MALDI-TOF मास स्पेक्ट्रोमेट्री और एक कस्टम डेटाबेस का उपयोग करने के लिए एक अनोखा गुफा पर्यावरण (Kartchner कावेर्न्स, एरिज़ोना, संयुक्त राज्य अमरीका) के लिए स्वदेशी जीवाणु विशेषताएँ

Biology

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Zhang, L., Vranckx, K., Janssens, K., Sandrin, T. R. Use of MALDI-TOF Mass Spectrometry and a Custom Database to Characterize Bacteria Indigenous to a Unique Cave Environment (Kartchner Caverns, AZ, USA). J. Vis. Exp. (95), e52064, doi:10.3791/52064 (2015).

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Abstract

Protocol

चेतावनी: किसी भी वातावरण से अज्ञात बैक्टीरिया रोगजनक हो सकता है और उचित जैव सुरक्षा प्रोटोकॉल का उपयोग सावधानी से नियंत्रित किया जाना चाहिए। लाइव संस्कृतियों के साथ कार्य जैविक सुरक्षा स्तर 2 (बीएसएल -2) प्रक्रियाओं का उपयोग एक द्वितीय श्रेणी जैव सुरक्षा कैबिनेट में प्रदर्शन किया जाना चाहिए। बीएसएल दो प्रक्रियाओं के बारे में अधिक जानकारी के पन्नों 33-38 "सूक्ष्मजीवविज्ञानी और जैव चिकित्सा प्रयोगशालाओं, में जैव सुरक्षा" सीडीसी / एनआईएच शीर्षक पुस्तिका में उपलब्ध है। दस्तावेज़ ऑनलाइन पर उपलब्ध है http://www.cdc.gov/biosafety/publications/bmbl5/BMBL.pdf । प्रयोगशाला कोट / गाउन, सुरक्षा चश्मा, और nitrile या लेटेक्स दस्ताने सहित उपयुक्त व्यक्तिगत सुरक्षा उपकरण (पीपीई), पहना जाना चाहिए। स्टैंडर्ड सूक्ष्मजीवविज्ञानी प्रथाओं और सावधानियों का पालन किया जाना चाहिए, और biohazardous अपशिष्ट उचित खारिज कर दिया जाना चाहिए।

इस प्रदर्शन में इस्तेमाल बैक्टीरिया Kartchner कावेर्न्स से अलग थे,एरिज़ोना, संयुक्त राज्य अमेरिका, सूखी speleothem, प्रवाह पत्थर, नम speleothem और stalactite ड्रिप (तालिका 1) सहित चार वातावरण से। सभी वियोजन -16 rDNA अनुक्रमण द्वारा की पहचान की है और 25% ग्लिसरॉल-आर 2 बी माध्यम में -80 डिग्री सेल्सियस पर रखा गया था। सभी प्रयोगों आरटी पर पूरा किया गया।

नोट: हम डेटाबेस निर्माण और unknowns के जन स्पेक्ट्रा के लिए बड़े पैमाने पर स्पेक्ट्रा प्राप्त करने के लिए एक ही नमूना तैयारी विधि का उपयोग करना चाहिये। नमूना तैयार विधि स्पेक्ट्रम गुणवत्ता और reproducibility 3 को प्रभावित करने के लिए पहले से दिखाया गया है। एक अलग नमूना तैयार पद्धति का उपयोग करके वांछित है (तनाव के स्तर पर जैसे,) unknowns की गलत पहचान, खासकर जब उच्च वर्गीकरण संकल्प का कारण बन सकता है।

MALDI लक्ष्य पर 1. जमाव

सावधानी: कई प्रोटोकॉल प्रोटीन अर्क GUID के अनुसार उपयोग किया जाना चाहिए कि एसिड और कार्बनिक सॉल्वैंट्स के उपयोग की आवश्यकता प्राप्त करने के लिएउनके संबंधित सामग्री सुरक्षा डाटा शीट (एमएसडीएस) में निहित elines और जानकारी। उपयुक्त पीपीई पहना जाना चाहिए और प्रयुक्त रसायनों के प्रकार और मात्रा के आधार पर अलग अलग होंगे (जैसे, ऐसे acetonitrile के रूप में विषाक्त, ज्वलनशील सॉल्वैंट्स के महत्वपूर्ण मात्रा में, जब साथ काम / गाउन, दस्ताने, सुरक्षा चश्मा, और सांस की सुरक्षा के लिए इस्तेमाल किया जाना चाहिए प्रयोगशाला कोट, और इस तरह चींटी और trifluoroacetic एसिड के रूप में संक्षारक एसिड,)।

  1. एक स्टेनलेस स्टील MALDI लक्ष्य थाली पर है और यह शुष्क करने की अनुमति (उपयुक्त, पहले वर्णित प्रोटोकॉल 11-13 का उपयोग कर प्राप्त) कोई व्यवहार्य कोशिकाओं से युक्त प्रोटीन निकालने μl जमा 1। 1 μl मैट्रिक्स समाधान (α-cyano-4-हाइड्रोक्सी-cinnamic एसिड समाधान) के साथ सूखे प्रोटीन निकालने ओवरले, और यह शुष्क करने की अनुमति देते हैं।
  2. प्रत्येक जैविक को दोहराने के लिए, तकनीकी प्रतिकृति (5 से 20 तकनीकी प्रतिकृति) का एक उपयुक्त संख्या हाजिर। यहाँ, प्रत्येक जैविक को दोहराने के लिए 10 तकनीकी प्रतिकृति और 3 जैविक प्रतिकृति डब्ल्यू हाजिरपहले तैयार किया।
    नोट: हम प्रोटीन निष्कर्षण नमूना तैयार विधि का उपयोग करते समय एक पॉलिश MALDI स्टील लक्ष्य प्लेट का उपयोग करना चाहिये। जमीन इस्पात लक्ष्य प्लेट का उपयोग फैल रहा है और अलग-अलग नमूना कुओं के बाहर विभिन्न नमूनों के बिना किसी खास उद्देश्य के मिश्रण के कारण हो सकता है।
  3. जमा एक μl calibrant लक्ष्य थाली पर मानक और यह शुष्क करने की अनुमति देते हैं। 1 μl मैट्रिक्स समाधान के साथ ओवरले और यह शुष्क करने की अनुमति देते हैं।
  4. एक नकारात्मक नियंत्रण के रूप में लक्ष्य थाली पर जमा 2 μl मैट्रिक्स समाधान।

2. जन स्पेक्ट्रा अधिग्रहण

  1. एक नाइट्रोजन लेजर (λ = 337 एनएम) के साथ सुसज्जित एक MALDI-TOF मास स्पेक्ट्रोमीटर का प्रयोग करें और Bruker FlexControl सॉफ्टवेयर का उपयोग कर संचालित है।
  2. 100 शॉट वेतन वृद्धि में 500 लेजर दृश्यों के संचय से सकारात्मक रैखिक मोड में प्रत्येक जन स्पेक्ट्रम लीजिए। 20 केवी आयन स्रोत एक वोल्टेज सेट; आयन स्रोत 2 वोल्टेज 18.15 केवी करने के लिए; और 9.05 केवी लेंस वोल्टेज। इन मापदंडों साधन-तकनीक और नवीनता हैं कि नोटऔर FIC इष्टतम परिणाम प्राप्त करने के लिए अन्य उपकरणों पर समायोजन की आवश्यकता हो सकती है।
  3. आरोप के अनुसार 2 से 20 केडीए से स्वचालित स्पेक्ट्रम मूल्यांकन के लिए बड़े पैमाने पर करने के लिए प्रभारी सीमा निर्धारित करें। केन्द्रक चोटी का पता लगाने एल्गोरिथ्म का उपयोग करें। 100 दा पर न्यूनतम संकल्प दहलीज निर्धारित करें। 100 से कम न्यूनतम तीव्रता सीमा निर्धारित 2. पर सीमा: शोर अनुपात (एन एस) के लिए संकेत सेट करें।

3. डाटाबेस निर्माण

  1. डाटाबेस डिजाइन
    1. "नए डेटाबेस जादूगर" की मदद BioNumerics 7.1 में एक नया डेटाबेस बनाने।
    2. "प्रयोग प्रकार" पैनल में आदेशों का उपयोग एक स्पेक्ट्रम प्रयोग प्रकार, जैसे, MALDI, बनाएँ।
    3. "डेटाबेस डिजाइन पैनल" का उपयोग स्तर बनाएँ। का उपयोग कर नए स्तरों जोड़ें "धन्यवाद" मेनू में कमांड "स्तर> नए स्तर ... जोड़ें"। यहाँ, "प्रजाति" स्तर, "जैविक दोहराने" स्तर "और" तकनीकी दोहराने "स्तर, respectiv बनाइली।
  2. आयात और कच्चे जन स्पेक्ट्रा preprocessing
    1. "फाइल" मेनू में "निर्यात> जन स्पेक्ट्रम" कमांड क्लिक करके FlexAnalysis का उपयोग कर .txt फ़ाइलें के रूप में कच्चे जन स्पेक्ट्रा निर्यात करें।
    2. तकनीकी प्रतिकृति के स्तर में डेटाबेस में कच्चे जन स्पेक्ट्रा (.txt फ़ाइलें) आयात करें।
    3. कच्चे जन स्पेक्ट्रा preprocess।
      1. आयात और प्रतिदर्श चैनल (एक द्विघात फिटिंग कलन विधि का प्रयोग करके)।
      2. (50 अंक की एक आकार के साथ एक रोलिंग डिस्क) के साथ एक आधारभूत घटाव प्रदर्शन करते हैं।
      3. (एक खिड़की 20 अंक के आकार और 10 अंक की बीटा के साथ कैसर विंडो) शोर [सतत तरंगिका परिवर्तन (CWT)], चिकनी कंप्यूट, और एक दूसरे आधारभूत घटाव (200 अंक के आकार के साथ डिस्क रोलिंग) प्रदर्शन करते हैं।
      4. [: 10 का (एन एस) शोर अनुपात करने के लिए एक न्यूनतम संकेत के साथ CWT] चोटियों का पता लगाएँ।
    4. Preprocessing के बाद, जैसे चोटी युक्त शिखर सूचियों के रूप में प्रत्येक जन स्पेक्ट्रम की विशेषता पैटर्न, को बचाने केआकार, शिखर तीव्रता, एस: डेटाबेस में एन, आदि।
  3. समग्र जन स्पेक्ट्रा बनाना
    1. "विश्लेषण" मेनू में "... संक्षेप" आदेश का उपयोग preprocessed स्पेक्ट्रा से समग्र स्पेक्ट्रा बनाएँ। लक्ष्य के स्तर के रूप में "जैविक दोहराने" चुनें।
    2. यहाँ, "जैविक दोहराने" के स्तर पर है कि अलग करने के लिए तीन समग्र जन स्पेक्ट्रा में जिसके परिणामस्वरूप, कि कॉलोनी के लिए एक समग्र जन स्पेक्ट्रम उपज के लिए एक ही कॉलोनी के 10 तकनीकी प्रतिकृति की जन स्पेक्ट्रा गठबंधन।
    3. यहाँ, कि "प्रजाति" के स्तर पर अलग-थलग करने के लिए एक समग्र स्पेक्ट्रम बनाने के लिए तीन समग्र स्पेक्ट्रा संक्षेप।
      नोट: समग्र स्पेक्ट्रम तकनीकी प्रतिकृति के बिंदु-दर-बिंदु औसत है। कम से कम 95% (डिफ़ॉल्ट सेटिंग) की औसत करने के लिए एक समानता (पियर्सन सहसंबंध) के साथ प्रतिकृति समग्र से बाहर रखा गया है। वे (75% में मौजूद हैं अगर समग्र स्पेक्ट्रा चोटियों पर ही कहा जाता हैशामिल प्रतिकृति की डिफ़ॉल्ट सेटिंग)। जैविक प्रतिकृति के लिए, इन सेटिंग्स को क्रमश: 90 और 60% थे।

4. जन स्पेक्ट्रम डेटा विश्लेषण

  1. डेटाबेस में प्रविष्टियों का चयन करें और "तुलना" पैनल में "नए तुलना बनाएँ" आदेश पर क्लिक करके तुलना पैदा करते हैं।
  2. यहाँ, तुलना और विश्लेषण करती है दिखाने के लिए "तकनीकी दोहराने" और / या "जैविक दोहराने" स्तरों पर जन स्पेक्ट्रा का उपयोग करें।
  3. समानता आधारित क्लस्टर विश्लेषण और बहु-आयामी स्केलिंग (एमडीएस)
    1. रंगों के साथ समूह बनाएं। तीन जैविक समग्र जन स्पेक्ट्रा का चयन करें और इसी को अलग करने के लिए एक समूह बनाने के लिए "समूह" मेनू में कमांड "चयन से बनाएँ नए समूह" पर क्लिक करें। स्वचालित रूप से इन तीन जन स्पेक्ट्रा के लिए इस्तेमाल एक रंग निर्दिष्ट।
    2. वैकल्पिक रूप से, में आदेश का उपयोग इसी रंग के साथ क्षेत्र के राज्यों को परिभाषित "इस परिभाषित क्षेत्र के आधार पर किसी भी समूह के इस समूह के लिए परिभाषित एक ही रंग का उपयोग करता है कि इस तरह के डेटाबेस प्रविष्टियों "पैनल।
    3. क्लस्टर विश्लेषण करते हैं। "क्लस्टरिंग" मेनू में "क्लस्टर विश्लेषण की गणना" कमांड क्लिक करें। तुलना सेटिंग 1 पृष्ठ पर "पियर्सन सहसंबंध" का चयन करें और डिफ़ॉल्ट रूप में अन्य मानकों को छोड़ दें। पृष्ठ 2 पर, "UPGMA" का चयन करें। तो फिर "समाप्त" पर क्लिक करें।
    4. "सांख्यिकी" मेनू में एक एमडीएस का उपयोग कर साजिश "बहु-आयामी स्केलिंग ..." आदेश प्राप्त करते हैं।
  4. पीक मिलान
    1. "प्रयोगों" पैनल में स्पेक्ट्रम प्रकार "MALDI" पर क्लिक करें। फिर "लेआउट> दिखाएँ छवि" का चयन करें। स्पेक्ट्रा जेल बैंड के रूप में दिखाया जाता है।
    2. "स्पेक्ट्रा" मेनू में "पीक मिलान" आदेश का उपयोग शिखर मिलान प्रदर्शन करते हैं।
  5. शिखर वर्गों की पहचान
    1. प्रमुख घटक विश्लेषण (पीसीए) प्रदर्शन करते हैं। हाइलाइट "MALDI प्रायोगिक "प्रयोग में प्रकार" "पैनल और उपयोग" पीसीए प्रदर्शन करने के लिए सांख्यिकीय "" मेनू में कमांड "प्रमुख घटक विश्लेषण ...।
    2. दो-तरफा क्लस्टरिंग प्रदर्शन करते हैं। "तुलना" विंडो में "सांख्यिकी> मैट्रिक्स खनन ..." पर क्लिक करें। शिखर कक्षाओं के लिए मिलान चोटियों की तीव्रता अलग अलग रंग (गर्मी नक्शा) का उपयोग प्रतिनिधित्व किया है।

एक कस्टम डेटाबेस के साथ 5. जीवाणु पहचान

  1. समानता गुणांक के आधार पर विधि
    1. एक तुलना बनाएँ और कदम 4.3.3 में वर्णित के रूप में "तकनीकी दोहराने" स्तर पर जन स्पेक्ट्रा के आधार पर एक dendrogram उत्पन्न करते हैं। समानता की तुलना के लिए dendrogram बचाओ।
    2. "चयनित प्रविष्टियों को पहचानें> विश्लेषण" एक अज्ञात जन स्पेक्ट्रम का चयन करें, और क्लिक करें। पहचान संवाद बॉक्स प्रकट होता है।
    3. "तुलना आधारित" वर्गीकारक प्रकार (या एक संग्रहीत classif का चयन करेंier) और "अगले" पर क्लिक करें। अगले पृष्ठ पर, एक संदर्भ तुलना के रूप में सहेजा dendrogram चुनते हैं और फिर "अगला" क्लिक करें।
    4. एक पहचान पद्धति के रूप में "बुनियादी समानता" चुनें और फिर "अगला" क्लिक करें।
    5. स्कोरिंग पद्धति के रूप में "अधिकतम समानता" चुनें। प्रत्येक पैरामीटर के लिए उपयुक्त दहलीज मूल्यों और न्यूनतम फर्क मूल्यों में टाइप करें और फिर "अगला" क्लिक करें।
    6. गणना के पूरा हो जाने के बाद, पहचान विंडो प्रकट होता है। "परिणाम" पैनल में, सबसे अच्छा अज्ञात है कि मैच के डेटाबेस के सदस्यों सूचीबद्ध हैं।
    7. पहचान परियोजना को बचाने और "पहचान परियोजना" पैनल में "पार सत्यापन विश्लेषण" आदेश का उपयोग पहचान मान्य।
  2. संभावित बायोमार्कर आधारित पद्धति
    1. शिखर वर्गों को परिभाषित करें। 'मैट्रिक्स खनन "विंडो में, सामान्य विशेषताओं को बांटने चोटियों के सेट का चयन करें और तकनीक और नवीनता के रूप में इन चोटियों को परिभाषितFIC शिखर वर्गों (संभावित बायोमार्कर) का उपयोग "स्पेक्ट्रा> शिखर वर्ग प्रकार ... प्रबंधित करें" "तुलना खिड़की" में।
    2. यहाँ, सभी 15 वियोजन के लिए अलग-थलग प्रत्येक के लिए विशिष्ट शिखर वर्गों को परिभाषित।
    3. Unknowns के जन स्पेक्ट्रा का चयन करें और पहले से वर्णित के रूप में परिभाषित शिखर वर्गों के लिए इन स्पेक्ट्रा की चोटियों से मेल खाते हैं।

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Representative Results

इस प्रदर्शन में निर्माण डेटाबेस "प्रजाति", "जैविक दोहराने" और "तकनीकी दोहराने", क्रमशः (चित्रा 1 ए), सहित "सभी स्तरों" उच्चतम से निम्नतम स्तर पर चार स्तर, था। "तकनीकी दोहराने" स्तर के तकनीकी प्रतिकृति के सभी preprocessed स्पेक्ट्रा निहित। "जैविक दोहराने" और "प्रजाति" का स्तर समग्र (सारांश) स्पेक्ट्रा निहित। "सभी स्तरों" सभी तकनीकी को दोहराने के स्पेक्ट्रा के साथ-साथ सभी समग्र स्पेक्ट्रा निहित।

स्पेक्ट्रम संक्षिप्तीकरण प्रक्रियाओं प्रतिनिधि चोटियों का उपयोग कर चित्र 1 में दिखाया जाता है। प्रत्येक सदस्य जन स्पेक्ट्रम एक पतली ग्रे लाइन के रूप में प्रकट होता है। समग्र स्पेक्ट्रम लाल रंग में रंग एक पंक्ति के रूप में प्रतिनिधित्व किया है। निकटस्थ चोटियों आसान दृश्य निरीक्षण (चित्रा 1 बी) की अनुमति के लिए एक अलग रंग के साथ चिह्नित कर रहे हैं।

तालिका 1 में दिखाया जाता है। उच्चतम reproducibility के बेसिलस प्रजातियों बी के लिए 98.0 ± 1.4 था, और सबसे कम reproducibility के Curvibacter प्रजातियों (तालिका 1) के लिए 89.4 ± 7.8 था।

जटिल जन स्पेक्ट्रा डेटा में सौपानिक संरचना के जैविक को दोहराने के स्तर में मदद की दृश्य में गुच्छ विश्लेषण। चित्रा 2 में दिखाया गया है, जैविक प्रतिकृति का एक समूह है, और बैक्टीरिया की 15 प्रजातियों में 15 समूहों का गठन किया। निकट से संबंधित प्रजातियों, उदाहरण के लिए, बी सपा। ए, बी, डी, और ई, एक साथ क्लस्टर के लिए जाती थी। हालांकि, outliers, उदाहरण के लिए, बी सपा। सी और एफ, भी मनाया गया। "तकनीकी और जैविक" स्तरों पर जन स्पेक्ट्रा के आधार पर एमडीएस भूखंडों चित्रा 3। एमडीएस पी में दिखाए जाते हैंबहुत सारे इन जीवाणुओं की स्पेक्ट्रा के बीच समानता का एक स्पष्ट, 3 डी दृश्य सामने आए। दोनों तकनीकी प्रतिकृति और जैविक प्रतिकृति एक समान समूहीकरण (चित्रा 3 ए और बी) दिखाया।

पीक मिलान जन स्पेक्ट्रा में चोटियों के सेट भेद करने के लिए इस्तेमाल किया गया था। लगातार सहिष्णुता (एक्स-अक्ष पर अंक), रैखिक सहिष्णुता (पीपीएम) और शिखर पता लगाने की दर सहित पीक मिलान पैरामीटर, उपयोगकर्ता द्वारा निर्दिष्ट किए जाने की जरूरत है। मी / z × स्थिति सहिष्णुता = निरंतर सहिष्णुता + रैखिक सहिष्णुता: लगातार सहिष्णुता और रैखिक सहिष्णुता समीकरण का उपयोग चोटियों की स्थिति सहिष्णुता की गणना करने के लिए प्रयोग किया जाता कारक हैं। बढ़ रही एम / जेड के साथ, निरंतर सहिष्णुता का महत्व कम हो। चोटी का पता लगाने दर एक चोटी स्पेक्ट्रा परिभाषित दर से अधिक के लिए उस स्थिति में पाया जाता है, तभी एक चोटी वर्ग बना है कि इसका मतलब है। एक या एक से अधिक पैटर्न पर एक चोटी एक चोटी वर्ग का प्रतिनिधित्व करता है। उदाहरण के लिए, यदि चोटी का पता लगाने दर equaस्पेक्ट्रा के 10% से अधिक की स्थिति में चोटियों है तो 10% रास, एक चोटी वर्ग ही बनाया जा सकता है। इस तकनीकी प्रतिकृति के साथ एक सेट में कम प्रसार चोटियों (आमतौर पर शोर चोटियों) शामिल नहीं है। सेट जैविक प्रतिकृति के समग्र स्पेक्ट्रा के आधार पर किया जाता है तो कम प्रसार चोटियों पहले से ही समग्र स्पेक्ट्रा के निर्माण के दौरान बाहर फ़िल्टर्ड किया गया है, के रूप में इस संख्या कम होने की आवश्यकता हो सकती है। इस प्रदर्शन में, शिखर मिलान "तकनीकी दोहराने" स्तर पर जन स्पेक्ट्रा का उपयोग किया गया था और इन मानकों के मूल्यों में क्रमश: 1.9, 550 और 10% थे। चयनित मापदंडों के आधार पर, चोटियों अलग शिखर समूहों में जिसके परिणामस्वरूप, मिलान या मिलान के रूप में नहीं माना जाता था। शिखर मिलान परिणामों का एक उदाहरण एक भी अलग से 30 प्रतिकृति (बेसिलस प्रजातियों ए) का उपयोग करते हुए 4 चित्र में दिखाया गया है। मिलान परिणाम कच्चे तीव्रता रंग के रूप में मौजूद हैं, जिसमें एक तालिका के रूप में कल्पना थे। ब्लू कम तीव्रता का संकेत है और लाल उच्च मैं इंगित करता हैntensity। शिखर मिलान परिणामों के आधार पर, उपयोगकर्ताओं अनुवर्ती का विश्लेषण करती है की सुविधा के जो शिखर वर्गों को परिभाषित कर सकते हैं।

दोनों प्रमुख घटक विश्लेषण (पीसीए) (अनुपूरक चित्रा 1) और दो ​​तरह क्लस्टरिंग जटिल शिखर वर्गों का विश्लेषण करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है। "तकनीकी दोहराने" स्तर पर जन स्पेक्ट्रा का उपयोग कर एक प्रतिनिधि दो तरह क्लस्टरिंग परिणाम चित्रा 5 में दिखाया गया है। दो dendrograms दिखाए जाते हैं। एक मी / z मूल्यों के बगल में है और अन्य जीवाणुओं प्रविष्टियों से ऊपर (चित्रा 5) है। शिखर तीव्रता हरी कम तीव्रता का संकेत है और लाल उच्च तीव्रता इंगित करता है जिसमें रंगों द्वारा प्रतिनिधित्व किया था। उदाहरण के लिए, बी सपा। एक और एफ बी सपा के साथ बहुत कुछ चोटी कक्षाएं साझा करें। बी और डी (चित्रा 5)। परीक्षा पास बी सपा दिखाया। बी और डी भी प्रजाति विशेष के शिखर वर्गों (चित्रा 5) का सेट है। इन परिणामों के विशिष्ट शिखर सेट प्रमाणपत्र बांटने के संकेत मिलता है कि ऐन विशेषताओं प्रजातियों स्तर के संभावित बायोमार्कर के रूप में परिभाषित किया जा सकता है। उदाहरण के लिए, तेरह शिखर सेट बी सपा से संबंधित। डी चयनित और बी सपा के शिखर वर्गों (संभावित बायोमार्कर) के रूप में परिभाषित किया गया। (तालिका 2), 3420.8, 2894.9, 2152.5 4302.0, 4339.9, 4629.2, 5189.4, 5448.4, 5878.7, 6388.8, 6838.8, 6931.1, और 7849.1 सहित विकास,। विभिन्न आइसोलेट्स की पीक कक्षाएं अलग अलग रंग (अनुपूरक चित्रा 2) में दिखाया जा सकता है। प्रत्येक के लिए विशिष्ट पीक कक्षाओं तालिका 2 में सारणीबद्ध थे पृथक। परिभाषित शिखर कक्षाओं आगे मैन्युअल रूप से वे इसके अलावा 100 ए.यू. की न्यूनतम तीव्रता के साथ सभी तकनीकी प्रतिकृति में दिखाई दिया है कि यह सुनिश्चित करने के लिए जाँच की थी, शिखर कक्षाओं के सबसेट भी बैक्टीरिया के लक्षण वर्णन की सुविधा के लिए भंडारित किया जा सकता है उप प्रजातियों और / या तनाव के स्तर पर, उदाहरण के लिए, गैर रोगजनक तनाव से रोगजनक उपभेदों भेद करने के लिए और / या एंटीबायोटिक प्रतिरोध / संवेदनशीलता की जांच करने के लिए।

पहचान के संबंध में ईएनटी ">, अंधा कोडित वियोजन की जन स्पेक्ट्रा एकत्र की है और डेटाबेस में संदर्भ जन स्पेक्ट्रा के रूप में एक ही रास्ते में preprocessed गया। समानता गुणांक की तुलना के आधार पर पहचान के लिए, पैरामीटर मान अधिकतम समानता सहित निर्दिष्ट किया गया न्यूनतम समानता निर्दिष्ट नहीं किया गया था 95.0% और 87% से कम औसत समानता पर। (यानी, अनियंत्रित छोड़ दिया)। न्यूनतम फर्क मूल्यों अधिकतम समानता और औसत समानता है कि दोनों के लिए 5 के रूप में स्थापित किया गया था। इन मूल्यों को आगे बढ़ाने के लिए अनुकूलित करने की आवश्यकता हो सकती है सही पहचान की दर। आंकड़ा 6 समानता गुणांक (चित्रा 6) की तुलना के आधार पर पहचान परिणामों से पता चलता है। मिलान परिणाम इस अंधे कोडित जीवाणु सबसे अधिक संभावना बी सपा था कि सुझाव दिया। ए यह पहचान परियोजना की तुलना के आधार पर समानता गुणांक आगे पार सत्यापन (अनुपूरक चित्रा 3 द्वारा मान्य किया गया था (अनुपूरक चित्रा 3) है। दिलचस्प है, शिखर वर्गों की तुलना के आधार पर पहचान की परियोजनाओं के लिए पार सत्यापन समानता गुणांक की तुलना के आधार पर उन लोगों की तुलना में ज्यादा तेजी से होता है।

पहचान भी शिखर वर्ग मिलान (अनुपूरक चित्रा 4) के आधार पर पूरा किया जा सकता है। चोटियों के बेमेल (अनुपूरक चित्रा 4) मनाया गया हालांकि। बेमेल संबंधित प्रोटीन में अमीनो एसिड एक्सचेंजों से उत्पन्न एक जन पारी की वजह से हो सकता है। नहीं मिलान किया जा रहा चोटियों भी प्रजाति के स्तर पर विवेकशील नहीं कर रहे हैं, लेकिन इस तनाव के लिए विशिष्ट हैं या अलग-थलग कि चोटियों हो सकता है। हे, साथ में ले लीसमानता गुणांक और बायोमार्कर आधारित - - आसानी से karstic नमूना तैयार करने का उपयोग कर वातावरण, स्पेक्ट्रम अधिग्रहण से प्रजातियों के स्तर पर बैक्टीरिया की पहचान कर सकते हैं, और डेटा विश्लेषण कार्यप्रवाह यहाँ वर्णित उर परिणाम दोनों की पहचान के तरीकों का सुझाव देते हैं।

चित्रा 1
चित्रा 1. डाटाबेस निर्माण और जन स्पेक्ट्रा संक्षिप्तीकरण इस प्रदर्शन (ए) में निर्माण डेटाबेस की संरचना। Aminobacter प्रजातियों ए (बी) के 10 तकनीकी प्रतिकृति से चोटियों का उपयोग करते हुए शिखर संक्षिप्तीकरण का चित्रण।

चित्रा 2
समग्र चित्रा 2. Dendrogramजैविक को दोहराने के स्तर पर जन स्पेक्ट्रा। डेटा सेट प्रत्येक प्रजाति के लिए तीन समग्र स्पेक्ट्रा के साथ 15 विभिन्न प्रजातियों के स्पेक्ट्रा शामिल हैं। प्रत्येक प्रजातियों एक रंग के साथ कोडित किया गया था।

चित्रा 3
बहु-आयामी स्केलिंग (एमडीएस) 30 प्रत्येक प्रजाति के लिए स्पेक्ट्रा (ए) और प्रत्येक प्रजाति के लिए तीन समग्र स्पेक्ट्रा (बी) के साथ जैविक को दोहराने के स्तर के साथ तकनीकी दोहराने के स्तर पर जन स्पेक्ट्रा के निरूपण। रंग ही रंग के रूप में कोडित रहे थे 3. चित्रा चित्रा 2 में प्रयोग किया जाता है।

चित्रा 4
चित्रा 4. शिखर मिलान तालिका का एक उदाहरण। टेबल तकनीकी दोहराने छुट्टी पर बेसिलस प्रजातियों में एक की जन स्पेक्ट्रा के आधार पर तैयार की गई थीएल। शिखर मिलान मापदंडों के मूल्यों को क्रमशः रैखिक सहिष्णुता के लिए निरंतर सहिष्णुता के लिए 1.9, 550 और चोटी का पता लगाने की दर के लिए 10%, थे। ब्लू कम शिखर तीव्रता का संकेत है और लाल ऊंची चोटी तीव्रता इंगित करता है। आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्रा 5
चित्रा 5. दो तरह क्लस्टरिंग का एक उदाहरण। चित्रा तकनीकी दोहराने के स्तर पर जन स्पेक्ट्रा का उपयोग कर उत्पन्न किया गया था। चित्रा 2 में उपयोग के रूप वियोजन का रंग एक ही रंग के रूप में कोडित रहे थे। पीक तीव्रता रंग, हरी अर्थ कम तीव्रता और लाल अर्थ उच्च तीव्रता का प्रतिनिधित्व करती है। आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।


कस्टम डेटाबेस का उपयोग कर समानता गुणांक की तुलना के आधार पर 6 चित्रा जीवाणु पहचान।

आईडी एक स्रोत निकटतम रिश्तेदार बी / जाति / क्लास परिग्रहण # (निकटतम रिश्तेदार ख) % मेल BioNumerics कुंजी Reproducibility (%)
डी 2 सूखी speleothem बेसिलस सपा। ई-257 / Firmicutes FJ764776.1 98.8 बेसिलस प्रजाति एक 94.9 ± 4.0
D7 सूखी speleotझालर बेसिलस सपा। GGC-पी 3 / Firmicutes FJ348039.1 99.0 बेसिलस प्रजातियों बी 98.0 ± 1.4
एफ 1 फ्लो पत्थर बेसिलस नियासिन M27 / Firmicutes तनाव KC315764.1 99.2 बेसिलस प्रजातियों सी 96.5 ± 2.4
F4 फ्लो पत्थर बेसिलस सपा। GGC-P5A1 / Firmicutes FJ348046.1 99.1 बेसिलस प्रजातियों डी 89.8 ± 8.8
F9 फ्लो पत्थर बेसिलस सपा। ओएसएस 19 / Firmicutes EU124558.1 99.4 बेसिलस प्रजातियों ई 96.5 ± 1.9
R10 Stalactite ड्रिप बेसिलस सपा। K1 / Firmicutes GU968734.1 99.8 बेसिलस प्रजातियों एफ 95.4 ± 3.9
D11 सूखी speleothem Brevibacillus ब्रेविस तनाव IMAU80218 / Firmicutes GU125635.1 99.5 Brevibacillus प्रजातियों 94.3 ± 5.8
F14 फ्लो पत्थर Exiguobacterium सपा। ZWU0009 / Firmicutes JX292087.1 99.3 Exiguobacterium प्रजातियों 96.5 ± 2.5
M7 नम speleothem Brevibacterium सपा। N78 के / Actinobacteria HQ188605 97.6 Brevibacterium प्रजाति एक 97.5 ± 2.0
M14 नम speleothem Kocuria rhizophila तनाव Ag09 / Actinobacteria EU554435.1 100 Kocuria प्रजातियों 95.2 ± 4.1
M15 नम speleothem Brevibacterium सपा। MN3-3 / Actinobacteria JQ396535.1 99.5 Brevibacterium प्रजातियों बी 92.1 ± 4.9
R4 है Stalactite ड्रिप Aminobacter सपा। के.सी. ईपी-एस 4 / α-Proteobacteria FJ711220.1 99.9 प्रजाति के एक Aminobacter 95.4 ± 2.7
F5 फ्लो पत्थर Comamonas testosteroni तनाव NBRC 12,047 / β-Proteobacteria AB680219 100 Comamonas प्रजातियों 96.4 ± 2.6
R8 Stalactite ड्रिप Curvibacter नाज़ुक कपड़े / β-Proteobacteria AB680705 97.0 Curvibacter </ उन्हें> प्रजातियों 89.4 ± 7.8
F8 फ्लो पत्थर Moraxella सपा। 19.2 KSS / γ-Proteobacteria HE575924.1 99.9 Moraxella प्रजातियों 92.6 ± 4.9

एक जीवाणु Kartchner कावेर्न्स, एरिज़ोना, संयुक्त राज्य अमेरिका से अलग और 16S rDNA अनुक्रमण का उपयोग कर पहचान की गई। दो प्राइमरों, 27F (5 'आगा GTT टीजीए टीसीसी TGG सीटीसी एजी 3') और 1492r (5 'टीएसी GGT टीएसी सीटीटी GTT ACG अधिनियम टी 3'), लगभग 1,400 बीपी लंबाई -16 rRNA जीन दृश्यों प्राप्त करने के लिए इस्तेमाल किया गया।
बी एन सी बी आई डेटाबेस के एक विस्फोट खोज के आधार पर।
सी सूचना दी मान एक मानक विचलन ± 30 प्रतिकृति (तीन जैविक प्रतिकृति 10 तकनीकी प्रतिकृति के साथ प्रत्येक) की औसत सहसंबंध गुणांक हैं।

तालिका 1 बैक्टीरिया प्रदर्शन में इस्तेमाल आइसोलेट्स।

BioNumerics कुंजी पीक कक्षाओं / संभावित बायोमार्कर (डीए)
बेसिलस प्रजाति एक 2152.5, 2224.9, 2595.8, 2894.9, 2921.3, 3380.5, 3496.3, 3515.0, 3733.5, 4302.0, 4340.0, 4385.8,4763.9, 4910.6, 5189.4, 5227.0, 5634.6, 5769.6, 5892.8, 6301.4, 6756.2, 6789.4, 6990.3, 7029.5, 7466.3
बेसिलस प्रजातियों बी 2152.5, 2941.2, 3196.9, 3262.7, 3352.9, 3420.8, 3733.5, 3925.2, 4302.0,4339.9, 4629.2, 4713.4, 4859.3, 4900.6, 5189.4, 5227.0, 5541.8, 5878.7, 6388.8, 6524.0, 6704.5, 6838.8, 7142.7, 7317.5, 7466.3, 7849.1, 9263.9, 9721.2
बेसिलस प्रजातियों सी 2588.0, 3361.8, 4330.4, 5173.0, 5847.6, 6332.0, 6524.0, 6720.3
बेसिलस प्रजातियों डी 2152.5, 2894.9, 3420.8, 4302.0, 4339।9, 4629.2, 5189.4, 5448.4, 5878.7, 6388.8, 6838.8, 6931.1, 7849.1
बेसिलस प्रजातियों ई 2152.5, 2224.9, 2941.2, 3180.1, 3380.5, 4302.0, 4339.9, 4705.3, 5878.7, 6356.6, 6735.1, 6756.2
बेसिलस प्रजातियों एफ 3308.6, 3367.8, 3567.5, 4279.7, 4489.2, 4629.2, 4727.9, 4751.7, 5067.7, 6614.7, 6919.7, 7130.9
Brevibacillus प्रजातियों 2133.3, 2611.0, 4263.3, 4302.0, 4859.3, 4900.6, 5080.2, 5219.0, 5847.6, 6775.7, 7529.4, 9721.2
Exiguobacterium प्रजातियों 2588.0, 3053.3, 3420.8, 3695.5, 4263.3, 5133.1, 5173.0, 5248.8, 6104.8, 6605.3, 6804.4, 6838.8, 7390.2
Brevibacterium प्रजाति एक 3053.3, 6104.8, 6146.5
Kocuria प्रजातियों 3080.0, 4366.6, 5080.2, 5163.8, 5207.1, 5892.8, 6160.0, 6197.5, 6445.0, 7433.7
Brevibacterium प्रजातियों बी 3222.8, 3330.4, 3367.8, 4330.4, 4350.4, 4795.3, 4995.7, 5731.6, 6445.0, 6735.1,7487.3
प्रजाति के एक Aminobacter 2133.3, 2562.4, 3361.8, 3410.4, 4289.2, 4629.2, 4662.0, 4869.8, 6064.1, 6221.0, 6720.3, 6789.4,6818.8, 7216.1, 7447.4
Comamonas प्रजातियों 2806.0, 2921.4, 3246.5, 4350.4, 4727.9, 5607.5, 5666.3, 6221.0, 6488.3, ​​7317.5, 9362.6
Curvibacter प्रजातियों 2868.6, 3453.2, 4319.8, 5133.1, 6292.4, 6903.4, 7433.7
Moraxella प्रजातियों 3011.2, 5698.0, 6720.3, 7064.8, 7366.6

प्रत्येक प्रजाति के लिए निर्धारित तालिका 2. पीक वर्गों (संभावित बायोमार्कर) (डीए)।

पूरक चित्रा 1. वें पर जन स्पेक्ट्रा के सिद्धांत घटक विश्लेषण (पीसीए)चित्रा 2 में इस्तेमाल के रूप में ई तकनीकी दोहराने के स्तर (ए) और शिखर वर्गों (बी)। रंग ही रंग के रूप में कोडित रहे थे।

पूरक चित्रा 2. दो तरह क्लस्टरिंग के आधार पर चयनित शिखर कक्षाओं का एक उदाहरण। एक ही लेबल होने पीक कक्षाएं एक ही रंग के साथ रंग के होते हैं।

पूरक चित्रा BioNumerics में कस्टम डेटाबेस के आधार पर पहचान परियोजना 3. क्रॉस सत्यापन का परिणाम है।

कस्टम डेटाबेस का उपयोग करते हुए शिखर मिलान के आधार पर पूरक चित्रा 4. जीवाणु पहचान।

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Discussion

इस प्रदर्शन लक्षण वर्णन और MALDI-TOF एमएस और एक कस्टम डेटाबेस का उपयोग बैक्टीरिया की पहचान की विस्तृत प्रक्रियाओं दिखाया। उदाहरण के लिए पारंपरिक आणविक विधियों, की तुलना में, 16S rDNA अनुक्रमण, MALDI-TOF एमएस आधारित फिंगरप्रिंट विधियों विविध जीवाणुओं की अधिक तेजी से पहचान की सुविधा। क्योंकि इसकी मजबूती की वजह से, इस तकनीक का व्यापक रूप से पर्यावरण से और नैदानिक ​​सेटिंग 1,14-16 में बैक्टीरिया, वायरस, कवक और खमीर चिह्नित करने के लिए प्रयोग किया जाता है। इसके अलावा, MALDI-TOF एमएस, कुछ मामलों में, उच्च वर्गीकरण संकल्प एक वहन करने के लिए सूचित किया गया है। उदाहरण के लिए, बी सपा। ए, बी, डी, और ई, एक साथ क्लस्टर के लिए (चित्रा 2) प्रवृत्त है, हालांकि स्पष्ट रूप से अलग हो गए थे और विभिन्न बी सपा के स्पेक्ट्रा के बीच समानता। (चित्रा 2) कम से कम 80% थी। इसके विपरीत, इन आइसोलेट्स की 16S rDNA दृश्यों इन वियोजन अंतर करने के लिए इस्तेमाल नहीं किया जा सकता है, जो उच्च समानता थी,प्रजातियों के स्तर पर। बी सपा के 16S rDNA दृश्यों। बी और डी, कई संरेखण विश्लेषण के आधार पर 99% समानता है बी सपा के दृश्यों है। ए और ई बी सपा के दृश्यों के लिए क्रमश: 95% और 96% समानता दिखा। बी और डी Outliers भी मनाया गया। उदाहरण के लिए, बी सपा। सी और एफ दूर अन्य बी सपा से वर्गीकृत किया है। (चित्रा 2)। ग़ैर वियोजन की उपस्थिति जन स्पेक्ट्रा के क्लस्टरिंग विश्लेषण जरूरी वंशावली संबंध स्थापित नहीं कर रहा है कि इंगित करता है। आइसोलेट्स से जो वातावरण भी जन स्पेक्ट्रा क्लस्टरिंग को प्रभावित कर सकता प्राप्त किया गया। उदाहरण के लिए, Brevibacterium प्रजातियों बी और नम speleothem और बी सपा से अलग थे जो Kocuria प्रजातियों। Stalactite ड्रिप से पृथक किया गया है, जो एफ एक साथ (1 टेबल, चित्रा 2) क्लस्टर हो जाती थी, लेकिन आगे अनुसंधान के इस ISOL का एक बड़ा संग्रह में मनाया जाता है कि क्या जांच करने की जरूरत हैates।

इस पुस्तकालय आधारित तकनीक को भी कुछ सीमाएं हैं। लक्षण वर्णन आमतौर पर डेटाबेस पर आधारित है। वर्तमान वाणिज्यिक डेटाबेस मुख्य रूप से जीवाणु उपभेदों, विशेष रूप से रोगजनक वालों में से बना रहे हैं। ये वाणिज्यिक डेटाबेस नैदानिक ​​सूक्ष्म जीव विज्ञान प्रयोगशाला सेटिंग्स में सबसे उपयोगी होते हैं। पर्यावरण आइसोलेट्स के साथ ही वायरस, कवक और खमीर चिह्नित करने के लिए, कस्टम डेटाबेस बड़े तनाव संग्रह प्रयोग का निर्माण करने की आवश्यकता है। अनुवर्ती विश्लेषण में इस्तेमाल मानकों को भी विशेष रूप से उप-प्रजाति और तनाव के स्तर पर, वर्गीकरण संकल्प को बढ़ाने के लिए अनुकूलित किया जाना पड़ सकता है। उदाहरण के लिए, एस: इस प्रदर्शन में चोटी का पता लगाने के लिए इस्तेमाल एन यह मान प्रजातियों स्तर की पहचान के लिए उपयुक्त है, लेकिन तनाव के स्तर की पहचान के लिए, यह मान उतारा जा करना पड़ सकता है 10 था। इन प्रसंस्करण मानकों के साथ ही वर्कफ़्लोज़ डाटा प्रोसेसिंग के बाद से कभी कभी उदाहरण, ClinProTools और Bionume के लिए, कई सॉफ्टवेयर पैकेज में उपयोगकर्ता के परिभाषित कर रहे हैंRICS, पैरामीटर मूल्यों और उपयुक्त वर्कफ़्लोज़ के चयन की एक अनुकूलन की संभावना डेटा विश्लेषण का अनुकूलन करने की आवश्यकता होगी। इस प्रदर्शन में, शिखर मिलान पैरामीटर, दहलीज मूल्यों पहचान परियोजना में इस्तेमाल किया, और पार सत्यापन सब सही पहचान दरों में सुधार करने के लिए अनुकूलन की आवश्यकता है। इन मानकों के अनुकूलन करने के लिए एक तरीका है और / या प्रक्रिया को खोजने के लिए हमारी प्रयोगशाला में बहुत रुचि है। उदाहरण के लिए, एक दृष्टिकोण हम MALDI-TOF डाटा अधिग्रहण 17 स्वचालित अनुकूलन करने के लिए हाल ही में इस्तेमाल किया जो सांख्यिकीय भाज्य डिजाइन, शामिल हो सकता है। अपर भविष्य अनुप्रयोगों और MALDI-TOF एमएस आधारित माइक्रोबियल फिंगरप्रिंटिंग की वृद्धि के व्यापक रूप से उपलब्ध का निर्माण, पर्यावरण बैक्टीरिया और / या गैर बैक्टीरियल सूक्ष्मजीवों के रूप में अच्छी तरह से मिश्रित संस्कृतियों 18 और सूक्ष्म समुदायों के लक्षण वर्णन का बड़ा डेटाबेस शामिल हैं।

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Materials

Name Company Catalog Number Comments
α-cyano-4-hydroxy-cinnamic acid ACROS Organics 163440050 ≥ 97%, CAS 28168-41-8
Bruker FlexControl software Bruker Daltonics version 3.0
Bruker FlexAnalysis software Bruker Daltonics version 3.0
Bionumerics software Applied Maths version 7.1

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References

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