Orofacial phenotypes की मात्रा में

Biology

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Summary

Xenopus laevis भ्रूण की orofacial आकार और आकृति यों के लिए एक विधि विकसित किया गया है. इस प्रोटोकॉल में, पारंपरिक आकार माप orofacial विकास और दोषों की अधिक परिष्कृत विश्लेषण के लिए अनुमति देने के लिए ज्यामितीय आकृति के साथ संयुक्त कर रहे हैं.

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Kennedy, A. E., Dickinson, A. J. Quantification of Orofacial Phenotypes in Xenopus. J. Vis. Exp. (93), e52062, doi:10.3791/52062 (2014).

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Abstract

Xenopus craniofacial विकास और दोष गवर्निंग तंत्र विदारक के लिए एक महत्वपूर्ण उपकरण बन गया है. Orofacial विकास यों के लिए एक विधि आनुवंशिक रूप से या molecularly जीन अभिव्यक्ति या प्रोटीन समारोह में हेरफेर कर सकते हैं कि पदार्थ के साथ निराकरण पर orofacial phenotypes की अधिक कठोर विश्लेषण के लिए अनुमति देगा. भ्रूण के सिर के दो आयामी चित्र का प्रयोग, पारंपरिक आकार आयाम-ऐसे orofacial चौड़ाई, ऊंचाई के रूप में और area- मापा जाता है. इसके अलावा, भ्रूण मुंह खोलने का एक गोलाई उपाय मुंह के आकार का वर्णन करने के लिए प्रयोग किया जाता है. इन दो आयामी छवियों के ज्यामितीय आकृति भी orofacial क्षेत्र के आकार में परिवर्तन के और अधिक परिष्कृत दृश्य प्रदान करने के लिए किया जाता है. लैंडमार्क्स orofacial क्षेत्र में विशेष अंक के लिए आवंटित कर रहे हैं और निर्देशांक बनाई गई हैं. एक सिद्धांत घटक विश्लेषण तो इलाज भेदभाव उस सिद्धांत घटकों के लिए मील का पत्थर निर्देशांक कम करने के लिए प्रयोग किया जाता हैसमूहों. इन परिणामों के समान orofacial आकार के साथ व्यक्तियों को एक साथ क्लस्टर जिसमें एक तितर बितर साजिश के रूप में प्रदर्शित कर रहे हैं. यह भी सांख्यिकीय दो उपचार समूहों के बीच स्थलों के पदों तुलना जो एक विभेदक समारोह विश्लेषण, प्रदर्शन करने के लिए उपयोगी है. इस विश्लेषण ऐतिहासिक स्थिति में परिवर्तन वैक्टर के रूप में देखा जाता है, जहां एक परिवर्तन ग्रिड पर प्रदर्शित किया जाता है. एक ग्रिड एक warping पैटर्न महत्वपूर्ण मील का पत्थर पदों को बदल दिया है, जहां दिखाने के लिए प्रदर्शित किया जाता है तो इन वैक्टर पर आरोपित है. विभेदक समारोह विश्लेषण में आकार में परिवर्तन एक सांख्यिकीय माप के आधार पर कर रहे हैं, और इसलिए एक पी मूल्य द्वारा मूल्यांकन किया जा सकता है. इस विश्लेषण केवल एक स्टिरियोस्कोप और फ्रीवेयर सॉफ्टवेयर की आवश्यकता होती है, सरल और सुलभ है, और इस तरह एक मूल्यवान अनुसंधान और शिक्षण संसाधन हो जाएगा.

Introduction

मानव जन्म दोष का सबसे प्रचलित और विनाशकारी प्रकार के अलावा इस तरह के orofacial clefts 1 के रूप में मुंह और चेहरे को प्रभावित कर रहे हैं. विकृत orofacial संरचनाओं के साथ बच्चों को उनके जीवन भर कई सर्जरी से गुजरना और चेहरे disfigurements, भाषण, सुनवाई और खाने की समस्याओं के साथ संघर्ष. इसलिए, cranio- और orofacial विकास में नए अनुसंधान की सुविधा मनुष्य में जन्म दोष के इन प्रकार की रोकथाम और उपचार के लिए सर्वोपरि है. Xenopus laevis craniofacial विकास शासी तंत्र विदारक के लिए एक नए उपकरण के रूप में उभरा है (कुछ उदाहरण 2,3,4 शामिल -11). इसलिए, इस प्रजाति के सिर के विकास और चेहरे के दौरान आकार और आकार में परिवर्तन का विश्लेषण करने के लिए एक मात्रात्मक विधि 3 बहुत शक्तिशाली हो सकता है.

यहाँ, हम एक ऐसी विधि प्रस्तुत; एक Xenopus अध्ययन 12 से अनुकूलित ज्यामितीय आकृति के साथ परंपरागत आकार माप के संयोजन 13-15 विश्लेषण अध्ययन का समर्थन> और खजाना. इस प्रोटोकॉल के लक्ष्य के शोधकर्ताओं ने सामान्य और असामान्य विकास के दौरान विभिन्न orofacial phenotypes के बीच भेद करने के लिए चेहरे का आकार और आकृति यों करने की अनुमति है. इस विश्लेषण में इस तरह के जीन और / या पर्यावरणीय कारकों के synergistic प्रभाव से उत्पन्न होने वाले उन जैसे सूक्ष्म craniofacial दोषों के बीच बेहतर भेदभाव के लिए अनुमति देगा. साथ ही, इस मात्रा का ठहराव विधि भी एक orofacial दोष का भी मामूली सुधार या बचाव प्रकट कर सकता है. यह इसलिए यह संभावित चिकित्सा विज्ञान का विश्लेषण करने में एक उपयोगी गाइड बनाता है.

यहाँ प्रस्तुत है कि चेहरे की माप और ज्यामितीय आकृति का संयोजन काफी हद तक केवल एक या अन्य 15-18 का उपयोग, जो आकार और मौजूदा प्रोटोकॉल से orofacial क्षेत्र का आकार दोनों की एक अधिक व्यापक सांख्यिकीय विश्लेषण के लिए अनुमति देता है. इसके अलावा, हम औसत दर्जे का और के पार्श्व विमानों दोनों का आकलन करने के लिए एक सरल तरीका पेशवर्तमान अध्ययन 13,19 में इस्तेमाल किया परिष्कृत तीन आयामी इमेजिंग उपकरणों की आवश्यकता के बिना चेहरा.

हम Xenopus पर इस प्रोटोकॉल असामान्य orofacial विकास और एक मंझला फांक तालु 2,3 लाती है कि एक retinoic एसिड रिसेप्टर अवरोध करनेवाला के साथ इलाज भ्रूण laevis प्रदर्शित करता है. इन भ्रूणों में orofacial क्षेत्र के आयाम और आकार की मात्रा समान तालु clefts और माउस मॉडल 20,21 के साथ मनुष्य के अनुरूप है कि midface में परिवर्तन से पता चला है. हालांकि, इस प्रोटोकॉल जैसे विकास कारक के रूप में प्राकृतिक पदार्थ, herbicides, या प्रोटीन के रूप में orofacial विकास पर अन्य यौगिकों के प्रभाव का आकलन करने के लिए उपयोग किया जा सकता है. इसके अलावा, नुकसान या समारोह प्रयोगों के लाभ के माध्यम से जीन अभिव्यक्ति की गड़बड़ी से उत्पन्न होने वाली orofacial आकार और आकार में परिवर्तन (antisense morpholinos या Crispers का उपयोग / Talens) भी इस प्रोटोकॉल का उपयोग मात्रा निर्धारित किया जा सकता है. अंत में, हम इस विधि specifica विकसितlly Xenopus आकृति विज्ञान का आकलन करने के लिए; हालांकि, यह आसानी से किसी भी कशेरुकी के विश्लेषण के लिए संशोधित किया गया है. अन्य आवेदन भी विकासवादी या पारिस्थितिक अध्ययन के लिए निकट से संबंधित प्रजातियों की तुलना के लिए इस प्रोटोकॉल का उपयोग शामिल हो सकते हैं. हम यहाँ प्रदान उदाहरण orofacial क्षेत्र के विश्लेषण का वर्णन करने के लिए इस प्रोटोकॉल का इस्तेमाल करता है, यह आसानी से अन्य क्षेत्रों, अंगों, या संरचनाओं के विश्लेषण के लिए संशोधित किया जा सकता है.

इस orofacial मात्रा का ठहराव प्रोटोकॉल अनुसंधान समुदाय के लिए एक बहुमूल्य संसाधन है, साथ ही एक वीडियो प्रदर्शन के रूप में स्नातक छात्रों के लिए एक उत्कृष्ट शिक्षण उपकरण बन जाएगा.

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Protocol

Xenopus laevis का उपयोग किया सभी प्रयोगों IACUC (प्रोटोकॉल # AD20261) द्वारा अनुमोदित किया गया है.

1. तैयारी अभिकर्मकों और आवश्यक सामग्री

  1. अभिकर्मकों:
    1. 10x एमबीएस (संशोधित बार्थ खारा) समाधान 22 की 1 एल बनाओ. आसुत जल का 1 एल के लिए सोडियम क्लोराइड (880 मिमी), KCl (10 मिमी), MgSO 4 (10 मिमी), HEPES (50 मिमी, 7.8 पीएच), और 3 NaHCO (25 मिमी) जोड़ें. NaOH के साथ 7.8 पीएच को समायोजित करें.
    2. आसुत पानी की 900 मिलीलीटर में 10x एमबीएस समाधान के 100 मिलीलीटर गिराए द्वारा 1x एमबीएस के 1 एल बनाओ. 1 एम 2 CaCl समाधान के 0.7 मिलीलीटर जोड़ें.
    3. आसुत पानी की 900 मिलीलीटर में 1x एमबीएस समाधान के 100 मिलीलीटर गिराए द्वारा 0.1x एमबीएस के 1 एल बनाओ. 0.1x एमबीएस समाधान के 1 एल, भ्रूण संस्कृति में उपयोग के लिए 10 मिलीग्राम / एमएल जेंटामाइसिन समाधान के 1 मिलीलीटर जोड़ें.
    4. 10x एमबीएस की 100 मिलीलीटर में 5 एम NaCl के 4 मिलीलीटर भंग करके उच्च नमक एमबीएस बनाओ. कुल मात्रा 1 एल है तो जब तक आसुत जल जोड़ें
    5. 100% ई गिराए द्वारा 70% इथेनॉल बनाने70% इथेनॉल के लिए thanol आसुत जल का उपयोग कर.
    6. डाइमिथाइल sulfoxide (DMSO) में एक 10 मिमी शेयर समाधान की तैयारी से बीएमएस-543 बनाओ.
    7. पानी आसुत 50 मिलीलीटर paraformaldehyde के पाउडर की 4 जी जोड़कर 4% paraformaldehyde (पीएफए) बनाते हैं. समाधान को साफ करता है जब तक एक गर्म थाली पर हीट लगभग बिंदु, जिस पर 65 डिग्री सेल्सियस, 5 एम NaOH बूंद-वार जोड़ने के लिए.
      1. समाधान को साफ करता है एक बार, पीबीएस 2x 50 मिलीग्राम और 100 μl बीच 20 गर्मी से निकालें और जोड़ें. बर्फ पर आरटी को शांत करने के लिए अनुमति दें. एचसीएल का उपयोग 7.2 के बीच और 7.5 पीएच को समायोजित करें.
    8. 8 ग्राम सोडियम क्लोराइड, 0.2 ग्राम KCl, ना 2 HPO 4 से 1.44 जी, और पानी आसुत 800 मिलीलीटर में के.एच. 2 पीओ 4 का 0.24 छ भंग करके बीच (पीबीटी) के साथ एक फॉस्फेट बफर खारा समाधान करें. एचसीएल का प्रयोग, 7.4 पीएच को समायोजित. बीच 20 से 2 मिलीलीटर जोड़ें. बराबर 1 एल आसुत जल के साथ अंतिम मात्रा समायोजित करें
    9. 50 मिलीलीटर आसुत जल या 0.1x एमबीएस में सिस्टीन की 1 ग्राम भंग करके एक सिस्टीन समाधान करें. 5 एम NaOH एक के 1.5 मिलीलीटर जोड़ेंएन डी 7.8 पीएच को समायोजित.
    10. 100 मिलीलीटर 100% EtOH के लिए benzocaine पाउडर के 10 ग्राम जोड़कर एक 10% benzocaine शेयर समाधान करें. वयस्क पुरुषों और निर्धारण के लिए तैयार भ्रूण की इच्छामृत्यु के लिए, एक 0.05% समाधान के लिए पतला.
    11. L15 बफर के 9 मिलीलीटर बछड़ा सीरम के 1 मिलीलीटर जोड़कर एक वृषण भंडारण समाधान करें.
  2. आवश्यक उपकरण और उपकरण:
    1. सामग्री और उपकरण की तालिका में सूचीबद्ध उपकरण प्राप्त, चित्र 1 में दिखाया गया.
    2. एक पिपेट उपकरण सुधारे. एक लेम्प बर्नर से एक लौ में एक गिलास पाश्चर पिपेट की नोक रखें. यह पिघला देता है और एक गोल सील अंत रूपों तक पिपेट टिप घुमाएँ.
    3. पूरी थाली को कवर करने के लिए बाहर चौरसाई, एक प्लास्टिक पेट्री डिश के तल में क्ले मॉडलिंग समतल (किसी भी आकार में इस्तेमाल किया जा सकता है) (चित्रा 1Aiv).
      1. हल्के से एक 45 डिग्री के कोण पर मिट्टी से अटे डिश में एक सीधे चिढ़ा सुई दबाएँ. पेट्री लिए कदम धीरे-धीरे वहाँ सुई पकड़ो, औरएक उदास लाइन (चित्रा 1Bi) बनाने के लिए क्षैतिज पकवान. पंक्तियों की वांछित संख्या के लिए दोहराएँ.
      2. Photographing जबकि भ्रूण के आयोजन में भ्रूण सिर (चित्रा 1Bii) और सहायता स्थान के लिए मिट्टी तैयार पकवान की प्रत्येक पंक्ति में उथले, परिपत्र गड्ढों बनाने के लिए एक गिलास पिपेट उपकरण के अंत का उपयोग करें.
      3. फोटोग्राफी के लिए, पीबीटी (चित्रा 1Biii) के साथ पकवान भरें. उपयोगों के बीच, अच्छी तरह से 70% इथेनॉल द्वारा पीछा बाँझ पानी के साथ पकवान और मिट्टी की सतह, धो लो.

2. Xenopus laevis भ्रूण संस्कृति और एफडीए उपचार

  1. Xenopus अंडे की इन विट्रो निषेचन और संस्कृति में:
    1. प्राप्त और संस्कृति Xenopus मानक प्रकाशित तरीकों 22,23 का उपयोग भ्रूण laevis.
    2. संक्षेप में, एक 0.05% benzocaine समाधान में डुबकी द्वारा एक वयस्क पुरुष euthanize. वृषण भंडारण बफर में वृषण और दुकान काटना. इंजेक्षनमानव chorionic gonadotropin (एचसीजी) के साथ वयस्क महिलाओं, उच्च नमक एमबीएस में अंडे एकत्रित करते हैं, और (चित्रा 2A, बी) विच्छेदित वृषण साथ इन विट्रो में खाद डालना.
    3. 15 डिग्री सेल्सियस पर 0.1x एमबीएस में संस्कृति भ्रूण वांछित चरण (Nieuwkoop और फैबर 24,25 से Xenopus laevis के सामान्य तालिका के अनुसार चरण भ्रूण) तक पहुँच जाता है.
      1. इधर, चरण 22 (24 घंटा के बाद निषेचन (HPF)), और तेज संदंश के दो जोड़े का उपयोग कर एक stereomicroscope के तहत पीतक झिल्ली को हटा दें जब तक संस्कृति भ्रूण. 0.1x एमबीएस के 30-40 मिलीलीटर युक्त एक साफ पेट्री डिश (व्यास में 100 मिमी) के लिए एक मानक, डिस्पोजेबल हस्तांतरण विंदुक के साथ स्थानांतरण भ्रूण.
  2. (चित्रा 2 में सचित्र) Xenopus भ्रूण की एफडीए उपचार:
    1. एक calibrated पिपेट-आदमी का उपयोग 0.1x एमबीएस के 1 मिलीलीटर के साथ एक 24 अच्छी तरह से संस्कृति पकवान की आवश्यक कुओं भरें. एक अच्छी बात निशान के साथ अच्छी तरह से बाहर हदबंदीईआर (चित्रा 2 डी, इनसेट). भी सामग्री 24 अच्छी तरह से संस्कृति डिश ढक्कन पर प्रत्येक अच्छी तरह से करने के लिए जोड़ा जा करने के लिए लेबल करने के लिए मार्कर का उपयोग करें. प्रयोगशाला नोटबुक में एक 24 अच्छी तरह से सेट-अप पृष्ठ पर इस जानकारी को कॉपी करें.
    2. अच्छी तरह से एक मानक, डिस्पोजेबल हस्तांतरण विंदुक (चित्रा -2) का उपयोग करते हुए प्रत्येक में 5-10 भ्रूण स्थानांतरण. अच्छी तरह से प्रत्येक में भ्रूण की एक ही नंबर रखें.
    3. ऊपर ऊपर या यह 1 मिलीलीटर चिह्नित लाइन (चित्रा 2 डी) के साथ स्तर इतना है कि 0.1x एमबीएस हटा दें. DMSO के उचित मात्रा में जोड़ें (DMSO के अंतिम मात्रा इतनी है कि 1%) और धीरे ज़ुल्फ़. भ्रूण को भी बंद DMSO जोड़ने के प्रति सावधान रहें, और बफर की सतह से भ्रूण के संपर्क से बचें.
    4. नामित वेल्स को रासायनिक का उचित मात्रा में जोड़ें और धीरे फिर ज़ुल्फ़. इधर, 1 मिलीलीटर 0.1x के एमबीएस के लिए 10 मिमी बीएमएस-453 (एक retinoic एसिड रिसेप्टर प्रतिपक्षी) और DMSO के 9 μl की 1 μl जोड़ें.
    5. रासायनिक संवेदनशील प्रकाश है, तो शिथिल संस्कृति लपेटएल्यूमीनियम पन्नी में संरचना पकवान. वांछित स्तर तक एक 15 डिग्री सेल्सियस इनक्यूबेटर में संस्कृति भ्रूण. इस उदाहरण में, 16-18 घंटे के लिए भ्रूण का इलाज.
  3. उपचार के बाहर भ्रूण धोने और टैडपोल चरणों तक पालन:
    1. एक डिस्पोजेबल हस्तांतरण विंदुक के साथ समाधान की तीन चौथाई के लिए एक से डेढ़ निकालें. भ्रूण को परेशान करने के लिए नहीं सावधान रहना होगा. एक नए हस्तांतरण विंदुक का प्रयोग, 0.1x एमबीएस के साथ अच्छी तरह से फिर से भरना. इस 3-6 बार दोहराएँ.
    2. जेंटामाइसिन साथ 0.1x एमबीएस के 100 मिलीलीटर (1 मिलीग्राम / एल) युक्त एक बड़े पेट्री डिश (व्यास में 150 मिमी) पर स्थानांतरण भ्रूण. वे मंच 42-45 (82-100 HPF) तक पहुँचने तक 15 डिग्री सेल्सियस पर भ्रूण सेते हैं.
    3. दैनिक 0.1x एमबीएस समाधान युक्त जेंटामाइसिन बदलें, और अन्य भ्रूण के प्रदूषण या मौत को रोकने के लिए तुरंत मृत भ्रूण को हटा दें. प्रयोगशाला नोटबुक में मृत भ्रूण की संख्या रिकॉर्ड.
  4. Paraformaldehyde में फिक्सिंग भ्रूण (पीएफए):
    1. चरणों में 42 और 45 (82 और 100 के बीच भ्रूण फिक्स0.1x एमबीएस के 1-2 मिलीलीटर युक्त एक नया 24 अच्छी तरह से संस्कृति डिश में उन्हें स्थानांतरित करने से क्रमशः HPF,). उपचार सेट अप ऊपर वर्णित के रूप में एक ही जानकारी (धारा 2.2.1) के साथ ढक्कन लेबल.
    2. अभी भी कवर भ्रूण जा रही है और चोट को रोकने के लिए कम से कम संपर्क सुनिश्चित करते हुए, प्रत्येक में अच्छी तरह से संभव के रूप में ज्यादा 0.1x एमबीएस निकालें. 0.1x एमबीएस में 0.05% benzocaine समाधान के 1-2 मिलीलीटर जोड़ें और भ्रूण को अब उत्तेजनाओं के लिए उत्तरदायी हैं जब तक सेते हैं.
    3. 4% पीएफए ​​के 1-2 मिलीलीटर जोड़ें. वरीय अगर वैकल्पिक रूप से, निर्धारण के लिए लेबल microcentrifuge ट्यूबों में भ्रूण जगह है.
    4. एक घूर्णन प्रकार के बरतन पर 4 डिग्री सेल्सियस पर 24 घंटे के लिए पीएफए ​​में भ्रूण सेते हैं. एक 3-5 घंटा अवधि में पीबीटी साथ 3-4 washes के प्रदर्शन से पीएफए ​​निकालें.

3. Xenopus टैडपोल की orofacial क्षेत्र तस्वीरें

  1. पूर्व फोटोग्राफी तैयारी (यह आंकड़ा 3 में सचित्र है):
    1. (150 एक बड़े पेट्री डिश में तय भ्रूण रखेंपीबीटी के लगभग 100 मिलीलीटर युक्त व्यास में मिमी).
    2. शरीर (चित्रा 3 ए, ठोस काले लाइनों) से सिर तोड़ दो चीरों बनाओ. सबसे पहले, संदंश की एक जोड़ी के साथ भ्रूण पकड़ और एक बाँझ स्केलपेल (3B चित्रा) के साथ आंत के पीछे ओर एक चीरा बनाने. पूरी तरह से सिर (चित्रा -3 सी) को हटाने के लिए, दिल के पास पेट के पूर्वकाल पक्ष पर एक दूसरे चीरा.
    3. पिपेट एक मानक, डिस्पोजेबल हस्तांतरण पिपेट का उपयोग कर एक मिट्टी से अटे पकवान (भाग 1.2.2) में भ्रूण सिर कटे.
      1. ललाट विचारों के लिए, परिपत्र गड्ढों के अंदर नीचे भ्रूण सिर पीछे की ओर की स्थिति के लिए संदंश के दो जोड़े का उपयोग करें. संदंश का प्रयोग भ्रूण सिर और आसपास मिट्टी, वे कैमरे का सामना कर रहे और पिछड़े या दोनों तरफ (चित्रा 3 डी) के लिए झुका नहीं कर रहे हैं कि इस तरह की स्थिति भ्रूण दोनों हेरफेर करने के लिए. धीरे संदंश और / या कांच का उपयोग कर सिर के चारों ओर आस-पास मिट्टी धक्कापिपेट उपकरण जगह में सिर सुरक्षित करने के लिए.
      2. पार्श्व विचारों के लिए, वे एक ही दिशा सामना करना पड़ रहा है, उनके पक्ष में हैं, और मिट्टी के खिलाफ फ्लैट हैं कि इस तरह के परिपत्र गड्ढों के अंदर भ्रूण के सिर की स्थिति के लिए संदंश का उपयोग करें. भ्रूण सिर और सभी भ्रूण की सीमेंट ग्रंथियों उसी कोण (चित्रा 3E) में नीचे स्थान दिया जाता है, ताकि आसपास के मिट्टी में हेरफेर. पार्श्व माप लेने जब सटीकता सुनिश्चित करने के लिए एक गाइड के रूप में चिढ़ा सुई के साथ तैयार की पंक्तियों का प्रयोग करें.
  2. टैडपोल सिर की छवियों पर कब्जा:
    1. एक संलग्न डिजिटल कैमरा और इसी कैमरा सॉफ्टवेयर के साथ किसी भी विदारक माइक्रोस्कोप का उपयोग टैडपोल का सिर तस्वीर. सभी भ्रूण के लिए स्थिर रखा जा सकता है कि उच्चतम बढ़ाई प्रयोग करें.
    2. भ्रूण केंद्र और एक ही दिशा में उन सब का सामना. Orofacial क्षेत्र की सबसे सटीक छवि के लिए अनुमति देते हैं कि सबसे अच्छा प्रकाश व्यवस्था की स्थिति का उपयोग कर छवियों पर कब्जा. स्थानरोशनी अत्यधिक छाया से बचने के लिए. झगड़ा संभव उच्चतम संकल्प के साथ फाइल के रूप में छवियों को बचाओ.

4. मापने और Xenopus टैडपोल में चेहरे का आकार आयाम का विश्लेषण

  1. (चित्रा 4 में संक्षेप) orofacial आयाम उपाय:
    1. चेहरे की चौड़ाई का निर्धारण करते हैं. प्रत्येक आंख के उदर भाग चेहरा (चित्रा -4 ए, तीर) की परिधि से मिलता है जिस पर अंक पहचानें, और इन बातों (चित्रा -4 ए, लाल रेखा) के बीच की दूरी को मापने.
    2. चेहरा ऊंचाई निर्धारित करते हैं. सबसे पहले, हर आंख के बीच की दूरी को मापने और आधे रास्ते मार्क की गणना के द्वारा midline के निर्धारण करते हैं. अगला, आँखों के पृष्ठीय सबसे किनारों और पृष्ठीय सीमेंट ग्रंथि (चित्रा 4 बी, सफेद लाइनें) के सबसे बिंदु चिह्नित कि क्षैतिज लाइनों आकर्षित. Midline पर, क्षैतिज लाइनों (4B चित्रा, लाल रेखा) के बीच की दूरी को मापने.
    3. टी निर्धारण करेंवह orofacial क्षेत्र. क्षेत्र माप मार्गदर्शन करने के लिए आंखों और सीमेंट ग्रंथि की पृष्ठीय किनारों (चित्रा 4C, सफेद लाइनें) अंकन ही क्षैतिज लाइनों का प्रयोग करें. सीमेंट ग्रंथि के शीर्ष अंकन क्षैतिज रेखा चेहरा (चित्रा 4Ca) के बाईं ओर की परिधि से मिलता है जहां बिंदु पर शुरू.
      1. आंखों के ऊपर अंकन क्षैतिज रेखा चेहरा (चित्रा 4Cb) की परिधि से मिलता है इस मुद्दे पर जहां तक आंख शामिल चेहरे की बढ़त के साथ ट्रेस. यह चेहरा (चित्रा 4Cc) के दाहिनी ओर की परिधि से मिलता है इस मुद्दे पर जहां तक इस पृष्ठीय सबसे क्षैतिज रेखा के साथ पता लगाने के लिए जारी रखें.
      2. सीमेंट ग्रंथि के शीर्ष अंकन उदर सबसे क्षैतिज रेखा चेहरा (चित्रा 4Cd) के दाहिनी ओर की परिधि से मिलता है इस मुद्दे पर जहां तक आंख शामिल चेहरे की बढ़त के साथ नीचे की ओर ट्रेस. इस तल क्षैतिज रेखा UNT साथ पता लगाने के लिए जारी रखेंआईएल यह त्रुटि शुरू हुआ इस मुद्दे पर जहां पूरा करती है. ट्रेसिंग के अंदर क्षेत्र की गणना के लिए तस्वीर संपादन सॉफ्टवेयर का प्रयोग करें.
    4. थूथन लंबाई निर्धारित करते हैं. पार्श्व चित्र पर, आंख की पूर्वकाल के निशान है कि एक खड़ी रेखा बनाने. अगला, चेहरा आंख (चित्रा 4D) के पूर्वकाल अंकन खड़ी रेखा को सीमेंट ग्रंथि की पृष्ठीय किनारे से मिलता है जहां पूर्वकाल सबसे बिंदु से क्षैतिज दूरी को मापने.
    5. मुंह चौड़ाई का निर्धारण करते हैं. बाएँ और दाएँ अंक के बीच क्षैतिज दूरी को मापने जहां मुंह खोलने से मिलो (चित्रा 4E) के ऊपर और नीचे "होंठ". ये ओष्ठ commissures के मेंढक समकक्ष माना जा सकता है.
    6. मुंह गोलाई का निर्धारण करते हैं. (जहां एक उलटा पहलू अनुपात के रूप में 4 मुंह गोलाई की गणना × [क्षेत्र]) / (π × [प्रमुख धुरी] 2 >).
      1. चित्रा 4F में दिखाया गया के रूप में मुंह खोलने के किनारों का पता लगाने के लिए एक तस्वीर संपादक में कमंद उपकरण का उपयोग करें. मुख्य उपकरण पट्टी में विश्लेषण का चयन करें, और उपाय चुनें. वैकल्पिक रूप से, क्षेत्र और मुंह खोलने की व्यास की माप से गोलाई की गणना.
  2. चेहरे का आयाम का डेटा विश्लेषण:
    1. इनपुट एक डेटा विश्लेषण कार्यक्रम में चेहरे आयामों की माप नियंत्रण के साथ इलाज के समूह की तुलना करने के लिए. बार रेखांकन बनाने के लिए प्रयोगात्मक और नियंत्रण समूहों दोनों के लिए प्रत्येक माप का मतलब निर्धारित करते हैं. त्रुटि सलाखों बनाने के क्रम में मानक विचलन का निर्धारण करते हैं. सांख्यिकीय समूहों की तुलना करने के लिए छात्र के टी-परीक्षण करते हैं.
      नोट: इस डेटा की वजह से भ्रूण के बीच विकास का थोड़ा अलग दरों को काफी चर हो सकता है.

Orofacial आकार और आकृति की 5. मात्रात्मक विश्लेषण

  1. प्लेस स्थलों और बनाने की प्रक्रिया(चित्रा 5A में सचित्र) ते ऐतिहासिक समन्वय फ़ाइल.
    1. वे लक्ष्य छवि का आकार पर कब्जा, और विश्लेषण किया जा रहा है बार बार सभी नमूनों में एक ही रिश्तेदार स्थान में रखा जा सकता है कि इस तरह के स्थलों का चयन करें. एक संरचना सभी नमूनों में मौजूद नहीं है, तो इस संरचना पर एक ऐतिहासिक जगह नहीं है.
      1. यहाँ, ऐसी आंखें, नाक, और मुंह के रूप में विशिष्ठ निशान के साथ midface प्रतिनिधित्व करने के लिए 24 स्थलों को जगह है. स्थिरता के लिए, जगह पहले से रखा है (उदाहरण के लिए, मुँह स्थलों, चित्रा 5Ai) स्थलों के बीच आधे रास्ते स्थलों.
    2. मील का पत्थर निर्देशांक कब्जा है और "मील का पत्थर फ़ाइल समन्वय" पैदा करते हैं. एक टैडपोल चेहरा (उदाहरण के लिए, पहले नियंत्रण भ्रूण) की पहली छवि खोलें.
      1. मुख्य उपकरण पट्टी पर प्लगइन्स टैब का चयन करें और लटकती मेनू से Pointpicker चुनें. स्थलों बहुरंगी पार के रूप में दिखाई देगा के रूप में (इच्छित स्थानों में जोड़ने के अंक टैब और जगह स्थलों का चयन करें
      2. हटो पार उपकरण का चयन करके नियुक्ति के बाद ऐतिहासिक स्थानों में ले जाएँ. सभी स्थलों छवि पर रखा गया है, मुख्य उपकरण पट्टी पर प्रदर्शित परिणाम टैब का चयन करें और मील का पत्थर निर्देशांक प्रदर्शन और एक स्प्रेडशीट कार्यक्रम (चित्रा 5Aiii) में कॉपी करने के लिए शो (चित्रा 5Aii) का चयन करें.
      3. एक स्प्रेडशीट कार्यक्रम में यह पहली भ्रूण से इन निर्देशांक चिपकाने जब, डेटा के ऊपर एक खाली पंक्ति छोड़ दें. नमूने में स्थलों की संख्या के साथ इस खाली पंक्ति (पंक्ति 1), प्रकार "एल एम =" का कॉलम बी में. 24 स्थलों (चित्रा 5Aiii, लाल बॉक्स) बनाया गया था के बाद से यहाँ, "एल एम = 24" दर्ज करें.
      4. नमूना पहचान एक नाम के साथ डेटा अंक, प्रकार नीचे पंक्ति "id =" में. इस ऐतिहासिक पहली नियंत्रण भ्रूण (चित्रा 5Aiii, लाल तीर) के डेटा का समन्वय है क्योंकि यहाँ चित्रा 5Aiii में, "id = CON1" दर्ज करें.
      5. नोट: यह प्रत्येक भ्रूण "id =" पंक्ति में एक अद्वितीय नाम दिया जाता है कि महत्वपूर्ण है. यह नियंत्रण समूह में दूसरा भ्रूण था क्योंकि यहाँ उदाहरण के लिए, मील का पत्थर निर्देशांक के अगले सेट "CON2" की आईडी दी गई है.
      6. एक पाठ दस्तावेज़ में पूरे दूसरे और तीसरे कॉलम कॉपी और एक .txt फ़ाइल के रूप में बचाने के लिए.
  2. (चित्रा 5 ब में सचित्र) के आंकड़ों के विश्लेषण के लिए morphometric सॉफ्टवेयर प्रोग्राम की स्थापना की.
    1. इधर, morphometric सॉफ्टवेयर प्रोग्राम में मुख्य मेनू पर नया डेटा सेट बनाने का चयन करें. फ़ाइल और उपयुक्त बॉक्स में सेट डेटा नाम (उदाहरण के लिए, "retinoic एसिड निषेध" और "चेहरे स्थलों", क्रमशः) पॉप अप स्क्रीन में (चित्रा 5Bi). एक टीपीएस, और एसईएल के रूप में फ़ाइल आयात करेंect के डाटासेट (चित्रा 5Bi, लाल तीर) बनाने के लिए निर्देशांक का पाठ फ़ाइल.
    2. डाटा संरेखण और procrustes फिट:
      1. एक procrustes फिट और संरेखण प्रदर्शन. , परियोजना के पेड़ टैब में डेटा सेट हाइलाइट मुख्य उपकरण पट्टी पर प्रारंभिक चयन, और लटकती मेनू में नई Procrustes फ़िट.
      2. मुख्य धुरी से संरेखित चुनें और बॉक्स (चित्रा 5Bii, लाल तीर) के तल पर Procrustes फ़िट प्रदर्शन का चयन करें. , ड्रॉप डाउन मेनू प्रारंभिक पर वापस सहप्रसरण मैट्रिक्स (चित्रा 5Biii) उत्पन्न चयन करें, और निष्पादित चयन करें.
      3. परिणाम टैब में सहप्रसरण मैट्रिक्स के सहसंबंध देखें.
    3. यह प्रायोगिक समूह या नियंत्रण समूह में है कि क्या भेद करने के लिए उपयुक्त वर्गीकारक चर सेट करने के लिए डेटा में प्रत्येक नमूना बताए द्वारा एक "वर्गीकारक फ़ाइल" बनाएँ.
      1. एक स्प्रेडशीट में दो कॉलम लेबल. पहले colum के हैडर लेबलएन "आईडी" और इनपुट के साथ एक ही आईडी के प्रत्येक नमूने के लिए दिए गए हैं (उदाहरण के लिए, CON1, RARINHIB1, और इतने पर, चित्रा 5Biv). प्रत्येक सेल में आसन्न आईडी सेल में सूचीबद्ध नमूना से मेल खाती है कि इलाज के समूह "इलाज" और इनपुट के साथ दूसरे स्तंभ के हैडर लेबल.
      2. इधर, classifiers (चित्रा 5Biv) के रूप में "नियंत्रण और RAR अवरोध" लेबल का उपयोग करें. एक पाठ फ़ाइल में कॉपी और एक .txt फ़ाइल के रूप में बचाने के लिए. Morphometric सॉफ्टवेयर प्रोग्राम में आयात क्लासिफायरफ़ाइल चर. पहचानकर्ता से मिलान चुनें, और पाठ फ़ाइल (चित्रा 5Bv) खुला.
  3. रूपांतर लटकती मेनू का चयन और प्रधानाचार्य घटक विश्लेषण (चित्रा 6Ai) का चयन करके एक प्रमुख घटक विश्लेषण (पीसीए) तितर बितर साजिश बनाएँ. पीसी का आकार बदलता है eigenvalues, और पीसी के स्कोर (चित्रा 6Aii): अगले तीन अतिरिक्त टैब को देखने के लिए ग्राफिक्स टैब का चयन करें. पीसी स्कोर टैब बी प्रदर्शित करता हैProcrustes फिट ऐतिहासिक डेटा (चित्रा 6Aii) के प्रमुख घटक scatterplot ivariate.
    1. प्रमुख घटक प्लॉट किए जाते हैं जो बदलने के लिए, प्लाट अंतरिक्ष में पॉप-अप मेनू लाने और (चित्रा 6Aiii, लाल तीर) बदलने के लिए वांछित अक्ष का चयन करें.
    2. रंग डेटा बिंदुओं उपकरण (चित्रा 6Aiii) का चयन करें. चयन classifiers पहले प्रत्येक श्रेणी (चित्रा 6Aiv) का रंग निर्धारित करने के लिए प्रकट होता है कि दूसरा पॉप-अप मेनू में (धारा 5.2.2) का आयात किया.
    3. परिणाम टैब (चित्रा 6Av) में प्रत्येक प्रमुख घटक ने कब्जा कर लिया विचरण की राशि देखें. एक .bmp फ़ाइल के रूप में निर्यात ग्राफ.
  4. तुलना टैब (चित्रा 6Bi) के तहत विभेदक फंक्शन विश्लेषण चुनकर morphometric सॉफ्टवेयर प्रोग्राम में एक विभेदक समारोह विश्लेषण (DFA) परिवर्तन ग्रिड बनाने. पॉप-अप मेनू में, उपयुक्त डाटासेट एसईएल है कि सुनिश्चितected और डेटा के प्रकार Procrustes फिट निर्देशांक है.
    1. समूहों के जोड़े तुलना करने पर प्रकाश डाला, और 1,000 क्रमचय परीक्षण (चित्रा 6Bii) चलाते हैं.
    2. ग्राफिक्स के तहत, आकार अंतर टैब (चित्रा 6Biii) में निर्देशांक के वेक्टर नक्शे को देखने. छवि उलटा है, तो सही अभिविन्यास (चित्रा 6Biii) में चित्र फ्लिप करने के लिए साजिश अंतरिक्ष में पॉप-अप मेनू ऊपर लाने के लिए.
    3. वैक्टर की दिशा पूर्व विश्लेषण (चित्रा 6Bii) चलाने के लिए विभेदक समारोह मेनू में प्रदर्शित किया जाता है जो दूसरे की तुलना में पहले समूह से आकार अंतर को दर्शाता है. , वैक्टर की दिशा रिवर्स साजिश अंतरिक्ष में पॉप-अप मेनू ऊपर लाने के लिए और यह नकारात्मक है कि इतने बड़े पैमाने कारक के हस्ताक्षर को बदलने के लिए (चित्रा 6Biii, चतुर्थ). पैमाने मूल्य का मूल्य सबसे अच्छा betwee ऐतिहासिक स्थिति में सांख्यिकीय मतभेद का प्रतिनिधित्व करता है कि दस में से एक कारक के लिए सेट हैएन विरूपण के बिना दो समूहों, और आमतौर पर डिफ़ॉल्ट (चित्रा 6Biv) पर छोड़ दिया है.
    4. इसके अलावा पॉप-अप मेनू में, एक ग्रिड पर वैक्टर मिलाना एक परिवर्तन ग्रिड ग्राफ परिवर्तन (चित्रा 6Biii, वि).
    5. पॉप-अप मेनू में ग्रिड की क्षैतिज और ऊर्ध्वाधर लाइनों की संख्या निर्दिष्ट (चित्रा 6Biii, वि).
    6. एक .bmp फ़ाइल के रूप ग्राफ में निर्यात करें.
    7. परिणाम टैब (चित्रा 6Bvi) के तहत Procrustes और Mahalinobis दूरी और पी-मान देखें.
  5. एक से अधिक उपचार समूह के आकलन के लिए उपयोगी होते हैं कि अतिरिक्त morphometric विश्लेषण
    1. एक प्रमुख घटक विश्लेषण परिवर्तन ग्रिड बनाने. पीसी आकार टैब प्रत्येक नमूना समूह में विचरण के लिए लेखांकन आकार में परिवर्तन के वेक्टर नक्शा प्रदर्शित करता बदलता है. एक परिवर्तन ग्रिड पर वैक्टर ठीक से छवि पूरबी और मिलाना प्लाट क्षेत्र में पॉप-अप मेनू का प्रयोग करें. पैमाने कारक सेटनियंत्रण समूह की अनुमानित केंद्र से मेल खाती है कि पीसी स्कोर ग्राफ की एक्स अक्ष पर मूल्य के लिए. एक .bmp फ़ाइल के रूप में छवि निर्यात.
    2. एक CVA scatterplot बनाएँ. मुख्य उपकरण पट्टी पर तुलना टैब के तहत विहित variate विश्लेषण का चयन करें, और पहले से (धारा 5.2.3 देखें) आयात किया गया था कि वर्गीकारक चर सेट पर प्रकाश डाला. क्रमचय परीक्षण के लिए 1,000 पुनरावृत्तियों का चयन करें, और निष्पादित चयन करें. द्विचर CVA scatterplot देखने के लिए सीवी स्कोर टैब का चयन करें. इस अपलोड classifiers के आधार पर रंग कोडित है. भूखंड अंतरिक्ष में पॉप-अप मेनू लाकर रंग योजना बदलने (धारा 5.3.3 देखें). एक .bmp फ़ाइल के रूप में निर्यात.
    3. एक CVA परिवर्तन ग्रिड बनाने. अधिक से अधिक दो समूहों की तुलना करते समय CVA परिणामों के एक परिवर्तन ग्रिड उत्पन्न किया जा सकता. ग्राफिक्स टैब के तहत, मील का पत्थर निर्देशांक के परिवर्तन ग्रिड कल्पना करने के लिए सीवी आकार में परिवर्तन का चयन करें. बदलने के लिए भूखंड अंतरिक्ष में पॉप अप मेनू लानेवेक्टर की दिशा, एक परिवर्तन ग्रिड पर परिणाम मिलाना, और ग्रिडलाइनें की संख्या निर्दिष्ट करें. एक .bmp फ़ाइल के रूप ग्राफ में निर्यात करें.

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Representative Results

इधर, orofacial आकार और आकार की एक मात्रात्मक विश्लेषण अनुपचारित नियंत्रण करने के लिए एक retinoic एसिड रिसेप्टर अवरोध RAR (अवरोध) के साथ इलाज भ्रूण तुलना करने के लिए प्रदर्शन किया गया. भ्रूण, 30 (26-35 HPF) के लिए चरण 24 से इस रासायनिक अवरोध के 1 माइक्रोन एकाग्रता के साथ इलाज को धोया, और चरण 42 (82 HPF) पर तय किया गया. वे तो संसाधित और प्रोटोकॉल में वर्णित के रूप में विश्लेषण किया गया. परिणाम मूल डेटा, लेकिन पिछले प्रकाशनों 2,3 में टिप्पणियों के साथ संगत कर रहे हैं. नियंत्रण भ्रूण वाहन, DMSO के साथ इलाज किया, और (चित्रा 7Ai, द्वितीय) सामान्य रूप से विकसित किए गए. (चित्रा 7Aiii, चतुर्थ) अधिक त्रिकोणीय आकार के RAR अवरोध के 1 माइक्रोन एकाग्रता के साथ इलाज भ्रूण चेहरा, आंख विसंगतियों की मामूली संकुचन दिखाया है, और कि खोलने एक विकृत भ्रूण मुंह था.

सबसे पहले, पारंपरिक orofacial आयाम मापा गया और चित्रा 7B में संक्षेप हैं. एस tatistical महत्व प्रत्येक माप के लिए अवरोध इलाज किया भ्रूण और नियंत्रण के बीच असमान विचरण मानते हुए एक छात्र के टी-परीक्षण प्रदर्शन द्वारा निर्धारित किया गया था. हम थूथन लंबाई और चेहरे चौड़ाई दोनों काफी नियंत्रण की तुलना RAR अवरोध इलाज किया भ्रूण में कमी आई पाया गया कि (क्रमशः पी-मूल्यों = 0.0062 और 0.0058,, चित्रा 7Bi, द्वितीय). चेहरा ऊंचाई और मुंह गोलाई काफी बढ़ गया जबकि (पी-मूल्यों = एक्स 10 -6 3.7772, 1.4812 एक्स 10 -7), मुंह चौड़ाई काफी कम था (पी मूल्य = 2.5175 एक्स 10 -10, चित्रा 7Biii-V) व्याप्ति (; चित्रा 7Bvi पी मूल्य = 0.3754) का परिणाम दो समूहों के बीच समग्र orofacial क्षेत्र में कोई महत्वपूर्ण अंतर दिखाया. इन आंकड़ों भ्रूण मुंह खोलने की है कि एक छोटा थूथन में विकास के परिणाम में एक विशिष्ट समय में retinoic एसिड संकेतन की हानि, midface क्षेत्र की मामूली संकुचन, और कुरूपता दिखा.

NT "> कम retinoic एसिड संकेतों के जवाब में भ्रूण orofacial क्षेत्र के आकार में परिवर्तन का एक परिष्कृत दृष्टिकोण प्रदान करने के लिए, हम अगले ज्यामितीय morphometric. पहचान करने और morphometric विश्लेषण सॉफ्टवेयर का उपयोग कर orofacial स्थलों aligning के बाद, हम तो प्रत्येक के भीतर विचरण जांच विश्लेषण का उपयोग पहले दो प्रमुख घटकों एक दूसरे, RAR अवरोध इलाज किया भ्रूण के खिलाफ साजिश रची गया जब प्रमुख घटक विश्लेषण (पीसीए) के माध्यम से समूह. PC1 अक्ष (चित्रा 7C) के साथ नियंत्रण से स्पष्ट रूप से विख्यात थे. इस परीक्षा में भी नमूना सेट में outliers दिखाया समूह (चित्रा 7C, तीर) के आराम के साथ क्लस्टर नहीं था कि दो अवरोध इलाज किया भ्रूण से यह साफ.

अगला, RAR अवरोध इलाज किया भ्रूण और नियंत्रण के बीच orofacial क्षेत्र के आकार में सांख्यिकीय मतभेद का आकलन किया और एक विभेदक समारोह विश्लेषण (DFA) प्रदर्शन से कल्पना थे. Procrustes दूरी बीetween दो समूहों में काफी अलग था (दूरी = 0.2665, पी मूल्य <0.0001, चित्रा 7 दिन), retinoic एसिड संकेत बाधित है जब orofacial आकार में बदलाव का संकेत है. दरअसल, orofacial क्षेत्र में पार्श्व स्थलों की स्थिति में नाटकीय बदलाव अवरोध इलाज किया भ्रूण (चित्रा 7 दिन) में ऊंचाई के लिए संबंधित चेहरे को आकार के एक संकुचन का संकेत मिलता है. इसके अलावा, नाक स्थलों (चित्रा 7 दिन, तीर) की स्थिति में मामूली जावक पारी थूथन की कमी हुई परिणाम के साथ संगत है कि इन भ्रूणों में नथुने स्थिति में असामान्यता का पता चलता है. कि खोलने एक त्रिकोणीय आकार मुंह के गठन को प्रतिबिंबित कि मुंह खोलने शो स्थिति परिवर्तन के किनारों को निर्धारित करती स्थलों में बदलाव हमारे पिछले अध्ययनों 2,3 में सूचना दी मंझला फांक के अनुरूप है. वेक्टर पारियों के अलावा, परिवर्तन ग्रिड के warping पैटर्न भी आकार में परिवर्तन दिखाता है याofacial क्षेत्र. Midface क्षेत्र में Warping कमी आई retinoic एसिड संकेत (चित्रा 7 दिन) के साथ भ्रूण में देखा midface हाइपोप्लेसिया और समग्र चेहरे का संकुचन के अनुरूप है.

विभेदक समारोह विश्लेषण के परिणामों (DFA) पर्याप्त रूप से अकेले पारंपरिक आकार माप द्वारा कब्जा नहीं कर रहे थे कि कुछ बदलाव खुलासा आकार हमारे गुणात्मक विश्लेषण के साथ संगत कर रहे थे कि परिवर्तन, साथ ही दिखाते हैं. Orofacial क्षेत्र नियंत्रण के बीच काफी अलग नहीं था और भ्रूण (चित्रा 7Bvi) में इलाज अवरोध जबकि उदाहरण के लिए, DFA परिवर्तन ग्रिड अवरोध इलाज किया भ्रूण (चित्रा 7A, डी) में देखा चेहरे का संकुचन के साथ लगातार इस क्षेत्र में नाटकीय परिवर्तन का पता चला. इसके अलावा, हम मुंह गोलाई में देखा महत्वपूर्ण परिवर्तन के साथ मिलकर मुंह खोलने के warping पैटर्न और ऐतिहासिक बदलाव, अवरोध इलाज किया Embry में आकार खोलने मुंह की कुरूपता को वर्णनओएस. Retinoic एसिड संकेतों बाधित कर रहे हैं जब सारांश में, चेहरे का आयाम और ज्यामितीय morphometric विश्लेषण के परंपरागत माप का एक संयोजन आकार और orofacial क्षेत्र के आकार में परिवर्तन दिखाता है.

चित्रा 1
1. आवश्यक सामग्री चित्रा. डेटा विश्लेषण के लिए (ए) उपकरण. (मैं) 24 अच्छी तरह से थाली, (द्वितीय) मानक डिस्पोजेबल हस्तांतरण विंदुक (iii) ड्यूमॉन्ट # 5 आईनॉक्स संदंश, (चतुर्थ) मिट्टी से अटे पेट्री डिश, (वि) सीधे चिढ़ा सुई, (vi) के गिलास पिपेट उपकरण, (सप्तम ) बाँझ, डिस्पोजेबल स्केलपेल. मिट्टी से अटे पकवान (बी) तैयार करना. (मैं) एक सीधे चिढ़ा सुई मिट्टी में क्षैतिज लाइनों आकर्षित करने के लिए प्रयोग किया जाता है. (II) एक गिलास पिपेट उपकरण प्रत्येक पंक्ति के साथ परिपत्र गड्ढों बनाने के लिए प्रयोग किया जाता है. (Iii) के पकवान इमेजिंग के लिए पीबीटी से भर जाता है.

पेज = "हमेशा"> चित्रा 2
Xenopus अंडे की इन विट्रो निषेचन और संस्कृति में चित्रा 2. एचसीजी इंजेक्शन के बाद (ए), वयस्क Xenopus महिलाओं अंडे देना करने के लिए प्रेरित कर रहे हैं laevis. (बी) अंडे मानक तरीकों का उपयोग कर, उच्च नमक एमबीएस में एकत्र एक पुरुष से निकाले वृषण साथ निषेचित, और संवर्धित कर रहे हैं. (सी) भ्रूण एक करने के लिए स्थानांतरित कर रहे हैं एक मानक, डिस्पोजेबल हस्तांतरण पिपेट का उपयोग 0.1x एमबीएस युक्त 24 अच्छी तरह से पकवान. (डी) एक calibrated पिपेट-आदमी एक खाली कुएं में 1 मिलीलीटर मापने के लिए प्रयोग किया जाता है, और एक मार्कर सभी कुओं के बाहर पर इस स्तर हदबंदी के लिए प्रयोग किया जाता है युक्त भ्रूण (इनसेट). 0.1x एमबीएस फिर जोड़ा या यह इस निशान के साथ स्तर है कि इतनी दूर ले जाया जाता है.

highres.jpg "चौड़ाई =" 500 "/>
इमेजिंग के लिए भ्रूण सिर 3. तैयारी चित्रा. सिर, ठोस काले लाइनों को हटाने के लिए आवश्यक दो चीरों की (ए) आरेख. स्केल बार = 400 माइक्रोन. (बी) के पहले चीरा स्केलपेल से पूंछ और रिहाई के दबाव को दूर करने के आंत के पीछे अंत में किया जाता है. स्केल बार = 400 माइक्रोन. (सी) दूसरा चीरा पूरी तरह से सिर तोड़, दिल के पास पेट के पूर्वकाल अंत में किया जाता है. स्केल बार = 400 माइक्रोन. (डी) मिट्टी में तैनात भ्रूण सिर की पंक्ति के ललाट विचार. स्केल बार = 650 माइक्रोन. (ई) मिट्टी में भ्रूण सिर स्थिति की पंक्ति के पार्श्व विचार. स्केल बार = 500 माइक्रोन तटरक्षक: सीमेंट ग्रंथि.

चित्रा 4
Orofacial आयाम 4. पारंपरिक आकार माप चित्रा. (ए) चेहरा चौड़ाई. तीर आंख के उदर भाग चेहरे की परिधि से मिलता है जहां अंक का संकेत मिलता है. रेड लाइन इन बिंदुओं के बीच की दूरी के रूप में मापा चेहरा चौड़ाई, है. स्केल बार = 210 माइक्रोन. (बी) अंकित ऊँचाई. सफेद लाइनें आंखों की पृष्ठीय धार और सीमेंट ग्रंथि की पृष्ठीय किनारे पर माप से पहले तैयार की मार्गदर्शक हैं. लाल रेखा चेहरे के midline पर इन दो गाइडों के बीच की दूरी के रूप में मापा चेहरा ऊंचाई, है. स्केल बार = 210 माइक्रोन. (सी) orofacial क्षेत्र. सफेद लाइनें माप से पहले तैयार की मार्गदर्शक हैं. नीचे गाइड बाईं आंख के उदर बढ़त मिलती (एक) बिंदु. रेड लाइन बाईं आंख के आसपास अनुरेखण पता चलता है. आंख की पृष्ठीय किनारे शीर्ष मार्गदर्शन मिलता है जहां (ख) बिंदु. ब्लू लाइन आँखों के पृष्ठीय किनारे पर शीर्ष गाइड के साथ पता लगाया orofacial क्षेत्र के पृष्ठीय सीमा को दिखाती है. शीर्ष गाइड सही चेहरे की परिधि से मिलता है जहां (ग) प्वाइंट. ग्रीन लाइन से पता चलता हैदाहिनी आंख के आसपास अनुरेखण. दाहिनी आंख के उदर किनारे नीचे मार्गदर्शन मिलता है जहां (डी) प्वाइंट. पीली लाइन सीमेंट ग्रंथि की पृष्ठीय किनारे पर नीचे गाइड के साथ पता लगाया orofacial क्षेत्र के उदर सीमा को दिखाती है. स्केल बार = 210 माइक्रोन. (डी) थूथन लंबाई. व्हाइट लाइन आंख की पूर्वकाल में बढ़त है और माप से पहले एक गाइड के रूप में तैयार की है. रेड लाइन सीमेंट ग्रंथि की पृष्ठीय किनारे चेहरे के पार्श्व परिधि से मिलता है इस मुद्दे पर जहां इस रेखा से मापा थूथन लंबाई, है. स्केल बार = 300 माइक्रोन. (ई) मुँह चौड़ाई. तीर अंक हैं जहां पृष्ठीय और उदर होठों से मिलो. लाल रेखा इन दो बिंदुओं के बीच की दूरी के रूप में मापा मुंह चौड़ाई, है. स्केल बार = 200 माइक्रोन. (एफ) मुँह गोलाई. मुंह खोलने की परिधि का पता लगाया और लाल रंग में दिखाया गया है. तटरक्षक: सीमेंट ग्रंथि. स्केल बार = 200 माइक्रोन.

चित्रा 5. ज्यामितीय morphometric विश्लेषण के लिए स्थलों और प्रारंभिक कैप्चरिंग. (ए) के स्थलों और कब्जा निर्देशांक स्थान के लिए तस्वीर संपादन सॉफ्टवेयर और एक स्प्रेडशीट प्रोग्राम का उपयोग करना. (मैं) बहुरंगी पार orofacial क्षेत्र के आकार का प्रतिनिधित्व करने के ImageJ में जोड़ें अंक उपकरण का उपयोग कर छवि पर रखा निशानियां हैं. (Ii) के ऐतिहासिक डेटा प्रदर्शित परिणाम उपकरण का उपयोग करके प्रदर्शित किया जाता है. (Iii) के ऐतिहासिक डेटा की नकल की और एक स्प्रेडशीट में चिपकाया जाता है. दूसरे स्तंभ के ऊपर स्थलों की संख्या की पहचान करने और "एल एम = 24" (लाल बॉक्स) से चिह्नित एक शीर्षक है. डेटा के दूसरे स्तंभ के नीचे, नमूना एक अद्वितीय नाम दिया जाता है और "id = CON1" (लाल तीर) से चिह्नित. यह एक नमूना सेट में सभी छवियों के लिए दोहराया है और डेटा एक पाठ फ़ाइल के रूप में सहेजा जाता है. एक ज्यामितीय morphometric softw में (बी) के प्रारंभिक डेटा विश्लेषणकार्यक्रम कर रहे हैं. (मैं) तस्वीर संपादन सॉफ्टवेयर से बनाया पाठ फ़ाइल एक टी पी एस फ़ाइल के रूप में, morphometric कार्यक्रम, MorphoJ में आयात किया जाता है. फ़ाइल लाल तीर द्वारा संकेत दिया है. (Ii) के ऐतिहासिक समन्वय डेटा प्रिंसिपल कुल्हाड़ियों से Procrustes फिट से गठबंधन किया है. लाल तीर संरेखण के निष्पादन को इंगित करता है. (Iii) के Procrustes फिट स्थलों में से एक सहप्रसरण मैट्रिक्स प्रारंभिक मेनू में उत्पन्न होता है. (Iv) वर्गीकारक फ़ाइल एक स्प्रेडशीट में बनाया जाता है. स्तंभ A और B क्रमशः हेडर "आईडी" और "इलाज", दिया जाता है. प्रत्येक नमूने अंतर्गत आता है जो आईडी के ऐतिहासिक डेटा संग्रह में प्रत्येक नमूने लिए हैं दिया स्तंभ ए के तहत इनपुट, और उपचार समूह स्तंभ बी (वी) वर्गीकारक फ़ाइल एक वर्गीकारक चर सेट के रूप में morphometric कार्यक्रम में आयात और मिलान किया जाता है में इनपुट है पहचानकर्ता द्वारा चुना डेटा सेट के लिए. का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करेंयह आंकड़ा.

चित्रा 6
Morphometric सॉफ्टवेयर में 6. सांख्यिकीय विश्लेषण चित्रा. (ए) प्रधान घटक विश्लेषण (पीसीए) (i) के पीसीए रूपांतर टैब से चयन किया जाता है. (द्वितीय) Procrustes स्थलों में से पहले दो प्रमुख घटकों पीसी स्कोर टैब में एक scatterplot के रूप में प्रदर्शित कर रहे हैं. (ग) एक पॉप-अप मेनू साजिश अंतरिक्ष में लाया जाता है. यह मेनू एक दूसरे (लाल तीर) के खिलाफ साजिश रची रहे प्रिंसिपल जो घटकों को बदलने के लिए और (नीले रंग में प्रकाश डाला) डेटा बिंदुओं रंग करने के लिए प्रयोग किया जाता है. (चतुर्थ) के आंकड़ों अंक पॉप-अप मेनू में वर्गीकारक चर के अनुसार रंग के होते हैं. प्रत्येक प्रमुख घटक ने कब्जा कर लिया विचरण (v) प्रतिशत परिणाम टैब में देखा जाता है. (बी) विभेदक फंक्शन विश्लेषण (DFA) (मैं) DFA तुलना टैब से चयन किया जाता है. (द्वितीय) Procrustes के डेटा सेट DFA के लिए चुना जाता है निर्देशांक, और पहले अपलोड classifiers समूह के लिए चुना जाता है. तुलना करने के लिए वांछित समूहों चुना जाता है और क्रमचय परीक्षण चलाए जा रहे हैं. (Iii) के DFA परिणाम आकार अंतर टैब में एक वेक्टर नक्शे के रूप में प्रदर्शित कर रहे हैं. भूखंड अंतरिक्ष में एक पॉप-अप मेनू सही ढंग से छवि ग्रहण करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. (चतुर्थ) पॉप-अप मेनू में सेट पैमाने कारक टैब का चयन करके, पैमाने कारक के हस्ताक्षर बदला जा सकता है. (V) के वेक्टर मानचित्र वेक्टर नक्शा पॉप-अप मेनू में ग्राफ का प्रकार बदलने चुनकर ग्रिड लाइनों की वांछित संख्या के साथ एक परिवर्तन ग्रिड में बदल जाता है. (Vi) महालनोबिस और Procrustes दूरी और इसी P-मूल्यों परिणाम टैब के तहत देखा जाता है. यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें.

नियंत्रण और RAR चित्रा 7. orofacial विश्लेषण भ्रूण इलाज किया हिचकते. (क) (i, ii) के नियंत्रण के प्रतिनिधि छवियों. स्केल सलाखों के 270 माइक्रोन =. (तृतीय, चतुर्थ) भ्रूण के RAR अवरोध, बीएमएस-453 के 1 माइक्रोन एकाग्रता के साथ इलाज किया. स्केल सलाखों के 260 माइक्रोन =. (मैं, III) विचारों ललाट. मुंह खोलने लाल डॉट्स में उल्लिखित है. (द्वितीय, चतुर्थ) साइड बार देखा गया. तटरक्षक:. सीमेंट ग्रंथि (बी) के नियंत्रण के पारंपरिक orofacial आयाम (काला) और (नीला) भ्रूण इलाज किया अवरोध करनेवाला. मिमी में मिमी (द्वितीय) चेहरा चौड़ाई में (मैं) थूथन लंबाई, (iii) चेहरा ऊंचाई, मिमी में (चतुर्थ) मुंह चौड़ाई, मिमी (v) मुंह गोलाई, समीकरण का उपयोग ImageJ में निर्धारित एक इकाई से कम संख्या: (4 × [क्षेत्र]) / (π × मिमी में [प्रमुख धुरी] 2). (Vi) orofacial क्षेत्र, (सी) प्रधान घटक विश्लेषण. नियंत्रण काले और RAR अवरोध इलाज किया भ्रूण में हैं नीले रंग में हैं. काला तीर outliers संकेत मिलता है. PC1 = 73.63%, PC2 = 9.56%. (डी) एक परिवर्तन ग्रिड के अलावा Procrustes दूरी और पी-मूल्य, प्रदर्शित विभेदक फंक्शन विश्लेषण. वेक्टर के बंद चक्र के अंत के RAR अवरोध इलाज किया भ्रूण में मील का पत्थर स्थिति है. वेक्टर की रेखा के अंत नियंत्रण में मील का पत्थर स्थिति है. काला तीर नाक स्थलों में बदलाव का संकेत मिलता है. यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें.

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Discussion

Xenopus laevis विकास तंत्र अंतर्निहित orofacial विकास विदारक के लिए एक उपयोगी उपकरण बन गया है; हालांकि, मेंढ़क में इस क्षेत्र का आकार और आकार में परिवर्तन का वर्णन कोई प्रोटोकॉल नहीं है. यहाँ वर्णित विधि Xenopus और अन्य रीढ़ में orofacial phenotypes की अधिक कठोर मात्रा का ठहराव के लिए अनुमति देकर orofacial विकास के क्षेत्र में महत्वपूर्ण योगदान देगा.

ठीक से इस प्रोटोकॉल को क्रियान्वित करने के पहले, सबसे महत्वपूर्ण पहलू दोनों सही और reproducibly मील का पत्थर नियुक्ति चेहरे आयाम को मापने और निर्धारित करने की क्षमता है. यह अंत करने के लिए, यह भ्रूण चेहरे ही कोण, दिशा और बढ़ाई फोटो खिंचवाने कि महत्वपूर्ण है. यह पार्श्व भ्रूण हेरफेर और लगातार नियुक्ति प्राप्त करने के लिए मुश्किल है के रूप में विशेष देखभाल, थूथन लंबाई के सटीक मापन प्राप्त करने के लिए लिया जाना चाहिए. एक ही व्यक्ति पर सभी मापन का प्रदर्शन करने के बादपरिणामों के reproducibility जबकि अधिकतम AME दिन, इस प्रकार की त्रुटि को कम करता है. अच्छे परिणाम सुनिश्चित करने का दूसरा सबसे महत्वपूर्ण पहलू ऐसे विकास मतभेद या आनुवंशिक पृष्ठभूमि के रूप में अनावश्यक परिवर्तनशीलता, की कमी है. सूक्ष्म दोषों के बीच सांख्यिकीय महत्व का आकलन करते समय यह विशेष रूप से महत्वपूर्ण है. भ्रूण, इसलिए, इलाज और फोटो खिंचवाने जब एक ही चरण में होने की जरूरत है. इसके अलावा, केयर विकास दर के बीच और उपचार समूहों के बीच बराबर हैं सुनिश्चित करने के लिए लिया जाना चाहिए. परिवर्तनशीलता के साथ इस तरह की समस्याओं को कम करने के लिए, सभी भ्रूण एक ही माता पिता से कर रहे हैं और प्रयोग की शुरुआत में मिलान चरण हैं कि सुनिश्चित करें. इसके अलावा (भीड़ को रोकने, उदाहरण के लिए) ऐसी संस्कृति बर्तन में अलग बफर स्रोतों और मात्रा, भ्रूण के विभिन्न समूहों, और वितरण के रूप में परिवर्तनशीलता के बाहरी स्रोतों को कम.

ज्यामितीय आकृति के माध्यम से आकार में परिवर्तन के आकलन में एक महत्वपूर्ण कदम alignmen हैमील का पत्थर का टी Procrustes फिट के माध्यम से समन्वय करता है. इस गणितीय एल्गोरिथ्म के आवेदन के द्वारा, आकार या छवि के रोटेशन में मतभेद के बारे में कोई जानकारी निकाल दिया जाता है. ऐतिहासिक प्रदर्शन किया जा सकता है इस तरह के प्रमुख घटक या विभेदक समारोह analyses- रूप सांख्यिकीय तकनीकों बहुभिन्नरूपी जिस पर डेटा सेट में सभी भ्रूण, बीच निर्देशांक के बाद उत्पन्न सहप्रसरण मैट्रिक्स unstandardized सहसंबंध को निर्धारित करता है.

एक प्रमुख घटक विश्लेषण (पीसीए) प्रमुख घटक 26 बुलाया चर के एक छोटे सेट करने के लिए एक जटिल नमूना कम कर देता है. पहला घटक बाकी के लिए लेखांकन प्रत्येक बाद घटक के साथ, नमूना सेट के भीतर सबसे विचरण के लिए खातों. एक दूसरे का उपयोग morphometric सॉफ्टवेयर के खिलाफ पहले दो घटकों, एक साथ क्लस्टर ज्यादा समान हैं कि नमूनों की साजिश रचने के द्वारा. साथ ही साथ उन्हें भीतर भिन्नता का निर्धारण करते हुए इस तरह, पीसीए, एक नमूना सेट के भीतर समूहों भेदभाव. सोम मेंई मामलों, समूहों को एक दूसरे से स्पष्ट रूप से प्रतिष्ठित हो सकता है और या तो या दोनों axes साथ ओवरलैप नहीं हो सकता है. इस मामले में, यह समूह भेदभाव कर रहे हैं जिसके द्वारा सूक्ष्म सुविधाओं प्रकट करने के क्रम में (उदाहरण, PC3 के लिए) अन्य घटकों की साजिश के लिए फायदेमंद है. कुल विचरण अधिक समान रूप से पहले कई चर के बीच वितरित किया जाता है जब यह विशेष रूप से प्रासंगिक है.

Procrustes फिट डेटा की विभेदक समारोह विश्लेषण (DFA) एक डेटा सेट में नमूने उन्हें प्रभावी ढंग से परिभाषित कि निरंतर चर द्वारा समूहों में भेदभाव कर रहे हैं कि निर्धारित करता है. नमूने इसलिए विश्लेषण करने से पहले समूहों में वर्गीकृत किया जाता है, और चर समूह 27 के बीच सांख्यिकीय संबंध निर्धारित करने के लिए भेदभाव कार्यों बुलाया घटकों में अनुवाद कर रहे हैं. इस विश्लेषण रन करने से पहले, यह क्रमचय परीक्षण की संख्या इंगित करने के लिए महत्वपूर्ण है. ये क्रमचय परीक्षण इसके वितरण के बारे में कोई अनुमान elimina हैं कि इस तरह के डेटा randomizeटेड. अधिक क्रमचय परीक्षण पुनरावृत्तियों पी मूल्य की शुद्धता को बढ़ाने के. एक परिवर्तन ग्रिड के रूप में कल्पना करते हैं, समूहों के बीच ऐतिहासिक स्थिति में महत्वपूर्ण परिवर्तन प्रदर्शित कर रहे हैं की तुलना में किया जा रहा है. आकार में परिवर्तन होते हैं, जहां इसके अलावा, ग्रिड के warping पैटर्न का पता चलता है. इस विश्लेषण का दोष यह है कि यह केवल दो समूहों की तुलना के लिए उपयोग किया जा सकता है. तुलना के लिए एक नमूना सेट में तीन या अधिक समूह हैं, तो यह एक विहित variate विश्लेषण करने के लिए बेहतर है. यह यह एक सांख्यिकीय पी मूल्य उत्पन्न करता है कि एक DFA के समान है; हालांकि, यह है कि सेट के भीतर अलग-अलग समूहों के बीच होने वाली उन के अलावा सेट पूरे नमूना भर में होने वाली परिवर्तन को दर्शाता है.

इस orofacial मात्रा का ठहराव प्रोटोकॉल की प्रमुख सीमा है कि यह केवल दो आयामी डेटा के लिए लागू किया जा सकता है. हमारे भविष्य के लक्ष्यों तीन आयामी डेटा के विश्लेषण के लिए इसी तरह के तरीकों को विकसित करने के लिए सीटी स्कैन या confocal माइक्रोस्कोपी का उपयोग शामिल है. दूसरी ओर,दो आयामी छवियों के साथ काम भी इस प्रोटोकॉल की प्रमुख शक्तियों में से एक है. कैमरों के साथ लगे केवल बुनियादी stereoscopes भ्रूण चेहरे की छवियों पर कब्जा करने के लिए आवश्यक हैं. लागत को कम करते हुए इस डेटा के विश्लेषण के लिए उपयोग किया Openware भी, इस विधि की पहुंच बढ़ जाती है. इसके अलावा, sophistical इमेजिंग, सांख्यिकीय विश्लेषण, या कंप्यूटर प्रोग्रामिंग के लिए एक उन्नत ज्ञान डेटा से सार्थक और महत्वपूर्ण परिणाम निकालने के लिए आवश्यक नहीं है. वास्तव में, इस तकनीक वर्तमान में जीव विज्ञान की VCU विभाग में एक स्नातक प्रयोगशाला पाठ्यक्रम के हिस्से के रूप में पढ़ाया जा रहा है. इस प्रकार, यहाँ प्रस्तुत orofacial मात्रा का ठहराव प्रोटोकॉल जानने के लिए और समय की एक छोटी अवधि में लागू करने के लिए आसान है. एक वीडियो प्रतिनिधित्व के रूप में इस तरह के सॉफ्टवेयर भ्रूण स्थिति और नेविगेट के रूप में महत्वपूर्ण कदम सफलतापूर्वक भी अप्रशिक्षित छात्रों और शोधकर्ताओं द्वारा उपयोग किया जा सकता प्रोटोकॉल सुनिश्चित करने के लिए डाला जाता है. संक्षेप में, इस प्रोटोकॉल एक बहुमूल्य संसाधन प्रदान करेगाअनुसंधान समुदाय के लिए और एक शिक्षण उपकरण के रूप में.

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Disclosures

लेखकों का खुलासा करने के लिए कुछ भी नहीं है.

Acknowledgements

VCU से ए डिकिंसन शुरू हुआ पैसा इस काम का समर्थन किया.

लेखकों योजनाबद्ध चित्र बनाने में अपनी कलात्मक प्रतिभा के लिए दान Nacu स्वीकार करना चाहते हैं.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Dissecting microscope Zeiss fitted with AxioCamICC1 camera
Dumont #5 Inox forceps Fine Science Tools 11251-10
Sterile, disposable scalpel Sklar 06-2015
24-well plate Fisher Scientific 087721
Standard Disposable transfer pipettes Fisher Scientific 13-711-7M
150 mm x 15 mm Petri dishes Falcon 351058
Incubators Ectotherm set to 15 °C or 20 °C
Modeling Clay Premo, or other non-toxic modeling clay in black or white
Straight teasing needle Thermo Scientific 19010
Capillary Tubing (for needles) FHC 30-30-1 Borosil 1.0 mm OD x 0.5 mm ID/Fiber, 100 mm each
Needle Puller, Model P-97 Sutter Instrument Co. Needle Puller: P-97 Flaming/ Bown micropipette puller Filament: FB300B For filaments, use Sutter 3.00 mm square box filaments, 3.0 mm wide.
Pipettemen Gilson F144802, F123600, F123602
BMS-453 Tocris 3409
DMSO American Bioanalytical AB00435-01000
Cysteine Sigma-Aldrich 52-90-4
Paraformaldehyde powder Sigma-Aldrich 158127
Petri dishes Falcom 353003, 351058 100 mm diameter and 150 mm in diameter
100% Ethanol VWR 89125-170

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References

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