의 절개의 (A) 다이어그램. 스케일 바 = 400 μm의. (B) 첫 번째 절개는 메스에서 꼬리 방출 압력을 제거하는 창자의 뒤쪽 끝에서 이루어진다. 스케일 바 = 400 μm의. (C) 두 번째 절개는 완전히 머리를 절단하는, 심장 근처 창자의 앞쪽 끝에서 이루어진다. 스케일 바 = 400 μm의. (D) 점토에 위치 배아 머리의 행의 정면 전망. 스케일 바 = 650 μm의. (E) 점토에서 태아 머리 위치의 행의 측면보기. 스케일 바 = 500 μm의의 CG : 시멘트 선.

그림 4
구강 안면 치수 4. 전통적인 크기 측정 도표. (A) 얼굴 폭. 화살표는 눈의 복부 부분이 얼굴의 주위를 충족 포인트를 나타낸다. 적색 선은 이러한 점들 사이의 거리로 측정면의 폭이다. 스케일 바 = 210 μm의. (B) 얼굴 높이. 화이트 라인은 눈의 지느러미 가장자리와 시멘트 글 랜드의 지느러미 가장자리에 측정 전에 그린 가이드입니다. 적색 선은 얼굴의 중심선에서 두 가이드 사이의 거리로서 측정면의 높이이다. 스케일 바 = 210 μm의. (C) 구강 안면 영역입니다. 흰색 선은 측정 전에 그린 가이드입니다. 하단 가이드는 왼쪽 눈의 복부 가장자리를 만나는 곳 () 포인트. 레드 라인은 왼쪽 눈 주위의 추적을 보여줍니다. 눈의 지느러미 쪽이 위쪽 가이드를 만나는 곳 (B) 포인트. 블루 라인은 눈의 지느러미 가장자리에 상단 가이드를 따라 추적 구강 안면 영역의 등 경계를 보여줍니다. 상단 가이드는 오른쪽 얼굴 주변을 충족 (C) 포인트. 그린 라인 쇼오른쪽 눈 주위에 추적. 오른쪽 눈의 복부 가장자리가 아래 안내 사항을 충족 (D) 포인트. 노란색 선은 시멘트 글 랜드의 지느러미 가장자리 아래 가이드를 따라 추적 구강 안면 영역의 복부 경계를 보여줍니다. 스케일 바 = 210 μm의. (D) 주둥이의 길이. 흰색 선이 눈의 앞쪽 가장자리이며, 측정하기 전에 가이드로 그려집니다. 레드 라인은 시멘트 글 랜드의 지느러미 가장자리가 얼굴의 측면 주변을 만나는 지점이 라인에서 측정 주둥이의 길이입니다. 스케일 바 = 300 μm의. (E) 입 폭. 화살표가 포인트되는 곳 지느러미와 복부 입술을 충족. 적색 선은 이들 두 점 사이의 거리로 측정 입 폭이다. 스케일 바 = 200 μm의. (F) 입 둥근. 입 개구의 주변은 추적과 빨간색으로 표시되어있다. CG : 시멘트 선. 스케일 바 = 200 μM.

"그림 그림 5. 기하학적 형태 계측 학적 분석을위한 랜드 마크와 예선을 캡처. (A) 랜드 마크 및 캡처 좌표를 배치하는 사진 편집 소프트웨어, 스프레드 시트 프로그램을 사용. (ⅰ) 빛깔 십자가 구강 안면 영역의 형상을 나타내는 데에 ImageJ에 추가 포인트 툴을 사용하여 이미지에 배치 랜드 마크이다. (II) 랜드 마크 데이터는 결과 표시 도구를 사용하여 표시됩니다. (III) 랜드 마크 데이터 복사 및 스프레드 시트에 붙여 넣습니다. 두 번째 열 위 건축물의 수를 식별하고 "LM = 24"(빨간색 박스)로 표시 헤더이다. 데이터의 두 번째 열 아래 샘플은 고유 한 이름을 부여하고 "ID = CON1"(빨간색 화살표)로 표시. 이는 샘플 세트의 모든 이미지에 대해 반복되고, 데이터가 텍스트 파일로 저장된다. 기하학적 형태 계측 소프트웨어의 (B) 예비 데이터 분석프로그램입니다. (I) 사진 편집 소프트웨어에서 만든 텍스트 파일은 TPS 파일로, 형태 계측 학적 프로그램, MorphoJ로 가져옵니다. 파일은 빨간색 화살표로 표시됩니다. (II) 랜드 마크 좌표 데이터를 주축으로 프로크루스테스 맞춤에 의해 정렬됩니다. 빨간색 화살표는 정렬의 실행을 나타냅니다. (III) 프로크루스테스 맞는 랜드 마크의 공분산 행렬은 예선 메뉴에 생성됩니다. (IV) 분류 파일은 스프레드 시트에 생성됩니다. 열 A와 B는 각각 헤더 "ID"와 "치료"를, 주어진다. 각 샘플이 속한 ID의 랜드 마크 데이터 컬렉션에서 각 샘플에있는 지정된 열 아래에있는 A를 입력하고,에 치료 그룹은 열 B. (V) 분류 파일 분류 변수 세트와 형태 계측 학적 프로그램으로 가져 일치에 입력 식별자에 의해 선택된 데이터 세트에 대한. 의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오이 그림.

그림 6
형태 계측 학적 소프트웨어 6. 통계 분석을 그림. (A) 주 성분 분석 (PCA) (ⅰ) PCA는 변형 탭으로부터 선택된다. (II) 프로크루스테스의 랜드 마크 중 처음 두 개의 주요 구성 요소는 PC 점수 탭에서 산점도로 표시됩니다. (III) 팝업 메뉴가 플롯 공간에서 제기된다. 이 메뉴는 서로 (빨간색 화살표)에 대해 플롯 주요 구성 요소를 변경하고 (파란색으로 표시) 데이터 포인트 색상을 사용합니다. (ⅳ) 데이터 포인트는 팝업 메뉴의 분급 변수에 따라 착색된다. 각 주요 구성 요소에 의해 캡처 된 분산 (V) 비율 결과 탭에서 볼 수 있습니다. (B) 판별 기능 분석 (DFA) (I) DFA는 비교 탭에서 선택된다. (ⅱ) 프로크루스테스의 데이터 세트 DFA 위해 선택된다 좌표, 및 이전에 업로드 분급 그룹화를 위해 선택된다. 비교하기 원하는 그룹을 선택하고 순열 테스트가 실행됩니다. (III) DFA 결과는 모양 차이 탭의 벡터지도로 표시됩니다. 플롯 공간에서 팝업 메뉴가 정확하게 이미지를 배향하기 위해 사용될 수있다. (ⅳ) 팝업 메뉴의 설정 스케일 팩터 탭을 선택함으로써, 스케일 팩터의 부호가 변경 될 수있다. (v) 벡터지도는 벡터지도의 팝업 메뉴에 그래프의 형태를 변경 선택하여 그리드 선의 원하는 수와 변환 그리드로 변경된다. (VI) 마할 라 노비스와 프로크루스테스 거리와 상응하는 P-값은 결과 탭에서 볼 수 있습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

제어 및 RAR 그림 7. 구강 안면 분석 배아를 취급 억제 하였다. (A) (ⅰ, ⅱ) 제어의 대표적인 이미지. 스케일 바는 270 μm의 =. (III, IV) 배아 RAR 억제제, BMS-453의 1 μM 농도로 처리 하였다. 스케일 바는 260 μm의 =. (난, III) 뷰를 정면. 입 개방은 빨간 점에 설명되어 있습니다. (II, IV) 측면보기. CG :. 시멘트 선 (B) 제어의 전통적인 구강 안면 크기 (검은 색)과 (파란색) 배아를 처리 억제제. mm 단위 mm (II) 얼굴 폭 (I) 주둥이의 길이, (III)의 얼굴 높이, mm에서 (IV) 입 폭, mm 단위 (V) 입 원형, 방정식을 사용하여 ImageJ에 결정 단위가없는 수 : (4 × [영역]) / (π × mm에서 [주요 축] 2). (VI) 구강 안면 영역, (C) 주성분 분석. 컨트롤 흑인과 RAR 억제제 치료 배아에있는 파란색에 있습니다. 검은 색 화살표는 이상 값을 나타냅니다. PC1 = 73.63 %, PC2 = 9.56 %. (D) 변환 격자 이외에 프로크루스테스 거리 및 p- 값을 표시하는 기능 판별 분석. 벡터의 닫힌 원의 끝은 RAR 억제제 치료 배아에서 랜드 마크 위치입니다. 벡터의 행의 단부는 대조군에서 랜드 마크 위치이다. 검은 색 화살표 코 랜드 마크의 변화를 나타냅니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

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Discussion

아프리카 발톱 개구리는 laevis의 발달 기전 구강 안면 개발을 해부하는 데 유용한 도구가되었다; 그러나, 개구리에서이 지역의 크기와 모양 변화를 기술 한 프로토콜은 현재 존재하지 않는다. 여기에 설명 된 방법은 제노 푸스 다른 척추 동물에 구강 안면 표현형보다 엄격한 정량 허용함으로써 구강 안면 개발 분야에 크게 기여할 것이다.

제대로이 프로토콜을 실행하는 첫 번째, 가장 중요한 측면은 모두 정확하고 재현성 랜드 마크의 위치를​​ 얼굴 크기를 측정하고 판단 할 수있는 능력이다. 이를 위해 배아면이 동일한 각도, 방향 및 배율로 촬영하는 것이 중요하다. 이 측 방향 배아를 조작하고 일관된 배치를 달성하기 어렵 기 때문에 특히주의가 주둥이 길이의 정확한 측정을 얻기 위해주의해야한다. 한 사람의 모든 측정을 수행 갖는결과의 재현성을 극대화 아메 날, 이러한 유형의 에러를 최소화한다. 좋은 결과를 보장하는 두 번째로 가장 중요한 측면은 발달 또는 유전 적 배경 차이 불필요한 변동의 감소이다. 미세한 결함 간의 통계적 유의성을 평가할 때 특히 중요하다. 배아 따라서 처리하고, 촬영시와 동일한 단계에 있어야한다. 또한,주의가 발달 비율이 사이 치료 그룹 사이에 동등 확인해야한다. 변화와 이러한 문제를 줄이려면, 모든 배아가 같은 부모하고 실험의 시작 부분에 일치하는 단계 있는지 확인하십시오. 또한 (과밀을 방지, 예를 들어) 같은 배양 접시에서 다른 버퍼 소스와 볼륨, 배아의 다른 숫자, 분포 등의 변화의 외부 소스를 줄일 수 있습니다.

기하학적 morphometrics을 통해 형상 변경의 평가의 핵심 단계는 alignmen입니다랜드 마크의 T는 프로크루스테스의 적합을 통해 조정합니다. 이 수학적 알고리즘을 적용하여, 이미지의 크기 나 회전의 차이에 대한 정보가 제거됩니다. 랜드 마크가 수행 될 수있다 주성분이나 판별 함수 analyses- 통계적 techniques- 다변량하는 데이터 세트의 모든 배아 중에서 좌표이어서 생성 된 공분산 행렬은 표준화가 상관 관계를 결정한다.

주성분 분석 (PCA)을 주성분 (26)라는 변수들의 작은 세트 복소 샘플을 감소시킨다. 첫 번째 구성 요소는 나머지를 차지 이후의 각 구성 요소와 함께, 샘플 세트 내에서 가장 변화를 차지한다. 서로 사용하는 형태 계측 학적 소프트웨어에 대한 최초의 두 가지 구성 요소, 함께 클러스터 가장 유사한 샘플을 플로팅으로. 동시에 내 변형을 결정하는 동안 이러한 방식으로, PCA는 샘플 세트 내의 그룹을 식별한다. 소민전자의 경우는, 그룹은 서로 명확히 구별하고 있거나, 양쪽 축을 따라 중첩되지있다. 이 경우, 그룹은 차별되는 미묘한 기능을 공개하기 위해 (예, PC3 위해) 다른 성분을 플롯하는 것이 유리하다. 총 분산이보다 균등 제 여러 개의 변수 사이에 분산되는 경우에 특히 적합하다.

프로크루스테스 맞는 데이터의 판별 함수 분석 (DFA)는 데이터 세트의 샘플들을 효과적으로 정의 연속 변수에 의해 그룹으로 식별되는지 여부를 판정한다. 따라서 샘플은 분석 전에 그룹으로 분류되고, 변수는 그룹 (27) 사이의 통계적 관계를 결정하는 함수를 호출 차별 요소로 변환된다. 이 분석을 실행하기에 앞서 시험 순열의 수를 나타 내기 위해 중요하다. 이러한 순열 테스트 분포에 대한 가정이 elimina이되도록 데이터를 랜덤 화테드. 더 순열 테스트 반복은 p- 값의 정확도를 증가시킨다. 변환 그리드로 시각화 할 때, 그룹 사이의 랜드 마크 위치에 큰 변화가 표시됩니다 비교되는. 형상의 변화가 발생하는 곳 또한, 격자의 왜곡 패턴 보여준다. 이 분석의 단점은 단지 두 그룹의 비교를 위해 이용 될 수 있다는 것이다. 비교를위한 샘플 세트에서 세 개 이상의 그룹이있는 경우, 그것을 정규 변량 분석을 수행하는 것이 낫다. 이것은 통계적 p- 값을 생성한다는 점에서 유사하다 DFA; 그러나, 그 세트 내의 개별 그룹 사이에서 발생하는 것 이외에 설정된 샘플 전체에 걸쳐 발생하는 변화를 보여준다.

이 구강 안면 정량화 프로토콜의 주요 한계는만을 이차원 데이터에 적용될 수 있다는 것이다. 우리의 목표는 미래의 삼차원 데이터의 분석을위한 유사한 방법을 개발하는 CT 스캔 또는 공 초점 현미경을 사용하는 것을 포함한다. 한편,두 차원 이미지 작업 또한이 프로토콜의 주요 강점 중 하나입니다. 카메라가 장착되는 기본 stereoscopes는 배아 얼굴의 이미지를 캡처 필요합니다. 비용을 줄이면서이 데이터 분석을 위해 사용 된 Openware 또한,이 방법의 접근성을 증가시킨다. 또한, 궤변 영상, 통계 분석, 또는 컴퓨터 프로그래밍의 고급 지식은 데이터에서 의미 있고 중요한 결과를 추출 할 필요가 없습니다. 사실,이 기술은 현재의 생물학 VCU 부서 학부 실험실 과정의 일부로서 교시되고있다. 따라서, 여기에 제시된 구강 안면 정량화 프로토콜 배우고 단시간에 쉽게 적용 할 수있다. 비디오 표현 된 바와 같이, 이러한 소프트웨어 배아를 위치 및 이동과 같은 중요한 단계들은도 성공적 훈련받지 학생과 연구자에 의해 이용 될 수있는 프로토콜을 보장하기 위해 강조된다. 요약하면,이 프로토콜은 귀중한 자원을 제공 할 것입니다연구 커뮤니티 및 교육 도구로.

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Disclosures

저자가 공개하는 게 없다.

Acknowledgements

VCU에서 A. 디킨슨 시동 돈이 작업을 지원했다.

저자는 개략적 인 그림을 만드는 그의 예술적 재능 댄 Nacu을 인정하고 싶습니다.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Dissecting microscope Zeiss fitted with AxioCamICC1 camera
Dumont #5 Inox forceps Fine Science Tools 11251-10
Sterile, disposable scalpel Sklar 06-2015
24-well plate Fisher Scientific 087721
Standard Disposable transfer pipettes Fisher Scientific 13-711-7M
150 mm x 15 mm Petri dishes Falcon 351058
Incubators Ectotherm set to 15 °C or 20 °C
Modeling Clay Premo, or other non-toxic modeling clay in black or white
Straight teasing needle Thermo Scientific 19010
Capillary Tubing (for needles) FHC 30-30-1 Borosil 1.0 mm OD x 0.5 mm ID/Fiber, 100 mm each
Needle Puller, Model P-97 Sutter Instrument Co. Needle Puller: P-97 Flaming/ Bown micropipette puller Filament: FB300B For filaments, use Sutter 3.00 mm square box filaments, 3.0 mm wide.
Pipettemen Gilson F144802, F123600, F123602
BMS-453 Tocris 3409
DMSO American Bioanalytical AB00435-01000
Cysteine Sigma-Aldrich 52-90-4
Paraformaldehyde powder Sigma-Aldrich 158127
Petri dishes Falcom 353003, 351058 100 mm diameter and 150 mm in diameter
100% Ethanol VWR 89125-170

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

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