Kvantifisering av Orofacial fenotyper i

Biology

Your institution must subscribe to JoVE's Biology section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Summary

En fremgangsmåte for å kvantifisere orofacial størrelsen og formen av Xenopus laevis embryoer har blitt utviklet. I denne protokollen, er tradisjonell størrelse målinger kombinert med geometriske morphometrics å tillate mer sofistikerte analyser av orofacial utvikling og defekter.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Kennedy, A. E., Dickinson, A. J. Quantification of Orofacial Phenotypes in Xenopus. J. Vis. Exp. (93), e52062, doi:10.3791/52062 (2014).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Xenopus har blitt et viktig verktøy for å dissekere de mekanismene som styrer craniofacial utvikling og defekter. En metode for å kvantifisere orofacial utviklingen vil tillate mer grundig analyse av orofacial fenotyper ved opphevelse med stoffer som genetisk eller molekylært kan manipulere genuttrykket eller protein funksjon. Ved hjelp av todimensjonale bilder av embryonale hoder, er tradisjonelle dimensjoner-en slik størrelse som orofacial bredde, høyde og området-målt. I tillegg er en rundhet mål på den embryoniske munnåpningen brukt for å beskrive formen av munnen. Geometriske morphometrics av ​​disse to dimensjonale bilder blir også utført for å tilveiebringe en mer sofistikert riss av endringer i formen av orofacial regionen. Landemerker er tildelt spesifikke punkter i orofacial regionen og koordinatene er opprettet. Et prinsipp komponentanalyse anvendes for å redusere Landmark koordinater til prinsipielle komponenter som deretter diskriminere behandlingengrupper. Disse resultatene vises som et punktplott som personer med lignende orofacial former klynge sammen. Det er også nyttig å utføre en funksjon diskriminant analyse, som statistisk sammenligner posisjonene til landemerker mellom to behandlingsgruppene. Denne analysen vises på en transformasjon rutenett der endringer i landemerke posisjon blir sett på som vektorer. Et rutenett legges oppå disse vektorer slik at en fordreining mønster vises for å vise hvor viktig kjennetegn er flyttet. Formendringer i diskriminant funksjonsanalysen er basert på et statistisk mål, og kan derfor bli vurdert av en p-verdi. Denne analysen er enkel og tilgjengelig, krever bare et stereoskop og freeware programvare, og dermed vil være en verdifull forskning og undervisning ressurs.

Introduction

Blant de mest utbredte og ødeleggende typer av humant fødselsskader er de som påvirker munn og ansikt, slik som orofacial kløfter en. Barn med misdannede orofacial strukturer gjennomgå flere operasjoner i hele sin levetid, og sliter med ansikts disfigurements, tale, hørsel og spiseproblemer. Derfor er av vesentlig betydning for forebygging og behandling av disse typer misdannelser tilrettelegge ny forskning i cranio- og orofacial utvikling hos mennesker. Xenopus laevis har dukket opp som et nytt verktøy for å dissekere de mekanismene som styrer craniofacial utvikling (noen eksempler er 2,3,4 -11). Derfor kan en kvantitativ metode for å analysere størrelse og form endres under utviklingen av hodet og ansiktet av denne arten være svært kraftig tre.

Her presenterer vi en slik metode; kombinerer tradisjonelle målinger størrelse med geometriske morphometrics tilpasset fra en Xenopus studie 12 13-15. Målet med denne protokollen er å tillate forskere å kvantifisere ansikts størrelse og former for å skille mellom ulike orofacial fenotyper under normal og unormal utvikling. Denne analysen vil gi rom for bedre differensiering mellom subtile kraniofaciale defekter som dem som skyldes synergieffekter av gener og / eller miljømessige faktorer. I tillegg kan dette kvantifisering metoden også avsløre enda liten forbedring eller redning av en orofacial defekt. Dette gjør det derfor en nyttig guide i å analysere mulige behandlingsformer.

Kombinasjonen av ansikts målinger og geometriske morphometrics som vi presenterer her gjør det mulig for en mer omfattende statistisk analyse av både størrelsen og formen på den orofacial region enn nåværende protokoller som i stor grad utnytter bare den ene eller den andre 15-18. Videre presenterer vi en enkel måte å vurdere både den mediale og laterale flyene avansiktet uten å kreve avansert tredimensjonal bildeutstyr som brukes i dagens studier 13,19.

Vi demonstrerer denne protokollen på Xenopus laevis embryoer behandlet med en retinsyrereseptor hemmer som induserer unormal orofacial utvikling og en median ganespalte 2,3. Kvantifisering av dimensjonene og formen på orofacial regionen i disse embryoer har avdekket endringer i midface som er analog til mennesker med liknende palatal kløfter og musemodeller 20,21. Imidlertid kan denne protokollen benyttes for å vurdere effekten av andre forbindelser på orofacial utvikling som naturlige stoffer, plantevernmidler, eller proteiner som vekstfaktorer. Videre orofacial størrelse og form endringer som følger av endringen av genekspresjon via tap eller gevinst på funksjons eksperimenter (ved hjelp av antisense morpholinos eller Crispers / Talens) også kan kvantifiseres ved hjelp av denne protokollen. Til slutt, har vi utviklet denne metoden spesifikasjonlly å vurdere Xenopus morfologi; men det er imidlertid lett modifiseres for analyse av en hvilken som helst vertebrat. Andre programmer kan også omfatte å bruke denne protokollen for å sammenligne nært beslektede arter for evolusjonære eller økologiske studier. Mens eksempelet vi tilbyr her benytter denne protokollen å beskrive analyse av orofacial regionen, kan det lett bli endret for analyse av andre regioner, organer eller strukturer.

Dette orofacial kvantifisering protokollen vil bli en verdifull ressurs for forskersamfunnet, samt en utmerket læringsverktøy for lavere grads studenter som en video demonstrasjon.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Alle eksperimenter utført ved hjelp Xenopus laevis har blitt godkjent av IACUC (protokoll # AD20261).

1. Forberede Reagenser og nødvendige materialer

  1. Reagenser:
    1. Lag 1 liter 10x MBS (Modified Barths Saline) løsning 22. Legg NaCl (880 mM), KCl (10 mM), MgSO4 (10 mM), HEPES (50 mM, pH 7,8), og NaHCO3 (25 mM) til 1 liter destillert vann. Juster pH til 7,8 med NaOH.
    2. Lag 1 L av 1 x MBS ved å fortynne 100 ml av 10x MBS-oppløsning i 900 ml destillert vann. Legg 0,7 ml 1 M CaCl2-løsning.
    3. Lag 1 L av 0,1X MBS ved å fortynne 100 ml av 1 x MBS-oppløsning i 900 ml destillert vann. Til 1 liter av 0,1X MBS-oppløsning, tilsett 1 ml 10 mg / ml gentamicin-løsning for anvendelse i embryokultur.
    4. Gjør høye salt MBS ved oppløsning av 4 ml 5 M NaCl i 100 ml 10x MBS. Deretter legger destillert vann til totalt volum er en L.
    5. Gjør 70% etanol ved å fortynne 100% ethanol til 70% etanol under anvendelse av destillert vann.
    6. Gjør BMS-543 ved å forberede en 10 mM stamløsning i dimethylsulfoxyd (DMSO).
    7. Gjør 4% paraformaldehyd (PFA) ved tilsetning av 4 g paraformaldehyd pulver til 50 ml destillert vann. Heat på en varm plate til ca 65 ° C, noe som medførte legge 5 M NaOH dråpevis til løsningen forsvinner.
      1. Når løsningen forsvinner, fjern fra varmen og tilsett 50 ml 2x PBS og 100 ul Tween-20. Avkjøl til romtemperatur på is. Juster pH-verdien til mellom 7,2 og 7,5 ved hjelp av HCl.
    8. Foreta en fosfat-bufret saltløsning med Tween (PBT) ved å oppløse 8 g NaCl, 0,2 g KCl, 1,44 g Na HPO 2-4, og 0,24 g KH 2PO 4 i 800 ml destillert vann. Ved hjelp av HCl, justere pH til 7,4. Tilsett 2 ml Tween-20. Juster sluttvolum med destillert vann til lik en L.
    9. Lag en cystein løsning ved å løse opp 1 g av cystein i 50 ml destillert vann eller 0.1x MBS. Tilsett 1,5 ml av en 5 M NaOHnd justere pH til 7,8.
    10. Lag en 10% benzocaine stamløsning ved å tilsette 10 g benzocaine pulver til 100 ml 100% EtOH. For avliving av voksne menn og embryoer klar for fiksering, tynnes til en 0,05% løsning.
    11. Gjør en testiklene lagringsløsning ved tilsetning av 1 ml serum fra kalve til 9 ml av L15-buffer.
  2. Nødvendige verktøy og utstyr:
    1. Skaff utstyret listet i tabellen av materialer og utstyr, vist i figur 1.
    2. Endre en pipette verktøyet. Plasser tuppen av et glass Pasteur pipette inn en flamme fra en Bunsen-brenner. Roter pipettespissen til det smelter og danner en avrundet forseglet ende.
    3. Flat ut modelleringsleire inn i bunnen av en petriskål av plast, jevner ut for å dekke hele platen (alle størrelser kan benyttes) (figur 1Aiv).
      1. Trykk lett en rett teasing nål inn i leire-lined fatet i 45 ° vinkel. Hold nålen der, og beveg Petriparabolen horisontalt for å skape en deprimert linje (Figur 1Bi). Gjenta for ønsket antall rader.
      2. Bruk enden av en glass pipette verktøy for å lage grunne, sirkulære fordypninger i hver rad i leire-lined rett til å plassere embryo hoder (Figur 1Bii) og hjelpemiddel i organisering embryoene mens fotografere.
      3. For fotografering, fylle tallerken med PBT (figur 1Biii). Mellom anvendelser, vaskes grundig fatet og leireoverflaten med sterilt vann, etterfulgt av 70% etanol.

2. Xenopus laevis embryo Kultur og inhibitor Behandlinger

  1. In vitro fertilisering og kulturen i Xenopus egg:
    1. Innhente og kultur Xenopus laevis embryoer ved hjelp av standard publisert metoder 22,23.
    2. Kort, avlive en voksen mann ved neddykking i en 0,05% benzocaine løsning. Dissekere testikler og lagrer i testiklene lagring buffer. Injiserevoksne kvinner med humant choriongonadotropin (HCG), samle egg i høye salt MBS, og gjødsle in vitro med dissekert testiklene (Figur 2A, B).
    3. Kultur embryoer i 0,1X MBS ved 15 ° C inntil det ønskede stadium er nådd (etapper embryoer i henhold til vanlig bord av Xenopus laevis ved Nieuwkoop og Faber 24,25).
      1. Her, kultur embryo før scenen 22 (24 timer etter befruktning (HPF)), og fjern vitelline membran under en stereo bruker to par med skjerpet tang. Overfør embryoer med en standard, engangsoverføring pipette til en ren petriskål (100 mm i diameter) inneholdende 30-40 ml 0,1X MBS.
  2. Inhibitorkomplekser behandlinger av Xenopus embryoer (illustrert i figur 2):
    1. Fyll den nødvendige brønner i en 24-brønners kulturskål med 1 ml 0,1X MBS ved hjelp av en kalibrert pipette-mann. Demarcate utsiden av brønnen med en fin spiss markeh (figur 2D, innfelt). Bruk markør til også å merke at innholdet skal bli tilsatt til hver brønn på 24-brønners dyrkningsskål lokk. Kopier denne informasjonen til en 24-godt oppsett siden i laboratoriet notebook.
    2. Overfør 5-10 embryoer i hver brønn ved hjelp av en standard, engangs overføringspipetten (figur 2C). Plasser det samme antall embryoer i hver brønn.
    3. Topp opp eller fjerne 0.1x MBS slik at den er på nivå med en ml markerte linjen (figur 2D). Tilsett passende volum av DMSO (slik at det endelige volum av DMSO er 1%) og virvle. Vær forsiktig med å legge DMSO for nær embryoene, og unngå kontakt av embryoene med overflaten av bufferen.
    4. Legg det passende volumet av kjemiske til de utpekte brønner og virvle igjen. Her, tilsett 1 pl av 10 mM BMS-453 (en retinsyre-reseptor-antagonist) og 9 pl av DMSO til 1 ml 0,1X MBS.
    5. Hvis den kjemiske er lysfølsom, Vikle Culture rett inn i aluminiumsfolie. Kultur embryoer i en 15 ° C inkubator inntil det ønskede stadium. I dette eksempelet behandle embryoer for 16-18 hr.
  3. Vaske embryoer ut av behandling og stell før rumpetroll stadier:
    1. Ta en halv til tre fjerdedeler av løsningen med en engangsoverføring pipette. Vær forsiktig så du ikke å forstyrre embryoene. Ved hjelp av en ny overførings pipette, fylle brønnen med 0,1X MBS. Gjenta dette 3-6 ganger.
    2. Overfør embryoer til et stort petriskål (150 mm i diameter) inneholdende 100 ml 0,1X MBS med gentamicin (1 ml / l). Inkuber embryoene ved 15 ° C inntil de når trinn 42-45 (82-100 HPF).
    3. Endre 0.1x MBS løsning som inneholder gentamicin daglig, og fjerne døde embryoer omgående for å hindre forurensning eller død av andre embryoer. Registrere antall døde fostre i laboratoriet notebook.
  4. Feste embryoene i Paraformaldehyde (PFA):
    1. Fix embryoer mellom stadier 42 og 45 (82 og 100HPF, henholdsvis) ved å overføre dem til en ny 24-brønners kulturskål inneholdende 1-2 ml 0,1X MBS. Etikett lokket med den samme informasjonen som behandling set-up som er beskrevet ovenfor (avsnitt 2.2.1).
    2. Fjern så mye 0.1x MBS fra hver brønn som mulig, samtidig som forlater embryoer dekket og sikre minimal kontakt for å hindre skade. Legg 1-2 ml av 0,05% Benzocaine oppløsning i 0,1X MBS og inkuberes inntil embryoer ikke lenger er mottakelig for stimuli.
    3. Legg 1-2 ml 4% PFA. Alternativt plassere embryo i merkede mikrosentrifugerør for fiksering, hvis ønskelig.
    4. Inkuber i embryoer PFA i 24 timer ved 4 ° C på en roterende risteapparat. Fjern PFA ved å utføre 3-4 vasker med PBT over en 3-5 timers periode.

3. Fotografering i Orofacial regionen Xenopus Tadpoles

  1. Pre-fotografering preparat (dette er illustrert i figur 3):
    1. Plasser faste embryoene i en stor petriskål (150mm i diameter) inneholdende omtrent 100 ml av PBT.
    2. Lag to snitt til å kutte hodet fra kroppen (figur 3A, solide sorte linjer). Først holder embryoet med en pinsett og gjøre et snitt på den bakre side av tarmen med en steril skalpell (figur 3B). Foreta en andre innsnitt på fremre side av tarmen, i nærheten av hjertet, for fullstendig å fjerne hodet (figur 3C).
    3. Pipette kuttet embryo hoder inn en leire-lined fatet (del 1.2.2) ved hjelp av en standard, engangsoverføring pipette.
      1. For frontal utsikt, bruke to par pinsett til å plassere embryo hoder posterior side ned inne i sirkulære depresjoner. Ved hjelp av pinsett til å manipulere både embryo hodet og det omkringliggende leire, posisjons embryoer slik at de står overfor kameraet og er ikke skrå bakover eller til en av sidene (Figur 3D). Skyv den omkringliggende leire rundt hodet ved hjelp av pinsett og / eller glassetpipette verktøy for å feste et innlegg på plass.
      2. For sidevisninger Bruk pinsett til å plassere embryo hoder inne i sirkulære fordypninger slik at de er på deres side, vendt i samme retning, og er flatt mot leire. Manipulere embryoet hodet og den omliggende leire, slik at sement kjertler av alle embryoene er plassert nedover i samme vinkel (figur 3E). Bruk radene trukket med ertende nålen som en guide for å sikre nøyaktighet når du tar laterale målinger.
  2. Ta bilder av rumpetroll hodet:
    1. Fotografere leder av rumpetroll bruke noen dissekere mikroskop med et vedlagt digitalt kamera og tilsvarende kameraprogramvaren. Bruk den høyeste forstørrelse som kan holdes konstant for alle embryoer.
    2. Sentrer embryoer og møte dem alle i samme retning. Ta bilder ved hjelp av de beste lysforhold som gir rom for den mest nøyaktige bildet av orofacial regionen. Stillinglys for å unngå overdreven skygger. Lagre bilder som TIFF-filer med høyest mulig oppløsning.

4. Måle og analysere Facial Størrelse Mål i Xenopus Tadpoles

  1. Mål orofacial dimensjoner (oppsummert i figur 4):
    1. Bestem ansiktet bredde. Identifisere de punktene hvor ventral del av hvert øye oppfyller periferier av ansiktet (Figur 4A, piler), og måle avstanden mellom disse punktene (figur 4A, rød linje).
    2. Bestem ansiktet høyde. Først bestemmer midtlinjen ved å måle avstanden mellom hvert øye, og beregning av den halvveis. Neste, tegne horisontale linjer som markerer dorsal de fleste kanter av øynene og rygg mest punkt av sementkjertelen (figur 4B, hvite linjer). På midtlinjen, måle avstanden mellom de horisontale linjene (Figur 4B, rød linje).
    3. Bestem than orofacial området. Bruk samme horisontale linjer som markerer rygg kantene av øynene og sement kjertel å veilede arealmåling (Figur 4C, hvite linjer). Starter ved det punkt hvor den horisontale merkelinje toppen av sementkjertel møter omkretsen av den venstre side av ansiktet (figur 4CA).
      1. Spore langs kanten av ansiktet som omfatter øyet til det punkt der den horisontale linje som markerer toppen av øynene møter omkretsen av flaten (fig 4Cb). Fortsett å spore langs denne dorsal de horisontale linjen til det punkt hvor den møter omkretsen av den høyre side av ansiktet (figur 4Cc).
      2. Trace nedad langs kanten av ansiktet som omfatter øyet til det punkt hvor den ventrale mest horisontal linje som markerer toppen av sementkjertel møter omkretsen av den høyre side av ansiktet (figur 4CD). Fortsett å spore langs denne bunn horisontal linje until den møter det punkt hvor sporingen begynte. Bruk bildebehandlingsprogram for å beregne arealet inne i sporing.
    4. Bestem snute lengde. På sidebilder, foreta en vertikal linje som markerer den fremre av øyet. Deretter måler den horisontale avstanden fra det fremre punktet hvor ansiktet møter den dorsale kant av sementkjertel til den vertikale linje som markerer fremre av øyet (figur 4D).
    5. Bestem munnen bredde. Måle den horisontale avstanden mellom venstre og høyre punkter hvor de øvre og nedre "lepper" av munnen åpning møtes (figur 4E). Disse kan anses frosken tilsvarer labial commissures.
    6. Bestem munnen rundhet. Beregn munnen rundhet som en invers størrelsesforhold der (fire × [Område]) / (π × [Major akse] 2 >).
      1. Bruk lassoverktøyet i et fotoredigeringsprogram for å spore kantene av munnen åpningen som vist i figur 4F. Velg Analyser på hovedverktøylinjen, og velg Mål. Alternativt kan beregne rundhet fra målingen av området og diameteren av munningsåpningen.
  2. Dataanalyse av ansikts dimensjoner:
    1. Inngangs målingene av ansikts dimensjoner til en dataanalyseprogram for å sammenligne behandlingsgruppen med kontrollen. Bestem middelverdien for hver måling for både eksperimentelle og kontrollgrupper for å lage søylediagrammer. Bestem standardavvik for å skape feilstolper. Utfør Student t-tester for å statistisk sammenligne grupper.
      MERK: Disse dataene kan være ganske variable på grunn av litt forskjellige priser av utviklingen blant embryoer.

5. Kvantitativ analyse av Orofacial Shape og Morphometrics

  1. Plasser landemerker og creaTe fjell koordinat fil (illustrert i figur 5A).
    1. Velg landemerker slik at de fanger form av målbildet, og kan gjentatte ganger plassert i den samme relative plassering i alle prøvene som blir analysert. Hvis en struktur ikke finnes i alle prøvene, ikke plassere et landemerke på denne strukturen.
      1. Her plasserer 24 landemerker å representere midface med karakteristiske særtrekk som øyne, nese, og munn. For konsistens, landemerker sted midt mellom tidligere plassert landemerker (for eksempel munn landemerker, Figur 5Ai).
    2. Capture landemerke koordinater og skape "landemerke koordinere fil". Åpne den første bilde av et ansikt tadpole (for eksempel, det første styre embryo).
      1. Velg fanen Plugins på hovedverktøylinjen, og velg Pointpicker fra rullegardinmenyen. Velg legge peker kategorien og plassere landemerker i ønskede steder som landemerker vises som en flerfarget kors (
      2. Flytt landemerke steder etter plassering ved å velge Flytt kors verktøyet. Når alle landemerker har blitt plassert på bildet, velg Vis resultat Tab på hovedverktøylinjen, og velg Vis (figur 5Aii) for å vise landemerke koordinater og kopiere inn i et regnearkprogram (figur 5Aiii).
      3. Når du limer inn disse koordinatene fra denne første embryoet inn i en regnearkprogram, la en tom rad over dataene. I kolonne B i denne tom rad (rad 1), type "LM =" med antall landemerker i utvalget. Her angir du "LM = 24" siden 24 landemerker ble opprettet (Figur 5Aiii, rød boks).
      4. I raden under datapunktene, type "ID =" med et navn som identifiserer prøven. Her i Figur 5Aiii, skriv "ID = CON1" siden dette er landemerke koordinere data på den første kontroll embryo (figur 5Aiii, rød pil).
      5. NB: Det er viktig at hver embryo er gitt et unikt navn i "ID =" rad. Her for eksempel, er det neste settet med landemerke koordinater gitt ID for «CON2" siden det var den andre embryo i kontrollgruppen.
      6. Kopiere hele andre og tredje kolonne i et tekstdokument og lagre som en .txt-fil.
  2. Sett opp morfometrisk programmet for dataanalyse (se figur 5B).
    1. Her velger du Ny datasett på hovedmenyen i morfometrisk programmet. Gi filen navnet og datasettet i de aktuelle boksene (for eksempel "retinsyre Hemming" og "Facial landemerker", henholdsvis) i pop up-skjermen (Figur 5Bi). Importere filen som en TPS, og select tekstfilen av koordinater for å lage datasettet (figur 5Bi, rød pil).
    2. Justering av data og Procrustes passe:
      1. Utfør en Procrustes passform og justering. Marker datasettet i kategorien Prosjekt treet, velger Forutsetninger på hovedverktøylinjen, og New Procrustes Fit i nedtrekksmenyen.
      2. Velg Align ved Principal Axis og velg Utfør Procrustes Fit på bunnen av boksen (figur 5Bii, rød pil). Gå tilbake til Forutsetninger rullegardinmenyen, velg Generer Kovarians Matrix (figur 5Biii), og velg Kjør.
      3. Se sammenhenger av kovariansmatrisen i kategorien Resultater.
    3. Lag en "klassifikator fil" ved å tildele hver prøve i datasettet til den aktuelle klassifiseringsvariabel å skille om det hører hjemme i eksperimentgruppen eller kontrollgruppen.
      1. Etikett to kolonner i et regneark. Etikett overskriften på den første Column med "ID" og skriv inn samme ID er gitt for hver prøve (for eksempel CON1, RARINHIB1, og så videre; Figur 5Biv). Etikett overskriften på den andre kolonnen med "behandling" og inn i hver celle behandlingsgruppen som tilsvarer prøven oppført i tilstøtende ID cellen.
      2. Her bruker "CONTROL og RAR inhibitor" etiketter som klassifiserere (Figur 5Biv). Kopier inn i en tekstfil og lagre som en .txt-fil. Import Klassifiserings variabler inn i morfometrisk program. Velg Match av Identifier, og åpne tekstfilen (figur 5BV).
  3. Lag en prinsipal komponent analyse (PCA) punktplott ved å velge Variasjon nedtrekksmenyen og velge Principal Component Analysis (Figur 6Ai). Deretter velger du kategorien Grafikk for å se ytterligere tre kategorier: PC form endringer, egenverdier, og PC-score (Figur 6Aii). PC score kategorien viser bivariate prinsipal komponent scatterplot av Procrustes fit landemerke data (figur 6Aii).
    1. Slik endrer du hvilke hovedkomponenter er plottet, få opp hurtigmenyen i plottet plass og velge ønsket akse for å endre (figur 6Aiii, rød pil).
    2. Velg Color datapunkter verktøyet (figur 6Aiii). Velg klassifiserere tidligere importert (avsnitt 5.2.2) i den andre lokalmenyen som vises til å bestemme fargen på hver kategori (figur 6Aiv).
    3. Vis mengden avvik fanges opp av hver hovedkomponent i Resultater-fanen (Figur 6Av). Eksport graf som en .bmp-fil.
  4. Lag en diskriminant funksjonsanalyse (DFA) transformasjon rutenettet i morfometrisk program ved å velge diskriminantfunksjoner Funksjonsanalyse under Sammenligning fanen (Figur 6Bi). I pop-up menyen, sørge for at det aktuelle datasettet er selected og hvilken type data er Procrustes-fit koordinater.
    1. Marker par av gruppene som skal sammenlignes, og kjøre 1000 permutasjoner tester (Figur 6Bii).
    2. Under Graphics, vise vektorkart av koordinatene i Shape Difference fanen (Figur 6Biii). Hvis bildet er invertert, få opp hurtigmenyen i plottet plass til å snu diagrammet i riktig retning (Figur 6Biii).
    3. Retning av vektorer reflekterer formen forskjellen fra den første gruppen i forhold til den andre, noe som vises i diskriminant funksjonsmenyen før du kjører analysen (figur 6Bii). Hvis du vil snu retningen av vektorene, få opp hurtigmenyen i plottet plass og endre fortegnet av skalaen faktoren, slik at den er negativ (figur 6Biii, iv). Verdien av skalaen verdien er satt til en faktor på ti som best representerer de statistiske forskjellene i landemerke posisjon between de to gruppene uten forvrengning, og er vanligvis venstre ved mislighold (figur 6Biv).
    4. Også i lokalmenyen, endre grafen til en transformasjon rutenett for å sammenligne med vektorene inn i et rutenett (figur 6Biii, v).
    5. Angi antallet horisontale og vertikale linjer i rutenettet i hurtigmenyen (figur 6Biii, v).
    6. Eksportere grafen som en .bmp-fil.
    7. Vise Procrustes og Mahalinobis avstander og p-verdier under Resultater fanen (Figur 6Bvi).
  5. Ytterligere morfometriske analyse som er nyttig for evaluering av mer enn én behandlingsgruppe
    1. Lag en prinsipal komponent analyse transformasjon rutenett. PC-Shape Endrer kategorien viser vektorkart av form som utgjør avvik innenfor hvert av utvalgene. Bruk lokalmenyen i plottet området for å orientere bildet riktig og sammenligne med vektorer på en transformasjon rutenett. Sett skalafaktorentil verdien på x-aksen for PC-score graf som svarer til den estimerte sentrum av kontrollgruppen. Eksportere bildet som en .bmp-fil.
    2. Lag en CVA scatterplot. Under fanen Sammenligning på hovedverktøylinjen, velg Canonical Variate Analysis, og markere klassifikator variabelsett som tidligere ble importert (se avsnitt 5.2.3). Velg 1000 iterasjoner for permutasjon tester, og velg Kjør. Velg fanen CV score for å vise bivariate CVA scatterplot. Dette er fargekodet basert på de opplastede klassifiserere. Endre fargevalget ved å bringe opp hurtigmenyen i plottet plass (se avsnitt 5.3.3). Eksport som en .bmp-fil.
    3. Lag en CVA transformasjon rutenett. En transformasjon rutenett av CVA resultatene kan bli generert ved sammenligning av flere enn to grupper. Under kategorien Grafikk velger CV Shape endringer for å visualisere transformasjon rutenett av landemerket koordinater. Få opp hurtigmenyen i plottet plass til å endreretning av vektoren, innkopiering resultater på en transformasjon rutenettet, og angi antall rutenett. Eksportere grafen som en .bmp-fil.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Her ble en kvantitativ analyse av orofacial størrelse og form demonstrert å sammenligne embryoer behandlet med retinsyre-reseptor inhibitor (inhibitor RAR) til ubehandlede kontroller. Embryoene ble behandlet med en 1fiM konsentrasjon av denne kjemiske hemmer fra scenen 24-30 (26-35 HPF), vasket ut, og fikset på scenen 42 (82 HPF). De ble deretter behandlet og analysert som beskrevet i protokollen. Resultatene er originale data, men i samsvar med observasjoner i tidligere publikasjoner 2,3. Kontroll embryoer ble behandlet med den bilen, DMSO, og utviklet seg normalt (Figur 7Ai, ii). Embryoer som ble behandlet med en 1 mikrometer konsentrasjon av RAR inhibitor viste liten innsnevring av ansikt, øye anomalier, og en misformet embryonale munn åpning som var mer trekantet (figur 7Aiii, iv).

Først ble det tradisjonelle orofacial dimensjoner målt og er oppsummert i figur 7B. S tatistical betydning ble bestemt ved å utføre en T-test forutsatt ulik varians mellom hemmer behandlet embryoer og kontroller for hver måling. Vi fant at både snute lengde og ansiktsbredde ble signifikant redusert i RAR hemmer behandlet embryoer sammenlignet med kontroller (p-verdier = 0,0062 og 0,0058, henholdsvis Figur 7BI, ii). Mens ansiktshøyde og munn rundhet var signifikant høyere (p-verdier = 3,7772 x 10 -6, 1,4812 x 10 -7), munn bredde ble signifikant redusert (p-verdi = 2,5175 x 10 -10, figur 7Biii-v) .Den Resultatene viste ingen signifikant forskjell i den totale orofacial området mellom de to gruppene (p-verdi = 0,3754; Figur 7Bvi). Disse dataene viser at tap av retinsyre signale på et bestemt tidspunkt i utviklingsresultater i en kortere snute, liten innsnevring av midface regionen, og misdannelse av embryonale munnåpningen.

nt "> Å gi en sofistikert visning av form endringer av embryonale orofacial regionen som svar til reduserte retinsyre signaler, vi neste utnyttet geometrisk morfometrisk analyser. Etter å identifisere og samkjøre orofacial landemerker ved hjelp morfometrisk analyse programvare, vi deretter undersøkt variansen innenfor hver gruppen via prinsipal komponent analyse (PCA). Når de to første hovedkomponenter ble plottet mot hverandre, RAR inhibitor behandlet embryoer var tydelig atskilt fra kontroller langs PC1 aksen (Figur 7c). viste Denne testen også uteliggere i utvalget innstilling illustrert av to hemmer behandlet embryoer som ikke klynger seg med resten av gruppen (figur 7C, piler).

Deretter ble de statistiske forskjeller i formen av orofacial området mellom RAR-inhibitor behandlede embryoer og kontroller vurderes og visualisert ved å utføre en funksjon diskriminant analyse (DFA). Den Procrustes avstand between de to gruppene var signifikant forskjellige (avstand = 0,2665, p-verdi <0,0001, figur 7D), som indikerer en endring i form når orofacial retinsyre signalering blir forstyrret. Ja, dramatiske endringer i plasseringen av sidelandemerkene i orofacial regionen indikerer en innsnevring av ansiktsform respektive til høyden i hemmer behandlet embryoer (Figur 7D). I tillegg er den svakt utad forskyvning i posisjonen av neselandemerker (figur 7D, piler) avslører abnormitet i neseboret stilling i disse embryoer som er forenlig med redusert utvekst av snuten. De skift i landemerker som definerer kantene av munningsåpningen viser posisjonsendringer som reflekterer dannelse av et trekantet formet munnåpningen som er forenlig med median kløften rapportert i vårt tidligere studier 2,3. I tillegg til vektor skift, det fordreining mønster av transformasjonen gitter illustrerer også formendringer i ellerofacial regionen. Fordreining i midface regionen er konsistent med midface hypoplasia og generell ansikts innsnevring sett i embryoer med redusert retinsyre signaler (Figur 7D).

Resultatene av analysen diskriminant funksjon (DFA) viser formen endringer som var i tråd med vår kvalitativ analyse, samt avsløre noen endringer som ikke ble tilstrekkelig grad fanges opp av tradisjonelle størrelse målinger alene. For eksempel, mens orofacial området var ikke signifikant forskjellig mellom kontroller og hemmer behandlet embryoer (figur 7Bvi), DFA transformasjon grid avdekket dramatiske endringer i denne regionen i samsvar med ansikts innsnevring sett i hemmer behandlet embryoer (figur 7A, D). Videre er fordreining mønster og landemerke skift av munnen åpningen, kombinert med den betydelige endringen vi så i munnen rundhet, illustrerer misdannelse i munnen åpning form i inhibitor behandlet Embryos. I sammendrag, en kombinasjon av tradisjonelle målinger av ansikts dimensjoner og geometriske morfometrisk analyse illustrerer forandringer i form og størrelse av det orofacial region når retinsyre signalene blir forstyrret.

Figur 1
Figur 1. Nødvendige materialer. (A) Verktøy for dataanalyse. (I) 24-brønners plate, (ii) standard engangsoverføring pipette, (iii) Dumont # 5 Inox tang, (iv) leire foret petriskål, (v) rett erte nål, (vi) glasspipette verktøyet, (vii ) sterile engangs skalpell. (B) Fremstilling av leire-lined parabolen. (I) En rett erte nål brukes til å trekke horisontale linjer i leire. (Ii) En glass pipette verktøyet brukes til å lage sirkulære fordypninger langs hver rad. (Iii) Retten er fylt med PBT for bildebehandling.

page = "always"> Figur 2
Figur 2. In vitro fertilisering og kulturen i Xenopus egg. (A) Etter HCG injeksjon, laevis voksen Xenopus kvinner blir overtalt til å legge egg. (B) Egg er samlet i høye salt MBS, gjødslet med testiklene hentet fra en hann, og kultivert ved hjelp av standardmetoder. (C) Embryoet blir overført til en 24-brønn skål inneholdende 0,1X MBS ved hjelp av en standard, engangsoverføring pipette. (D) En kalibrert pipette-mennesket blir brukt til å måle 1 ml inn i en tom brønn, og en markør anvendes for å avgrense dette nivået på utsiden av alle brønner inneholder embryoer (innfelt). 0.1x MBS blir deretter lagt til eller tatt bort, slik at det er på nivå med dette merket.

highres.jpg "width =" 500 "/>
Figur 3. Utarbeidelse av embryo hoder for bildebehandling. (A) Diagram av de to snitt som kreves for å fjerne hodene, solide svarte linjer. Skala bar = 400 um. (B) Den første innsnitt er gjort ved den bakre ende av tarmen for å fjerne halen og frigjøringstrykk fra skalpell. Skala bar = 400 um. (C) Det andre snitt er gjort på den fremre ende av tarmen, i nærheten av hjertet, for fullstendig å kutte hodet. Scale bar = 400 mikrometer. (D) Frontal utsikt over rad med embryo hoder plassert i leire. Scale bar = 650 mikrometer. (E) Lateral utsikt over rad med embryo hoder posisjon i leire. Scale bar = 500 mikrometer cg: sement kjertel.

Figur 4
Figur 4. Tradisjonelle størrelse målinger av orofacial dimensjoner. (A) bredde Face. Piler angir de punkter hvor den ventrale delen av øyet møter omkretsen av ansiktet. Rød linje er ansiktet bredde, målt som avstanden mellom disse punktene. Scale bar = 210 mikrometer. (B) Face Høyde. Hvite linjer er guider trukket før måling på rygg kanten av øynene og rygg kanten av sement kjertel. Rød linje er ansiktet høyde, målt som avstanden mellom disse to guider på midtlinjen av ansiktet. Scale bar = 210 mikrometer. (C) Orofacial området. Hvite linjer er guider trukket før måling. (A) Forklar hvor bunnen henter ventral kanten av det venstre øyet. Rød linje viser tracing rundt venstre øye. (B) punkt der rygg kanten av øyet møter topp guide. Blå linje viser rygg grensen av orofacial området, spores langs toppen guide på rygg kanten av øynene. (C) Point der toppen henter rett ansikts periferien. Grønne linjen viseroppsporings rundt det høyre øyet. (D) Point hvor ventral kanten av høyre øyet møter bunn guide. Gul linje viser ventral grensen av orofacial området, spores langs bunnen guide på rygg kanten av sement kjertel. Scale bar = 210 mikrometer. (D) Snute lengde. Hvit linje er den fremre kanten av øyet, og er tegnet som en guide før måling. Rød linje er snute lengde, målt fra denne linje til et punkt der den dorsale kant av sementkjertel møter den sideveis periferi av ansiktet. Scale bar = 300 mikrometer. Bredde (E) Mouth. Piler er de punktene der dorsal og ventral leppene møtes. Den røde linjen er munnen bredde, målt som avstanden mellom disse to punktene. Scale bar = 200 mikrometer. (F) Mouth rundhet. Omkretsen av munnåpningen er sporet og vist i rødt. cg: sement kjertel. Scale bar = 200 mikrometer.

"Figur Figur 5. Fange landemerker og preliminaries for geometrisk morfometrisk analyse. (A) Ved hjelp av foto-redigering programvare og et regnearkprogram til å plassere landemerker og fangst koordinater. (I) flerfarget kors er landemerkene plasseres på bildet ved hjelp av Add punkter verktøy i ImageJ å representere formen på orofacial regionen. (Ii) Landmark data vises ved hjelp av Vis resultat Tool. (Iii) Landmark data kopieres og limes inn i et regneark. Over den andre kolonnen er en header som identifiserer antall landemerker og merket med "LM = 24" (rød boks). Under den andre kolonnen av data, prøven er gitt et unikt navn og merket med "ID = CON1" (rød pil). Dette gjentas for alle bildene i en prøvesett og dataene blir lagret som en tekstfil. (B) Foreløpige dataanalyse i en geometrisk morfometrisk programvarer programmet. (I) tekstfil opprettet i fra foto-redigering programvare er importert inn i morfometrisk program, MorphoJ, som en TPS-fil. Filen er merket med en rød pil. (Ii) Landmark koordinere data er justert etter Procrustes fit av hovedaksene. Rød pil viser henrettelsen av justering. (Iii) En kovariansmatrise av Procrustes fit landemerker genereres i Forutsetninger menyen. (Iv) En klassifiserings filen er laget i et regneark. Kolonne A og B er gitt overskrifter "ID" og "behandling", henholdsvis. ID er gitt til hver prøve i landemerke datainnsamling er innspill i henhold kolonne A, og behandlingsgruppen som hver prøve tilhører innspill i kolonne B. (v) klassifikator filen er importert til morfometrisk programmet som en klassifikator variabel sett og matchede av Identifier for den valgte datasettet. Klikk her for å se en større versjon avdenne figuren.

Figur 6
Figur 6. Statistisk analyse i morfometrisk programvare. (A) Principal Component Analysis (PCA) (i) PCA er valgt fra kategorien Variasjon. (Ii) De to første hovedkomponenter av landemerker Procrustes vises som en scatterplot i kategorien PC-score. (Iii) En pop-up-meny er brakt opp i plottet plass. Denne menyen brukes til å endre hvilke hovedkomponenter er plottet mot hverandre (rød pil) og å farge datapunktene (uthevet i blått). (Iv) Datapunktene er farget i henhold til klassifikator variabler i hurtigmenyen. (V) Prosent av variansen fanget av hver hovedkomponent er sett i kategorien Resultater. (B) diskriminantfunksjoner Funksjonsanalyse (DFA) (i) DFA er valgt fra kategorien Sammenligning. (ii) data sett Procrustes koordinater er valgt for DFA, og de tidligere opplastede klassifiserere er valgt for gruppering. De ønskede grupper som skal sammenlignes er valgt og permutasjon tester blir drevet. (Iii) DFA resultatene vises som et vektorkart i kategorien Shape Difference. En pop-up-menyen i plottet plassen kan brukes til å orientere bildet riktig. (Iv) Ved å velge fanen Set Scale Factor i pop-up menyen, kan bli endret skiltet av skalaen faktor. (V) vektorkart er endret til en transformasjon rutenett med ønsket antall rutenettet ved å velge Endre Type Graf i pop-up-meny med kartet vektoren. (Vi) Mahalanobis og Procrustes avstander og tilhørende p-verdier blir sett under fanen Resultater. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figur 7. Orofacial analyse av kontroll og RAR hemmet behandlet embryoer. (A) (I, II) Representative bilder av kontrollene. Skala barer = 270 mikrometer. (III, IV) Embryoer ble behandlet med en 1 mM konsentrasjon av det RAR-inhibitor, BMS-453. Skala barer = 260 mikrometer. (I, iii) frontal utsikt. Mouth åpning er skissert i røde prikker. (ii, iv) visninger i Side. cg:. sement kjertelen (B) Tradisjonelle orofacial dimensjoner av kontroll (svart) og hemmer behandlet (blå) embryoer. (I) snute lengde, i mm (ii) flate bredde, i mm (iii) ansiktshøyde i mm (iv) munnbredde, i mm (v) munningen rundhet, en enhet-nummer mindre bestemt i ImageJ ved hjelp av ligningen: (4- × [Område]) / (π × [Store akse] 2). (Vi) Orofacial område, i mm (C) Principal Component Analysis. Kontrollene er i svart og RAR hemmer behandlet embryoer er i blått. Svarte piler indikerer uteliggere. PC1 = 73,63%, PC2 = 9,56%. (D) diskriminant Funksjonsanalyse viser Procrustes avstand og p-verdi, i tillegg til en transformasjon rutenett. Lukket sirkel slutten av vektor er landemerke posisjon i RAR hemmer behandlet embryoer. Den ende av linjen av vektoren er landemerke posisjon i kontrollene. Svarte piler indikerer skifte i neselandemerker. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Xenopus laevis har blitt et nyttig verktøy for å dissekere den utviklingsmessige mekanismer underliggende orofacial utvikling; men det er for øyeblikket ingen protokoller som beskriver størrelse og form endringer i denne regionen i frosker. Metoden som beskrives her vil bidra vesentlig til feltet av orofacial utvikling ved å tillate for strengere kvantifisering av orofacial fenotyper i Xenopus og andre virveldyr.

Den første, mest kritiske aspekt ved riktig utførelse av denne protokoll er evnen til å måle dimensjonene og ansikts bestemme fjell plassering både nøyaktig og reproduserbart. For dette formål er det avgjørende at embryoniske flater bli fotografert ved samme vinkel, retning og forstørrelse. Spesiell forsiktighet må utvises for å oppnå nøyaktige målinger av snuten lengde, da det er vanskelig å manipulere embryoer lateralt og oppnå konsekvent plassering. Å ha en enkelt person utføre alle målinger på de same dag minimaliserer denne type feil, samtidig maksimere reproduserbarheten av resultatene. Det nest mest kritiske aspektet av å sikre gode resultater er reduksjon av variabiliteten unødvendig, slik som utviklingsmessige forskjeller eller genetisk bakgrunn. Dette er spesielt viktig når man vurderer statistisk signifikant sammenheng mellom subtile defekter. Embryoer, derfor trenger å være på samme scene når de ble behandlet og fotografert. Dessuten bør man sørge for å sikre utviklings priser er tilsvarende mellom og mellom behandlingsgruppene. For å redusere slike problemer med variasjon, sørge for at alle fostre er fra samme foreldre og er scenen matchet i begynnelsen av forsøket. Redusere også eksterne kilder til variasjon som for eksempel ulike bufferkilder og volumer, forskjellig antall embryoer, og utdeling i kultur retter (for eksempel hindre oppsamling).

Et viktig steg i vurderingen av form endringer gjennom geometriske morphometrics er alignment av landemerke koordinater via Procrustes passform. Ved anvendelse av denne matematiske algoritmen, er noen informasjon om størrelse eller forskjeller i rotasjon av bildet fjernes. Den senere generert kovariansmatrise bestemmer på ikke-standard korrelasjoner av landemerke koordinerer blant alle embryoene i datasettet, som multivariate statistiske teknikker-som hovedkomponent eller diskriminant funksjon analyses- kan utføres.

Et hovedkomponentanalyse (PCA) reduserer en kompleks prøve til et mindre sett av variabler som kalles hovedkomponenter 26. Den første komponenten står for den mest variansen i prøvesett, med hver påfølgende komponent sto for resten. Ved å plotte de to første komponentene mot hverandre ved hjelp morfometrisk programvare, prøver som er mest lik klynge sammen. På denne måten, diskriminerer PCA-grupper innenfor et prøvesett, samtidig bestemmelse av variasjonen i dem. I Some tilfeller kan gruppene ikke kan skilles klart fra hverandre og overlapper hverandre langs den ene eller begge akser. I dette tilfelle er det fordelaktig å plotte andre komponenter (for eksempel, PC3) for å avdekke subtile trekk ved hvilke grupper blir diskriminert. Dette er spesielt relevant når den totale variansen er jevnere fordelt blant de første flere variabler.

Discriminant funksjonsanalyse (DFA) av Procrustes fit data avgjør om prøver i et datasett er effektivt diskriminert i grupper av kontinuerlige variabler som definerer dem. Prøver er derfor klassifisert i grupper før analyse, og variablene er oversatt til komponenter som kalles diskriminere funksjoner for å avgjøre den statistiske sammenhengen mellom gruppene 27. Før kjøring av denne analyse, er det viktig å indikere antallet permutasjoner tester. Disse permutasjon tester random dataene slik at ingen forutsetninger om sin distribusjon er eliminated. Flere permutasjon test gjentakelser øke nøyaktigheten av p-verdi. Når visualiseres som en transformasjon rutenett, betydelige endringer i fjell stilling mellom gruppene som sammenlignes er vist. Videre, den fordreining av gittermønster avslører der formforandringer oppstår. Ulempen med denne analyse er at den bare kan brukes for sammenligning av to grupper. Hvis det er tre eller flere grupper i et eksempelsett for sammenligning, er det bedre å utføre en kanonisk varians analyse. Dette ligner på en DFA ved at den genererer en statistisk p-verdi; Imidlertid viser det endringer som forekommer i løpet av hele prøven satt i tillegg til de som forekommer mellom de enkelte grupper i settet.

Den viktigste begrensning av denne orofacial kvantifisering protokollen er at den bare kan anvendes til to-dimensjonale data. Våre fremtidige mål inkluderer bruk av CT-skanning eller konfokalmikroskopi å utvikle tilsvarende metoder for analyse av tredimensjonale data. På den annen side,jobber med to-dimensjonale bilder er også en av de store styrkene til denne protokollen. Bare grunnleggende stereoscopes utstyrt med kameraer er nødvendig for å ta bilder av den embryonale ansiktet. Den OpenWare anvendes for denne dataanalyse øker også tilgjengeligheten av denne fremgangsmåte, samtidig redusere kostnadene. Videre er en avansert kunnskap om sophistical bildebehandling, statistiske analyser, eller programmering ikke er nødvendig å trekke meningsfulle og betydningsfulle resultater fra dataene. Faktisk er denne teknikken i dag blir undervist som en del av en lavere laboratoriekurset i VCU avdeling for biologi. Dermed er lett å lære og bruke i en kort periode på orofacial kvantifisering protokoll som presenteres her. Som en video representasjon, er viktige skritt som posisjonerer embryoer og navigere programvaren uthevet å sikre protokollen kan med hell benyttes av selv utrente studenter og forskere. Oppsummert vil denne protokollen gi en verdifull ressursfor forskersamfunnet og som et pedagogisk verktøy.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne har ikke noe å avsløre.

Acknowledgements

Oppstarts penger til A. Dickinson fra VCU støttet dette arbeidet.

Forfatterne ønsker å erkjenne Dan Nacu for sitt kunstneriske talent i å skape skjematisk illustrasjon.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Dissecting microscope Zeiss fitted with AxioCamICC1 camera
Dumont #5 Inox forceps Fine Science Tools 11251-10
Sterile, disposable scalpel Sklar 06-2015
24-well plate Fisher Scientific 087721
Standard Disposable transfer pipettes Fisher Scientific 13-711-7M
150 mm x 15 mm Petri dishes Falcon 351058
Incubators Ectotherm set to 15 °C or 20 °C
Modeling Clay Premo, or other non-toxic modeling clay in black or white
Straight teasing needle Thermo Scientific 19010
Capillary Tubing (for needles) FHC 30-30-1 Borosil 1.0 mm OD x 0.5 mm ID/Fiber, 100 mm each
Needle Puller, Model P-97 Sutter Instrument Co. Needle Puller: P-97 Flaming/ Bown micropipette puller Filament: FB300B For filaments, use Sutter 3.00 mm square box filaments, 3.0 mm wide.
Pipettemen Gilson F144802, F123600, F123602
BMS-453 Tocris 3409
DMSO American Bioanalytical AB00435-01000
Cysteine Sigma-Aldrich 52-90-4
Paraformaldehyde powder Sigma-Aldrich 158127
Petri dishes Falcom 353003, 351058 100 mm diameter and 150 mm in diameter
100% Ethanol VWR 89125-170

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Mossey, P. A., Little, J., Munger, R. G., Dixon, M. J., Shaw, W. C. Cleft lip and palate. Lancet. 374, 1773-1785 (2009).
  2. Kennedy, A. E., Dickinson, A. J. Median facial clefts in Xenopus laevis: roles of retinoic acid signaling and homeobox genes. Dev Biol. 365, 229-240 (2012).
  3. Kennedy, A. E., Dickinson, A. J. Quantitative Analysis of Orofacial Development and Median Clefts in Xenopus Laevis. Anat Rec (Hoboken). (2014).
  4. Dickinson, A., Sive, H. Positioning the extreme anterior in Xenopus: cement gland, primary mouth and anterior pituitary. Semin Cell Dev Biol. 18, 525-533 (2007).
  5. Dickinson, A. J., Sive, H. Development of the primary mouth in Xenopus laevis. Dev Biol. 295, 700-713 (2006).
  6. Dickinson, A. J., Sive, H. L. The Wnt antagonists Frzb-1 and Crescent locally regulate basement membrane dissolution in the developing primary mouth. Development. 136, 1071-1081 (2009).
  7. Barnett, C., et al. Syndrome Transcription Factor is critical for neural crest cell function in Xenopus laevis. Mech Dev. 129, 324-338 (2012).
  8. Gonzales, B., Yang, H., Henning, D., Valdez, B. C. Cloning and functional characterization of the Xenopus orthologue of the Treacher Collins syndrome (TCOF1) gene product. Gene. 359, 73-80 (2005).
  9. Reisoli, E., De Lucchini, S., Nardi, I., Ori, M. Serotonin 2B receptor signaling is required for craniofacial morphogenesis and jaw joint formation in Xenopus. Development. 137, 2927-2937 (2010).
  10. Schuff, M., et al. FoxN3 is required for craniofacial and eye development of Xenopus laevis. Dev Dyn. 236, 226-239 (2007).
  11. Slater, B. J., Liu, K. J., Kwan, M. D., Quarto, N., Longaker, M. T. Cranial osteogenesis and suture morphology in Xenopus laevis: a unique model system for studying craniofacial development. PLoS One. 4, (2009).
  12. Vandenberg, L. N., Adams, D. S., Levin, M. Normalized shape and location of perturbed craniofacial structures in the Xenopus tadpole reveal an innate ability to achieve correct morphology. Dev Dyn. 241, 863-878 (2012).
  13. Bugaighis, I., Mattick, C. R., Tiddeman, B., Hobson, R. 3D Facial Morphometry in Children with Oral Clefts. Cleft Palate Craniofac J. (2013).
  14. Farkas, L. G., Katic, M. J., Forrest, C. R. Surface anatomy of the face in Down's syndrome: anthropometric proportion indices in the craniofacial regions. J Craniofac Surg. 12, 519-524 (2001).
  15. Scheuer, H. A., Holtje, W. J., Hasund, A., Pfeifer, G. Prognosis of facial growth in patients with unilateral complete clefts of the lip, alveolus and palate. J Craniomaxillofac Surg. 29, 198-204 (2001).
  16. Parsons, K. J., Andreeva, V., James Cooper, W., Yelick, P. C., Craig Albertson, R. Morphogenesis of the zebrafish jaw: development beyond the embryo. Methods Cell Biol. 101, 225-248 (2011).
  17. Farkas, L. G., Katic, M. J., Forrest, C. R. Surface anatomy of the face in Down's syndrome: age-related changes of anthropometric proportion indices in the craniofacial regions. J Craniofac Surg. 13, 368-374 (2002).
  18. Cooper, W. J., et al. Bentho-pelagic divergence of cichlid feeding architecture was prodigious and consistent during multiple adaptive radiations within African rift-lakes. PLoS One. 5, (2010).
  19. Klingenberg, C. P., et al. Prenatal alcohol exposure alters the patterns of facial asymmetry. Alcohol. 44, 649-657 (2010).
  20. Zhao, Y., et al. Isolated cleft palate in mice with a targeted mutation of the LIM homeobox gene lhx8. Proc Natl Acad Sci U S A. 96, 15002-15006 (1999).
  21. Allam, K. A., et al. The spectrum of median craniofacial dysplasia. Plast Reconstr Surg. 812-821 (2011).
  22. Sive, H. L., Grainger, R., Harlard, R. Early development of Xenopus laevis: a laboratory manual. Cold Spring Harbor Laboratory Press. (2000).
  23. Cross, M. K., Powers, M. Obtaining eggs from Xenopus laevis females. J Vis Exp. (2008).
  24. Nieuwkoop, P. D., Faber, J. Normal Table of Xenopus Laevis (Daudin). Garland Publishing Inc. (1967).
  25. Nieuwkoop, P. D. aF. J. Normal Table of Xenopus laevis (Daudin): A Systematical and Chronological Survey of the Development from the Fertilized Egg till the End of Metamorphosis. Garland Publishing Inc. (1994).
  26. Abdi, H., Williams, L. J. Principal Component Analysis. WIREs Computational Statistics. 2, (2010).
  27. Hill, T. L. P. STATISTICS: Methods and Applications. StatSoft, Inc. Tulsa, OK. (2013).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics