Viral Koncentration Fastställande Genom plackanalyser: med hjälp av traditionella och Novel Overlay Systems

Immunology and Infection
 

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations | Reprints and Permissions

Baer, A., Kehn-Hall, K. Viral Concentration Determination Through Plaque Assays: Using Traditional and Novel Overlay Systems. J. Vis. Exp. (93), e52065, doi:10.3791/52065 (2014).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Plackanalyser är fortfarande en av de mest exakta metoder för direkt kvantifiering av infektiösa vironer och antivirala substanser genom räkning av diskreta plack (infektiösa enheter och cellulära döda zoner) i cellkultur. Här visar vi hur du utför en grundläggande plackanalys, samt hur skilda över och tekniker kan påverka plackbildning och produktion. Typiskt fasta eller halvfasta overlay substrat, såsom agaros eller karboximetyl-cellulosa, har använts för att begränsa viral spridning, förebygga urskillningslös infektion genom vätsketillväxtmedium. Immobiliserade över begränsar cellulär infektion till närmast omgivande monoskiktet, vilket gör att bildandet av diskreta kvantifierbart foci och efterföljande plackbildning. För att övervinna de svårigheter som är förknippade med att använda traditionella över, en ny flytande över utnyttjar mikrokristallin cellulosa och karboximetylcellulosanatrium har blivit allt vanligare som en ersättning i standardenplackanalys. Flytande overlay plackanalyser kan lätt utföras i antingen standard 6 eller 12 och plattformat enligt traditionella tekniker och kräver ingen speciell utrustning. På grund av dess flytande tillstånd och efterföljande enkel applicering och borttagning, kan mikrokulturplattformat alternativt användas som en snabb, korrekt och hög kapacitet alternativ till större skala virala titreringar. Användning av en icke uppvärmd viskös flytande polymer ger möjlighet att effektivisera arbetet, sparar reagenser, inkubator utrymme och ökar driftsäkerheten vid användning i traditionella eller höga inneslutningslaboratorier som ingen uppvärmning av reagens eller glas krävs. Flytande över kan också visa sig vara känsligare än traditionella överlägg för vissa värme labila virus.

Introduction

Den exakta isolering och kvantifiering av livskraftiga virusprover har alltid varit ett pågående forskningsprojekt mål i virologi. Det var inte förrän tillkomsten av plackanalys 1952 som ett medel för att kvantitativt och kvalitativt beräkna djurens virustitrar utvecklades först 1,2. Denna teknik var först anpassas och modifieras från fag-analyser, som tidigare hade använts för att beräkna titrar av stock bakteriofager i växtbiologi 1,2. Även alternativa metoder för viral kvantifiering har sedan utvecklats och anpassats, såsom immun, fluorescens och transmissionselektronmikroskop, avstämbara resistiv puls avkänning (TRPS), flödescytometri, rekombinanta reportersystem, och kvantitativ RT-PCR (QRT-PCR) Dessa metoder misslyckas med att identifiera och kvantifiera replikationskompetenta vironer 1,3. Medan framsteg inom teknik och tekniker fortsätter att förfina och förändra landskapet; plaque-analyser utgör fortfarande den gyllene standarden för att bestämma virushalter för smitt lytiska vironer 1,4.

Under en plackanalys, är ett sammanflytande monolager av värdceller infekterade med en lytisk virus av en okänd koncentration som har seriespäddes till en uppräknelig intervall, vanligtvis mellan 5-100 virioner. Infekterade mono täcks sedan med en immobiliserande overlay medium för att förhindra viral infektion från urskillningslöst sprider sig genom antingen mekanisk eller convectional flöde av det flytande mediet under viral förökning. Medan fasta eller halvfasta överlag såsom agaros, metylcellulosa eller karboximetylcellulosa (CMC) har traditionellt använts, har flytande beläggningar blivit ett alltmer attraktivt alternativ med utveckling av nya flytande övertäckningar, såsom Avicel 5- 7. Plackanalyser som använder flytande kontra traditionella över har flera fördelar som överlagringen kan vara applied vid rumstemperatur, och applicering och borttagande är betydligt enklare. Som flytande överlag inte kräver uppvärmning, kan känsliga och värme labila virus också vara lättare att plack.

Efter den initiala infektionen och tillämpning av den immobiliserande overlay, individuella placker, eller zoner av celldöd, kommer att börja utveckla såsom viral infektion och replikation är begränsade till den omgivande monoskiktet. Infekterade celler fortsätter repliker-lys-infektionscykeln vidare smittan sprids, vilket resulterar i allt mer distinkta och diskreta plack. Beroende på den virala tillväxt kinetik och värdcell som används, kommer en synlig plack normalt bildar inom 2-14 dagar. Cellulära monoskikt kan sedan räknas med en standardljusfältmikroskop, eller mer typiskt fast och motfärgades med neutralrött eller kristall våldsamt för att lätt identifiera plack med blotta ögat. Det finns ett brett utbud av plack motverka fläckar tillgängliga, varje erbjudande thEIR specifika fördelar och nackdelar. Crystal violet sätts typiskt vid punkten för insamling och efter upptagningen / borttagning av overlay, vilket ger en snabb och tydlig disk fläck som möjliggör identifiering av mycket små plack när blandad morfologi är närvarande. Neutral rött har fördelen av tidig tillämpning och ständig kontakt med overlay, vilket möjliggör live övervakning av utvecklingen av plackbildning, vilket är särskilt användbart när man arbetar med ett okänt virus eller replikering kinetik. Vi har emellertid funnit att färgningen är typiskt inte lika distinkt vid användning av neutralrött. 3- (4,5-dimetyltiazol-2-yl) -2,5-difenyl-tetrazolium-bromid (MTT) erbjuder flera fördelar, såsom de gula färgade färgämnes fläckar lever celler mörkblå och virala plack kan räknas utan avlägsnande av överlägget som med neutralrött. Den höga kontrasten mellan levande och döda celler som erbjuds genom MTT medger också detektion av små plack vid en tidigare tidpunkt efter infektion, Även om minne som fortfarande skulle kräva borttagande av överlagringen 8. Som kristallviolett kan enkelt göras i en lösning av vatten och alkohol, och ger en hög grad av känslighet för blandad plackmorfologi har vi valt det som en prioriterad och förenklad motverka fläck för protokollet visade när vi utnyttjar flera familjer av väl karakteriserade virus.

Efter fixering och färgning av infekterade cellmonoskikt, är plack räknades för att titrera virala stock prover i form av plackbildande enheter (pfu) per ml. En logg droppe bör noteras mellan seriespäd och beroende på plåtstorlek, mellan 5-100 plack räknades, med en negativ kontroll används som referens. Statistiskt prov varierar med 10% för varje 100 plack räknas när man jämför prov replikerar 3. Fördelen med att använda plackanalyser för att bestämma virustitrar ligger i deras förmåga att kvantifiera det faktiska antalet infektiösa viruspartiklar wnom provet. Som flera virioner skulle kunna infektera en enda cell, är terminologin enheter kontra vironer används under plack titreringar 1,2.

Plackmorfologi kan variera dramatiskt under olika tillväxtbetingelser och mellan virusarter. Plack storlek, klarhet, definition gränsen, och distribution bör alla noteras eftersom de kan ge värdefull information om de tillväxt- och virulensfaktorer av viruset i fråga.

Grundläggande plack analysprinciper kan även anpassas och modifieras på ett antal olika sätt, till exempel vid användning av fokusbildande analyser (FFAs). FFAs inte lita på cellysering och motfärgning att upptäcka plackbildning, utan snarare använder immunfärgning tekniker för att direkt upptäcka intracellulära virusproteiner genom taggade antikroppar. Ökad känslighet, minskad inkubationstider efter infektion, och framför allt förmågan att kvantifiera icke-lytiska virus är alla distinktafördelar när de anställer FFAs. Medan stor utsträckning, de kritiska begränsande faktorerna i FFAs kontra en traditionell plackanalys ligger i behovet av lämpliga antikroppar och förmåga att endast sond för virala proteinsubenheter versus aktuella infektiösa vironer 4.

För denna studie kommer vi att begränsa vår diskussion till klassiska plackanalyser och beskriver användningen av traditionella fasta och halvfasta över (agaros och CMC), tillsammans med nya flytande mikrokristallin cellulosa överlägg.

Protocol

1. Beredning av celler och reagenser

  1. Dagen före analysen, platt lämpliga värdceller för viruset i fråga (tabell 1 och 2) på 90-100% sammanflytning.
  2. Bered fixeringslösning av 10% formaldehyd i dH 2 O. I exempel, blanda 5,56 ml av 36% stam formaldehyd med 14,44 ml destillerat H2O (dH 2 O).
    OBS: Använd lämpliga metoder för säker hantering och ventilation vid användning av formaldehyd.
  3. Förbered kristallviolett fläck: 1% Crystal Violet (CV) i 20% etanol och dH 2 O.
  4. Förbered 2x plackmedia (celltyp beroende på 2x koncentration, se tabell 2). Filtrera med hjälp av en 0,2 ìm filter om några reagenser är inte sterila.
  5. Beredning av immobilisering över (tabell 3)
    1. För flytande över, göra en steril 2,4% lösning av Avicel i dH 2 O. För att förhindra ihopklumpning, tillsätt pulvret till en kolv innehållande vatten thvid snabbt blandning med en omrörare, häll Avicel in långsamt och rör om snabbt vid rumstemperatur (RT). När lösningen visar sig vara för viskös för en omrörare för att homogenisera, byta till en kolv shaker för> 30 min med kraftig omrörning för att säkerställa jämn homogenisering.
      NOTERA: Förrådslösningar kan göras vid lägre koncentrationer, men lösningarna får separera och kommer att behöva återblandas för att säkerställa homogenisering. Arbetslösningar av Avicel kan användas i intervallet från 0,6 till 3%.
    2. Efter homogenisering, autoklavera lösningen och lagra förseglad vid RT.
    3. För agaros och karboximetylcellulosa (CMC) över, bereda en stamlösning i dH 2 O 2% CMC eller 0,6% -ig. Blanda med en omrörare och autoklav eller mikrovågsugn för att sätta i lösningen.

2. Utspädningar och Infektioner

  1. Dagen efter plätering, visuellt kontrollera sammanflyt och livskraften hos cellerna före analysen startas. Se till standard cellulär morfologi and en ~ 90% sammanflytande monolager finns.
  2. Utför en tiofaldig serieutspädning av de infektiösa prover. Använd den cellulära tillväxtmedia för viral förökning som utspädningsmedel (tabell 2). Variera antalet spädningar som behövs på grundval av den förväntade titer av viruset i fråga, och alltid använda en icke-infekterade kontrollprov för att självständigt säkerställa cellulär viabilitet och stöd plack identifiering.
  3. Från seriespädningarna, infektera cellerna under 45 min till 1 h (tabell 1). Använd en tillräcklig volym av inokulat för att täcka cellerna, samtidigt som volymen så lågt som möjligt för att maximera viral kontakt med monolagret (tabell 4). Försiktigt stenplattor var 20 minuter för att säkerställa jämn täckning och förebygga cellmonolager från att torka.
  4. Efter infektionen, överlagra en lämplig volym av immobilisera mediet direkt till ympar i brunnen (tabell 2) med en 1: 1 blandning av 2x plack media och immobilizing lagring av val (CMC, agaros eller Avicel). Skaka för att blanda.
    1. För flytande över, blanda 1: 1 med värmde 2x plack media och 1,2-2,4% RT lager Avicel att få en arbetslösning av 0,6-1,2% Avicel överliggande mediet.
    2. För en agarosöverskikt, använd en 1: 1 blandning av uppvärmda 2x plack media och en stamlösning av uppvärmd 0,6% agaros, plats i en 56 ° C vattenbad under 30 minuter för att få samma temperatur erhålla en slutlig agaros / överkoncentration av 0,3 %.
    3. För CMC, förbereda en 2% stamlösning och behandla som beskrivits för agarosöverskikt.
    4. Vid tillämpning av överlägg till monolager, alltid jämvikt varm agaros eller CMC i en 56 ° C vatten för att förhindra skador på monolager. Kontrollera att lösningen är varm, men inte het vid beröring för att förhindra celldöd och minskad virustitrar. De flesta agaros över börjar stelna under 42 ° C, arbeta snabbt och / eller förbereda små satser för att förhindra stel vid hantering.
  5. Efter tillsats av overlay, inkubera plattorna för att producera distinkta plack som är klart kvantifierbart. Plackbildning kan ta 2-14 dagar beroende på virus som analyseras, Tabell 1.
    OBS: När vätskelagrade plattorna placeras i inkubatorn, inte flytta dem inte. Rörelse av de flytande övertäckningar under inkuberingsperioden kommer att resultera i smort plack. Agaros och CMC överlagring är halvfast och kan flyttas eller kontrolleras regelbundet under ett ljusmikroskop för att övervaka plackutveckling.

3. Fastställande och färga celler

  1. För att fixera cellerna, häll bort eller aspirera Avicel overlay, och fixera cellerna med användning av 10% -ig formaldehydlösning under 30 min till över natten (<1 ml per brunn för en 6-brunnsplatta).
    1. För agaros eller CMC, direkt lägga formaldehydlösning på overlay för 1 timme till över natten.
      NOTERA: Prov kan förvaras under utsträckta tidsperioder i fixativ förutsatt det görinte avdunstar och torkar ut eftersom detta kan snedvrida monolagret.
  2. Före färgning och efter fixering, kassera formaldehyd och ta bort halvfasta pluggar för agarosen och CMC med antingen rinnande vatten eller manuellt med en spatel. Skölj Avicel placker med vatten för att avlägsna kvarvarande överlagring / fixativ före färgning.
  3. För färgning, täcka cellerna med en minimal mängd av kristallviolettlösning i ~ 15 min. Rock plattor vid behov för att säkerställa jämn täckning.
  4. Tvätta försiktigt av kristallviolett fläcken med vatten. När fast, färgas, och torkas, lagra plack på obestämd tid för framtida analys.

4. Fastställande virustitrar

  1. Räkna plack i varje brunn, med genomsnittet för alla tekniska replikat av samma utspädning. För stora plattformat, rabatt brunnar med färre än 5 eller högre än 100 plack. Ta del av plack storlek och morfologi. Den negativa kontrollen bör ha en enhetlig monolager ochkan användas som en referenskontroll.
  2. Bestämma den virala titern av beståndet provet genom att det genomsnittliga antalet placker för en spädning och det inverterade värdet av det totala utspädningsfaktor.

Ekvation 1

NOTERA: Som ett exempel, 30 och 32 plack räknades för replikat av 1 x 10 -7 utspädning [31 (medeltal) / 10 -7 (utspädning) x 0,4 ml (inokulum)] skulle ge en titer på 7,75 x 10 8 pfu / ml.

Representative Results

Förmågan hos plackanalyser för att exakt bedöma virustitrar är beroende av ett flertal faktorer: lämpligt val värdcell, riktiga medier och tillväxtbetingelser för cellulär och viral livskraft, immobiliserade virusförökning, och en noggrann bestämning av den virala inkubationstiden för att ge företagen tid distinkt och uppräknelig plackbildning.

För denna studie har virus från tre representativa familjer valt att påvisa skillnader i: overlay val, inkubationstid och plackmorfologi över olika provtyper. Venezuelanskt hästencefalit (VEEV) valdes som en (+) ssRNA viral modell, som kan orsaka betydande sjukdom hos hästdjur och människor och representerar Togaviridae familjen. Influensa B Taiwan stam, en segmenterad (-) ssRNA virus främst infekterar människor, representerar Orthomyxoviridae familjen. Rift Valley-feber virus (RVFV), en (-) ssRNA leddjur född virus främst infekterar leddjur,idisslare och människor, valdes som representant för Bunyaviridae familjen.

För RVFV (figur 1), var titrarna bestämdes från en stamlösning av ett rekombinant levande försvagat MP12 stam av RVFV i en 12 brunnars platta format med användande av CMC, agaros, eller Avicel överlagringar som inkuberades sida-vid-sida för 72 h efter infektion (HPI). En representativ platta visar utspädningar från 10 -4 till 10 -7 kan ses i Panel A. Plattor med hjälp av CMC och agaros över visade små, klara och tydliga plack med en väldefinierad cirkulär gränsen. Plack med flytande över var något rikligare och större i jämförelse till agaros och CMC plack, och gav en mindre distinkt gräns. Virala titrar jämfördes i panel B med alla de överlag utför jämförelsevis.

För att få en tydligare visuell jämförelse mellan överlägg för MP12 tillsammans med en större provstorlek för att bestämma reprobilitet, en 6-brunnsplatta var också trialed i tre exemplar (Figur 2). I 6 brunnar format, användning av en CMC overlay visade mindre plack än antingen agaros eller flytande beläggningar, som var jämförbar i storlek till varandra. Medan virala titrar var liknande mellan alla tre överlägg (panel D), plack som bildas i agaros och flytande övertäckningar visade sig vara lättare att räkna på grund av deras ökade storlek.

I kontrast med RVFV, VEEV titrar och plackmorfologi bland de olika övertäckningar varierade markant (figur 3A). Plack som bildas i CMC över visat en tydlig och distinkt morfologi vid användning av en 12 brunnar format, på bekostnad av plackstorlek och känslighet (panel B). I motsats till CMC, användning av agaros och flytande övertäckningar resulterade i signifikant större plack, vilket tyder på lägre viral inhibering och ökad känslighet för VEEV replikering. Detta har tidigare bekräftats när enbart jämföra agaros kontra CMC i apaper publicerats av Juarez et al. 4. Medan agaros och flytande över producerade större plack än CMC hade placken dåligt definierade gränser och var svåra att räkna i en 12 bra format, med flytande över ger den största gräns diffusion. När plack trialed i 6 brunnsplattor (Figur 4), förnekade den större 6 brunnsformat frågan om öppet stora plack som var svåra att skilja på 12 bra format, med agaros och flytande över bevisar överlägsen de CMC överlägg i form av plack definition och lyhört (Figur 4D).

I jämförelse med RVFV eller VEEV ger influensa flera unika utmaningar när plaquing, till exempel kravet på en extern proteas. Känsligheten hos influensavirus till olika overlay val har också väl dokumenterade i det förflutna som väsentliga förändringar har noterats då modifieringar som mindre som olika märken av agaros har varasv använde 9.

Intressant för influensa B Taiwan stam, användning av CMC som ett över medfört betydligt mindre plack som var svåra att räkna och visade sig vara svårt att på ett tillförlitligt poäng (Figur 5A). Användningen av ett agarosöverskikt förutsatt de bästa plack (panel C), och resulterade i en mörkare bakgrundsfärgning (troligen på grund av ökad monoskikt viabilitet), och visade klarare och skarpare plack i direkt jämförelse med användningen av vätskelagring (Panel B ).

En distinkt fördel av flytande polymerer över fasta och halvfasta beläggningar, såsom agaros och CMC, ligger i lättheten att avlägsna och tillämpning. Halvfasta över kräver värme, och stel kan visa sig problematisk vid hantering och demontering. För att dra nytta av dessa fördelar och bestämma praktiska att använda Avicel i en hög genomströmning sätt för RVFV, var en platta med 96 brunnar format trialed vid varierande overlay concentrations (fig 6). För RVFV MP-12 gjordes utspädningar utfördes i fyra exemplar på både 0,6 och 1,2% slutkoncentrationer av Avicel. Heltäckande och borttagning bevisade enkelt, utan några uppenbara skillnader mellan replikat eller mellan koncentrationerna noterats, visar en hög grad av reproducerbarhet. När scoring, plack var distinkt och uppräkneliga för blotta ögat, påvisa möjligheten att utnyttja flytande över i en hög genomströmning sätt för RVFV.

Figur 1
Figur 1:. RVFV plack overlay jämförelser som använder 12-hålsplattor Veros ströks ut med 2,5 x 10 5 celler i 12-brunnsplattor och infekterades med 200 ni använder samma serieutspätt startprov MP12. Efter infektion 1,5 ml övertäckningar av 0,3% agaros, 0,6% Avicel eller 1% CMC (slutlig concentrations), har tillämpats för att direkt jämföra över vilket visas i panel A. Plack räknades och titrerades i Panel B.

Figur 2
Figur 2:. RVFV plack overlay jämförelser använder 6 brunnsplattor Veros ströks på 5 x 10 5 celler i 6-brunnsplattor och infekterades med 400 fil med hjälp av samma serieutspätt startprov MP12. Tre ml överlagringar av 0,3% agaros, 0,6% Avicel eller 1% CMC, applicerades i syfte att direkt jämföra de överlägg som visas i panel A, var B och C. Separata experiment utförs på samma sätt som beskrivits för Paneler AC, med plack räknades och titrerades i panel D (N = 3).

Figur 3
Figur 3: <strong> VEEV plack overlay jämförelser som använder 12-hålsplattor. Veros ströks ut med 2,5 x 10 5 celler i 12-brunnsplattor och infekterades med 200 ni använder samma serieutspätt start prov av VEEV TC-83 vaccinstam. Efter infektion 1,5 ml över 0,3% agaros, 0,6% Avicel, eller 1% CMC, tillämpades i syfte att direkt jämföra över vilket visas i panel A. Plack räknades och titrerades i panel B.

Figur 4
Figur 4:. V EEV plack overlay jämförelser använder 6 brunnsplattor Veros ströks på 5 x 10 5 celler i 6-brunnsplattor och infekterades med 400 fil med hjälp av samma serieutspätt börjar prov av VEEV TC-83. Efter infektion, 3 ml överlägg av 0,3% agaros, 0,6% Avicel, eller en 1% CMC, applicerades i syfte att direkt jämföra de överlägg som visati paneler A, var B och C. Separata experiment utförs på samma sätt som beskrivits för Paneler A - C med plack räknades och titrerades i panel D (N = 3).

Figur 5
Figur 5: Influensavirus plack overlay jämförelser MDCK-celler pläterades vid 5 x 10 5 celler i 6-brunnsplattor och infekterades med 400 | il av inokulum med användning av samma serieutspäddes med början prov av influensa B-Taiwan.. Nr fetalt bovint serum (FBS) användes i tillväxtmediet eller överlagringar, såsom FBS kan inhibera influensa förökning genom hämning av vissa proteaser, vilka erfordras för viral fusion. TPCK-trypsin sattes till alla över före ansökan för att underlätta viral fusion och post med värdcellerna. Efter infektion, var 3 ml överlägg av 0,3% agaros, 0,6% Avicel eller 1% CMC tillämpas i syfte att direkt jämföraöverläggen som demonstreras i panel A, B och C. Separata experiment genomfördes på samma sätt som beskrivits i paneler A - C med plack räknades och titrerades i panel D (N = 3). Medan ett genomsnitt togs för CMC plack var svåra att tillförlitligt räknas som de visat diffusa gränser och mycket små plack storlekar.

Figur 6
Figur 6:. Hög genomströmning placköverlag En 96-brunnsplatta av Veros pläterade vid 3 x 10 4 celler per brunn, infekterades med 50 | il av inokulum med användning av samma serieutspäddes med början prov av RVFV MP12 för 1 h, i fyra exemplar. För överlägg, var 0,6 respektive 1,2% slutkoncentrationer av Avicel trialed för att avgöra om det är genomförbart och reproducerbarhet utnyttja flytande över i en hög genomströmning sätt, paneler A och B.

RVFV VEEV Influensa B
Celltyp Vero Vero MDCK
Infektionsperiod 1 hr 1 hr 45 min
Inkubationstid 3 dagar 2 dagar 3 dagar

Tabell 1: plaqueanalys inokulering Villkor och celltyper

RVFV VEEV Influensa B
Celltyp Vero Vero MDCK
Tillväxt Typ DMEM 1 DMEM 1 DMEM 2
Plack Media 2xEMEM A 2xEMEM A 2xEMEM B

1. Dulbeccos modifierade Eagle-medium kompletterat med 10% fetalt bovint serum, 1% L-glutamin, 1% Penicllin / streptomycin.
2. Dulbeccos modifierade Eagles medium kompletterat med 1% L-glutamin, 1% Penicllin / streptomycin, 0,2% bovint serumalbumin, 0,025% HEPES, DEAE-dextran 50 ug / ml.
A. 2x Minimal Essential Media (500 ml) med tillsats av 5% FBS (25 ml), 1% Minimi essentiella aminosyror (5 ml), 1% natriumpyruvat (5 ml), 1% L-glutamin (5 ml), 2% Pen / Strep (10 ml).
B. 2x Minimal Essential Media (500 ml) med tillsats av 0,2% bovint serumalbumin, 1% Minimum Essential Amino Acids (5 ml), 50 ug / ml, 0,025% HEPES, DEAE-dextran, Trypsin-TPCK *
* Strax före beredning, tillsätt 1 l per 25ml 2 ug / ml lager av TPCK-trypsin till portionen som du ska använda för att blanda med agaros för plack.

Tabell 2: Plack och Viral / Cellular Growth Medias

RVFV VEEV Influensa B
Celltyp Vero Vero MDCK
Infektionsperiod 1 hr 1 hr 45 min
Inkubationstid 3 dagar 2 dagar 3 dagar

Overlay lösningar kommer inte att upphöra när de görs så länge som sterilitet bibehålls.

Tabell 3: Överlägg Stock

6 väl 12 väl 96 väl
# Av celler / brunn 5 x 10 5 2,5 x 10 5 3 x 10 4
Volym innoculum (pl) 400 200 50
volymen av överlagring (ml) 3 1,5 0,100

Tabell 4: Tallriksformat

Discussion

Den mest kritiska faktorn för en framgångsrik plackanalys ligger i optimeringen av protokollet för den speciella virusodling i fråga som villkor kan variera kraftigt. Viktiga punkter att ta hänsyn till är: värd cellulär kompatibilitet med viruset i fråga, lämpliga virala tillväxtförhållanden, tillräckliga utspädnings intervall för att tydligt skilja plack, och korrekt över val och färgning för celler och virus i fråga.

Medan VEEV och RVFV båda växa under mycket likartade förhållanden som använder många av samma typer värdcell, skillnader i plackmorfologi och tillväxt kinetik varierar kraftigt. Vid användning av Vero-celler för plackanalyser, som traditionellt har använts som en förökning och indikator cellinje för hemorragisk febervirus och alfavirus, växer VEEV normalt till högre titrar än RVFV och visar ökad replikering kinetik, utveckla stora enhetliga plack vid 48 hpi 4, ett0-12. I motsats till VEEV kräver RVFV 72 hpi och visar plack som normalt mycket mindre och varierar i storlek.

I opposition till RVFV och VEEV är influensavirus starkt värdcellsspecifika och kan vara svårt att utbreda sig genom vävnadsodling. För influensavirus, är viralt inträde och fusion normalt initieras genom bindning av cellytreceptor med det virala glykoproteinet hamagglutinin (HA), som medierar inträdet i målcellen genom bindning med värdcellens α-sialinsyra ytreceptor. HA är en trimer glykoprotein som är närvarande i membranhölje av alla Influensavirus och kräver klyvning in i subenheterna HA1 och HA2 med en specifik värdcell proteas. För att ytterligare komplicera frågan, kan dessa klyvningsställen varierar ofta mellan virusstammar 13. Som ett uttryck för proteaser kan klyva HA är begränsad till specifika vävnader, proteaser are ofta läggs till cellodlingsmedier för att underlätta viral fusion och inträde i den utvalda värdcellen 13. TPCK-trypsin är ett exempel på ett allmänt använt proteas som används i cellodling med både MDCK och Vero-celler: att underlätta multicykelreplikation (i frånvaro av någon trypsin inaktiveserum) genom proteolytisk aktivering av viralt HA 14,15.

Som visats i denna studie och andra, kan skillnader i virala livscykler påverkar overlay val, tallriksformat och uppsamlingstider, med betydande variationer mellan olika klasser och arter av virus. I vår studie agaros över visade tydligare plack vid högre titrar än både CMC eller flytande överlägg för både RVFV och influensa B-virus, stärka dess användbarhet hos ett brett spektrum av virus och celltyper. Med hjälp av en låg slutlig koncentration av agaros stor nytta i att ta bort de fasta pluggar och förenklad färgning. CMC övergripande visat poorest effektivitet som ett över för alla tre testade virus och producerade mycket små och otydliga plack för influensa B-virus. Även om den totala CMC visade de minst önskvärda egenskaper, dess användning i snabbväxande och mycket virulenta virus skulle kunna visa sig fördelaktigt, eftersom det gjorde verkar kunna minska plackstorleken med endast en minimal minskning i titer. Vätske overlay visade sig vara den mest mångsidiga i att det var mycket enkel att förbereda, ökad användarvänlighet och var jämförbar med agaros över alla de virus som selekterats. I en högre genomströmning 96-brunnars plattformat, applicering och borttagning inhiberades inte på grund av stelning som med traditionella övertäckningar, och förutsatt exakta och konsekventa resultat. En övervägande vid användning av flytande över ligger i opaka färg och oförmåga att övervaka plackbildning eftersom plattorna inte kan flyttas fram till tidpunkten för insamling, begränsar denna anpassning till virus med tidigare karakteriserade replikering kinetik.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
6-well CellStar plate for tissue culture Greiner Bio-One 658 160
12-well CellStar plate for tissue culture Greiner Bio-One 665 180
96-well CellStar plate for tissue culture Greiner Bio-One 655 180
96-2ml deep well plate USA Scientific C15046314 For serial dilutions
DMEM Quality Biologicals 112 013 101 Cell Media/Diluent
2x EMEM for plaques Quality Biologicals 115 073 101 Warm to 37 °C
MEM 100x  Cellgro 25 025 Cl
Sodium Pyruvate  Cellgro 25 000 Cl
Penicillin Streptomycin Gibco 15140 122
L-Glutamine Gibco 25030 081
HyClone FBS  Thermo Scientific SH30910.03 Heat inactivate before use at 62 °C for 30 min
Bovine Serum Albumin Sigma Aldritch A7030-50G
Trypsin TPCK Sigma Aldritch T1426-50mg Make aliquots/Avoid freeze thawing
HEPES  Gibco 15630-080
DEAE-Dextran Sigma Aldritch D9885-10G
Crystal Violet Sigma Aldritch C3886-25G
Formaldehyde Solution Sigma Aldritch F8775-500ml
Ethanol denatured Reagent Grade Sigma Aldritch 362808-1L
Avicel RC-591 NF FMC BioPolymer USA RC-591 NF Shake vigorously when reconsitiuting  for >30 min to homogenize
UltraPure Agarose  Invitrogen 16500-100
Carboxymethyl cellulose, Sodium Salt Medium Viscosity  Sigma Aldrich C4888

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Cooper, P. D. The plaque assay of animal viruses. Adv. Virus Res. 8, 319-378 (1961).
  2. Dulbecco, R., Vogt, M. Some problems of animal virology as studied by the plaque technique. Cold Spring Harb. Symp. Quant. Biol. 18, 273-279 (1953).
  3. Hartley, J. W., Rowe, W. P. Tissue culture cytopathic and plaque assays for mouse hepatitis viruses. Proc. Soc. Exp. Biol. Med. Soc. Exp. Biol. Med. N. Y. 113, 403-406 (1963).
  4. Juarez, D., Long, K. C., Aguilar, P., Kochel, T. J., Halsey, E. S. Assessment of plaque assay methods for alphaviruses. J. Virol. Methods. 187, 185-189 (2013).
  5. Shurtleff, A., Keuhne, A., Biggins, J., Keeney, A. Use of alternative overlays in plaque assays. USAMRIID. Fort Detrick, MD USA. (2011).
  6. Shurtleff, A. C., et al. Standardization of the Filovirus Plaque Assay for Use in Preclinical Studies. Viruses. 4, 3511-3530 (2012).
  7. Matrosovich, M., Matrosovich, T., Garten, W., Klenk, H. -D. New low-viscosity overlay medium for viral plaque assays. Virol. J. 3, 63 (2006).
  8. Klebe, R. J., Harriss, J. V. A technically simple ‘non-lethal’ vital staining procedure for viral plaque and cell transformation assays. Arch. Virol. 81, 359-362 (1984).
  9. Gaush, C. R., Smith, T. F. Replication and plaque assay of influenza virus in an established line of canine kidney cells. Appl. Microbiol. 16, 588-594 (1968).
  10. Abiko, C., et al. Outbreak of Human Metapneumovirus Detected by Use of the Vero E6 Cell Line in Isolates Collected in Yamagata, Japan, in 2004 and 2005. J. Clin. Microbiol. 45, 1912-1919 (2004).
  11. Baer, A., et al. Induction of DNA damage signaling upon Rift Valley fever virus infection results in cell cycle arrest and increased viral replication. J. Biol. Chem. 287, 7399-7410 (2012).
  12. Austin, D., et al. p53 Activation following Rift Valley Fever Virus Infection Contributes to Cell Death and Viral Production. PLoS ONE. 7, (2012).
  13. Böttcher-Friebertshäuser, E., Stein, D. A., Klenk, H. -D., Garten, W. Inhibition of influenza virus infection in human airway cell cultures by an antisense peptide-conjugated morpholino oligomer targeting the hemagglutinin-activating protease TMPRSS2. J. Virol. 85, 1554-1562 (2011).
  14. Youil, R., et al. Comparative study of influenza virus replication in Vero and MDCK cell lines. J. Virol. Methods. 120, 23-31 (2004).
  15. Tobita, K., Sugiura, A., Enomoto, C., Furuyama, M. Plaque assay and primary isolation of influenza a viruses in an established line of canine kidney cells (MDCK) in the presence of trypsin. Med. Microbiol. Immunol. (Berl.). 162, 9-14 (1975).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics