Kvantificering af Orofacial fænotyper i
1Biology Department, Virginia Commonwealth University

Biology

Your institution must subscribe to JoVE's Biology section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

Welcome!

Enter your email below to get your free 10 minute trial to JoVE!





We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.

If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.

 

Summary

En fremgangsmåde til at kvantificere orofacial størrelse og form af Xenopus laevis embryoner er blevet udviklet. I denne protokol, er traditionelle størrelse målinger kombineret med geometriske morphometrics at give mulighed for mere avancerede analyser af orofacial udvikling og defekter.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Kennedy, A. E., Dickinson, A. J. Quantification of Orofacial Phenotypes in Xenopus. J. Vis. Exp. (93), e52062, doi:10.3791/52062 (2014).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Xenopus er blevet et vigtigt redskab til at dissekere de mekanismer, der styrer kraniofacial udvikling og defekter. En metode til at kvantificere orofacial udvikling vil give mulighed for mere grundig analyse af orofaciale fænotyper ved ophævelse med stoffer, genetisk eller molekylært kan manipulere genekspression eller protein funktion. Anvendelse af to dimensionelle billeder af de embryonale hoveder er de traditionelle størrelsesdimensioner-såsom orofacial bredde, højde og område-målt. Desuden er en rundhed mål for embryonale mundingsåbning anvendes til at beskrive formen af ​​munden. Geometriske morphometrics disse to dimensionelle billeder er også udført for at tilvejebringe en mere sofistikeret visning af ændringer i formen af ​​orofacial region. Seværdigheder er angivet for specifikke punkter i orofacial region og koordinater er oprettet. Et princip komponent analyse anvendes til at reducere skelsættende koordinater til princippet komponenter, der derefter diskriminerer behandlinggrupper. Disse resultater vises som et punktdiagram, hvor individer med lignende orofaciale former klynge sammen. Det er også nyttigt at udføre en diskriminant funktion analyse, som statistisk sammenligner positionerne af landmærker mellem to behandlingsgrupper. Denne analyse er vist på en transformation gitter hvor ændringer i skelsættende position betragtes som vektorer. Et gitter er overlejret på disse vektorer, således at en vridning mønster vises at vise, hvor vigtig milepæl holdninger har ændret sig. Shape ændringer i diskriminant funktion analyse er baseret på et statistisk mål, og kan derfor blive evalueret af en p-værdi. Denne analyse er enkel og tilgængelig, som kun kræver en stereoskop og freeware software, og derfor vil være en værdifuld forskning og undervisning ressource.

Introduction

Blandt de mest udbredte og ødelæggende typer af humane fosterskader er dem, der påvirker munden og ansigtet, såsom orofaciale spalter 1. Børn med misdannede orofaciale strukturer undergår mange operationer i hele deres levetid, og kæmper med ansigts vansiring, tale, hørelse og spiseproblemer. Derfor lette ny forskning i cranio- og orofacial udvikling er afgørende for forebyggelse og behandling af disse typer af fosterskader hos mennesker. Xenopus laevis er dukket op som et nyt værktøj til at dissekere de mekanismer, der styrer kraniofaciale udvikling (nogle eksempler kan nævnes 2,3,4 -11). Derfor kunne en kvantitativ metode til at analysere størrelse og form ændres under udviklingen af hoved og ansigt af denne art være meget kraftig 3.

Her præsenterer vi en sådan fremgangsmåde; kombinerer traditionel størrelse målinger med geometriske morphometrics tilpasset fra en Xenopus undersøgelse 12 13-15. Målet med denne protokol er at gøre det muligt for forskerne at kvantificere facial størrelse og former til at skelne mellem forskellige orofaciale fænotyper under normal og unormal udvikling. Denne analyse vil give mulighed for en bedre differentiering mellem subtile kraniofaciale defekter, såsom dem, der opstår fra synergistiske virkninger af gener og / eller miljømæssige faktorer. Derudover kunne denne kvantificering metode også afsløre selv lille forbedring eller redning af et orofacial defekt. Dette gør det derfor en nyttig vejledning i at analysere potentielle lægemidler.

Kombinationen af ansigts målinger og geometriske morphometrics præsenterer vi her mulighed for en mere omfattende statistisk analyse af både størrelse og form af den orofacial region end de nuværende protokoller, som i vid udstrækning udnytter kun den ene eller den anden 15-18. Endvidere præsenterer vi en enkel måde at vurdere både de mediale og laterale planeransigtet uden at kræve avanceret tredimensional billedbehandling udstyr, der anvendes i igangværende undersøgelser 13,19.

Vi demonstrerer denne protokol på Xenopus laevis embryoer behandlet med en retinsyrereceptor inhibitor, der inducerer abnorm orofacial udvikling og en median ganespalte 2,3. Kvantificering af dimensionerne og formen af den orofacial region i disse embryoner har afsløret ændringer i midface, der er analog til mennesker med lignende palatinalt kløfter og musemodeller 20,21. Dog kan denne protokol anvendes til at vurdere virkningerne af andre forbindelser på orofacial udvikling såsom naturlige stoffer, herbicider eller proteiner såsom vækstfaktorer. Endvidere orofaciale størrelse og form ændringer som følge af forstyrrelse af genekspression via tab eller gevinst af funktion eksperimenter (ved hjælp af antisense morpholinos eller Crispers / Talens) kan også kvantificeres ved hjælp af denne protokol. Endelig har vi udviklet denne metode specifikally at vurdere Xenopus morfologi; er det imidlertid let modificeres til analyse af alle hvirveldyr. Andre applikationer kan også omfatte hjælp af denne protokol til at sammenligne nært beslægtede arter for evolutionære eller økologiske undersøgelser. Mens det eksempel, vi giver her udnytter denne protokol til at beskrive analyse af den orofacial region, kunne det let modificeres til analyse af andre regioner, organer eller strukturer.

Denne orofacial kvantificering protokol vil blive en værdifuld ressource for forskningsverdenen, samt et glimrende pædagogisk redskab for studerende som en video demonstration.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Alle eksperimenter udført ved hjælp af Xenopus laevis er blevet godkendt af IACUC (protokol # AD20261).

1. Forberedelse Reagenser og nødvendige materialer

  1. Reagenser:
    1. Lav 1 L 10x MBS (modificeret Barths saltvand) opløsning 22. Tilføj NaCl (880 mM), KCI (10 mM), MgSO4 (10 mM), HEPES (50 mM, pH 7,8), og NaHCO3 (25 mM) til 1 l destilleret vand. Juster pH til 7,8 med NaOH.
    2. Til 1 l 1x MBS ved at fortynde 100 ml 10x MBS opløsning i 900 ml destilleret vand. Tilføj 0,7 ml 1 M CaCl2-opløsning.
    3. Til 1 L af 0,1x MBS ved at fortynde 100 ml 1x MBS opløsning i 900 ml destilleret vand. Til 1 liter 0,1x MBS opløsningen, tilsættes 1 ml 10 mg / ml gentamicin løsning til brug i embryo kultur.
    4. Gør højt saltindhold MBS ved at opløse 4 ml 5 M NaCl i 100 ml 10x MBS. Derefter tilsættes destilleret vand, indtil den samlede mængde er 1 L.
    5. Gøre 70% ethanol ved at fortynde 100% ethanol til 70% ethanol med destilleret vand.
    6. Gøre BMS-543 ved fremstilling af en 10 mM stamopløsning i dimethylsulfoxid (DMSO).
    7. Lav 4% paraformaldehyd (PFA) ved tilsætning af 4 g paraformaldehyd pulver til 50 ml destilleret vand. Der opvarmes på en varmeplade til ca. 65 ° C, på hvilket tidspunkt tilsættes 5 M NaOH dråbevis indtil opløsningen rydder.
      1. Når opløsningen rydder, fjernes fra varmen og tilsæt 50 ml 2x PBS, og 100 ul Tween-20. Lad dem køle af til stuetemperatur på is. Justere pH til mellem 7,2 og 7,5 ved anvendelse af HCI.
    8. Lav en phosphatpufret saltopløsning med Tween (PBT) ved at opløse 8 g NaCl, 0,2 g KCI, 1,44 g Na 2 HPO 4, og 0,24 g KH 2 PO 4 i 800 ml destilleret vand. Ved anvendelse af HCI, justere pH til 7,4. Tilsæt 2 ml Tween-20. Juster endelige volumen med destilleret vand til lige 1 L.
    9. Lav en cystein løsning ved at opløse 1 g cystein i 50 ml destilleret vand eller 0,1x MBS. Tilføj 1,5 ml 5 M NaOH etnd justere pH til 7,8.
    10. Lav en 10% benzocain stamopløsning ved tilsætning af 10 g af benzocain pulver til 100 ml 100% EtOH. For aflivning af voksne mænd og embryoner klar til fiksering, fortyndes til en 0,05% opløsning.
    11. Lav en testiklerne lagerløsning ved tilsætning af 1 ml kalveserum til 9 ml L15 buffer.
  2. Nødvendige værktøj og udstyr:
    1. Anskaf udstyr opført i tabellen af materialer og udstyr, der er vist i figur 1.
    2. Ændre en pipette værktøj. Placér spidsen af ​​et glas Pasteur pipette ind i en flamme fra en bunsenbrænder. Rotere pipettespidsen indtil det smelter og danner en afrundet forseglet ende.
    3. Flade modellervoks i bunden af en plast Petri-skål, udglatte at dække hele pladen (kan enhver størrelse anvendes) (figur 1Aiv).
      1. Tryk let på en lige drilleri nål i ler-foret fad i en 45 ° vinkel. Holde nålen der, og langsomt flytte Petriparabol vandret for at skabe en deprimeret linje (figur 1Bi). Gentag for det ønskede antal rækker.
      2. Brug enden af en glaspipette redskab til at gøre lavvandede, cirkulære fordybninger i hver række i ler-foret skål til at placere embryo hoveder (Figur 1Bii) og støtte i forbindelse med tilrettelæggelsen af de embryoner, mens fotografere.
      3. For fotografering, fyld fad med PBT (figur 1Biii). Mellem brugere, vaskes grundigt skålen og leroverfladen med sterilt vand, efterfulgt af 70% ethanol.

2. Xenopus laevis embryokultur og Inhibitor Behandlinger

  1. In vitro-befrugtning og kultur i Xenopus æg:
    1. Anskaf og kultur Xenopus laevis embryoner ved hjælp af standard offentliggjorte metoder 22,23.
    2. Kort fortalt aflive en voksen mand ved nedsænkning i en 0,05% benzocain løsning. Dissekere testikler og lagrer i testiklerne opbevaring buffer. Injicerevoksne hunner med humant choriongonadotropin (HCG), indsamle æg i høje salt MBS, og gøde in vitro med dissekerede testikler (figur 2A, B).
    3. Kultur embryoner i 0,1x MBS ved 15 ° C, indtil den ønskede scene er nået (embryoer henhold til den normale tabel over Xenopus laevis ved Nieuwkoop og Faber 24,25).
      1. Her, kultur embryoner indtil trin 22 (24 timer efter befrugtning (HPF)), og fjern vitellinmembranen under et stereomikroskop ved hjælp af to par skærpede pincet. Overfør embryoner med en standard, engangs overførselspipetten til en ren petriskål (100 mm i diameter), der indeholder 30-40 ml 0,1x MBS.
  2. Inhibitor behandlinger af Xenopus embryoer (illustreret i figur 2):
    1. Fyld de nødvendige brønde i en 24-brønds dyrkningsplade med 1 ml 0,1x MBS ved hjælp af en kalibreret pipette-mand. Afgrænse ydersiden af ​​brønden med en fin spids markER (figur 2D, indsat). Brug markøren til også mærke indholdet skal tilsættes til hver brønd på 24-brønds dyrkningsplade låg. Kopier denne information på en 24-godt set-up side i laboratoriet notesbog.
    2. Overfør 5-10 embryoner i hver brønd ved hjælp af en standard, engangs transfer pipette (figur 2C). Placer samme antal embryoner i hver brønd.
    3. Fyld op eller fjerne 0,1x MBS, så det er på niveau med 1 ml mærket linje (figur 2D). Tilføj det passende volumen af ​​DMSO (således at den endelige mængde af DMSO er 1%) og omrystes forsigtigt. Vær omhyggelig med ikke at tilføje DMSO for tæt på embryoner, og undgå kontakt af fostrene med overfladen af ​​bufferen.
    4. Tilsæt passende mængde kemikalie til de udpegede brønde og forsigtigt hvirvel igen. Her tilsættes 1 pi 10 mM BMS-453 (en retinoinsyre receptor antagonist) og 9 pi DMSO til 1 ml 0,1x MBS.
    5. Hvis kemikaliet er lysfølsomt, viklet løst cultur fad i aluminiumsfolie. Kultur embryoner i en 15 ° C inkubator, indtil den ønskede fase. I dette eksempel behandle embryoner til 16-18 timer.
  3. Vask embryoner ud af behandlingen og opdræt indtil haletudse faser:
    1. Tag en halv til tre fjerdedele af løsningen med en disponibel overførselspipette. Vær omhyggelig med ikke at forstyrre embryoner. Ved hjælp af en ny overførsel pipette, refill godt med 0,1x MBS. Gentag dette 3-6 gange.
    2. Overfør embryoner til en stor petriskål (150 mm i diameter) indeholdende 100 ml 0,1x MBS med gentamicin (1 ml / l). Inkubere fostrene ved 15 ° C, indtil de når trin 42-45 (82-100 HPF).
    3. Skift 0,1x MBS opløsning indeholdende gentamicin dagligt, og fjerne døde embryoner omgående for at forebygge forurening eller død af andre embryoner. Registrere antallet af døde fostre i laboratoriet notesbog.
  4. Fastsættelse embryoner i paraformaldehyd (PFA):
    1. Fix embryoner mellem trin 42 og 45 (82 og 100HPF, henholdsvis) ved at overføre dem i en ny 24-brønds dyrkningsplade, der indeholder 1-2 ml 0,1x MBS. Mærk låget med de samme oplysninger som den behandling set-up, der er beskrevet ovenfor (afsnit 2.2.1).
    2. Fjern så meget 0,1x MBS fra hver godt som muligt, mens du stadig efterlader embryoner dækket og sikre minimal berøring for at undgå skader. Tilsættes 1-2 ml 0,05% benzocain opløsning i 0,1x MBS og inkuberes indtil embryoner ikke længere reagerer på stimuli.
    3. Tilføj 1-2 ml 4% PFA. Alternativt, skal du placere embryoner i mærkede mikrocentrifugerør til fiksering, hvis det foretrækkes.
    4. Inkuber embryoner i PFA i 24 timer ved 4 ° C på en rotationsryster. Fjern PFA ved at udføre 3-4 vaske med PBT over en 3-5 timers periode.

3. fotografere Orofacial Region Xenopus Tadpoles

  1. Forberedelse før fotografering (dette er vist i figur 3):
    1. Placer faste embryoner i en stor petriskål (150mm i diameter) indeholdende ca. 100 ml PBT.
    2. Lav to snit til at skille hovedet fra kroppen (figur 3A, massive sorte linjer). Hold først embryo med en pincet og lave et snit på den bageste side af tarmen med en steril skalpel (figur 3B). Foretage et andet snit på den forreste side af tarmen, nær hjertet, for fuldstændigt at fjerne hovedet (figur 3C).
    3. Pipette brudt embryo hoveder i en ler-foret skål (del 1.2.2) ved hjælp af en standard, engangs overførselspipetten.
      1. For frontal synspunkter, bruge to par pincet til at placere embryo hoveder posterior side ned inde de cirkulære fordybninger. Ved hjælp af pincet til at manipulere både embryo hoved og den omgivende ler, position embryoer således, at de står over for kameraet og ikke skråt bagud eller til begge sider (figur 3D). Skub forsigtigt omgivende ler omkring hovedet med pincet og / eller glaspipette redskab til at sikre hovedet på plads.
      2. For laterale synspunkter, bruge pincet til at placere embryo hoveder inde i de cirkulære fordybninger sådan, at de er på deres side, der vender i samme retning, og er fladt mod leret. Manipulere embryo hovedet og den omgivende ler, således at cement kirtler alle embryoner er placeret nedad under den samme vinkel (figur 3E). Brug rækkerne trukket med drilleri nål som en guide for at sikre nøjagtighed, når du tager laterale målinger.
  2. Tage billeder af den haletudse hoved:
    1. Fotografere lederen af ​​haletudse ved hjælp af en dissektionsmikroskop med en vedhæftet digital kamera og den tilsvarende kamera software. Anvende den højeste forstørrelse, kan holdes konstant for alle embryoer.
    2. Centrer embryoner og møde dem alle i den samme retning. Capture billeder ved hjælp af de bedste lysforhold der giver mulighed for den mest præcise billede af orofacial region. Positionlys til at undgå uforholdsmæssigt store skygger. Gem billeder som .tiff-filer med den højest mulige opløsning.

4. måling og analyse Facial Størrelse Dimensioner i Xenopus Tadpoles

  1. Mål orofaciale dimensioner (opsummeret i figur 4):
    1. Bestem tandbredde. Identificere de punkter, hvor den ventrale del af hvert øje opfylder periferien af ansigtet (figur 4A, pile), og måle afstanden mellem disse punkter (figur 4A, red line).
    2. Bestem ansigt højde. Først bestemmes midterlinjen ved at måle afstanden mellem hvert øje og beregning af halvvejen. Dernæst tegne vandrette linjer, der markerer den dorsale fleste kanter af øjne og den dorsale mest punkt af cement kirtel (figur 4B, hvide linjer). På midterlinjen måle afstanden mellem de vandrette linjer (figur 4B, red line).
    3. Bestem than orofacial område. Brug de samme vandrette linjer markerer ryggens kanter af øjnene og cement kirtel til at guide arealmålingen (figur 4C, hvide linjer). Starter på det punkt, hvor den vandrette linie, der markerer toppen af cement kirtel opfylder periferien af den venstre side af ansigtet (figur 4CA).
      1. Spore langs kanten af ansigtet omfatter øjet, indtil det punkt, hvor den vandrette linie, der markerer toppen af øjnene opfylder periferien af ansigtet (figur 4CB). Fortsæt med at spore langs denne dorsale mest vandret linie, indtil det punkt, hvor den møder periferien af den højre side af ansigtet (figur 4CC).
      2. Spore nedad langs kanten af ansigtet omfatter øjet, indtil det punkt, hvor den ventrale mest vandret linie, der markerer toppen af cement kirtel opfylder periferien af den højre side af ansigtet (figur 4CD). Fortsæt med at spore langs denne nederste vandrette linje UNTil det opfylder det punkt, hvor sporing begyndte. Brug fotoredigering software til at beregne arealet inde i sporing.
    4. Bestemme snuden længde. På laterale billeder, lave en lodret linje, der markerer den forreste af øjet. Dernæst måle den vandrette afstand fra den forreste mest punkt, hvor ansigtet opfylder den dorsale kant af cement kirtel til den lodrette linie, der markerer forreste af øjet (figur 4D).
    5. Bestemme munden bredde. Måle den vandrette afstand mellem venstre og højre punkter, hvor de øverste og nederste "læber" i munden åbning mødes (figur 4E). Disse kan betragtes som frøen omregnet labial commissures.
    6. Bestem munden rundhed. Beregn munden rundhed som en invers formatforhold hvor (4 × [Area]) / (π × [Hovedakse] 2 >).
      1. Brug lassoværktøjet i en foto-editor at spore kanterne af mundingsåbningen som vist i figur 4F. Vælg Analyze i hovedværktøjslinjen, og vælg Mål. Alternativt beregne rundhed fra måling af området og diameter af munden åbning.
  2. Dataanalyse af ansigts dimensioner:
    1. Input målingerne af ansigts dimensioner i en dataanalyse program til at sammenligne den behandlede gruppe med kontrollen. Bestem middelværdien af ​​hver måling for både forsøgs- og kontrolgrupper for at skabe søjlediagrammer. Bestemme standardafvigelsen for at skabe fejlsøjler. Udfør Students t-test for at sammenligne statistisk grupper.
      BEMÆRK: Denne data kan være ganske variabel på grund af de lidt forskellige satser for udvikling blandt fostre.

5. Kvantitativ analyse af Orofacial Form og Morphometrics

  1. Vartegn Place og kreate skelsættende koordinere fil (illustreret i figur 5A).
    1. Vælg vartegn såsom at de fange formen af ​​målbilledet og kan gentagne gange placeret i samme relative placering i alle prøver, der analyseres. Hvis en struktur ikke findes i alle prøver, ikke placere en milepæl på denne struktur.
      1. Her placere 24 landmærker at repræsentere midface med karakteristiske kendetegn, såsom øjne, næsebor og mund. For konsistens, vartegn sted halvvejs mellem tidligere placeret landmærker (f.eks vartegn munden, Figur 5Ai).
    2. Capture skelsættende koordinater og skabe "skelsættende koordinere fil". Åbne det første billede af en haletudse flade (for eksempel den første kontrol embryo).
      1. Vælg fanen plugins på hovedværktøjslinjen, og vælg Pointpicker fra rullemenuen. Vælg at tilføje punkter fanen og sted vartegn i ønskede positioner som lokaliteter vil fremstå som flerfarvede krydsninger (
      2. Flyt skelsættende steder efter anbringelse ved at vælge Flyt krydser værktøjet. Når alle vartegn er blevet placeret på billedet, skal du vælge Vis søgeresultater Tab på de vigtigste værktøjslinjen og vælge Vis (Figur 5Aii) til at vise skelsættende koordinater og kopiere ind i et regneark (Figur 5Aiii).
      3. Når du indsætter disse koordinater fra denne første foster i et regnearksprogram, efterlade en tom række over dataene. I kolonne B i denne tomme række (række 1), type "LM =" med antallet af milepæle i prøven. Her skal du indtaste "LM = 24", da 24 vartegn blev skabt (figur 5Aiii, rød boks).
      4. I rækken under datapunkter, type "ID =" med et navn, der identificerer prøven. Her i figur 5Aiii, indtast "ID = CON1", da dette er den skelsættende koordinere data fra den første kontrol embryo (figur 5Aiii, rød pil).
      5. BEMÆRK: Det er vigtigt, at hver foster får et unikt navn i "ID =" række. Her for eksempel er det næste sæt skelsættende koordinater givet ID "CON2", da det var det andet embryo i kontrolgruppen.
      6. Kopier hele anden og tredje kolonne i et tekstdokument og gemme som en .txt-fil.
  2. Opsæt morfometriske software program til dataanalyse (illustreret i figur 5B).
    1. Her skal du vælge Opret nyt datasæt på hovedmenuen i morfometrisk softwareprogram. Navngiv filen, og de ​​data, der er fastsat i de relevante felter (for eksempel "Retinoid syrehæmning" og "Facial vartegn", henholdsvis) i pop op-skærmen (Figur 5Bi). Importere filen som en TPS, og select tekstfilen koordinater at skabe datasættet (Figur 5Bi, rød pil).
    2. Data, tilpasning og Procrustes passe:
      1. Udfør en Procrustes pasform og tilpasning. Fremhæv datasættet under fanen Project Tree vælge indledende kampe på hovedværktøjslinjen, og New Procrustes Fit i dropdown-menuen.
      2. Vælg Juster ved Principal Axis og vælg Udfør Procrustes Fit nederst i boksen (figur 5Bii, rød pil). Retur til de indledende drop down menu, vælg Generer kovariansmatrix (figur 5Biii), og vælg Udfør.
      3. Vis korrelationerne kovariansmatrixen i fanen Results.
    3. Opret en "klassifikatør file" ved at tildele hver prøve i datasættet til den relevante klassificeringen variabel til at skelne, om det hører hjemme i den eksperimentelle gruppe eller kontrolgruppen.
      1. Mærk to kolonner i et regneark. Mærk overskriften på den første Column med "ID" og indtaste den samme ID'er givet for hver prøve (for eksempel CON1, RARINHIB1, og så videre, figur 5Biv). Mærk overskriften til anden kolonne med "behandling" og input ind i hver celle behandlingsgruppen, der svarer til prøven er opført i den tilstødende ID celle.
      2. Her, brug "kontrol og RAR inhibitor" etiketter som klassificører (figur 5Biv). Kopier ind i en tekstfil og gemme som en .txt-fil. Import Classifier variabler ind den morfometriske software program. Vælg Match af Identifier, og åbne tekstfilen (Figur 5Bv).
  3. Opret en principal komponent analyse (PCA) punktdiagram ved at vælge Variation dropdown menuen og vælge Principal Component Analysis (figur 6Ai). Dernæst skal du vælge fanen Grafik for at se yderligere tre faner: PC formændringer, egenværdier og PC score (figur 6Aii). Fanen PC scores viser bivariate principal komponent Scatterplot af Procrustes fit skelsættende data (figur 6Aii).
    1. Sådan ændres, hvilke hovedkomponenter er plottet, opdrage pop-up-menuen i plottet rum og vælge den ønskede akse for at ændre (Figur 6Aiii, rød pil).
    2. Vælg Color datapunkter værktøj (figur 6Aiii). Vælg klassifikatorer tidligere importerede (afsnit 5.2.2) i den anden pop-up menu, der ser ud til at bestemme farven på hver kategori (Figur 6Aiv).
    3. Vis den mængde af varians fanget af hver hovedkomponent i fanen Resultater (Figur 6Av). Export graf som en .bmp fil.
  4. Opret en diskriminant funktion analyse (DFA) transformation gitter i morfometriske software program ved at vælge Discriminant Function Analyse under fanen Sammenligning (Figur 6Bi). I pop-up-menuen, skal du sikre, at den relevante datasæt er selected og den type data er Procrustes-fit koordinater.
    1. Fremhæv de par af grupper, der skal sammenlignes, og køre 1.000 permutation tests (Figur 6Bii).
    2. Under Graphics, se vektor kort over koordinaterne i Form Forskel fanen (Figur 6Biii). Hvis billedet er inverteret, hente pop-op-menuen i plottet plads til at vende diagrammet i den rigtige retning (figur 6Biii).
    3. Retning af vektorer afspejler formen forskel fra den første gruppe i forhold til den anden, som vises i Diskriminant funktionsmenuen før analysen udføres (fig 6Bii). For at vende retningen af vektorer, hente pop-op-menuen i plottet rum og skifte fortegn af skalaen faktor, således at den er negativ (figur 6Biii, iv). Værdien af ​​skalaen værdi er sat til en faktor ti, der bedst repræsenterer de statistiske forskelle i skelsættende position between de to grupper uden forvrængning, og er normalt venstre ved default (figur 6Biv).
    4. Også i pop-up-menuen, ændre grafen til en transformation gitter for at overlejre vektorer på et gitter (figur 6Biii, v).
    5. Angiv antallet af vandrette og lodrette linjer i gitteret i pop-up-menuen (Figur 6Biii, v).
    6. Eksporter grafen som en .bmp fil.
    7. Se de Procrustes og Mahalinobis afstande og p-værdier under fanen Resultater (Figur 6Bvi).
  5. Yderligere morfometriske analyser, som er nyttige til vurdering af mere end en behandlingsgruppe
    1. Opret en principal komponent analyse transformation nettet. PC Shape Ændrer fane viser vektor kort over formændringer tegner sig for varians inden for hver testgruppe. Brug pop-up-menuen i plot-området for at orientere billedet korrekt og oven vektorer på en transformation gitter. Indstil skalafaktorentil værdien på x-aksen af ​​pc-scoringer graf, der svarer til den skønnede centrum af kontrolgruppen. Eksportere billedet som en .bmp fil.
    2. Opret en CVA Scatterplot. Under fanen Sammenligning på hovedværktøjslinjen, vælg Canonical Variate Analysis, og fremhæve klassificeringen variable sæt, der tidligere blev importeret (se afsnit 5.2.3). Vælg 1.000 iterationer for permutation tests, og vælg Udfør. Vælg fanen CV scores at se den bivariate CVA Scatterplot. Dette er farvekodet baseret på de uploadede klassifikatorer. Skift farveskema ved at bringe op pop-up-menuen i plottet rum (se afsnit 5.3.3). Eksport som en .bmp fil.
    3. Opret en CVA transformation gitter. En transformation gitter af CVA resultater kan genereres, når man sammenligner mere end to grupper. Under fanen Grafik, vælg CV formændringer at visualisere transformation gitter af de skelsættende koordinater. Åbn genvejsmenuen i plottet plads til at ændreretningen af ​​vektoren, overlejre resultaterne på en transformation gitter, og angive antallet af gitterlinjer. Eksporter grafen som en .bmp fil.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Her blev en kvantitativ analyse af orofacial størrelse og form vist sig at sammenligne embryoer behandlet med retinsyre receptor inhibitor (RAR-inhibitor) til ubehandlede kontroller. Embryoer blev behandlet med en 1 uM koncentration af denne kemiske inhibitor fra trinet 24 til 30 (26-35 HPF), vasket ud og fikseret i trin 42 (82 HPF). De blev derefter behandlet og analyseret som beskrevet i protokollen. Resultaterne er originale data, men i overensstemmelse med observationer i tidligere udgivelser 2,3. Kontrol embryoer blev behandlet med køretøjet, DMSO, og udvikles normalt (figur 7Ai, ii). Embryoer behandlet med en 1 uM koncentration af RAR inhibitor viste lille indsnævring af ansigtet, øjet anomalier og en misdannet embryonale mund åbning, der var mere trekantet (fig 7Aiii, iv).

Først blev de traditionelle orofaciale dimensioner målt og er opsummeret i figur 7B. S TATISTISK signifikans blev bestemt ved at udføre en T-test antager ulige varians mellem inhibitorbehandlede embryoner og kontroller for hver måling. Vi fandt, at både snude længde og ansigt bredde blev reduceret betydeligt i RAR inhibitorbehandlede embryoner i forhold til kontrolgruppen (p-værdier = 0,0062 og 0,0058, henholdsvis, figur 7BI, ii). Mens ansigt højde og mund rundhed blev signifikant forøget (P-værdi = 3,7772 x 10 -6, 1,4812 x 10 -7), mund bredde faldt signifikant (p-værdi = 2,5175 x 10 -10, figur 7Biii-v) .Den Resultaterne viste ingen signifikant forskel i den samlede orofacial området mellem de to grupper (p-værdi = 0,3754; fig 7Bvi). Disse data viser, at tabet af retinsyre signalering på et bestemt tidspunkt i udviklingsprojekter resulterer i en kortere snude, lille indsnævring af midface regionen, og misdannelse af embryonale mund åbning.

nt "> At give et sofistikeret udsigt af formen ændringer af embryonale orofacial region som reaktion på reducerede retinsyreholdige signaler, vi næste udnyttet geometriske morfometri. Efter at identificere og tilpasse orofaciale vartegn hjælp morfometrisk analyse software, så undersøgte vi variansen inden for hver gruppe via principal komponent analyse (PCA). Da de første to hovedkomponenter blev plottet mod hinanden, RAR inhibitor behandlede embryoer var klart adskilt fra kontrollen langs PC1-aksen (figur 7C). Denne test viste også de afvigende værdier i stikprøven indstilling illustreret ved to inhibitorbehandlede embryoner, der ikke klynge med resten af gruppen (figur 7C, pile).

Dernæst blev de statistiske forskelle i form af orofacial region mellem RAR inhibitorbehandlede embryoner og kontroller vurderes og visualiseret ved at udføre en diskriminant funktion analyse (DFA). Den Procrustes afstanden Between de to grupper var signifikant forskellige (distance = 0,2665, p-værdi <0,0001, figur 7D), hvilket indikerer en ændring i orofacial form, når retinsyre signalering forstyrres. Faktisk dramatiske ændringer i placeringen af laterale vartegn i orofacial region indikerer en indsnævring af ansigtsform respektive til højden i inhibitorbehandlede embryoner (figur 7D). Desuden den lille udadgående forskydning i positionen af nasale landmærker (figur 7D, pile) afslører abnormitet i næsebor stilling i disse embryoner, der er i overensstemmelse med nedsat udvækst af snuden. De forskydninger i vartegn, der definerer kanterne af mundingsåbningen show holdning ændringer, der afspejler dannelsen af en trekantet formet mund åbning, der er i overensstemmelse med median kløft rapporteret i vores tidligere studier 2,3. Ud over vektor skift, vridning mønster transformation nettet illustrerer også formændringer i ellerofacial region. Vridning i midface regionen er i overensstemmelse med midface hypoplasi og overordnede facial indsnævring set i fostre med nedsat retinsyreholdige signaler (figur 7D).

Resultaterne af diskriminant funktion analyse (DFA) viser formændringer, der var i overensstemmelse med vores kvalitative analyse, samt afslører nogle ændringer, der ikke tager tilstrækkeligt højde traditionelle størrelse målinger alene. For eksempel, mens den orofacial område var ikke signifikant forskellig mellem kontrol og behandlet med inhibitor embryoner (figur 7Bvi), DFA transformation nettet afslørede dramatiske ændringer i denne region i overensstemmelse med ansigtet indsnævring set i inhibitorbehandlede embryoner (figur 7A, D). Endvidere vridning mønster og skelsættende skift af munden åbning, kombineret med den betydelige ændring, vi oplevede i munden rundhed, illustrerer misdannelse af munden åbning form i inhibitorbehandlede EmbryOS. I sammendrag, en kombination af traditionelle målinger af ansigts dimensioner og geometriske morfometriske analyse illustrerer ændringerne i form og størrelse af den orofacial region når retinsyreholdige signaler forstyrres.

Figur 1
Figur 1. Nødvendige materialer. (A) Værktøjer til dataanalyse. (I) 24-brønds plade, (ii) standard engangs transfer pipette, (iii) Dumont # 5 Inox pincet, (iv) ler-foret petriskål, (v) lige drilleri nål, (vi) glaspipette værktøj, (vii ) steril, engangs skalpel. (B) Fremstilling af ler-foret skål. (I) en lige drilleri nål anvendes til at trække vandrette linjer i leret. (Ii) Et glas pipette værktøj anvendes til at fremstille cirkulære fordybninger langs hver række. (Iii) Skålen er fyldt med PBT til billeddannelse.

page = "altid"> Figur 2
Figur 2. In vitro befrugtning og dyrkning af Xenopus æg. (A) Efter HCG injektion, voksne Xenopus laevis hunner induceres til at lægge æg. (B) Æg opsamles i høj salt MBS, gødet med testikler ekstraheret fra en mandlig og dyrket ved anvendelse af standardmetoder. (C) Embryoer overføres til en 24-brønds skål indeholdende 0,1x MBS anvendelse af en standard, engangs transfer pipette. (D) En kalibreret pipette mand bruges til at måle 1 ml i en tom brønd, og en markør anvendes til at afgrænse dette niveau på ydersiden af alle brønde indeholder embryoner (indsat). 0,1X MBS tilsættes derefter eller taget væk, så det er på niveau med dette mærke.

highres.jpg "width =" 500 "/>
Figur 3. Forberedelse af embryo hoveder til billeddannelse. (A) Diagram af de to snit, der er nødvendige for at fjerne hoveder, solide sorte streger. Scale bar = 400 um. (B) Den første incision ved den bageste ende af tarmen for at fjerne halen og frigivelse pres fra skalpel. Scale bar = 400 um. (C) Den anden incision ved den forreste ende af tarmen, nær hjertet, til helt at afskære hovedet. Scale bar = 400 um. (D) Frontal udsigt over rækken af embryo hoveder placeret i ler. Scale bar = 650 um. (E) Lateral udsigt over rækken af embryo hoveder position i ler. Scale bar = 500 um cg: cement kirtel.

Figur 4
Figur 4. Traditionel størrelse målinger af orofaciale dimensioner. (A) Face bredde. Pile indikerer de punkter, hvor den ventrale del af øjet opfylder periferien af ​​ansigtet. Rød linje er ansigtet bredde, målt som afstanden mellem disse punkter. Scale bar = 210 uM. (B) Face Højde. Hvide linjer er vejledninger trukket før målingen på den dorsale kant af øjne og den dorsale kant cement kirtel. Røde linie ansigtet højde, målt som afstanden mellem disse to føringer på midterlinjen af ​​ansigtet. Scale bar = 210 uM. (C) Orofacial område. Hvide linjer er vejledninger trukket før målingen. (A) punkt, hvor bunden guide opfylder ventrale kant af det venstre øje. Røde linje viser sporing omkring venstre øje. (B) punkt, hvor den dorsale kant af øjet møder top guide. Blå linje viser den dorsale grænsen af ​​orofacial område spores langs den øverste guide på den dorsale kant af øjnene. (C) punkt, hvor den øverste guide møder højre facial periferien. Grønne linje visersporing omkring det højre øje. (D) Et punkt, hvor den ventrale kant af højre øje møder bunden guide. Gule linje viser ventrale grænse af orofacial område spores langs bunden guide på den dorsale kant af cement kirtel. Scale bar = 210 uM. (D) Snude længde. Hvid linie er den forreste kant af øjet og er tegnet som en vejledning før måling. Røde linie snude længde målt fra denne linje til det punkt, hvor den dorsale kant af cement kirtel opfylder lateral periferi af ansigtet. Scale bar = 300 uM. (E) Mouth bredde. Pile er de punkter, hvor den dorsale og ventrale læber mødes. Den røde linje er munden bredde, målt som afstanden mellem disse to punkter. Scale bar = 200 uM. (F) Mouth rundhed. Omkredsen af ​​mundingsåbningen opspores og vist i rødt. cg: cement kirtel. Scale bar = 200 uM.

"Figur Figur 5. Optagelse vartegn og sagsbehandling geometrisk morfometrisk analyse. (A) Brug af software til fotoredigering og et regneark til at placere vartegn og capture koordinater. (I) Flerfarvede kors er vartegn placeret på billedet ved hjælp af at tilføje punkter værktøj i ImageJ at repræsentere formen af orofacial region. (Ii) Landmark data vises ved hjælp af Vis søgeresultater Tool. (Iii) Landmark data kopieres og indsættes i et regneark. Over den anden kolonne er en header identificerer antallet af vartegn og betegnet med "LM = 24" (rød boks). Under den anden kolonne med data, prøven gives et unikt navn og betegnet med "ID = CON1" (rød pil). Dette gentages for alle billeder i en prøve sæt, og data gemmes som en tekstfil. (B) Indledende dataanalyse i et geometrisk morfometrisk softwer program. (I) Teksten fil oprettet fra fotoredigeringssoftware importeres til morfometriske program, MorphoJ, som TPS-fil. Fil er angivet med en rød pil. (Ii) Landmark koordinere data tilpasses ved Procrustes fit af hovedakser. Røde pil viser udførelsen af ​​justering. (Iii) En kovariansmatrix af Procrustes vartegn fit genereres i menuen indledende kampe. (Iv) En klassifikator filen er oprettet i et regneark. Kolonne A og B er givet overskrifter "ID" og "behandling", hhv. ID er givet til hver prøve i skelsættende dataindsamling er input i kolonne A, og behandlingen gruppe, som hver prøve tilhører input i kolonne B. (v) Klassifikatoren fil importeres til morfometriske program som en variabel sæt sorterer og matches ved Identifier for den valgte datasæt. Klik her for at se en større udgave afdette tal.

Figur 6
Figur 6. Statistisk analyse i morfometrisk software. (A) Principal Component Analysis (PCA) (i) PCA er valgt fra fanen Variation. (Ii) De første to vigtigste komponenter vartegn Procrustes vises som en Scatterplot i fanen PC scoringer. (Iii) En pop-up menu frem i plottet rummet. Denne menu bruges til at ændre, hvilke primære komponenter er plottet mod hinanden (rød pil), og at farve datapunkter (fremhævet med blåt). (Iv) De datapunkter er farvet i henhold til klassificeringen variabler i pop-up-menuen. (V) Procentdel af varians fanget af hver hovedkomponent ses i fanen Results. (B) Discriminant Function Analysis (DFA) (i) DFA er udvalgt fra fanen Sammenligning. (ii) datasættet Procrustes koordinater er valgt for DFA, og de tidligere uploadede klassifikatorer vælges til gruppering. De ønskede grupper, der skal sammenlignes, er valgt, og permutation test køres. (Iii) DFA resultaterne vises som en vektor kort under fanen Shape Difference. En pop op-menuen i plottet plads kan bruges til at orientere billedet korrekt. (Iv) ved at vælge fanen Set Scale Factor i pop-up-menuen, kan tegnet af skalaen faktor ændres. (V) vektorkort ændres til en transformation nettet med det ønskede antal gitterlinjer ved at vælge Skift type Graph i pop-up menuen i vektorkort. (Vi) Mahalanobis og Procrustes afstande og tilsvarende p-værdier ses under fanen Results. Klik her for at se en større udgave af dette tal.

Figur 7. Orofacial analyse af kontrol og RAR inhiberede behandlede embryoer. (A) (I, II) Repræsentative billeder af kontroller. Skalapanelerne = 270 um. (Iii, iv) Embryoner behandlet med en 1 uM koncentration af RAR-inhibitor, BMS-453. Skalapanelerne = 260 um. (I, iii) Frontal synspunkter. Mundingsåbning er skitseret i røde prikker. (II, IV) visninger Side. cg:. cement kirtel (B) Traditionelle orofaciale dimensioner af kontrol (sort) og behandlet med inhibitor (blå) embryoner. (I) snude længde, i mm (ii) ansigt bredde i mm (iii) ansigt højde i mm (iv) mund bredde i mm (v) mund rundhed, en enhed-mindre antal bestemmes i ImageJ anvendelse af ligningen: (4 × [Area]) / (π × [Major akse] 2). (Vi) Orofacial område, mm (C) Principal Component Analysis. Controls er i sort og RAR inhibitorbehandlede embryoner er i blåt. Sorte pile angiver outliers. PC1 = 73,63%, PC2 = 9,56%. (D) Diskriminantanalyse Function Analysis viser Procrustes afstand og p-værdi, i tillæg til en transformation gitter. Lukket cirkel ende vektor er skelsættende position i RAR inhibitor behandlede embryoer. Den ende af linjen af ​​vektoren er den skelsættende position i kontrol. Sorte pile angiver skift i nasale vartegn. Klik her for at se en større udgave af dette tal.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Xenopus laevis er blevet et nyttigt redskab til at dissekere de udviklingsmæssige mekanismer underliggende orofacial udviklingsbehov; men der er i øjeblikket ingen protokoller, der beskriver størrelse og form ændringer i denne region i frøer. Den her beskrevne fremgangsmåde vil bidrage væsentligt til området for orofacial udvikling ved at tillade mere præcis kvantificering af orofaciale fænotyper i Xenopus og andre hvirveldyr.

Den første, mest kritiske aspekt af korrekt udførelse af denne protokol er evnen til at måle facial dimensioner og bestemme skelsættende placering både nøjagtigt og reproducerbart. Til dette formål, er det afgørende, at embryonale ansigter blive fotograferet i samme vinkel, retning og forstørrelse. Der skal udvises særlig omhu for at opnå præcise målinger af snuden længde, da det er svært at manipulere embryoner sideværts og opnå ensartet placering. At have en enkelt person udføre alle målinger på Same dag minimerer denne type fejl, og samtidig maksimere reproducerbarhed af resultaterne. Den anden mest kritiske aspekt af at sikre gode resultater er en reduktion af unødige udsving, såsom udviklingsmæssige forskelle eller genetisk baggrund. Dette er især vigtigt, når vurderingen af ​​statistisk signifikans mellem subtile defekter. Embryoner derfor nødt til at være på samme stadium, når de behandles og fotograferet. Desuden bør der drages omsorg for at sikre udviklingsmæssige satser er ækvivalente mellem og blandt behandlingsgrupper. For at formindske sådanne problemer med variation, så sørg for, at alle fostre er fra de samme forældre og er scenen matches ved begyndelsen af ​​eksperimentet. Reducerer også eksterne kilder til variation såsom forskellige buffer kilder og mængder, forskellige antal embryoner, og udlodninger i kulturen retter (for eksempel forhindre fortrængning).

Et vigtigt skridt i vurderingen af ​​formændringer gennem geometriske morphometrics er alignment skelsættende koordinater via Procrustes pasform. Ved anvendelse af denne matematisk algoritme er enhver oplysning om størrelse eller forskelle i rotation af billedet fjernet. Den efterfølgende genererede kovariansmatrix bestemmer unstandardized korrelationer af skelsættende koordinater blandt alle embryoner i datasættet, som multivariat statistisk teknikker-såsom hovedkomponent eller diskriminant funktion analyses- kan udføres.

En principal komponent analyse (PCA) reducerer en kompleks prøve til et mindre sæt variabler kaldet hovedkomponenter 26. Den første komponent tegner sig for den mest varians inden prøven sæt, med hver efterfølgende komponent tegner sig for resten. Ved at plotte de første to komponenter mod hinanden ved hjælp af morfometrisk software, prøver, der er mest ligner klynge sammen. På denne måde, PCA diskriminerer grupper i et prøvesæt, samtidig med at bestemme variationen i dem. I whiche tilfælde kan grupper ikke være klart adskilt fra hinanden og overlapper hinanden langs den ene eller begge akser. I dette tilfælde er det fordelagtigt at plotte andre komponenter (fx PC3) for at afsløre subtile egenskaber ved hvilke grupper diskrimineres. Dette er især relevant, når den samlede varians er mere jævnt fordelt blandt de første flere variable.

Diskriminant funktion analyse (DFA) i Procrustes fit data bestemmer, om prøver i et datasæt effektivt forskelsbehandles i grupper, som de kontinuerlige variabler, der definerer dem. Prøver derfor klassificeret i grupper forud for analyse, og variablerne er oversat til komponenter kaldet diskriminere funktioner til at bestemme den statistiske sammenhæng mellem grupperne 27. Forud for at køre denne analyse, er det vigtigt at angive antallet af permutation tests. Disse permutation tests randomisere dataene således at eventuelle antagelser om dennes fordeling er elimineringTed. Flere permutationstest iterationer forøge nøjagtigheden af ​​p-værdien. Når visualiseret som en transformation gitter, idet betydelige ændringer i skelsættende position mellem grupperne sammenlignet vises. Yderligere vridning mønster af nettet afslører, hvor forekomme formændringer. Ulempen ved denne analyse er, at den kun kan anvendes til sammenligning af to grupper. Hvis der er tre eller flere grupper i en prøve sæt til sammenligning, er det bedre at udføre en kanonisk variate analyse. Dette svarer til en DFA, at det genererer en statistisk p-værdi; Men det viser forandringer over hele prøven er angivet ud over dem, der forekommer mellem de enkelte grupper i sættet.

Den største begrænsning i denne orofacial kvantificering er, at den kun kan anvendes på todimensionale data. Vores fremtidige mål omfatter brug af CT-scanning eller konfokal mikroskopi at udvikle lignende metoder til analyse af tre-dimensionelle data. På den anden side,arbejder med to-dimensionelle billeder er også en af ​​de store styrker ved denne protokol. Kun grundlæggende stereoscopes udstyret med kameraer der er behov for at tage billeder af den embryonale ansigt. Den anvendes til dette dataanalyse Openware øger også tilgængeligheden af ​​denne fremgangsmåde, men med færre omkostninger. Endvidere er en avanceret viden om sofistisk billeddannelse, statistiske analyser, eller edb-programmering ikke forpligtet til at udtrække meningsfulde og væsentlige resultater fra dataene. I virkeligheden er denne teknik i øjeblikket undervises som en del af en bachelor laboratorium kursus i VCU Biologisk Institut. Således orofacial kvantificering protokol, der præsenteres her er let at lære og anvende i en kort periode. Som en video repræsentation, er kritiske skridt såsom positionering embryoner og navigere i softwaren fremhævet for at sikre protokollen held kan udnyttes ved selv uøvede studerende og forskere. Sammenfattende vil denne protokol giver en værdifuld ressourcetil forskningsmiljøet, og som et pædagogisk redskab.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne har ikke noget at afsløre.

Acknowledgements

Nystartede penge til A. Dickinson fra VCU støttet dette arbejde.

Forfatterne ønsker at anerkende Dan Nacu for sit kunstneriske talent i at skabe den skematisk illustration.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Dissecting microscope Zeiss fitted with AxioCamICC1 camera
Dumont #5 Inox forceps Fine Science Tools 11251-10
Sterile, disposable scalpel Sklar 06-2015
24-well plate Fisher Scientific 087721
Standard Disposable transfer pipettes Fisher Scientific 13-711-7M
150 mm x 15 mm Petri dishes Falcon 351058
Incubators Ectotherm set to 15 °C or 20 °C
Modeling Clay Premo, or other non-toxic modeling clay in black or white
Straight teasing needle Thermo Scientific 19010
Capillary Tubing (for needles) FHC 30-30-1 Borosil 1.0 mm OD x 0.5 mm ID/Fiber, 100 mm each
Needle Puller, Model P-97 Sutter Instrument Co. Needle Puller: P-97 Flaming/ Bown micropipette puller Filament: FB300B For filaments, use Sutter 3.00 mm square box filaments, 3.0 mm wide.
Pipettemen Gilson F144802, F123600, F123602
BMS-453 Tocris 3409
DMSO American Bioanalytical AB00435-01000
Cysteine Sigma-Aldrich 52-90-4
Paraformaldehyde powder Sigma-Aldrich 158127
Petri dishes Falcom 353003, 351058 100 mm diameter and 150 mm in diameter
100% Ethanol VWR 89125-170

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Mossey, P. A., Little, J., Munger, R. G., Dixon, M. J., Shaw, W. C. Cleft lip and palate. Lancet. 374, 1773-1785 (2009).
  2. Kennedy, A. E., Dickinson, A. J. Median facial clefts in Xenopus laevis: roles of retinoic acid signaling and homeobox genes. Dev Biol. 365, 229-240 (2012).
  3. Kennedy, A. E., Dickinson, A. J. Quantitative Analysis of Orofacial Development and Median Clefts in Xenopus Laevis. Anat Rec (Hoboken). (2014).
  4. Dickinson, A., Sive, H. Positioning the extreme anterior in Xenopus: cement gland, primary mouth and anterior pituitary. Semin Cell Dev Biol. 18, 525-533 (2007).
  5. Dickinson, A. J., Sive, H. Development of the primary mouth in Xenopus laevis. Dev Biol. 295, 700-713 (2006).
  6. Dickinson, A. J., Sive, H. L. The Wnt antagonists Frzb-1 and Crescent locally regulate basement membrane dissolution in the developing primary mouth. Development. 136, 1071-1081 (2009).
  7. Barnett, C., et al. Syndrome Transcription Factor is critical for neural crest cell function in Xenopus laevis. Mech Dev. 129, 324-338 (2012).
  8. Gonzales, B., Yang, H., Henning, D., Valdez, B. C. Cloning and functional characterization of the Xenopus orthologue of the Treacher Collins syndrome (TCOF1) gene product. Gene. 359, 73-80 (2005).
  9. Reisoli, E., De Lucchini, S., Nardi, I., Ori, M. Serotonin 2B receptor signaling is required for craniofacial morphogenesis and jaw joint formation in Xenopus. Development. 137, 2927-2937 (2010).
  10. Schuff, M., et al. FoxN3 is required for craniofacial and eye development of Xenopus laevis. Dev Dyn. 236, 226-239 (2007).
  11. Slater, B. J., Liu, K. J., Kwan, M. D., Quarto, N., Longaker, M. T. Cranial osteogenesis and suture morphology in Xenopus laevis: a unique model system for studying craniofacial development. PLoS One. 4, (2009).
  12. Vandenberg, L. N., Adams, D. S., Levin, M. Normalized shape and location of perturbed craniofacial structures in the Xenopus tadpole reveal an innate ability to achieve correct morphology. Dev Dyn. 241, 863-878 (2012).
  13. Bugaighis, I., Mattick, C. R., Tiddeman, B., Hobson, R. 3D Facial Morphometry in Children with Oral Clefts. Cleft Palate Craniofac J. (2013).
  14. Farkas, L. G., Katic, M. J., Forrest, C. R. Surface anatomy of the face in Down's syndrome: anthropometric proportion indices in the craniofacial regions. J Craniofac Surg. 12, 519-524 (2001).
  15. Scheuer, H. A., Holtje, W. J., Hasund, A., Pfeifer, G. Prognosis of facial growth in patients with unilateral complete clefts of the lip, alveolus and palate. J Craniomaxillofac Surg. 29, 198-204 (2001).
  16. Parsons, K. J., Andreeva, V., James Cooper, W., Yelick, P. C., Craig Albertson, R. Morphogenesis of the zebrafish jaw: development beyond the embryo. Methods Cell Biol. 101, 225-248 (2011).
  17. Farkas, L. G., Katic, M. J., Forrest, C. R. Surface anatomy of the face in Down's syndrome: age-related changes of anthropometric proportion indices in the craniofacial regions. J Craniofac Surg. 13, 368-374 (2002).
  18. Cooper, W. J., et al. Bentho-pelagic divergence of cichlid feeding architecture was prodigious and consistent during multiple adaptive radiations within African rift-lakes. PLoS One. 5, (2010).
  19. Klingenberg, C. P., et al. Prenatal alcohol exposure alters the patterns of facial asymmetry. Alcohol. 44, 649-657 (2010).
  20. Zhao, Y., et al. Isolated cleft palate in mice with a targeted mutation of the LIM homeobox gene lhx8. Proc Natl Acad Sci U S A. 96, 15002-15006 (1999).
  21. Allam, K. A., et al. The spectrum of median craniofacial dysplasia. Plast Reconstr Surg. 812-821 (2011).
  22. Sive, H. L., Grainger, R., Harlard, R. Early development of Xenopus laevis: a laboratory manual. Cold Spring Harbor Laboratory Press. (2000).
  23. Cross, M. K., Powers, M. Obtaining eggs from Xenopus laevis females. J Vis Exp. (2008).
  24. Nieuwkoop, P. D., Faber, J. Normal Table of Xenopus Laevis (Daudin). Garland Publishing Inc. (1967).
  25. Nieuwkoop, P. D. aF. J. Normal Table of Xenopus laevis (Daudin): A Systematical and Chronological Survey of the Development from the Fertilized Egg till the End of Metamorphosis. Garland Publishing Inc. (1994).
  26. Abdi, H., Williams, L. J. Principal Component Analysis. WIREs Computational Statistics. 2, (2010).
  27. Hill, T. L. P. STATISTICS: Methods and Applications. StatSoft, Inc. Tulsa, OK. (2013).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics