Viral Determinazione Concentrazione Attraverso placca saggi: Sistemi overlay per mezzo di tradizionali e nuovi

Immunology and Infection
 

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Baer, A., Kehn-Hall, K. Viral Concentration Determination Through Plaque Assays: Using Traditional and Novel Overlay Systems. J. Vis. Exp. (93), e52065, doi:10.3791/52065 (2014).

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Abstract

Saggi placca rimangono uno dei metodi più accurati per la quantificazione diretta di virons infettivi e sostanze antivirali attraverso il conteggio delle placche discreti (unità infettive e le zone morte cellulare) in coltura cellulare. Qui mostriamo come eseguire un saggio di placca di base, e come sovrapposizioni e tecniche differenti in grado di influenzare la formazione di placca e la produzione. Tipicamente substrati sovrapposizione solidi o semisolidi, come agarosio o carbossimetilcellulosa, sono stati utilizzati per limitare la diffusione virale, impedendo l'infezione indiscriminata attraverso il terreno di coltura liquido. Sovrapposizioni immobilizzati limitano infezione cellulare per il monostrato immediatamente circostante, consentendo la formazione di foci discreta numerabile e la successiva formazione della placca. Per superare le difficoltà insite nell'uso sovrapposizioni tradizionali, una sovrapposizione di liquido romanzo utilizzando cellulosa microcristallina e carbossimetilcellulosa di sodio è stato sempre più utilizzato come sostituto nella normasaggio di placca. Overlay test placca liquidi possono essere facilmente eseguite in entrambi i formati lastra e standard di 6 o 12 secondo le tecniche tradizionali e non richiedono attrezzature speciali. Grazie al suo stato liquido e successiva facilità di applicazione e rimozione, formati lastra microcultura possono inoltre essere utilizzati come un rapido, preciso e throughput elevato alternativa titolazioni virali scala più grande. L'uso di un polimero liquido viscoso riscaldato non offre la possibilità di snellire il lavoro, conserva i reagenti, spazio incubatore, e aumenta la sicurezza operativa quando viene utilizzato nei laboratori tradizionali o alti di contenimento, come il riscaldamento del reagente o vetreria sono obbligatori. Sovrapposizioni liquidi possono anche rivelarsi più sensibili di overlay tradizionali per alcuni di calore virus labili.

Introduction

L'isolamento e la quantificazione accurata di campioni virali vitali è stata sempre un obiettivo di ricerca in corso in virologia. Non è stato fino all'avvento del saggio di placca nel 1952 che un mezzo per calcolare quantitativamente e qualitativamente titoli virali di origine animale per la prima volta messo a punto 1,2. Questa tecnica è stato adattato e modificato da saggi fagi, che era stato precedentemente utilizzato per calcolare titoli azionari di batteriofagi in biologia vegetale 1,2. Mentre mezzi alternativi per la quantificazione virale da allora sono stati sviluppati e adattati, come ad esempio immunologiche, fluorescenza e microscopia elettronica a trasmissione, il rilevamento degli impulsi resistivo regolabile (TRPS), citometria a flusso, sistemi di giornalista ricombinanti, e inverso quantitativa reazione a catena della polimerasi della trascrizione (qRT-PCR) , questi metodi non riescono a identificare e quantificare replica virons competenti 1,3. Mentre i progressi delle tecnologie e delle tecniche continuano a perfezionare e modificare il paesaggio; plaque saggi continuano a rappresentare il gold standard per determinare le concentrazioni virali infettive per virons litiche 1,4.

Nel corso di un saggio di placca, un monostrato confluente di cellule ospiti è stato infettato da un virus litico di una concentrazione sconosciuta che è stata diluita in serie ad una serie numerabile, in genere tra 5-100 virioni. Monostrati infetti vengono poi coperti con un mezzo di copertura immobilizzante per prevenire l'infezione virale da diffondere indiscriminatamente sia attraverso il flusso meccanico o convezione del mezzo liquido durante la propagazione virale. Mentre sono stati tradizionalmente utilizzati sovrapposizioni solidi o semisolidi come agarosio, metilcellulosa e carbossimetilcellulosa (CMC), sovrapposizioni liquidi sono diventati un'alternativa sempre più attraente con lo sviluppo di nuovi strati liquidi come Avicel 5- 7. Saggi placca che utilizzano liquido contro le sovrapposizioni tradizionali presentano diversi vantaggi come la sovrapposizione può essere applicato a temperatura ambiente, e l'applicazione e la rimozione è molto più semplice. Come sovrapposizioni liquidi non necessitano di riscaldamento, virus labili delicate e di calore possono anche risultare più facile placca.

Dopo l'infezione iniziale e l'applicazione della sovrapposizione immobilizzare, singole placche o zone di morte cellulare, inizierà a sviluppare infezione e la replicazione virale sono vincolati al monostrato circostante. Cellule infettate continuerà il ciclo di replica-lisi-infezione si propaga ulteriormente l'infezione, con conseguente placche sempre più distinti e discreti. A seconda della cinetica di crescita e di accoglienza delle cellule virale utilizzato, una targa visibile normalmente formare entro 2-14 giorni. Monostrati cellulari possono poi essere contate con un microscopio a campo chiaro normale, o più tipicamente fissi e contrastate dal rosso neutro o violento cristallo per identificare prontamente placche ad occhio nudo. Vi è un'ampia varietà di macchie contatore placca disponibili, ciascuna offerta thEIR vantaggi e svantaggi specifici. Cristal violetto è tipicamente aggiunto nel punto di raccolta e dopo il fissaggio / rimozione della sovrapposizione, fornendo una macchia contatore rapida e distinta che consente l'identificazione di piccole placche quando morfologia mista è presente. Rosso neutro ha il vantaggio di prima applicazione e il contatto costante con la sovrapposizione, consentendo il monitoraggio in tempo reale di sviluppare la formazione della placca, che è particolarmente utile quando si lavora con uno sconosciuto virus o di replica cinetica. Abbiamo però scoperto che la colorazione non è in genere distinto durante l'utilizzo rosso neutro. 3- (4,5-dimetiltiazol-2-il) -2,5-difenil tetrazolio bromuro (MTT) offre numerosi vantaggi, come le macchie gialle colorante cellule vive scuro placche blu e virali possono essere contati senza rimozione della sovrapposizione come con rosso neutro. L'elevato contrasto tra cellule vive e morte offerte dalla MTT permette anche la rilevazione di piccole placche in un momento precedente l'infezione punto di post, Anche se lo stoccaggio sarebbe comunque richiedere la rimozione della sovrapposizione 8. Come cristal violetto può essere fatta semplicemente in una soluzione di acqua e alcol, e fornisce un elevato grado di sensibilità per la morfologia di placca mista, abbiamo scelto come un contatore macchia preferito e semplificato per il protocollo dimostrato come stiamo utilizzando diverse famiglie di ben virus caratterizzati.

Dopo aver sistemato e colorare il monostrato cellulare infetto, placche sono contati per poi titolare azionari campioni virali in termini di unità formanti placca (PFU) per millilitro. Una goccia registro deve essere osservata tra diluizioni seriali e, a seconda delle dimensioni piatto, tra 5-100 placche contati, con un controllo negativo utilizzato come riferimento. Campioni statisticamente possono variare del 10% per ogni 100 placche contati quando si confrontano campione replica 3. Il vantaggio di utilizzare saggi placca per determinare i titoli virali risiede nella loro capacità di quantificare il numero effettivo di particelle virali infettive well'ambito del campione. Come più virioni potrebbero potenzialmente infettare una singola cella, la terminologia di unità rispetto virons viene utilizzato durante titolazioni placca 1,2.

La morfologia della placca può variare notevolmente in condizioni di crescita differenti e tra le specie virali. Dimensione della placca, la chiarezza, la definizione dei bordi, e la distribuzione dovrebbero essere annotate in quanto possono fornire informazioni preziose sui fattori di crescita e di virulenza del virus in questione.

Principi di base del saggio di placca possono anche essere adattate e modificate in vari modi diversi, ad esempio nell'uso di focus formare saggi (FFA). FFAs non si basano su lisi cellulare e di contrasto per rilevare la formazione della placca, ma piuttosto impiegano tecniche per rilevare direttamente le proteine ​​virali intracellulari mediante anticorpi marcati immunoistochimica. Aumento della sensibilità, riduzione tempi di incubazione dopo l'infezione, e, soprattutto, la capacità di quantificare i virus non-litici sono tutti distintivantaggi quando si impiegano FFAs. Mentre ampiamente utilizzati, i fattori critici limitanti in FFAs differenziano un saggio di placca tradizionale risiede nella necessità di anticorpi appropriati e la capacità di rilevarne solo subunità proteiche virali infettive rispetto virons attuale 4.

Ai fini di questo studio, ci limiteremo la nostra discussione di saggi placca classica e descrivere l'uso di strati solidi e semisolidi tradizionali (agarosio e CMC), insieme a nuovi liquido microcristalline sovrapposizioni di cellulosa.

Protocol

1. Preparazione di cellule e reagenti

  1. Il giorno prima del test, sulla piastra cellule ospiti per il virus in questione (Tabella 1 e 2) a 90 - 100% di confluenza.
  2. Preparare soluzione di fissaggio del 10% di formaldeide in dH 2 O. A esempio, mescolare 5,56 ml di 36% stock di formaldeide con 14,44 ml di H 2 O distillata (dH 2 O).
    NOTA: uso sicuro appropriata pratiche di manipolazione e ventilazione durante l'uso di formaldeide.
  3. Preparare macchia di cristallo viola: 1% di cristallo viola (CV) in etanolo al 20% e dH 2 O.
  4. Preparare il supporto targa 2x (tipo di cellula dipendente a concentrazione 2x; vedi tabella 2). Filtrare su un filtro da 0,2 micron se qualche reagenti non sono sterili.
  5. Preparazione di sovrapposizioni immobilizzanti (Tabella 3)
    1. Per sovrapposizioni liquidi, fare una soluzione sterile 2,4% di Avicel in dH 2 O. Per evitare grumi, aggiungere la polvere in un pallone contenente acqua tha sta rapidamente mescolando con un ancoretta, versare Avicel lentamente e mescolare rapidamente a temperatura ambiente (RT). Quando la soluzione si rivela troppo viscoso per un ancoretta per omogeneizzare, passare a uno shaker pallone per> 30 min con pesanti agitazione per assicurare una omogeneizzazione.
      NOTA: Le soluzioni madre possono essere effettuate a concentrazioni più basse, ma le soluzioni possono separare e dovranno essere remixato per garantire omogeneizzazione. Soluzioni di lavoro Avicel possono essere usate vanno 0,6-3%.
    2. Dopo omogeneizzazione, autoclave la soluzione e conservare sigillato a temperatura ambiente.
    3. Per agarosio e carbossimetilcellulosa (CMC) sovrapposizioni, preparare una soluzione madre in dH 2 O del 2% CMC o 0,6% di agarosio. Mescolare con un ancoretta e autoclave o forno a microonde per portare in soluzione.

2. diluizioni e infezioni

  1. Il giorno dopo la placcatura, controllare visivamente la confluenza e la vitalità delle cellule prima di iniziare il test. Garantire standard di morfologia cellulare untrovare un monostrato confluente ~ 90% è presente.
  2. Effettuare una diluizione seriale di dieci volte dei campioni infettive. Utilizzare i mezzi di crescita cellulare per la propagazione virale come diluente (Tabella 2). Variare il numero di diluizioni necessarie sulla base del titolo atteso del virus in questione, e utilizzare sempre un campione di controllo non infetto al fine di garantire in modo indipendente la vitalità cellulare e l'aiuto nell'identificazione della placca.
  3. Dalle diluizioni seriali, di infettare le cellule per 45 minuti a 1 ora (Tabella 1). Utilizzare un volume sufficiente di inoculo a coprire le cellule, mantenendo il volume più basso possibile per massimizzare il contatto virale con il monostrato (Tabella 4). Lastre di roccia delicatamente ogni 20 min per assicurare una copertura uniforme e prevenire il monostrato cellulare si secchi.
  4. Dopo l'infezione, sovrapporre un volume adeguato di immobilizzare media direttamente ai inoculums nel pozzo (Tabella 2) utilizzando una miscela 1: 1 di supporti placca 2x e immobilizzione sovrapposizione di scelta (CMC, agarosio o Avicel). Agitare delicatamente per mescolare.
    1. Per sovrapposizioni liquido, miscelare 1: 1 con mezzi riscaldati placca 2x e 1,2-2,4% RT magazzino Avicel per ottenere una soluzione di lavoro di 0,6-1,2% Avicel mezzo di copertura.
    2. Per una sovrapposizione di agarosio, utilizzare una miscela 1: 1 di supporti 2x placca riscaldate e una soluzione madre di riscaldamento 0,6% di agarosio, posto in un bagno d'acqua a 56 ° per 30 minuti per equilibrare la temperatura ottenendo una concentrazione finale di agarosio / sovrapposizione di 0,3 %.
    3. Per CMC, preparare una soluzione madre 2% e trattare come descritto per la sovrapposizione di agarosio.
    4. Quando si applica la sovrapposizione al monostrato, equilibrare sempre agarosio caldo o CMC in acqua 56 ° C per evitare di danneggiare il monostrato. Assicurarsi che la soluzione è caldo, ma non bollente al tatto per prevenire la morte cellulare e titoli virali ridotti. La maggior parte delle sovrapposizioni agarosio inizierà a solidificarsi al di sotto di 42 ° C, lavorare velocemente e / o preparare piccoli lotti per evitare la solidificazione durante la manipolazione.
  5. Dopo l'aggiunta della sovrapposizione, incubare le piastre a produrre placche distinte che sono chiaramente numerabile. La formazione della placca può richiedere 2-14 giorni a seconda del virus in fase di analisi, la tabella 1.
    NOTA: Una volta che le piastre sovrapposte liquidi sono posti in incubatrice, non li sposta. Movimento delle sovrapposizioni liquido durante il periodo di incubazione si tradurrà in placche macchiate. Agarosio e CMC sovrapposizioni sono semisolida e possono essere spostati o controllati periodicamente al microscopio ottico per monitorare lo sviluppo della placca.

3. Fissaggio e Celle di colorazione

  1. Per fissare le cellule, travasare o aspirare la sovrapposizione Avicel, e fissare le cellule con la soluzione di formaldeide al 10% per 30 minuti per tutta la notte (<1 ml per pozzetto di una piastra ben 6).
    1. Per agarosio o CMC, aggiungere direttamente la soluzione di formaldeide per la sovrapposizione per 1 ora a tutta la notte.
      NOTA: I campioni possono essere conservati per lunghi periodi di tempo nel fissativo a condizione che fanon evaporare e asciugare come questo può distorcere il monostrato.
  2. Prima di colorazione e dopo la fissazione, scartare la formaldeide e togliere i tappi semisolidi per l'agarosio e CMC sia con acqua corrente o manualmente con una spatola. Sciacquare placche Avicel con acqua per eliminare residui di sovrapposizione / fissativo prima della colorazione.
  3. Per la colorazione, coprire le cellule con una quantità minima di soluzione di violetto cristallo per ~ 15 min. Lastre di roccia se necessario per garantire anche la copertura.
  4. Lavare delicatamente la macchia di cristallo viola con acqua. Una volta fissato, macchiato, e secco, negozio di placche a tempo indeterminato per le analisi future.

4. Determinazione virali I titoli

  1. Contare le placche in ciascun pozzetto, prendendo la media per eventuali repliche tecnici della stessa diluizione. Per i grandi formati lastra, pozzi di sconto con meno di 5 o superiore a 100 placche. Prendete nota di dimensioni della placca e morfologia. Il controllo negativo dovrebbe avere un monostrato uniforme epuò essere utilizzato come controllo di riferimento.
  2. Determinare il titolo virale del campione magazzino prendendo il numero medio di placche di diluizione e l'inverso del fattore di diluizione totale.

Equazione 1

NOTA: Come esempio, 30 e 32 placche contato per replicati del 1 x 10 -7 diluizione [31 (medio) / 10 -7 (diluizione) x 0,4 ml (inoculo)] produrrebbe un titolo di 7,75 x 10 8 pfu / ml.

Representative Results

La capacità del test di placca per valutare con precisione titoli virali si basa su numerosi fattori: la selezione della cellula ospite appropriato, i media adeguati e condizioni di crescita per la vitalità cellulare e virale, la propagazione virale immobilizzato, e una determinazione accurata del periodo di incubazione del virus per consentire un tempo adeguato per distinti e la formazione della placca numerabile.

Per questo studio, i virus provenienti da tre famiglie rappresentativi sono stati scelti per dimostrare le differenze di: selezione overlay, periodi di incubazione, e la morfologia della placca attraverso diversi tipi di campioni. Encefalite equina venezuelana (VeeV) è stato scelto come modello virale (+) ssRNA, che può causare significative malattie nelle specie equina e gli esseri umani e rappresenta la famiglia Togaviridae. Influenza B Taiwan ceppo, un segmentato (-) ssRNA virus di infettare gli esseri umani in primo luogo, rappresenta la famiglia Orthomyxoviridae. Rift Valley virus della febbre (RVFV), una - virus ssRNA artropode nato infettare principalmente artropodi, ()ruminanti e gli esseri umani, è stato selezionato come rappresentante della famiglia Bunyaviridae.

Per RVFV (figura 1), i titoli sono stati determinati da una soluzione madre di un ricombinante vivo attenuato ceppo MP12 di RVFV in un formato a 12 pozzetti utilizzando CMC, agarosio, o sovrapposizioni Avicel che sono state incubate side-by-side per la post infezione 72 ore (hpi). Un piatto rappresentante che mostra diluizioni che vanno da 10 -4 a 10 -7 può essere visto in Pannello di A. placche con CMC e sovrapposizioni di agarosio ha mostrato piccole, chiare e distinte placche con un bordo circolare ben definito. Le placche con una sovrapposizione di liquido erano leggermente più abbondanti e più grande rispetto a agarosio e placche CMC, e hanno fornito un bordo meno distinte. Titoli virali sono stati confrontati in Pannello B con tutte le sovrapposizioni di eseguire in modo paragonabile.

Per ottenere un confronto visivo più chiara tra overlay per MP12 insieme con un campione più grande per determinare riprodubilità, una piastra 6 pozzo è stato anche trialed in triplice copia (Figura 2). Nel formato piastra 6 bene, l'uso di una sovrapposizione CMC mostrato placche più piccole sia sovrapposizioni agarosio o liquide, che erano di dimensioni paragonabili a vicenda. Mentre titoli virali sono risultati simili tra i tre strati (pannello D), placche formate in sovrapposizioni di agarosio e liquidi dimostrato più facile contare a causa della loro maggiore dimensione.

In contrasto con RVFV, titoli VeeV e morfologia della placca tra le sovrapposizioni differenti variava notevolmente (Figura 3A). Le placche costituite sovrapposizioni CMC dimostrato una morfologia chiara e distinta quando si utilizza un formato a 12 pozzetti, a scapito della dimensione e sensibilità della placca (Pannello B). In contrasto con CMC, l'uso di agarosio e liquidi sovrapposizioni provocato placche significativamente più grandi, indicando l'inibizione virale inferiore e maggiore sensibilità alla replica VeeV. Ciò è stato già confermato quando si confrontano esclusivamente agarosio contro CMC in apaper pubblicato da Juarez et al. 4. Mentre agarosio e liquidi sovrapposizioni prodotte placche più grandi di CMC, le placche erano mal definiti confini ed erano difficili da contare in un formato 12 bene, con sovrapposizioni liquidi che forniscono la massima diffusione confine. Quando placche erano trialed in 6 pozzetti (Figura 4), ​​il più grande formato 6 ben negato il rilascio di apertamente grandi placche che sono difficili da differenziare in formato 12 bene, con agarosio e sovrapposizioni liquidi comprovanti superiore alle sovrapposizioni CMC in termini di definizione placca e sensibilità (Figura 4D).

In confronto a RVFV o VeeV, l'influenza fornisce diverse sfide uniche quando plaquing, come l'obbligo di un proteasi esterna. La sensibilità del virus dell'influenza a diverse selezioni di sovrapposizione è stato ben documentato in passato come cambiamenti significativi sono stati notati quando le modifiche come minori come marche di agarosio differenti hanno essereen usato 9.

È interessante notare che per il ceppo influenzale B Taiwan, l'uso di CMC come sovrapposizione provocato placche marcatamente più piccoli che sono difficili da contare e dimostrata difficilmente segnare affidabile (Figura 5A). L'uso di una sovrapposizione agarosio fornito i migliori placche (pannello C), e portato a una macchia sfondo più scuro (probabilmente dovuto alla maggiore redditività monostrato), e ha mostrato placche chiare e nitide in confronto diretto con l'uso della sovrapposizione liquido (Pannello B ).

Un vantaggio di polimeri liquidi oltre sovrapposizioni solidi o semisolidi, come agarosio e CMC, sta nella facilità di rimozione e applicazione. Sovrapposizioni semiduri richiedono riscaldamento, e solidificazione possono risultare problematico durante la manipolazione e la rimozione. Al fine di capitalizzare questi vantaggi e per determinare la praticità di utilizzare Avicel in modo high-throughput per RVFV, un formato a 96 pozzetti è stato trialed a vari concentrazi overlayons (Figura 6). Per RVFV MP-12, diluizioni sono state eseguite in quadruplicato in entrambi 0.6 e 1.2% concentrazioni finali di Avicel. Applicazione e rimozione Overlay dimostrato semplice, senza differenze apparenti tra replicati o tra concentrazioni notato, dimostrando un alto grado di riproducibilità. Quando segnando, placche erano distinte e numerabile ad occhio nudo, dimostrando la fattibilità di utilizzare sovrapposizioni liquidi in modo elevato throughput per RVFV.

Figura 1
Figura 1:. RVFV placca confronti di sovrapposizione utilizzando piastre da 12 pozzetti Veros sono stati piastrati a 2,5 x 10 5 cellule in piastre da 12 pozzetti e infettati con 200 microlitri utilizzando lo stesso campione di partenza in serie diluita di MP12. Dopo l'infezione 1,5 ml sovrapposizioni di agarosio 0,3%, 0,6% Avicel, o 1% CMC (c finaleconcentrazioni del), sono stati applicati al fine di confrontare direttamente le sovrapposizioni come dimostrato nel Pannello di A. placche sono stati contati e titolato nel Pannello B.

Figura 2
Figura 2:. RVFV placca confronti di sovrapposizione che utilizzano 6 pozzetti Veros sono stati piastrati a 5 x 10 5 cellule in 6 pozzetti e infettati con 400 microlitri utilizzando lo stesso campione di partenza in serie diluita di MP12. Tre ml sovrapposizioni di agarosio 0,3%, 0,6% Avicel o 1% CMC, sono stati applicati al fine di confrontare le sovrapposizioni come dimostrato nel Pannello A, B, e C. esperimenti indipendenti sono stati eseguiti in modo identico come descritto per pannelli AC, con placche contati e titolati nel Pannello di D (N = 3).

Figura 3
Figura 3: <strong> confronti di sovrapposizione VeeV placca utilizzando piastre da 12 pozzetti. Veros sono stati piastrati a 2,5 x 10 5 cellule in piastre da 12 pozzetti e infettati con 200 microlitri utilizzando lo stesso campione di partenza in serie diluito del ceppo del vaccino VeeV TC-83. Dopo l'infezione 1,5 ml sovrapposizioni di agarosio 0,3%, 0,6% Avicel, o 1% CMC, sono stati applicati al fine di confrontare direttamente le sovrapposizioni come dimostrato nel Pannello di A. placche sono stati contati e titolato nel Pannello di B.

Figura 4
Figura 4:. V EEV confronti placca di sovrapposizione che utilizzano 6 pozzetti Veros sono stati piastrati a 5 x 10 5 cellule in 6 pozzetti e infettati con 400 microlitri utilizzando lo stesso campione di partenza in serie diluita di VeeV TC-83. Dopo l'infezione, 3 ml sovrapposizioni di agarosio 0,3%, 0,6% Avicel, o un 1% di CMC, sono stati applicati al fine di confrontare le sovrapposizioni come dimostratoin pannelli A, B e C. esperimenti indipendenti sono stati eseguiti in modo identico come descritto per Pannelli A - C, con placche contati e titolato in Pannello D (N = 3).

Figura 5
Figura 5: Influenza confronti overlay placca cellule MDCK sono state piastrate a 5 x 10 5 cellule in 6 pozzetti e infettati con 400 ml di inoculo utilizzando lo stesso campione di partenza in serie diluita di influenza B Taiwan.. N siero fetale bovino (FBS) è stato utilizzato nei mezzi crescita o sovrapposizioni, come FBS può inibire influenza la propagazione attraverso l'inibizione di alcune proteasi che sono necessari per la fusione virale. TPCK-tripsina inserito in tutti gli overlay prima dell'applicazione al fine di facilitare la fusione virale e voce con le cellule ospiti. Dopo l'infezione, 3 ml sovrapposizioni di agarosio 0,3%, 0,6% Avicel, o 1% CMC sono stati applicati al fine di confrontare direttamentele sovrapposizioni come dimostrato nel riquadro A, B e C. esperimenti indipendenti sono stati eseguiti in modo identico come descritto Pannelli A - C, con placche contati e titolato in Pannello D (N = 3). Mentre in media è stata presa per placche CMC si sono dimostrati difficili da contare in modo affidabile come hanno dimostrato le frontiere diffuse e piccolissime dimensioni della placca.

Figura 6
Figura 6:. Alta velocità effettiva sovrapposizioni placca A 96 pozzetti di Veros placcato a 3 x 10 4 cellule per pozzetto, sono stati infettati con 50 ml di inoculo utilizzando lo stesso campione di partenza in serie diluita di RVFV MP12 per 1 ora, in quattro esemplari. Per le sovrapposizioni, 0.6 e 1.2% concentrazioni finali di Avicel stati trialed per determinare la fattibilità e la riproducibilità di utilizzare sovrapposizioni liquidi in maniera high throughput, pannelli A e B.

RVFV VeeV Influenza B
Tipo di cella Vero Vero MDCK
Periodo di infezione 1 ora 1 ora 45 min
Tempo di incubazione 3 giorni 2 giorni 3 giorni

Tabella 1: Targa del saggio di inoculazione Condizioni e cellulari Tipi

RVFV VeeV Influenza B
Tipo di cella Vero Vero MDCK
Tipo di Crescita DMEM 1 DMEM 1 DMEM 2
Targa media 2xEMEM A 2xEMEM A 2xEMEM B

1. Dulbecco Modified Eagle Medium supplementato con 10% siero fetale bovino, 1% L-glutammina, 1% Penicllin / streptomicina.
2. Dulbecco Modified Eagle Medium integrato con 1% di L-glutammina, 1% Penicllin / streptomicina, 0,2% sieroalbumina bovina, lo 0,025% HEPES, DEAE-Destrano 50ug / ml.
A. 2x minimo supporto essenziale (500 ml) supplementato con 5% FBS (25 ml), 1% minimo amminoacidi essenziali (5 ml), 1% di sodio piruvato (5 ml), 1% L-glutammina (5 ml), 2% Pen / Strep (10 ml).
B. 2x minimo supporto essenziale (500 ml) integrato con 0,2% sieroalbumina bovina, un 1% Minimum Essential Amino Acids (5 ml), 50ug / ml, 0,025% HEPES, DEAE-Destrano, tripsina-TPCK *
* Poco prima della preparazione, aggiungere 1 ml ogni 25ml di 2 mg / ml di brodo TPCK-tripsina alla aliquota che verrà utilizzato per mescolare con agarosio per placche.

Tabella 2: Placca e Viral / Cellular crescita Medias

RVFV VeeV Influenza B
Tipo di cella Vero Vero MDCK
Periodo di infezione 1 ora 1 ora 45 min
Tempo di incubazione 3 giorni 2 giorni 3 giorni

Le soluzioni di sovrapposizione non scadono quando fatto fino a quando la sterilità è mantenuta.

Tabella 3: Sovrapposizioni Archivio

6 bene 12 bene 96 bene
# Di cellule / pozzetto 5 x 10 5 2,5 x 10 5 3 x 10 4
Volume di inoculum (ml) 400 200 50
volume di sovrapposizione (ml) 3 1.5 0,100

Tabella 4: formati lastra

Discussion

Il fattore più critico per un saggio di placca successo risiede nella ottimizzazione del protocollo per la coltura virale specifico in questione come condizioni possono variare significativamente. Punti chiave da prendere in considerazione sono: ospitare la compatibilità cellulare con il virus in questione, adeguate condizioni di crescita virale, gli intervalli di diluizione sufficienti al fine di distinguere chiaramente placche, e la selezione di sovrapposizione corretta e colorazione per le cellule e virus in questione.

Mentre VeeV e RVFV sia crescere in condizioni molto simili utilizzando molti degli stessi tipi di cellula ospite, differenze di placca morfologia e cinetica di crescita variano notevolmente. Quando si utilizza cellule Vero per le prove di placca, che sono stati tradizionalmente utilizzati come una linea cellulare di propagazione e indicatore virus della febbre emorragica e alfavirus, VeeV cresce in genere a titoli più elevati rispetto RVFV e dimostra aumentato la cinetica di replica, lo sviluppo di placche di grandi dimensioni uniformi a 48 hpi 4, 10-12. In contrasto VeeV, RVFV richiede 72 hpi e dimostra placche che sono in genere molto più piccoli e di dimensioni variabili.

In opposizione a RVFV e VeeV, il virus dell'influenza è altamente cellula ospite specifico e può essere difficile da diffondere attraverso la cultura dei tessuti. Per il virus dell'influenza, l'ingresso del virus e la fusione è normalmente attivate dal legame del recettore sulla superficie cellulare con la glicoproteina virale hamagglutinin (HA), che media l'ingresso nella cellula bersaglio attraverso il legame con il recettore di superficie di acido α-sialico della cellula ospite. HA è una glicoproteina trimeric che è presente nella busta membrana di tutti i virus influenzali e richiede fenditura nella subunità HA1 e HA2 da una proteasi specifica cellula ospite. A complicare ulteriormente la questione, questi siti di rottura possono spesso variare tra i ceppi virali 13. In quanto espressione di proteasi capaci di scindere HA è limitato a specifici tessuti, proteasi are spesso aggiunto al mezzo di coltura per facilitare la fusione e l'ingresso del virus nella cellula ospite selezionata 13. TPCK-tripsina è un esempio di una proteasi di uso comune che viene utilizzato in colture cellulari sia MDCK e cellule Vero: agevolare replica multi-ciclo (in assenza di siero inattivare la tripsina) attraverso l'attivazione proteolitica di HA virale 14,15.

Come dimostrato in questo studio e di altri, le differenze di cicli di vita virali possono influenzare le selezioni di sovrapposizione, formati lastra, e dei tempi di incasso, con variazioni significative tra le classi diverse e specie di virus. Nel nostro studio, le sovrapposizioni di agarosio dimostrato placche più chiare a titoli più elevati rispetto sia CMC o sovrapposizioni liquidi sia per RVFV e virus dell'influenza B, rafforzando la sua utilità tra una vasta gamma di virus e tipi di cellule. Utilizzando una bassa concentrazione finale di agarosio grande aiuto nel rimuovere i tappi solidi e colorazione semplificata. CMC generale ha dimostrato la poorest efficacia come un overlay per tutti e tre i virus testati e prodotti molto piccoli e indistinti placche per il virus dell'influenza B. Anche se nel complesso CMC ha dimostrato le caratteristiche meno desiderabili, il suo uso in rapida crescita ed estremamente virulenti virus potrebbe rivelarsi vantaggiosa, come ha fatto apparire per ridurre le dimensioni della placca con solo una riduzione minima del titolo. La sovrapposizione del liquido si è rivelato il più versatile che era estremamente semplice da preparare, maggiore facilità di utilizzo, ed era paragonabile a agarosio su tutti i virus selezionati. In un formato piatto throughput più elevato a 96 pozzetti, l'applicazione e la rimozione non è stata inibita a causa di solidificazione come con sovrapposizioni tradizionali, e ha fornito risultati accurati e coerenti. Una considerazione quando si utilizza sovrapposizioni liquido sta nella colorazione opaca e l'incapacità di controllare la formazione della placca come le piastre non possono essere spostati fino al punto di raccolta, limitando questo adattamento per virus con una cinetica di replicazione precedentemente caratterizzati.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
6-well CellStar plate for tissue culture Greiner Bio-One 658 160
12-well CellStar plate for tissue culture Greiner Bio-One 665 180
96-well CellStar plate for tissue culture Greiner Bio-One 655 180
96-2ml deep well plate USA Scientific C15046314 For serial dilutions
DMEM Quality Biologicals 112 013 101 Cell Media/Diluent
2x EMEM for plaques Quality Biologicals 115 073 101 Warm to 37 °C
MEM 100x  Cellgro 25 025 Cl
Sodium Pyruvate  Cellgro 25 000 Cl
Penicillin Streptomycin Gibco 15140 122
L-Glutamine Gibco 25030 081
HyClone FBS  Thermo Scientific SH30910.03 Heat inactivate before use at 62 °C for 30 min
Bovine Serum Albumin Sigma Aldritch A7030-50G
Trypsin TPCK Sigma Aldritch T1426-50mg Make aliquots/Avoid freeze thawing
HEPES  Gibco 15630-080
DEAE-Dextran Sigma Aldritch D9885-10G
Crystal Violet Sigma Aldritch C3886-25G
Formaldehyde Solution Sigma Aldritch F8775-500ml
Ethanol denatured Reagent Grade Sigma Aldritch 362808-1L
Avicel RC-591 NF FMC BioPolymer USA RC-591 NF Shake vigorously when reconsitiuting  for >30 min to homogenize
UltraPure Agarose  Invitrogen 16500-100
Carboxymethyl cellulose, Sodium Salt Medium Viscosity  Sigma Aldrich C4888

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References

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