Porøs Silicon Mikropartikler for levering av siRNA Therapeutics

* These authors contributed equally
Bioengineering

Your institution must subscribe to JoVE's Bioengineering section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Summary

Levering er fortsatt den viktigste utfordringen for den terapeutiske gjennomføring av små RNA forstyrrende (siRNA). Denne protokollen innbefatter bruken av en multifunksjonell og biokompatibelt siRNA levering plattform, bestående av arginin og polyetylenimin podet porøse silisium mikropartikler.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Shen, J., Wu, X., Lee, Y., Wolfram, J., Yang, Z., Mao, Z. W., Ferrari, M., Shen, H. Porous Silicon Microparticles for Delivery of siRNA Therapeutics. J. Vis. Exp. (95), e52075, doi:10.3791/52075 (2015).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Introduction

Små interfererende RNA (sirnas) er dobbelt-RNA-molekyler som kan undertrykke uttrykket av gener. I de senere årene har sirnas blitt utviklet som en ny generasjon av biodrugs som viser terapeutisk potensial for fremtidig bruk i kliniske applikasjoner 1-5. Men fortsatt er vellykket implementering av siRNA terapi en betydelig utfordring, på grunn av nedbrytning av nukleaser, dårlig intracellulære opptaket, lav transfeksjonseffektivitet og ineffektiv utgivelse fra endosomet / lysosomet 5. Mange av disse hindringer kan overvinnes ved utvikling av levering plattformer, som sikkert og effektivt kan levere siRNA til sykt vev. Sammenlignet med virusbærere, ikke-virale plattformer gir flere fordeler, for eksempel sikkerhet, lave kostnader og enkel skreddersøm. Spesielt kationiske nanopartikler, så som polymerer og lipider, har vist seg nyttig for siRNA levering 3.

Tidligere har vi utviklet en skiveformede drug leveringssystem, betegnet flertrinns vektor (MSV). Denne plattformen er basert på sekvensielle trinn, hvor ett kjøretøy er frigjort fra hverandre. Det første trinn kjøretøy er en mikropartikkel laget av biologisk nedbrytbare porøse silisium (PSI), mens den andre fasen kjøretøyer er nanopartikler ladet med medikamenter eller kontrastmidler 6,7. Nanopartikler, som er innebygd i PSI materiale, er gradvis utgitt som Si degraderer 8. En fordel med å bruke Si partikler er at morfologi og overflateegenskaper kan enkelt tilpasses for å oppnå optimal biodistribusjon og narkotika utgivelse. Nylig ble den vellykkede bruk av MSV-plattform for levering av siRNA liposomer til tumorvevet vist i en ovarian og brystkreft musemodell 9, 10.

I dette arbeidet har vi fabrikkert en universell levering system for siRNA basert på prinsippene i MSV-plattformen. Effekten av dette avgivelsessystemet har tidligere blitt demonstrert ossing forskjellig siRNA molekyler 11. Systemet er et polykation-funksjonalisert porøs silisium (PCPS) bærer, som består av PSI podet med polyetylenimin (PEI) og arginin (Arg). PEI kan hjelpe til å danne elektrostatiske interaksjoner med siRNA, mens Arg og PSI kan tjene til å redusere giftigheten av PEI, som tidligere demonstarted 11. I tillegg kan tilstedeværelsen av PEI bistå i intracellulært opptak og endosomale flukt, mens psi mikropartikler mulig siRNA beskyttelse og forlenget frigivelse. PSI partiklene gradvis nedbrytes under fysiologiske betingelser, for derved å resultere i dannelsen av Arg-PEI / siRNA nanopartikler (figur 1), som har en distinkt morfologi og en smal størrelsesfordeling 11. For detaljer om stabiliteten i PCPS / siRNA system, henvises til studiet av Shen et al. 11. Dette PCPS plattformen skiller seg fra konvensjonell MSV, siden de andre scenenanopartikler ikke er i utgangspunktet present i transportøren, men dannes over tid som første-trinns bærer degraderer 11, 12. Den siRNA lasteeffektivitet, cytotoksisitet og genet stanse effektiviteten av PCPS systemet har blitt evaluert in vitro. Transfeksjonseffektiviteten ble målt ved hjelp av siRNA mot ataxia telangiectasia mutated (ATM) onkogen, som er involvert i DNA-reparasjon 10. Tidligere har undertrykkelse av ATM blitt vist å redusere tumorvekst i en brystkreftmodell 10.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. PCPS Particle Forberedelse

  1. Oksydere ikke-funksjonaliserte porøse silisiumpartikler i en 30% oppløsning av hydrogenperoksyd ved 95 ° C i 2 timer. Aminere de oksyderte partikler som i 2% (3- aminopropyl) trietoksysilan løsning i isopropylalkohol i 2 dager ved 65 ° C med forsiktig omrøring.
  2. Sentrifuger løsningen i 30 minutter ved 18800 xg og vaske partiklene to ganger i isopropylalkohol og tre ganger i etanol, ved hjelp av korte ultralydbehandling for å suspendere pelleten. La partiklene i etanol løsning når du utfører trinn 1.3 og 1.4.
  3. Legg til et kjent volum av suspensjon partikkel (for eksempel 10 mikroliter) til 10 ml isoton fortynningsmiddel og telle partikler med en partikkeltelling analysator for å bestemme konsentrasjonen av partikler i stamløsningen.
  4. Aktivere syregruppen av L-arginin (0,1 nmol) med N - (3-dimetylaminopropyl) - N'-etylkarbodiimidhydroklorid (EDC, 0,1 nmol) / N
  5. I korthet sonikere partikkelstamoppløsning og tilsett 1 milliard partikler til L-arginin løsningen og la reaksjonsblandingen i 18 timer ved romtemperatur med forsiktig omrøring.
  6. Aktivere den første asparaginsyre gruppe av N - (tert-butoksykarbonyl) -L-asparaginsyre (Boc-Asp-OH, 1 nmol) med EDC (0,1 nmol) / NHS (0,1 nmol) i 20 ml etanol i 4 timer ved 4 ° C under forsiktig omrøring.
  7. Oppløs 50 mg polyetylenimin i 10 ml etanol og tilsett løsningen til Boc-Asp-OH-blanding. La reaksjonen forløpe i 24 timer ved romtemperatur med forsiktig omrøring.
  8. Aktivere den andre asparaginsyre gruppe av Boc-Asp-OH / PEI-løsning med EDC (0,1 nmol) / NHS (0,1 nmol) ved 4 ° C i 6 timer under forsiktig omrøring.
  9. For å få PCPS partikler, legge partikkel løsning fra trinn 1.5 inn i Boc-Asp-OH / PEI løsning fra trinn 1.8. Tillat reaksjonen å forløpe i 18 timer ved romtemperatur med forsiktig st irring.
  10. Sentrifuger løsningen i 30 minutter ved 18800 xg og vaske partikkel løsningen tre ganger med etanol, ved hjelp av korte ultralydbehandling for å suspendere pelleten.

2. PCPS Particle Karakterisering

  1. Måle størrelsen av partiklene ved hjelp av et scanning elektronmikroskop (SEM).
    1. Plasser en dråpe partikkel suspensjon (10.000 partikler / mikroliter i etanol) på en ren silika SEM prøve spire og la tørke ved RT under vakuum.
    2. Mål SEM bilder på 8 kV med en 3-5 mm arbeidsavstand ved hjelp av en in-linse detektor.
  2. Måle zeta-potensialet for partiklene med en partikkelanalysesystem.
    1. Bland 10 ul av partikkelsuspensjonen (10 000 partikler / ul i etanol) med 1 ml 10 mM fosfatbuffer (pH 7,4).
    2. Laste prøven i foldet kapillær celler og måle zeta potensialet i henhold til produsentens instruksjoner.
le "> 3. Lasting av siRNA inn PCPS Partikler

  1. Tørk de PCP-partikler (fra PCPS Partikkelfremstilling trinn 1.9) under vakuum, O / N.
  2. Legg siRNA (4 mikrogram) i nukleasefritt vann (20 mL) til de tørkede PCPS partikler og sonikere kort. Bruk følgende partikkel til siRNA forholdstall: 2 × 10 5 partikler / 0,2 mikrogram siRNA, 4 × 10 5 partikler / 0,2 mikrogram siRNA, 6 × 10 5 partikler / 0,2 mikrogram siRNA, 8 × 10 5 partikler / 0,2 mikrogram siRNA, 10 × 10 5 partikler / 0,2 mikrogram siRNA og 12 × 10 5 partikler / 0,2 mikrogram siRNA.
  3. Inkuber i 3 timer ved 4 ° C på en ristemaskin (1000 opm) for å tillate siRNA binding til partiklene.

4. Optimalisering av siRNA / PCPS Partikkel Ratio

  1. Legg DNA lasting fargestoff til 20 mL av de PCPS / kontroll siRNA partikler med forskjellig partikkel til siRNA forholdstall (se lasting av siRNA inn PCPS partikler).
  2. Laste sampler inn i en 2% agarosegel inneholdende DNA-gel flekken.
  3. Utføre elektroforesen ved en konstant spenning på 120 V i 20 minutter i rennende buffer.
  4. Analyser gel med bilde oppkjøpet og analyseprogramvare.

5. Slipp av siRNA fra PCPS Partikler

  1. Bland 20 ul av de PCPS / kontroll siRNA partikler med forskjellig partikkel til siRNA-forhold (se trinn 3) i natriumdodecylsulfat (SDS, 2%) og la stå i 1 time ved RT.
  2. Legg DNA lasting fargestoff til prøvene.
  3. Belastningsprøver inn i en 2% agarosegel inneholdende DNA-gel flekken.
  4. Utføre elektroforese på en konstant spenning på 120 V i 20 min i buffer ved hjelp DNA elektroforese utstyr og en strømforsyning.
  5. Analyser gel med bilde oppkjøpet og analyseprogramvare.

6. Konfokalmikroskopi av PCPS Partikler

  1. Tilsett 5 mL av PCPS / fluorescerende kontroll siRNA partikler (10 × 10 5 partikler / 0.2 mikrogram siRNA / 20 fil) til et glass dekkglass.
  2. Visualisere partikkel lag ved konfokalmikroskopi.

7. Karakterisering av Arg-PEI / kontroll siRNA Nanopartikler

  1. Å nedbryte silikonmaterialet og danne Arg-PEI / kontroll siRNA nanopartikler, tilsett PCPS / siRNA partikler (10 x 10 6 PCPS partikler / 2 ug siRNA) til 100 ul av fosfatbufret saltvann og rist (1000 rpm) ved 37 ° C i 2 dager.
  2. Sentrifugere prøven i 30 minutter ved 18800 xg og samle supernatanten.
  3. Måle størrelsen på de dannede Arg-PEI / siRNA nanopartikler med dynamisk lysspredning (DLS).
    1. Bland 10 ul av supernatanten med 1 ml 10 mM fosfatbuffer (pH 7,4) og plasseres i en plast kyvette.
    2. Måle størrelsen av partiklene ved hjelp av et partikkelanalysesystemet i henhold til produsentens instruksjoner.
  4. Bestemme størrelsen og morfologien til det dannede Arg / PEI-siRNAnanopartikler med atomic force mikroskopi.
    1. Ta 10 mL av supernatanten og sted på en silisiumskive.
    2. Visual partiklene med atomic force mikroskopi (AFM).

8. Cell Culture

  1. Kultur MDA-MB-231 human brystcancer-celler i cellekulturmedium supplert med 10% føtalt bovint serum og 1% penicillin-streptomycin ved 5% CO2, 95% luftfuktighet og 37 ° C.

9. Konfokalmikroskopi av levende celler med PCPS Partikler

  1. Plate-celler i 2-brønners kultur glir på en seeding tetthet på 3 x 10 5 celler / brønn i 24 timer.
  2. Legg PCPS partikler lastet med fluorescerende kontroll siRNA (10 × 10 5 partikler / 0,2 mikrogram partikkel til siRNA ratio, 50 nM siRNA) til cellene.
  3. Ta opp en film av cellene med et konfokal mikroskop (følger med et kammer, 5% CO 2, 95% luftfuktighet og 37 ° C) i 12 timer etter partikkel exposikker.

10. Konfokalmikroskopi av Faste Celler med PCPS Partikler

  1. Plate-celler i 2-brønners kultur glir på en seeding tetthet på 3 x 10 5 celler / brønn i 24 timer.
  2. Legg PCPS partikler lastet med fluorescerende styre siRNA (10 x 10 5 partikler / 0,2 ug partikkel til siRNA-forhold, 50 nM siRNA) til cellene og inkuberes i 1 dag, 7 dager og 10 dager.
  3. Vask cellene to ganger med fosfat-bufret saltvann, og deretter feste dem med 4% paraformaldehydløsning i 10 min.
  4. Vask cellene med fosfatbufret saltvann.
  5. Permeabilisere cellene med 0,1% oktylfenol-etoksylat i 10 minutter og deretter vaske dem tre ganger med fosfat-bufret saltvann.
  6. Blokkere cellene med albumin fra bovin serum (10 mg / ml) i fosfatbufret saltvann i 10 minutter ved RT under forsiktig omrøring.
  7. For å visualisere trådformede aktin, inkuberes cellene med fluorescensmerket phalloidin (1 pl / 40 ulblokkeringsløsning) i 20 minutter ved romtemperatur med forsiktig omrøring, og deretter vaskes i fosfatbufret saltvann.
  8. Fjern lysbilder fra rammen og legge antifade reagens med 4 ', 6-diamidino-to-phenylindole (DAPI) for å visualisere kjernen.
  9. Legg et dekkglass på toppen og ta bilder av cellene med konfokal mikroskopi.

11. flowcytometrisystemer av Celler med PCPS / lysrør Kontroll siRNA Partikler

  1. Plate-celler i en 6-brønns plate ved en densitet på 3 seeding x 10 5 celler / brønn i 24 timer.
  2. Legg PCPS partikler lastet med fluorescerende styre siRNA (10 x 10 5 partikler / 0,2 ug partikkel til siRNA-forhold, 50 nM siRNA) til cellene og inkuberes i 24 timer.
  3. Vask cellene med fosfatbufret saltvann, og skrape dem med en celleskrape.
  4. Lagring av celler i fosfat-bufret saltløsning med 2% bovint fosterserum forut for analysen. Bruke ubehandlede celler som en negativ kontroll.
  5. Utføre flyt cytometry.

12. Cell Livskraftig av Celler med PCPS Partikler og PCPS / kontroll siRNA Partikler

  1. Plate-celler i en 96-brønns plate ved en celletetthet på 3 x 10 3 celler / brønn i 24 timer.
  2. Behandle cellene med PCPS partikler (1,5 × 10 5 / brønn og 6 × 10 5 / brønn) eller PCPS / kontroll siRNA partikler (10 × 10 5 partikler / 0,2 mikrogram partikkel til siRNA ratio, 10 nM og 100 nM siRNA) for 48 hr og 72 timer. Bruke ubehandlede celler og celler behandlet med fosfat-bufret saltvann (samme volum som de tilsatte partikler) som kontroller. Analyser hver prøve in triplo.
  3. Utfør en celleproliferasjonsanalyse henhold til produsentens instruksjoner.
  4. Representerer data som gjennomsnitt ± standardavvik.

13. Western Blot av Celler med PCPS / ATM mutert siRNA Partikler

  1. Plate-celler i en 6-brønns plate ved en celletetthet 2 x 10 5 celler / well i 24 timer.
  2. Inkuber cellene med PCPS / kontroll siRNA (50 nM) partikler eller PCPS / ATM siRNA (50 nM) partikler i 72 timer. Bruke ubehandlede celler som en kontroll.
  3. Lyse av cellene ved bruk av et protein ekstraksjon reagens supplert med protease inhibitor cocktail.
  4. Sentrifuger cellelysater i 10 minutter ved 14000 xg og gjenvinne supernatanten.
  5. Bestem proteinkonsentrasjonen med et protein kvantifisering assay i henhold til produsentens instruksjoner.
  6. Legg prøveladningsbuffer (med 5 pl 2-merkaptoetanol / ml buffer) til prøvene og varme dem i 6 minutter ved 99 ° C.
  7. Laste proteinprøver (20 ug / ul) i en 12% SDS-polyakrylamid-gel i rennende buffer og utføre polyakrylamidgelelektroforese (1 time, 120 V) ved hjelp av elektroforese utstyr og en strømforsyning.
  8. Overfør gelen i overføringsbuffer (med 20% metanol) til en nitrocellulosemembran (1 time, 100 V) ved hjelp av elektroforese utstyren strømforsyning.
  9. Blokkere membran med 5% tørrmelk for 1 time.
  10. Inkuber membran med ATM primære antistoff (fra kanin) i blokkeringsløsning (fra trinn 13.9) ved en 1: 1000 fortynning O / N.
  11. Vask membranen med fosfatbufret saltvann inneholdende 0,1% polyetylenglykol-sorbitan-monolaurat, og deretter inkubere den med sekundært antistoff (anti-kanin) i blokkeringsløsning (fra trinn 13.9) ved en 1: 2500 fortynning i 1 time.
  12. Vask membranen med fosfatbufret saltvann inneholdende 0,1% polyetylenglykol-sorbitan-monolaurat, og påvise proteinbåndene med Western blot deteksjonsreagensen hjelp bildeopptak og analyseprogramvare.
  13. For lasting kontroll, vaske membranen og gjenta trinn 13,9 til 13,12 ved hjelp av en β-aktin primær antistoff (fra mus, 1: 10.000 fortynning) og en sekundær antistoff (anti-mus 1: 4000 fortynning).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Denne protokollen beskriver anvendelsen av et ikke-virale leveringssystem for sikker og effektiv siRNA transfeksjon. SEM-resultater viser at de PCPS partiklene er sylindrisk i form og har en diameter på 2,6 um (figur 2A). Partiklene blir positivt ladet med et zeta potensial på omtrent 8,21 (figur 2B), for derved å muliggjøre elektrostatisk binding med negativt ladede nukleotider. Konfokale bilder av forskjellige lag av PCPS partiklene viser at fluorescerende kontroll siRNA er lagt inne i et porøst silisiumpartikler (figur 2C). Dannelse og frigjøring av Arg-PEI / siRNA nanopartikler fra PSI partikler ble bekreftet med DLS og AFM. Størrelsesfordelingen av partiklene varierte 70-120 nm, med en gjennomsnittlig størrelse på 94 nm (figur 2D). AFM bilder illustrerer at nanopartikler har en sfærisk form (figur 2E).

Den Ratio av partikler til siRNA ble optimalisert ved agarosegelelektroforese for å sikre høy bindingsaffinitet (figur 3A). Et bredt spekter av partikkel til siRNA-forhold ble brukt (2 x 10 5, 4 x 10 5, 6 x 10 5, 8 x 10 5, 10 x 10 5 og 12 × 10 5 /0.2 mikrogram siRNA). Resultatene tyder på at siRNA kan binde tett til partiklene når partikkel mengden er over 8 x 10 5. Et forhold på 10 x 10 5 PCPS / 0,2 ug siRNA ble valgt for videre eksperimenter. Videre siRNA ble vellykket frigjort fra bæreren ved behandling med SDS, som vist i figur 3B.

Deretter ble kjellerinternalisering av PCP / fluorescerende kontroll siRNA partikler evaluert i MDA-MB-231-celler. Konfokale bilder tatt etter 24 timers behandling viser at partiklene effektivt internalisert inn i celler (figur 4 Figur 5 viser at 89% av cellene har internalisert PCPS / siRNA partikler etter 24 timers inkubasjon. Videre ble det intern prosessen innspilt i 12 timer (video 1). Disse resultatene indikerer at de PCPS partikler kan effektivt levere siRNA inn i celler. Den langsiktig oppbygging av siRNA inne i cellene ble også evaluert av konfokal mikroskopi. På dag 7 og dag 10 siRNA var fremdeles detekterbare inne i cellene (figur 6).

En av de viktigste faktorene for å vurdere ved utvikling av et siRNA leveringssystem er sikkerheten til transportøren 13. PEI er kjent for å danne polyplexes med siRNA, hjelp i cellulært opptak og utløse frigjøring fra endosomet / lysosomet. Imidlertid PEI kan ha en toksisk virkning, på grunn av tilstedeværelsen av positivt ladede primære aminogrupper i ryggraden 14,15. For eksempel, PEI binding til glycocalyx på celleoverflaten kan resultere i at fooversikt over den store klynger 16. For å eliminere denne charge-indusert toksisitet, ble PEI kovalent konjugert til arginin gjennom en bro linkeren, for å redusere antallet av primære aminogrupper. Den celleviabilitet forble over 95% etter 48 timer og 72 timer når partikler og siRNA ble anvendt i en konsentrasjon på opp til 6 x 10 5 / brønn og 100 nM, respektivt (figur 7A). Deretter ble transfeksjon effekt av siRNA mot oncogenet ATM evaluert i MDA-MB-231-celler. Western blot resultater viser at protein nivåer av ATM er redusert etter behandling med PCPS / ATM siRNA (Figur 7B). Resultatene tyder på at PCPS Plattformen er en trygg og effektiv levering system for siRNA.

Figur 1
Figur 1. Skjematisk fremstilling av polykation-funksjon porøst silisium (PCP) partikler. sterk> Arginin (Arg) -polyethylenimine (PEI) / små RNA interfererende (siRNA) nanopartikler dannes som følge av nedbrytning av silisium (Si).

Figur 2
Figur 2. Karakterisering av PCPS-partikler. (A) Scanning elektronmikroskopi (SEM) bilde av PCPS-partikler. (B) Zeta-potensialet av PCPS-partikler. (C) konfokale bilder av forskjellige lag av PCPS / fluoriserende styre siRNA partikler. (D) Størrelsesfordeling av de arginin Arg-PEI / kontroll siRNA nanopartikler som frigjøres fra de porøse silisiummikropartikler. (E) Atomic force mikroskopi (AFM) bilder av Arg-PEI / kontroll siRNA nanopartikler. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

ve_content "fo: keep-together.within-side =" always "> Figur 3
Figur 3. Agarose-gel for optimalisering av PCPS / siRNA leveringssystem. (A) Binding affinitet mellom PCPS partikler og kontrollere siRNA. Bandene representerer ubundet siRNA. (B) siRNA meldingen etter inkubasjon med 2% SDS for 1 time. Bandene representerer total siRNA (ubundet og bundet). Prøve 1: siRNA; sample 2: 2 × 10 5 PCPS partikler / 0,2 mikrogram siRNA; Prøve 3: 4 × 10 5 PCPS partikler / 0,2 mikrogram siRNA; sample 4: 6 × 10 5 PCPS partikler / 0,2 mikrogram siRNA; sample 5: 8 × 10 5 PCPS partikler / 0,2 mikrogram siRNA; sample 6: 10 × 10 5 PCPS partikler / 0,2 mikrogram siRNA; sample 7: 12 × 10 5 PCPS partikler / 0,2 mikrogram siRNA.

75 / 52075fig4.jpg "/>
Figur 4. Confocal mikroskop bilder av PCPS / fluorescerende siRNA partikler (røde) i MDA-MB-231 celler (24 hr ruge). Kjernen og trådformede aktin ble visualisert med 4 ', 6-diamidino-to-phenylindole (DAPI, blå ) og phalloidin (grønn), henholdsvis. Tre forskjellige lag ble fotografert (øverst, midten og basal). Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figur 5
Figur 5. Kvantitativ strømningscytometri-analyse av fluorescerende MDA-MB-231-celler etter inkubasjon med PCPS / kontroll fluorescerende siRNA partikler. Ubehandlede celler ble anvendt som en negativ kontroll. 89% av cellene hadde internalisert partiklene.

igur 6 "src =" / files / ftp_upload / 52075 / 52075fig6.jpg "/>
Figur 6. Confocal bilder av fluorescerende kontroll siRNA (rød) inne MDA-MB-231 celler. Cellene ble inkubert med PCPS / fluorescerende kontroll siRNA partikler for en dag, 7 dager og 10 dager. Celler ble deretter visualisert med konfokal mikroskopi. Kjernen og trådformede aktin ble visualisert med 4 ', 6-diamidino-to-phenylindole (DAPI, blå) og phalloidin (grønn), henholdsvis. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figur 7
Figur 7. Cellenes levedyktighet og genet Slå in vitro. (A) En celleviabilitet analyse av celler inkubert med PCPS partikler og PCPS / kontroll siRNA partikler (SCR). Forsøket ble utført i turlicate og resultatene er presentert som gjennomsnitt ± standardavvik. Ubehandlede celler (tomme) og celler inkubert med PBS ble anvendt som kontroller. (B) Western blot av PCPS / ataksi telangiectasia mutert (ATM) siRNA partikler. Celler ble utsatt for PCPS / kontroll siRNA (SCR) partikler og PCPS / ATM siRNA partikler. Ubehandlede celler (mock) ble anvendt som en kontroll. β-aktin ble benyttet som en lastekontroll.

Video 1 . Tidsavhengig opptak av PCPS / fluorescerende kontroll siRNA partikler i live-MDA-MB-231 celler. Videoen ble spilt inn i 12 timer etter utsette cellene til partikler.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Denne protokollen beskriver en fremgangsmåte for en vellykket levering og transfeksjon av siRNA inn i celler. Spesielt er levering av siRNA oppnås ved hjelp av en multifunksjonell plattform bestående av polykation-funksjonalisert psi partikler. Bruk av siRNA terapi har stort potensial, for eksempel, kreftbehandling, som ulike onkogener kan være målrettet med høy spesifisitet. Derfor er det et krav om å utvikle siRNA levering kjøretøy, noe som kan redusere utfordringene i siRNA terapi. Avslutningsvis har vi skissert en protokoll som viser løfte om sikker og effektiv levering av siRNA. Men det er noen viktige faktorer som bør tas i betraktning når du utfører den beskrevne teknikken. For eksempel er en viktig faktor når fremstilling av PCPS-partikler til å håndtere siRNA forsiktig, for å unngå nedbrytning av nukleaser. Spesielt rene hansker og RNAse gratis rør og vann bør brukes til enhver tid når du arbeider medsiRNA. Dersom siRNA transfeksjon effekt er lav, kan en spray som fjerner RNAse forurensning brukes til å sprøyte hansker og arbeidsområder. I tillegg, hvis den ikke er vellykket transfeksjon, siRNA skal testes med en kommersiell transfeksjon reagens, for å finne ut om problemet er forårsaket av siRNA eller partiklene. En annen kritisk faktor for en vellykket gjennomføring av PCPS / siRNA levering systemet er å ta vare når du utfører sentrifugering og vasketrinn. Nemlig bør supernatanten bli fullstendig fjernet for å fjerne overskudd av reagenser som er nødvendige i hele partikkelfremstillingstrinnene.

En viktig fordel av PCPS / siRNA leveringssystem er sikkerhet. Flere siRNA transfeksjon midler har høy kationisk ladning, noe som bidrar til cellulær toksisitet 13,15. Faktisk, de fleste kommersielle protokoller viser at reagenser skal inkuberes med cellene i bare noen få timer, for å unngå celledød. Tvert imot, cells kan bli utsatt for de PCPS partikler i flere dager uten noen tegn på toksisitet, som det fremgår av cellenes levedyktighet resultater. De PCPS partikler kan binde siRNA med høy affinitet på grunn av tilstedeværelsen av PEI. Men lade-indusert toksisitet av PEI er forhindret av den unike oppsett av avleveringsplattformen. Spesielt den kovalente binding av Arg til PEI og innkapsling av PEI inne i Si porene bidrar til redusert toksisitet. En annen fordel av PCPS plattformen er at siRNA transfeksjon kan finne sted i nærvær av serum. Andre eksisterende fremgangsmåter krever vanligvis anvendelse av serumfritt cellekulturmedium, for derved å legge til ekstra trinn i prosessen transfeksjon og potensielt forstyrre jevncellesignalveier.

En ekstra fordel med PCPS systemet er at det ikke krever noen endring av siRNA-molekyler. Mens noen aktuelle metoder krever kompliserte konjugeringspartnere tiltak for å stabilisere siRNA eller å aktivere cellular intern 13, stoler PCPS system på enkel blanding for siRNA lasting. Bindingen til PEI og porene i Si materiale gir et beskyttende miljø for siRNA, og dermed redusere kontakt med nukleaser. De PCPS partiklene kan lagres i lengre tidsperioder som tørket materiale, eller i isopropylalkohol. Videre, hvis de PCPS / siRNA partikler er lyofilisert de kan lagres i minst tre måneder ved 4 ° C. De lyofiliserte PCPS partikler skal suspenderes i RNase fritt vann rett før transfeksjon, og bør ikke lagres i oppløsning. Endelig PCPS plattform tillater vedvarende frigivelse av siRNA, som tidligere rapportert 11, og følgelig å øke tidsperioden da målgener forblir undertrykket. Følgelig, etter cellulær internalisering, Si partikler gradvis brytes ned, noe som resulterer i dannelsen av Arg-PEI / siRNA nanopartikler. Deretter blir siRNA sakte utgitt i cytoplasma, der det kan binde seg til messenger RNA (mRNA), og dermed gir biologisk aktivitet. Selv PCPS partikler gir flere fordeler i forhold til eksisterende metoder for siRNA levering, en begrensning av teknikken er at ikke-funksjonaliserte mikropartikler psi er nødvendig som utgangsmateriale. Mens partiklene kan syntetiseres ved hjelp av fotolitografi og elektrokjemisk etsing 17, disse teknikkene er ikke lett tilgjengelig i alle institusjoner.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Polyethylenimine (PEI), branched Sigma-Aldrich 408727 Average molecular weight ~25,000 Da
L-Arginine Sigma-Aldrich A5006 Reagent grade, ≥98%
Boc-Asp-OH Sigma-Aldrich 408-468 99%
Hydrogen peroxide solution Sigma-Aldrich 216763 30 wt. % in H2O
Sulfuric acid Sigma-Aldrich 339741 100.00%
Isopropyl alcohol Sigma-Aldrich W292907 ≥99.7%
Ethanol Sigma-Aldrich 459844 ≥99.5% 
N-(3-Dimethylaminopropyl)-N′-ethylcarbodiimide hydrochloride (EDC) Sigma-Aldrich 03449 ≥99%
Albumin from bovine serum Sigma-Aldrich A7030-10G Blocking agent
Ataxia-telangiectasia mutated siRNA  Sigma-Aldrich Designed in-house
Tris Acetate-EDTA buffer Sigma-Aldrich T9650 For DNA agarose gel electrophoresis
Penicillin-Streptomycin Sigma-Aldrich P4333
Fetal Bovine Serum Sigma-Aldrich F2442
TWEEN 20 Sigma-Aldrich P1379 Polyethylene glycol sorbitan monolaurate
2-Mercaptoethanol Sigma Aldrich M6250 For Western blot
Sodium dodecyl sulfate Sigma-Aldrich L3771
Sodium phosphate monobasic Sigma-Aldrich 71496 For making phosphate buffer 
Sodium phosphate dibasic Sigma-Aldrich 71640 For making phosphate buffer
Anti-Mouse IgG Sigma-Aldrich A4416 Secondary antibody (anti-mouse) for Western blot
N-Hydroxysuccinimide (NHS) Sigma-Aldrich 130672 98%
CELLSTAR 96W Microplate Tissue Culture Treated Clear w/ Lid Greiner Bio-One 655182 96-well plate
10x Tris-Glycine Liquid Li-Cor  928-40010 Transfer buffer for Western blot
Paraformaldehyde solution 4% in PBS  Santa Cruz Sc-281692 Fixation of cells
CellTiter 96 AQueous Non-Radioactive Cell Proliferation Assay (MTS) Promega G5421 Proliferation assay
Phosphate buffered saline Fisher Scientific BP399-500 10x Solution
Corning cellgro Dulbecco's Modification of Eagle's (Mod.) Fisher Scientific  MT-15-017-CM Cell culture media, 1x solution
Triton X-100 Fisher Scientific AC21568-2500 Octyl phenol ethoxylate, permeabilization agent
Cover glass Fisher Scientific 12-530C 
Methanol Fisher Scientific  A412-1 For Western blot transfer buffer
Plastic Cuvettes Fisher Scientific  14-377-010  For size measurements using Zetasizer Nano ZS
Molecular BioProducts RNase AWAY Surface Decontaminant Fisher Scientific 14-754-34 Spray for removing RNAse contamination
Agarose Fisher Scientific BP165-25 Low melting point, for running RNA samples
ProLong Gold Antifade Reagent with DAPI  Invitrogen P36935 Antifade reagent with DAPI, nucelus detection
Alexa Fluor 488 Phalloidin Invitrogen A12379 Dissolve 300 units in 1.5 ml methanol, detection of filamentous actin
SYBR Safe DNA Gel Stain Invitrogen S33102 Visualization of RNA
Negative Control siRNA Qiagen 1022076 Control siRNA
AllStars Neg. siRNA AF 555 Qiagen 1027294 Fluorescent control siRNA
Cell scraper Celltreat 229310
BioLite Multidishes and Microwell Plates Thermo Scientific 130184 6-well plate
Pierce LDS Sample Loading Buffer (4x) Thermo Scientific 84788 Sample loading buffer for Western blot
Pierce BCS Protein Assay Kit Thermo Scientific 23227 Protein quantification assay
Halt Protease Inhibitor Single-Use Cocktails (100x) Thermo Scientific 78430 Protease inhibitor cocktail, use at 1x
M-PER Mammalian Protein Extraction Reagent Thermo Scientific  78501 Protein extraction reagent
Sorvall Legend Micro 21R Thermo Scientific 75002440 Centrifuge
Beta Actin Antibody  Thermo Scientific  MA1-91399 β-actin primary antibody (from mouse) for western blot
6x TriTrack DNA Loading Dye Thermo Scientific R1161 DNA loading dye
Nuclease-Free Water  Life Technologies AM9938
Non-Fat Dry Milk Lab Scientific M0841 For Western blot
2-well BD Falcon culture slides  BD Biosciences 354102 2-well culture slides
Amersham ECL Western blot detection reagent GE Healthcare Life Sciences RPN2106 Western blot detection reagent
BA Membranes GE Healthcare Life Sciences 10402096 Nitrocellulose membrane for Wester blot
ATM (D2E2) Rabbit mAb Cell Signaling 2873S ATM primary antibody (from rabbit) for Western blot
Anti-rabbit IgG, HRP-linked Antibody Cell Signaling  7074 Secondary antibody (anti-rabbit) for Western blot 
Folded capillary cells Malvern  DTS 1061 For zeta potentail measurements using Zetasizer Nano ZS
MDA-MB-231 cell line ATCC HTB-26 Mammary Gland/Breast
12% Mini-PROTEAN TGX Gel Bio-rad 456-1043  For Western blot
Biorad PowerPac HC Bio-rad 164-5052 Power supply for electrophoresis
10x Tris/Glycine/SDS Buffer Bio-rad 161-0732 Running buffer for Western blot
Wide Mini-Sub Cell GT Cell Bio-rad 170-4405 Electrophoresis equipment for DNA agarose gel 
Mini-PROTEAN Tetra cell Bio-rad 165-8000 Electrophoresis equipment for Western blot
ChemiDoc XRS+ System with Image Lab Software Bio-rad 170-8265 Image acquisition and analysis software for gels and blots
4" (10 cm) dia., 5 x 7 mm diced Silicon Wafer Ted Pella  16007 Silicon waferfor scanning electron microscopy and atomic force microscopy
Thermomixer R Eppendorf 22670107 Shaker 
Isoton II diluent Beckman Coulter 8546719 Isoton diluent
Multisizer 4 Coulter Counter Beckman Coulter A63076 Particle counting analyzer
Non-functionalized porous silicon particles  Microelectronics Research Center, University of Texas at Austin Dicoidal shape. 2.6 μm (diameter) x 0.7 μm (height), provided in isopropyl alcohol
Zetasizer Nano ZS Malvern Particle analyzer system for size and zeta potential 
Scanning Electron Microscope FEI Particle size and shape 
Atomic Force Microscope Bruker Particle size and shape
Fluo ViewTM 1000 Confocal Microscope Olympus Visualization of fixed and live cells

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. De Fougerolles, A., Vornlocher, H. P., Maraganore, J., Lieberman, J. Interfering with disease: a progress report on siRNA-based therapeutics. Nat Rev Drug Discov. 6, (6), 443-453 (2007).
  2. Rolland, A. Gene medicines: the end of the beginning. Adv Drug Deliv Rev. 57, (5), 669-673 (2005).
  3. Oh, Y. K., Park, T. G. siRNA delivery systems for cancer treatment. Adv Drug Deliv Rev. 61, (10), 850-862 (2009).
  4. Mintzer, M. A., Simanek, E. E. Nonviral vectors for gene delivery. Chem Rev. 109, (2), 259-302 (2009).
  5. Whitehead, K. A., Langer, R., Anderson, D. G. Knocking down barriers: advances in siRNA delivery. Nat Rev Drug Discov. 8, (2), 129-138 (2009).
  6. Decuzzi, P., et al. Size and shape effects in the biodistribution of intravascularly injected particles. J Control Release. 141, (3), 320-327 (2010).
  7. Decuzzi, P., Ferrari, M. Design maps for nanoparticles targeting the diseased microvasculature. Biomaterials. 29, (3), 377-384 (2008).
  8. Martinez, J. O., Evangelopoulos, M., Chiappini, C., Liu, X., Ferrari, M., Tasciotti, E. Degradation and biocompatibility of multistage nanovectors in physiological systems. J Biomed Mater Res A. 102, (10), 3540-3549 (2014).
  9. Shen, H., et al. Enhancing chemotherapy response with sustained EphA2 silencing using multistage vector delivery. Clin Cancer Res. 19, (7), 1806-1815 (2013).
  10. Xu, R., et al. Multistage vectored siRNA targeting ataxia-telangiectasia mutated for breast cancer therapy. Small. 9, (9-10), 1799-1808 Forthcoming.
  11. Shen, J., et al. High capacity nanoporous silicon carrier for systemic delivery of gene silencing therapeutics. ACS Nano. 7, (11), 9867-9880 (2013).
  12. Zhang, M., et al. Polycation-functionalized nanoporous silicon particles for gene silencing on breast cancer cells. Biomaterials. 35, (1), 423-431 (2014).
  13. Ozpolat, B., Sood, A. K., Lopez-Berestein, G. Nanomedicine based approaches for the delivery of siRNA in cancer. J Intern Med. 267, (1), 44-53 (2010).
  14. Philipp, A., Dehshahri, A., Wagner, A., E, Simple modifications of branched PEI lead to highly efficient siRNA carriers with low toxicity. Bioconjug Chem. 19, (7), 1448-1455 (2008).
  15. Hunter, A. C. Molecular hurdles in polyfectin design and mechanistic background to polycation induced cytotoxicity. Adv Drug Deliv Rev. 58, (14), 1523-1531 (2006).
  16. Andrews, P. M., Bates, S. B. Dose-dependent movement of cationic molecules across the glomerular wall. Anat Rec. 212, (3), 223-231 (1985).
  17. Ananta, J. S., et al. Geometrical confinement of gadolinium-based contrast agents in nanoporous particles enhances T1 contrast. Nat Nanotechnol. 5, (11), 815-821 (2010).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics