Viral Entschlossenheit Konzentration Durch Plaque-Assays: Mit Tradition und neuen Überzugssysteme

Immunology and Infection
 

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Baer, A., Kehn-Hall, K. Viral Concentration Determination Through Plaque Assays: Using Traditional and Novel Overlay Systems. J. Vis. Exp. (93), e52065, doi:10.3791/52065 (2014).

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Abstract

Plaque-Assays bleibt eines der genauesten Methoden zur direkten Quantifizierung von infektiösen Virionen und antivirale Substanzen durch die Zählung der einzelnen Platten (infektiöse Einheiten und zellulären Totzonen) in Zellkultur. Hier zeigen wir, wie man eine Grund Plaque-Test durchzuführen, und wie unterschiedliche Overlays und Techniken können die Plaquebildung und die Produktion auswirken. Regel feste oder halbfeste Overlay-Substrate, wie Agarose oder Carboxymethylcellulose, verwendet worden, um die Virusausbreitung zu begrenzen, verhindern, unterschiedslose Infektion durch das flüssige Wachstumsmedium. Immobilisiert Overlays beschränken Zellinfektion mit dem unmittelbar umgebenden Monoschicht, welche die Bildung von diskreten zählbaren Foci und die anschließende Bildung von Plaque. Um die Schwierigkeiten im Zusammenhang mit traditionellen Overlays zu überwinden, ein neuartiges Flüssigkeitslagerung Verwendung mikrokristalliner Cellulose und Carboxymethylcellulose Natrium wurde zunehmend als Ersatz in der Standard verwendetPlaque-Test. Flüssig-Overlay Plaque-Assays können leicht in Standard 6 oder 12-Well-Platte Formate nach traditionellen Techniken durchgeführt werden und erfordern keine spezielle Ausrüstung. Aufgrund seiner flüssigen Zustand und die anschließende einfache Anwendung und Entfernung kann Mikrokulturplattenformate alternativ als schnelle, präzise und mit hohem Durchsatz Alternative zu größeren Maßstab viralen Titrationen verwendet werden. Verwendung eines nicht beheizten viskose Flüssigkeit Polymer bietet die Möglichkeit, die Arbeit zu rationalisieren, schont Reagenzien, Inkubator Raum und erhöht die Betriebssicherheit, wenn in traditionellen oder High-Containment-Labors wie kein Reagenz Heizung oder Glaswaren verwendet benötigt werden. Flüssige Overlays kann sich auch als empfindlicher als traditionelle Overlays für bestimmte hitzelabilen Viren.

Introduction

Die genaue Trennung und Quantifizierung von lebensfähigen viralen Proben war stets eine laufende Forschungsziel in der Virologie. Es war nicht bis zum Aufkommen des Plaque-Test im Jahr 1952, die ein Mittel, um quantitativ und qualitativ zu berechnen Tier virale Titer wurde zuerst entwickelt, 1,2. Diese Technik wurde erstmals angepasst und aus Phagen-Assays, die zuvor verwendet worden war, um die Titer von Aktien Bakteriophagen in Pflanzenbiologie 1,2 berechnen modifiziert. Während alternative Mittel für virale Quantifizierung seit entwickelt und angepasst worden ist, wie Immunoassays, Fluoreszenz und Transmissionselektronenmikroskopie, abstimmbaren resistive Erfassungsimpuls (TRPS), Durchflusszytometrie, rekombinante Reportersysteme und quantitative reverse Transkriptase-Polymerase-Kettenreaktion (qRT-PCR) Diese Methoden versagen zu identifizieren und zu quantifizieren replikationskompetentem Vironen 1,3. Während Fortschritte in Technologien und Techniken weiter zu verfeinern und verändern die Landschaft; PLATEe-Assays weiterhin den Goldstandard bei der Bestimmung viralen Konzentrationen für Infektions lytische Vironen 1,4 darstellen.

Während eines Plaque-Assays wird eine konfluente Monoschicht von Wirtszellen mit einem lytischen Virus unbekannter Konzentration, die in Reihe mit einem zählbaren Bereich zwischen 5-100 Virionen verdünnt wurde, typischerweise infiziert. Infizierten Monoschichten werden dann mit einem Immobilisierungsmittel Deckungsmedium bedeckt, um eine virale Infektion von wahllos Ausbreitung durch entweder die mechanische oder konvektiven Strömung des flüssigen Mediums während der Virusvermehrung verhindern. Während feste oder halbfeste Overlays wie Agarose, Methylcellulose oder Carboxymethylcellulose (CMC) haben traditionell verwendet worden, haben Flüssigkeitsüberlagerungen eine zunehmend attraktive Alternative mit der Entwicklung von neuartigen flüssigen Overlays werden wie Avicel 5- 7. Plaque Assays Flüssigkeit im Vergleich zu herkömmlichen Overlays haben mehrere Vorteile, wie das Overlay kann applbei Raumtemperatur und Auftragen und Entfernen IED erheblich. Als flüssige Overlays nicht Erwärmung erfordern, kann zart und hitzelabilen Viren auch beweisen, leichter Plaque.

Nach der Erstinfektion und Anwendung der immobilisierenden Overlay einzelnen Plaques oder Zonen der Zelltod wird, beginnen sich zu entwickeln, wie virale Infektion und Replikation in die Umgebung Monoschicht eingeschränkt. Infizierte Zellen wird die Replikation-Lyse-Infektionszyklus fortzusetzen, weitere Vermehrung der Infektion, was zu immer deutliche und diskrete Plaques. Je nach Virus Wachstumskinetik und Wirtszelle verwendet wird, eine sichtbare Plaques bilden normalerweise innerhalb von 2-14 Tagen. Cellular Monoschichten können dann mit einem Standard-Hellfeld-Mikroskop, um ohne weiteres zu identifizieren Plaques mit dem bloßen Auge gezählt werden, oder typischer fixiert und durch Neutralrot oder Kristall gewaltsamen gegengefärbt. Es gibt eine Vielzahl von Plaque Gegen Flecken vorhanden, die jeweils thEIR spezifische Vor- und Nachteile. Kristallviolett ist üblicherweise am Ort der Sammlung und nach der Fixierung / Entfernen der Auflage aufgenommen, wodurch eine rasche und ausgeprägte Gegenfärbung, die für die Identifizierung von sehr kleinen Plaques können, wenn gemischte Morphologie vorliegt. Neutral Rot hat den Vorteil der frühen Anwendung und ständigem Kontakt mit dem Overlay, so dass für die Live-Überwachung der Entwicklung von Plaque-Bildung, was besonders nützlich ist, wenn die Arbeit mit einem unbekannten Virus oder Replikationskinetik. Wir haben jedoch festgestellt, dass Färbung ist in der Regel nicht so deutlich bei der Verwendung von Neutralrot. 3- (4,5-Dimethylthiazol-2-yl) -2,5-Diphenyl-Tetrazolium-Bromid (MTT) bietet einige Vorteile, da die gelben Farbstoff Flecken lebende Zellen dunkelblau und viralen Plaques können ohne Entfernen der Auflage angerechnet werden mit Neutralrot. Der hohe Kontrast zwischen lebenden und toten Zellen durch MTT ergab ermöglicht auch die Erkennung von kleinen Plaketten zu einem früheren Zeitpunkt nach der InfektionObwohl Speicher würde immer noch die Entfernung des Overlay-8 erforderlich. Als Kristallviolett können einfach in einer Lösung aus Wasser und Alkohol hergestellt werden und bietet ein hohes Maß an Sensibilität für gemischten Plaquemorphologie, haben wir es als eine bevorzugte und vereinfachte Gegenfärbung ausgewählt für das Protokoll gezeigt, wie wir nutzen mehrere Familien gut dadurch Viren.

Nach Fixierung und Färbung der infizierten Zellmonolayer werden Plaketten um Virusstammproben im Hinblick auf die Plaque-bildenden Einheiten (PFU) pro Milliliter titrieren gezählt. Eine Protokollabfall sollte zwischen serielle Verdünnungen angemerkt werden, und je nach Plattengröße zwischen 5-100 Plaques gezählt, mit einer Negativkontrolle als Referenz verwendet. Statistisch Proben um 10% auf 100 Plaques gezählt beim Vergleich Probe repliziert 3 variieren. Der Vorteil der Verwendung von Plaque-Assays auf Virus-Titer zu bestimmen, liegt in ihrer Fähigkeit, die tatsächliche Anzahl der infektiösen Viruspartikel w quantifizierennnerhalb der Probe. Als mehrere Virionen könnte eine einzelne Zelle zu infizieren, ist die Terminologie der Einheiten über Virionen während der Plaque-Titration 1,2 verwendet.

Plaquemorphologie können dramatisch unter unterschiedlichen Wachstumsbedingungen und zwischen Virusspezies variieren. Plaquegröße, Klarheit, Grenz Definition und Verteilung sollten alle beachten, da sie wertvolle Informationen über die Wachstums- und Virulenzfaktoren des Virus in Frage stellen werden.

Grundprinzipien Plaque-Assay kann auch angepasst und in einer Reihe von verschiedenen Möglichkeiten, wie beispielsweise bei der Verwendung der Schwerpunkt bildet Assays (FFAs) modifiziert werden. FFS nicht auf Zell-Lyse und Gegenfärbung verlassen, um die Plaquebildung zu erfassen, sondern beschäftigen Immuntechniken, um intrazelluläre virale Proteine ​​direkt zu erfassen durch getaggt Antikörper. Erhöhte Sensitivität, verringerte Inkubationszeiten nach Infektion und vor allem die Möglichkeit, zu quantifizieren nichtlytischen Viren sind alle verschiedenVorteile beim Einsatz von FFS. Während weit verbreitet, die kritischen begrenzenden Faktoren in FFAs gegenüber einem herkömmlichen Plaque-Assays besteht in der Notwendigkeit, geeignete Antikörper und die Fähigkeit, nur Sonde für die virale Proteinuntereinheiten und tatsächliche infektiösen Virionen 4.

Für die Zwecke dieser Studie werden wir unsere Diskussion auf klassische Plaque-Assays zu begrenzen und die Verwendung von traditionellen festen und halbfesten Overlays (Agarose und CMC), zusammen mit neuen flüssigen mikrokristalline Cellulose-Overlays.

Protocol

1. Herstellung der Zellen und Reagenzien

  1. Der Tag vor dem Test, Platte geeignete Wirtszellen für das Virus in Frage (Tabelle 1 und 2) bei 90 bis 100% Konfluenz.
  2. Vorbereitung Fixierlösung von 10% Formaldehyd in dH 2 O. In Beispiel mischen 5,56 ml 36% stock Formaldehyd mit 14,44 ml destilliertem H 2 O (dH 2 O).
    HINWEIS: Verwenden Sie geeignete sicheren Handhabung zu und Lüftung bei der Verwendung von Formaldehyd.
  3. Vorbereitung Kristallviolett-Färbung: 1% Kristallviolett (CV) in 20% Ethanol und dH 2 O.
  4. Bereiten 2x Plaque Medien (Zelltyp abhängig zu 2x Konzentration; siehe Tabelle 2). Filter mit einem 0,2 um Filter, wenn irgendwelche Reagenzien sind nicht steril.
  5. Vorbereitung der Immobilisierung Overlays (Tabelle 3)
    1. Für flüssige Overlays, machen Sie eine sterile 2,4% ige Lösung von Avicel in dH 2 O. Um ein Verklumpen zu verhindern, fügen Sie das Pulver in einen Kolben Wasser mit thbei rasch Mischen mit einem Rührstab, gießen Avicel langsam und rühren schnell bei Raumtemperatur (RT). Wenn die Lösung als zu viskos für ein Rührstab zu homogenisieren, zu einem Kolbenschüttler für> 30 min wechseln mit schweren Agitation sogar Homogenisierung zu gewährleisten.
      HINWEIS: Die Stammlösungen kann bei geringeren Konzentrationen hergestellt werden, aber die Lösungen getrennt und müssen wieder gemischt, um die Homogenisierung zu gewährleisten. Arbeitslösungen Avicel kann reichen von 0,6 bis 3% werden.
    2. Nach der Homogenisierung Autoklaven die Lösung und lagern bei RT versiegelt.
    3. Für Agarose und Carboxymethylcellulose (CMC) Overlays, bereiten eine Stammlösung in dH 2 O 2% CMC oder 0,6% Agarose. Mischen Sie mit einem Rührstab und Autoklaven oder Mikrowelle, um in Lösung zu bringen.

2. Verdünnungen und Infektionen

  1. Am Tag nach der Beschichtung, Sichtprüfung der Konfluenz und Lebensfähigkeit der Zellen vor dem Start des Assays. Stellen Sie sicher, Standardzellmorphologie einnd a ~ 90% konfluenten Monolayer vorhanden.
  2. Führen Sie eine Verzehnfachung serielle Verdünnung der infektiösen Proben. Verwenden der zellulären Wachstumsmedien für die Virusvermehrung als Verdünnungsmittel (Tabelle 2). Variieren Sie die Anzahl der Verdünnungen auf Basis der erwarteten Titer des Virus in Frage erforderlich, und immer eine nicht-infizierten Kontrollprobe zu verwenden, um unabhängig zu gewährleisten zelluläre Lebensfähigkeit und Hilfe bei der Plaque-Identifikation.
  3. Aus den seriellen Verdünnungen, infizieren die Zellen für 45 min bis 1 h (Tabelle 1). Verwenden ein ausreichendes Volumen des Inokulums, die Zellen abdecken, während das Volumen so gering wie möglich, um virale Kontakt mit der Monoschicht (Tabelle 4) zu maximieren. Sanft Felsplatten alle 20 min, um sicherzustellen, gleichmäßige Abdeckung und verhindern, dass die zelluläre Monoschicht vor dem Austrocknen.
  4. Nach der Infektion überlagern eines geeigneten Volumens der Immobilisierung Medium direkt auf die Inokula in der Vertiefung (Tabelle 2) unter Verwendung eines 1: 1-Mischung von 2 x Medium und dem Plaque immobilizing-Overlay der Wahl (CMC, Agarose oder Avicel). Schaukeln zu mischen.
    1. Für flüssige Overlays, mischen Sie 1: 1 mit erwärmt 2x Plaque Medien und 1,2-2,4% RT stock Avicel um eine Arbeitslösung von 0,6-1,2% Avicel Overlay Medium zu erhalten.
    2. Für eine Agarose-Overlay, verwenden Sie eine 1: 1-Mischung aus erwärmt 2x Plaque Medien und eine Stammlösung von beheizten 0,6% Agarose, in einem 56 ° C Wasserbad für 30 min, um die Temperatur Erhalt einer endgültigen Agarose / Overlay Konzentration von 0,3 ins Gleichgewicht %.
    3. Für CMC, bereiten eine 2% ige Stammlösung und Behandlung wie für die Agarose-Overlay beschrieben.
    4. Bei der Anwendung der Überlagerung zum Monoschicht immer äquilibrieren heißen Agarose oder CMC in einem 56 ° C Wasserbad, um Schäden an der Monoschicht zu verhindern. Stellen Sie sicher, die Lösung ist warm, aber nicht zu heiß zum Anfassen, Zelltod und geringere virale Titer verhindern. Die meisten Agarose Overlays beginnt unter 42 ° C erstarren, arbeiten schnell und / oder bereiten kleinen Chargen, um eine Verfestigung zu verhindern, während der Handhabung.
  5. Nach Zugabe des Overlay, Inkubation Platten deutliche Plaques, die eindeutig zählbare zu produzieren. Plaquebildung kann dauern 2-14 Tage, je nach Virus analysiert, Tabelle 1.
    HINWEIS: Sobald Flüssigkeit übereinandergelegten Platten werden in den Inkubator gestellt, nicht bewegen. Bewegung der Flüssigkeit Overlays während der Inkubationszeit wird in geschmiertem Plaques führen. Agarose und CMC Overlays sind halbfeste und können verschoben oder periodisch unter einem Lichtmikroskop überprüft, um Plaqueentwicklung zu überwachen.

3. Fixierung und Färbung Cells

  1. Um die Zellen zu fixieren, abgießen oder absaugen Avicel-Overlay, und fixieren Zellen unter Verwendung des 10% Formaldehydlösung für 30 min über Nacht (<1 ml pro Vertiefung für eine 6-Well-Platte).
    1. Für Agarose oder CMC, direkt fügen Sie die Formaldehyd-Lösung, um die Überlagerung für 1 h bis über Nacht.
      HINWEIS: Die Proben können für längere Zeiträume in dem Fixiermittel gehalten werden, sofern sie dannnicht verdunsten und austrocknen, da dies die Monolage verzerren.
  2. Vor der Färbung und nach der Fixierung, entsorgen Sie die Formaldehyd und entfernen Sie die halbfesten Stecker für die Agarose und CMC entweder mit fließendem Wasser oder manuell mit einem Spatel. Spülen Avicel Plaques mit Wasser auf Rest Overlay / Fixiermittel vor der Färbung zu entfernen.
  3. Zum Färben, decken die Zellen mit einer minimalen Menge an Kristallviolett-Lösung für ca. 15 min. Felsplatten, wenn notwendig, um eine gleichmäßige Abdeckung zu gewährleisten.
  4. Vorsichtig waschen den Kristallviolett-Färbung mit Wasser. Einmal fixiert, gefärbt und getrocknet, speichern Plaques auf unbestimmte Zeit für eine spätere Analyse.

4. Bestimmung Virustiter

  1. Zählen Sie die Plaques in jeder Vertiefung, wobei die durchschnittliche für technische Wiederholungen des gleichen Verdünnung. Für große Plattenformate, Discount Brunnen mit weniger als 5 oder mehr als 100 Tafeln. Beachten Plaquegröße und Morphologie. Die Negativkontrolle sollte eine einheitliche Mono haben undals Referenzkontrolle verwendet werden.
  2. Bestimmen Sie die virale Titer des Aktien Probe, indem die durchschnittliche Anzahl der Plaques für eine Verdünnung und dem Kehrwert der Gesamtverdünnungsfaktor.

Gleichung 1

HINWEIS: Als ein Beispiel, 30 und 32 Plaketten für Wiederholungen der 1 x 10 -7 Verdünnung [31 (Durchschnitt) / 10 -7 (Verdünnung) x 0,4 ml (Inokulum)] würde einen Titer von 7,75 erhalten x 10 8 pfu gezählt / ml.

Representative Results

Die Fähigkeit von Plaque-Assays, genau zu beurteilen Virustiter beruht auf zahlreichen Faktoren: geeignete Wirtszelle Auswahl geeigneten Medien und Wachstumsbedingungen für die zelluläre und virale Lebensfähigkeit immobilisierten Virusausbreitung und eine genaue Bestimmung des viralen Inkubationszeit, um eine angemessene Zeit für verschiedene ermöglichen und zählbare Plaquebildung.

Für diese Studie wurden Viren aus drei repräsentativen Familien gewählt, um Unterschiede in der zeigen: Overlay-Auswahl, Inkubationszeiten und Plaquemorphologie in unterschiedlichen Probenarten. Venezolanischen Pferde-Enzephalitis (VEEV) wurde als (+) ssRNA Virusmodell, das bedeutende Krankheit bei Equiden und Menschen verursachen und stellt die Familie Togaviridae ausgewählt. Influenza B Taiwan Stamm, einem segmentierten (-) ssRNA-Virus vor allem Menschen infizieren, stellt die Familie Orthomyxoviridae. Rift-Valley-Fieber-Virus (RVFV), ein (-) ssRNA Arthropoden geboren Virus primär infizieren Arthropoden,Wiederkäuer und Menschen wurde als Vertreter der Familie Bunyaviridae ausgewählt.

Für RVFV (Figur 1), wurden die Titer aus einer Stammlösung eines rekombinanten lebenden attenuierten Stamm von MP12 RVFV in einer 12-Well-Plattenformat unter Verwendung CMC, Agarose oder Avicel Overlays, die Seite-an-Seite für 72 Stunden nach der Infektion inkubiert wurden bestimmt (hpi). Ein Vertreter Schild mit Verdünnungen im Bereich von 10 -4 bis 10 -7 in Feld A. Plaques mit CMC zu sehen und Agarose Overlays zeigten kleine, klare und deutliche Plaques mit einem gut definierten Kreisgrenze. Plaques mit einer Flüssigkeit Overlay waren etwas reichlicher und im Vergleich zu Agarose und CMC Plaques größer, und lieferte eine weniger deutliche Grenze. Virustiter wurden in Tafel B mit allen Überlagerungen vergleichsweise Führen verglichen.

Um eine klarere visuelle Vergleich zwischen Overlays für MP12 zusammen mit einer größeren Stichprobenumfang zu bestimmen Reproduk erhaltenbilität wurde eine 6-Well-Platte auch in dreifacher Ausführung (Abbildung 2) erprobt. In der 6-Well-Plattenformat, die Verwendung eines CMC-Overlay zeigten kleinere Plaques als entweder Agarose oder Flüssigkeitsüberlagerungen, die in der Größe miteinander vergleichbar waren. Während virale Titer waren ähnlich zwischen allen drei Überlagerungen (Tafel D), erwies sich Plaques in Agarose und Flüssigkeitsüberlagerungen gebildet leichter zu zählen wegen ihrer erhöhten Größe.

Im Gegensatz RVFV, VEEV Titer und Plaquemorphologie zwischen den unterschiedlichen Überlagerungen stark variiert (3A). Plaques in CMC Overlays gebildet zeigte eine klare und deutliche Morphologie bei Verwendung einer 12-Well-Plattenformat, auf Kosten der Plaquegröße und Empfindlichkeit (Feld B). Im Gegensatz zu CMC, die Verwendung von Agarose und flüssigen Überlagerungen zu einer signifikant größeren Plaques, was geringere Virushemmung und erhöhte Empfindlichkeit gegen VEEV Replikation. Dieser wurde zuvor bestätigt, als allein zu vergleichen Agarose gegen CMC in apaper veröffentlicht von Juarez et al. 4. Während Agarose und Flüssigkeitsüberlagerungen erzeugt größere Plaques als CMC hatten die Plaques schlecht definierten Grenzen und waren schwierig, in einem 12-Well-Format zählen, mit flüssigem Overlays Erbringen der größten Grenzdiffusion. Wenn Plaques wurden in 6-Well-Platten (Abbildung 4) erprobt, negiert die größeren 6-Well-Format das Thema offenkundig großen Plaques, die schwer in der 12-Well-Format zu unterscheiden waren, mit Agarose und flüssigen Overlays beweisen besser als die CMC-Overlays in Bezug auf Plaque Definition und sensibel (4D).

Im Vergleich zu RVFV oder VEEV bietet einige einzigartige Herausforderungen Influenza bei Plaquebildungs, wie das Erfordernis einer externen Protease. Die Empfindlichkeit des Influenza-Virus zu unterschiedlichen Overlay Auswahl wurde auch in der Vergangenheit gut dokumentiert als signifikante Veränderungen festgestellt wurden, wenn Änderungen so gering wie unterschiedliche Marken aus Agarose habenen verwendet 9.

Interessant für das Influenza-B-Stamm Taiwan, die Verwendung von CMC als Overlay Folge deutlich kleinere Plaques, die schwer zu zählen sind, und erwies sich als schwierig, zuverlässig Note (5A). Die Verwendung eines Agarose-Overlay versehen die besten Plaques (Feld C) und ergab einen dunkleren Hintergrund-Färbung (wahrscheinlich aufgrund der erhöhten Mono Lebensfähigkeit) und zeigte deutlicher und schärfer Plaques im direkten Vergleich zu der Verwendung des Flüssigkeitsüberlagerung (Feld B ).

Ein deutlicher Vorteil von flüssigen Polymeren auf festen und halbfesten Overlays, wie Agarose und CMC, liegt in der Leichtigkeit der Entfernung und Anwendung. Halbfesten Overlays erfordern Heizung und Verfestigung kann problematisch erweisen bei der Handhabung und Beseitigung. Um diese Vorteile zu nutzen und die Praktikabilität der Verwendung von Avicel in einem Hochdurchsatz Weise RVFV zu bestimmen, wurde eine 96-Well-Platte-Format bei unterschiedlichen Lagerungs concentrati trialedons (Abbildung 6). Für RVFV MP-12 wurden in vierfacher Verdünnungen an beiden 0,6 und 1,2% Endkonzentrationen von Avicel geführt. Overlay Anwendung und Entfernung erwies sich als einfach, ohne erkennbare Unterschiede zwischen den Wiederholungen oder zwischen Konzentrationen festgestellt, was auf eine hohe Reproduzierbarkeit. Beim Vertonen waren Plaques deutliche und zählbaren mit dem bloßen Auge, die Machbarkeit der Verwendung flüssigen Overlays in einem Hochdurch Weise RVFV.

Figur 1
Fig. 1: RVFV Plaque Overlay Vergleiche unter Verwendung 12-Well-Platten wurden bei Veros 2,5 x 10 5 Zellen in 12-Well-Platten plattiert und mit 200 & mgr; l unter Verwendung der gleichen Reihe verdünnt Ausgangsprobe von MP12 infiziert. Nach der Infektion 1,5 ml Überlagerungen von 0,3% Agarose, 0,6% Avicel, oder 1% CMC (c endgültigenoncentrations) wurden um direkt vergleichen die Overlays angewendet wie im Feld A. Plaques nachgewiesen wurden gezählt und in Feld B titriert.

Figur 2
Fig. 2: RVFV Plaque Overlay Vergleiche Verwendung Platten mit 6 Vertiefungen Veros wurden bei 5 × 10 5 Zellen in 6-Well-Platten plattiert und mit 400 & mgr; l unter Verwendung der gleichen Reihe verdünnt Ausgangsprobe von MP12 infiziert. Drei ml Overlays von 0,3% Agarose, 0,6% Avicel, oder 1% CMC wurden, um direkt vergleichen die Overlays angewendet wie in Panel A gezeigt, wurden B und C. Separate Experimente identisch durchgeführt wie für Panels AC beschrieben mit Plaques gezählt und in Feld D (N = 3) titriert.

Figur 3
Figur 3: <strong> VEEV Plaque Overlay Vergleiche Verwendung Platten mit 12 Vertiefungen. Veros wurden bei 2,5 x 10 5 Zellen in 12-Well-Platten plattiert und mit 200 & mgr; l unter Verwendung der gleichen Reihe verdünnt Ausgangsprobe des VEEV TC-83-Impfstoff-Stamm infiziert. Nach der Infektion 1,5 ml Overlays von 0,3% Agarose, 0,6% Avicel, oder 1% CMC wurden, um direkt vergleichen die Overlays angewendet wie im Feld A. Plaques nachgewiesen wurden gezählt und in Feld B titriert

Figur 4
Fig. 4: V EEV Plaque Overlay Vergleiche Verwendung Platten mit 6 Vertiefungen Veros wurden bei 5 × 10 5 Zellen in 6-Well-Platten plattiert und mit 400 & mgr; l unter Verwendung der gleichen Reihe verdünnt Ausgangsprobe VEEV TC-83 infiziert. Nach der Infektion 3 ml Überlagerungen von 0,3% Agarose, 0,6% Avicel, oder eine 1% CMC wurden, um direkt vergleichen die Overlays angewendet als nachgewiesenin den Feldern A, B und C wurden Separate Experimente identisch durchgeführt wie bei den Feldern A beschrieben - C, mit Plaques gezählt und in Tafel D titriert (N = 3).

Figur 5
Figur 5: Influenza Plaque Overlay Vergleiche MDCK-Zellen wurden mit 5 x 10 5 Zellen in 6-Well-Platten plattiert und mit 400 & mgr; l Inokulum unter Verwendung der gleichen Reihe verdünnt Ausgangsprobe von Influenza B Taiwan infiziert.. Kein fötales Rinderserum (FBS) wurde in das Wachstumsmedium oder Überlagerungen verwendet werden, wie FBS kann Influenza Ausbreitung durch Inhibition von bestimmten Proteasen, die für die Virusfusion erforderlich hemmen. TPCK-Trypsin, um virale Fusion und die Eingabe mit den Wirtszellen zu erleichtern, um alle Überlagerungen vor der Anwendung hinzugefügt. Nach der Infektion wurden 3 ml Überlagerungen von 0,3% Agarose, 0,6% Avicel, oder 1% CMC, um direkt zu vergleichen angewendetdie Symbole wie in Panel A, B und C. Getrennte Experimente zeigten, wurden identisch durchgeführt wie in Panel A beschrieben - C, mit Plaques gezählt und in Tafel D titriert (N = 3). Während ein durchschnittlicher wurde für CMC Plaques ergriffen sie erwies sich als schwierig, um zuverlässig zu zählen, wie sie diffuse Grenzen und sehr kleine Plakette Größen demonstriert.

Figur 6
Fig. 6: Hochdurch Plaque Overlays Eine Platte mit 96 Vertiefungen ausplattiert der Veros bei 3 x 10 4 Zellen pro Well wurden mit 50 & mgr; l Inokulum unter Verwendung der gleichen Reihe verdünnt Ausgangsprobe RVFV MP12 für 1 Stunde infiziert, in vierfacher Ausfertigung. Für die Überlagerungen wurden 0,6 und 1,2% Endkonzentrationen von Avicel, um die Durchführbarkeit und Reproduzierbarkeit der Verwendung flüssigen Overlays in einem Hochdurchsatz-Weise Panels A und B zu bestimmen erprobt.

RVFV VEEV Influenza B
Zelltyp Vero Vero MDCK
Infektionsperiode 1 Stunde 1 Stunde 45 min
Inkubationszeit 3 Tage 2 Tage 3 Tage

Tabelle 1: Plaque-Assay Inokulation Bedingungen und Zelltypen

RVFV VEEV Influenza B
Zellen-Art Vero Vero MDCK
Wachstumstyp DMEM 1 DMEM 1 DMEM 2
Plaque Medien 2xEMEM A 2xEMEM A 2xEMEM B

1. Dulbecco modifiziertes Eagle-Medium mit 10% fötalem Rinderserum, 1% L-Glutamin, 1% Penicllin / Streptomycin ergänzt.
2. Dulbecco modifiziertes Eagle-Medium mit 1% L-Glutamin, 1% Penicllin / Streptomycin, 0,2% Rinderserumalbumin, 0,025% HEPES, DEAE-Dextran 50 ug / ml ergänzt.
A. 2x Minimal Essential Media (500 ml) mit 5% FBS (25 ml), 1% Minimum Essential Amino Acids (5 ml), 1% Natriumpyruvat (5 ml), 1% L-Glutamin (5 ml) ergänzt, 2% Pen / Strep (10 ml).
B. 2x Minimal Essential Media (500 ml) mit 0,2% Rinderserumalbumin, 1% Minimum Essential Amino Acids (5 ml), 50 ug / ml, 0,025% HEPES, DEAE-Dextran, Trypsin-TPCK ergänzt *
* Kurz vor der Zubereitung, fügen 1 ul pro 25ml 2 ug / ml Bestand TPCK-Trypsin zu dem aliquoten Sie verwenden werden, um mit Agarose für Plaques mischen.

Tabelle 2: Plaque und Viral / Zellwachstum Medias

RVFV VEEV Influenza B
Zelltyp Vero Vero MDCK
Infektionsperiode 1 Stunde 1 Stunde 45 min
Inkubationszeit 3 Tage 2 Tage 3 Tage

Overlay-Lösungen wird nicht erlöschen, wenn gemacht, so lange, wie die Sterilität erhalten bleibt.

Tabelle 3: Overlays Lizenz

6 gut 12 gut 96 gut
Anzahl der Zellen / Vertiefung 5 x 10 5 2,5 x 10 5 3 x 10 4
Volumen Innokulum (ul) 400 200 50
Volumen von Overlay (ml) 3 1,5 0,100

Tabelle 4: Plattenformate

Discussion

Der wichtigste Faktor für eine erfolgreiche Plaque-Assay liegt in der Optimierung des Protokolls für die bestimmte Viruskultur in Frage Bedingungen erheblich variieren kann. Wichtige Punkte zu berücksichtigen sind: Gastgeber zelluläre Verträglichkeit mit dem Virus in Frage, geeigneten viralen Wachstumsbedingungen, ausreichende Verdünnung reicht, um genau zu differenzieren Plaketten und korrekte Überlagerung Auswahl und Färbung für die Zellen und Viren im Frage.

Während VEEV und RVFV sowohl unter sehr ähnlichen Bedingungen unter Verwendung von vielen der gleichen Wirtszellarten wachsen, Unterschiede in der Plaque-Morphologie und Wachstumskinetik erheblich variieren. Bei der Verwendung von Vero-Zellen für die Plaque-Assays, die traditionell als die Ausbreitung und die Indikator-Zelllinie für hämorrhagische Fieberviren und Alphaviren verwendet wurden, wächst VEEV typischerweise zu höheren Titern als RVFV und zeigt erhöhte Replikationskinetik, Entwicklung großer Uniform Plaques bei 48 hpi 4, 10-12. Im Gegensatz zu VEEV, RVFV erfordert 72 hpi und zeigt Plaques, die in der Regel wesentlich kleiner sind und in der Größe variabel.

Im Gegensatz zu RVFV und VEEV ist das Influenza-Virus hochWirtsZelle spezifisch und können schwer durch Gewebekultur fortpflanzen. Für das Influenza-Virus, Viruseintritt und Fusion normalerweise durch die Bindung von Zelloberflächenrezeptors mit dem viralen Glycoprotein hamagglutinin (HA), die den Eintritt in die Zielzelle durch Bindung mit der Wirtszelle α-Sialinsäure-Oberflächenrezeptor vermittelt eingeleitet. HA ist ein Glykoprotein, das trimere im Membranhülle aller Influenza-Viren vorhanden ist und erfordert Spaltung in die Untereinheiten HA1 und HA2 durch eine spezifische Wirtszelle Protease. Um das Problem weiter zu komplizieren, können diese Schnittstellen oft schwanken zwischen Virusstämmen 13. Da die Expression von Proteasen spalten kann HA ist auf bestimmte Gewebe beschränkt, Proteasen are häufig Zellkulturmedien, um die viralen Fusion und den Eintritt in die ausgewählte Wirtszelle 13 zu erleichtern zugegeben. TPCK-Trypsin ist ein Beispiel eines üblicherweise verwendeten Protease, die in der Zellkultur sowohl mit MDCK und Vero-Zellen verwendet wird: Erleichtern Multizyklus-Replikation (in Ermangelung einer Trypsin zu inaktivieren Serum) durch die proteolytische Aktivierung der viralen HA 14,15.

Wie in dieser Studie und andere zeigten, können Unterschiede in der viralen Lebenszyklen Overlay Selektionen, Plattenformate und Abholzeiten, mit erheblichen Abweichungen zwischen den unterschiedlichen Klassen und Arten von Viren beeinflussen. In unserer Studie zeigte Agarose Overlays klarer Plaques bei höheren Titern als entweder CMC oder flüssigen Overlays für beide RVFV und Influenza-B-Virus, Verstärkungs ihre Nutzbarkeit unter einer breiten Palette von Viren und Zelltypen. Mit einem niedrigen Endkonzentration von Agarose stark bei der Beseitigung der festen Stecker und vereinfachte Färbung unterstützt. CMC Gesamt demonstrierte die poorest Wirksamkeit als Overlay für alle drei getesteten Viren und produziert sehr klein und undeutlich Plaques für Influenza-B-Virus. Obwohl insgesamt CMC zeigten die am wenigsten wünschenswerte Eigenschaften, die Nutzung im schnell wachsenden und vorteil extrem virulenten Viren nachweisen konnten, wie es tat scheinen Plaquegröße mit nur einem minimalen Rückgang der Titer zu reduzieren. Die Flüssigkeit erwies sich als Überlagerung der vielseitigste daß sein war es extrem einfach herzustellen, erhöhte Leichtigkeit der Verwendung und war vergleichbar mit der in allen ausgewählten Viren Agarose. In einem höheren Durchsatz 96-Well-Platte-Format, Anlegen und Entfernen nicht aufgrund der Verfestigung wie bei herkömmlichen Überlagerungen verhindert wird, und sofern genaue und konsistente Ergebnisse. Eine Überlegung bei der Verwendung von flüssigen Überlagerungen liegt in der undurchsichtigen Färbung und die Unfähigkeit, die Plaquebildung zu überwachen, wenn die Platten nicht bis zum Sammelpunkt bewegt werden, begrenzen diese Anpassung an Viren mit bereits charakterisierten Replikationskinetik.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
6-well CellStar plate for tissue culture Greiner Bio-One 658 160
12-well CellStar plate for tissue culture Greiner Bio-One 665 180
96-well CellStar plate for tissue culture Greiner Bio-One 655 180
96-2ml deep well plate USA Scientific C15046314 For serial dilutions
DMEM Quality Biologicals 112 013 101 Cell Media/Diluent
2x EMEM for plaques Quality Biologicals 115 073 101 Warm to 37 °C
MEM 100x  Cellgro 25 025 Cl
Sodium Pyruvate  Cellgro 25 000 Cl
Penicillin Streptomycin Gibco 15140 122
L-Glutamine Gibco 25030 081
HyClone FBS  Thermo Scientific SH30910.03 Heat inactivate before use at 62 °C for 30 min
Bovine Serum Albumin Sigma Aldritch A7030-50G
Trypsin TPCK Sigma Aldritch T1426-50mg Make aliquots/Avoid freeze thawing
HEPES  Gibco 15630-080
DEAE-Dextran Sigma Aldritch D9885-10G
Crystal Violet Sigma Aldritch C3886-25G
Formaldehyde Solution Sigma Aldritch F8775-500ml
Ethanol denatured Reagent Grade Sigma Aldritch 362808-1L
Avicel RC-591 NF FMC BioPolymer USA RC-591 NF Shake vigorously when reconsitiuting  for >30 min to homogenize
UltraPure Agarose  Invitrogen 16500-100
Carboxymethyl cellulose, Sodium Salt Medium Viscosity  Sigma Aldrich C4888

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References

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