Porøst silicium mikropartikler til levering af siRNA Therapeutics

* These authors contributed equally
Bioengineering

Your institution must subscribe to JoVE's Bioengineering section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Summary

Levering er stadig den største udfordring for den terapeutiske gennemførelse af små interfererende RNA (siRNA). Denne protokol indebærer anvendelse af en multifunktionel og biokompatibel siRNA levering platform bestående af arginin og polyethylenimin podet porøst silicium mikropartikler.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Shen, J., Wu, X., Lee, Y., Wolfram, J., Yang, Z., Mao, Z. W., Ferrari, M., Shen, H. Porous Silicon Microparticles for Delivery of siRNA Therapeutics. J. Vis. Exp. (95), e52075, doi:10.3791/52075 (2015).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Introduction

Små interfererende RNA'er (siRNA'er) er dobbeltstrengede RNA-molekyler, der kan undertrykke ekspressionen af ​​gener. I de seneste år har siRNAs blevet udviklet som en ny generation af biodrugs der viser terapeutisk potentiale for fremtidig anvendelse i kliniske anvendelser 1-5. Men en vellykket gennemførelse af siRNA terapi er stadig en stor udfordring, som følge af nedbrydning af nukleaser, dårlig intracellulær optagelse, lav transfektionseffektivitet og ineffektiv frigørelse fra endosomet / lysosomet 5. Mange af disse forhindringer kan overvindes ved at udvikle platforme, som sikkert og effektivt kan levere siRNA til sygt væv. Sammenlignet med virale bærere, ikke-virale platforme giver flere fordele, såsom sikkerhed, lave omkostninger og nem skræddersy. Især kationiske nanopartikler, såsom polymerer og lipider, har vist sig nyttigt for siRNA levering 3.

Tidligere har vi udviklet et skiveformet drUG leveringssystem, betegnet flertrins vektor (MSV). Denne platform er baseret på sekventielle trin, hvor et køretøj er frigivet fra en anden. Det første trin køretøj er en mikropartikel fremstillet af biologisk nedbrydeligt porøst silicium (PSI), mens den anden fase køretøjer er nanopartikler fyldt med medicin eller kontrastmidler 6,7. De nanopartikler, der er indlejret i PSI materiale, efterhånden udgivet som Si nedbryder 8. En fordel ved at bruge Si-partikler er, at morfologien og overfladeegenskaber let kan skræddersys til at opnå optimal biodistribution og lægemiddelfrigivelse. For nylig blev den vellykkede brug af MSV platform for levering af siRNA liposomer til tumorvæv vist i en æggestokkene og brystkræft musemodel 9, 10.

I dette arbejde har vi fabrikeret et universelt system for siRNA levering baseret på principper fra MSV-platformen. Effekten af ​​dette afgivelsessystem er tidligere påvist osing forskellige siRNA molekyler 11. Systemet er en polykation-funktionaliseret porøst silicium (PCPS) bærer, der består af psi podet med polyethylenimin (PEI) og arginin (Arg). PEI kan hjælpe ved dannelse af elektrostatiske interaktioner med siRNA, mens Arg og psi kan tjene til at reducere toksiciteten af PEI, som tidligere demonstarted 11. Desuden kan tilstedeværelsen af ​​PEI bistå i intracellulær optagelse og endosomale undslippe, mens PSI mikropartikler muliggøre siRNA beskyttelse og langvarig frigivelse. PSI partikler gradvist nedbrydes under fysiologiske betingelser, hvilket resulterer i dannelsen af Arg-PEI / siRNA nanopartikler (figur 1), som har en særskilt morfologi og en snæver størrelsesfordeling 11. For oplysninger om stabiliteten af PCPS / siRNA-system, henvises til den undersøgelse, som Shen et al. 11. Denne PCPS platform adskiller sig fra den konventionelle MSV, da den anden fase nanopartikler ikke i første omgang present i bæreren, men er dannet over tid som den første fase bærer nedbryder 11, 12. Den siRNA belastningseffektivitet, cytotoksicitet og gendæmpning effektivitet PCPS systemet er blevet evalueret in vitro. Transfektionseffektiviteten blev målt ved hjælp af siRNA mod ataksi telangiectasia muterede (ATM) onkogen, som er involveret i DNA-reparation 10. Tidligere har undertrykkelse af ATM blevet vist at mindske tumorvækst i en brystkræft model 10.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. PCPS Particle Fremstilling

  1. Oxidere ikke-funktionaliserede porøse silicium partikler i en 30% opløsning af hydrogenperoxid ved 95 ° C i 2 timer. Aminere de oxiderede partikler i 2% (3- aminopropyl) triethoxysilan opløsning i isopropylalkohol i 2 dage ved 65 ° C med forsigtig omrøring.
  2. Centrifugeres opløsningen i 30 minutter ved 18.800 xg og vaske partiklerne to gange i isopropylalkohol og tre gange i ethanol, ved hjælp af korte lydbehandling at suspendere pellet. Lad partiklerne i ethanolopløsning ved udførelse trin 1.3 og 1.4.
  3. Tilsæt en kendt mængde af partikel suspension (f.eks 10 pi) til 10 ml isoton fortyndingsmiddel og tælle partikler med en partikeltælling analysator for at bestemme koncentrationen af partikler i stamopløsningen.
  4. Aktiver syregruppe af L-arginin (0,1 nmol) med N - (3-dimethylaminopropyl) - N '-ethylcarbodiimide hydrochloride (EDC, 0,1 nmol) / N
  5. Kort sonikeres partikel stamopløsningen og tilsæt 1 milliard partikler til L-arginin-opløsning og lader reaktionen i 18 timer ved stuetemperatur med forsigtig omrøring.
  6. Aktivere det første asparaginsyre gruppe af N - (tert-butoxycarbonyl) -L-asparaginsyre (Boc-Asp-OH, 1 nmol) med EDC (0,1 nmol) / NHS (0,1 nmol) i 20 ml ethanol i 4 timer ved 4 ° C med forsigtig omrøring.
  7. 50 mg polyethylenimin i 10 ml ethanol opløses og tilsæt opløsningen til Boc-Asp-OH blanding. Lad reaktionen fortsætte i 24 timer ved stuetemperatur med forsigtig omrøring.
  8. Aktivere den anden asparaginsyre gruppe af Boc-Asp-OH / PEI løsning med EDC (0,1 nmol) / NHS (0,1 nmol) ved 4 ° C i 6 timer under forsigtig omrøring.
  9. Til opnåelse af PCPS partikler, tilsæt partikel opløsningen fra trin 1.5 i Boc-Asp-OH / PEI-opløsning fra trin 1.8. Lad reaktionen forløbe i 18 timer ved stuetemperatur med forsigtig st irring.
  10. Centrifugeres opløsningen i 30 minutter ved 18.800 xg og partikel opløsning vaskes tre gange med ethanol ved hjælp af kort lydbehandling for at suspendere pellet.

2. PCPS Particle karakterisering

  1. Måle størrelsen af ​​partiklerne ved hjælp af et scanningselektronmikroskop (SEM).
    1. Placer en dråbe partikel suspension (10.000 partikler / ul i ethanol) på en ren silica SEM prøve stub og lad tørre ved stuetemperatur under vakuum.
    2. Mål SEM billeder ved 8 kV med en 3-5 mm arbejder afstand ved hjælp af en in-linse detektor.
  2. Mål zetapotentialet af partiklerne ved hjælp af en partikel analysator system.
    1. Bland 10 pi partikel suspension (10.000 partikler / pl i ethanol) med 1 ml 10 mM phosphatbuffer (pH 7,4).
    2. Indlæs prøven i foldede kapillærer og måle zetapotentialet ifølge producentens anvisninger.
le "> 3. Loading af siRNA i PCPS Partikler

  1. Tør PCPS partikler (fra PCPS partikel forberedelse trin 1.9) under vakuum O / N.
  2. Tilføj siRNA (4 ug) i nuclease-frit vand (20 pi) til de tørrede PCPS partikler og sonikeres kortvarigt. Brug følgende partikel til siRNA forhold: 2 × 10 5 partikler / 0,2 ug siRNA, 4 × 10 5 partikler / 0,2 ug siRNA, 6 x 10 5 partikler / 0,2 ug siRNA, 8 × 10 5 partikler / 0,2 ug siRNA, 10 × 10 5 partikler / 0,2 ug siRNA og 12 × 10 5 partikler / 0,2 ug siRNA.
  3. Der inkuberes i 3 timer ved 4 ° C på et rysteapparat (1000 rpm) for at tillade siRNA binding til partiklerne.

4. Optimering af siRNA / PCPS Particle Ratio

  1. Tilføj DNA loading dye til 20 pi af de PCPS / kontrol siRNA partikler med forskellig partikel til siRNA-forhold (se indlæsning af siRNA i PCPS partikler).
  2. Indlæs samsempler i en 2% agarosegel indeholdende DNA gel pletten.
  3. Udfør elektroforese ved en konstant spænding på 120 V i 20 minutter i køreklar buffer.
  4. Analyser gelen med køb image og analysesoftware.

5. Frigivelse af siRNA fra PCPS Partikler

  1. Bland 20 pi af PCPS / kontrol siRNA partikler med forskellige partikel til siRNA forhold (se trin 3) i natriumdodecylsulfat (SDS, 2%) og lad stå i 1 time ved stuetemperatur.
  2. Tilføj DNA loading dye til prøverne.
  3. Load prøver til en 2% agarosegel indeholdende DNA gel pletten.
  4. Udfør elektroforese ved en konstant spænding på 120 V i 20 minutter i køreklar buffer under anvendelse af DNA elektroforese udstyr og en strømforsyning.
  5. Analyser gelen med køb image og analysesoftware.

6. konfokal mikroskopi PCPS Partikler

  1. Tilsæt 5 pi PCPS / fluorescerende kontrol siRNA partikler (10 × 10 5 partikler / 0.2 ug siRNA / 20 pi) til et glas dækglas.
  2. Visualiser partikellag ved konfokal mikroskopi.

7. Karakterisering af Arg-PEI / kontrol siRNA Nanopartikler

  1. At nedbryde silikonemateriale og danne Arg-PEI / kontrol siRNA nanopartikler, tilføje PCPS / siRNA partikler (10 × 10 6 PCPS partikler / 2 ug siRNA) til 100 pi phosphatpufret saltvand og ryste (1.000 rpm) ved 37 ° C i 2 dage.
  2. Centrifugeres prøven i 30 minutter ved 18.800 xg og indsamle supernatanten.
  3. Måle størrelsen af ​​de dannede Arg-PEI / siRNA nanopartikler med dynamisk lysspredning (DLS).
    1. Bland 10 pi af supernatanten med 1 ml 10 mM phosphatbuffer (pH 7,4) og anbringes i en plastik kuvette.
    2. Måle størrelsen af ​​partiklerne ved hjælp af en partikel analysator ifølge producentens anvisninger.
  4. Bestem størrelse og morfologi af det dannede Arg / PEI-siRNAnanopartikler med atomic force mikroskopi.
    1. Tag 10 pi af supernatanten og sted på en siliciumskive.
    2. Visualiser partiklerne med atomic force mikroskopi (AFM).

8. Cellekultur

  1. Kultur MDA-MB-231 humane brystkræftceller i cellekultur medier suppleret med 10% føtalt bovint serum og 1% penicillin-streptomycin ved 5% CO 2, 95% fugtighed og 37 ° C.

9. konfokalmikroskopi af levende celler med PCPS Partikler

  1. Plate celler i 2 brønde kultur glider på en podningsdensitet på 3 x 10 5 celler / brønd i 24 timer.
  2. Tilføj PCPS partikler fyldt med fluorescerende kontrol siRNA (10 × 10 5 partikler / 0,2 ug partikel til siRNA ratio, 50 nM siRNA) til celler.
  3. Optage en film af cellerne med et konfokalt mikroskop (leveres med et kammer, 5% CO2, 95% fugtighed og 37 ° C) i 12 timer efter partikel exposikker.

10. konfokalmikroskopi af fikserede celler med PCPS Partikler

  1. Plate celler i 2 brønde kultur glider på en podningsdensitet på 3 x 10 5 celler / brønd i 24 timer.
  2. Tilføj PCPS partikler fyldt med fluorescerende kontrol siRNA (10 × 10 5 partikler / 0,2 ug partikel til siRNA ratio, 50 nM siRNA) til celler og inkuberes i 1 dag, 7 dage og 10 dage.
  3. Vask cellerne to gange med phosphatbufret saltvand og derefter fastgøre dem med 4% paraformaldehyd-opløsning i 10 min.
  4. Vask cellerne med phosphatbufret saltvand.
  5. Permeabilisere cellerne med 0,1% octylphenol ethoxylat i 10 minutter og derefter vaske dem tre gange med phosphatbufret saltvand.
  6. Bloker cellerne med albumin fra bovin serum (10 mg / ml) i phosphatpufret saltopløsning i 10 minutter ved stuetemperatur under forsigtig omrøring.
  7. At visualisere filamentøs actin, inkuberes cellerne med fluorescensmærket phalloidin (1 pl / 40 piblokerende opløsning) i 20 minutter ved stuetemperatur med forsigtig omrøring og derefter vaske i phosphatbufret saltvand.
  8. Fjern objektglassene fra rammen og tilføj antifade reagens med 4 ', 6-diamidino-2-phenylindol (DAPI) at visualisere kernen.
  9. Tilføj et dækglas på toppen og tage billeder af cellerne med konfokal mikroskopi.

11. Flowcytometri af celler med PCPS / fluorescerende Kontrol siRNA Partikler

  1. Plate celler i en 6-brønds plade ved en podningsdensitet på 3 x 10 5 celler / brønd i 24 timer.
  2. Tilføj PCPS partikler fyldt med fluorescerende kontrol siRNA (10 × 10 5 partikler / 0,2 ug partikel til siRNA ratio, 50 nM siRNA) til cellerne og inkuberes i 24 timer.
  3. Vask cellerne med phosphatpufret saltvand og skrabe dem med en celleskraber.
  4. Opbevar cellerne i phosphatpufret saltvand med 2% føtalt bovint serum før analyse. Brug ubehandlede celler som en negativ kontrol.
  5. Udfør flow cytometry.

12. Cell levedygtighed Celler med PCPS Partikler og PCPS / kontrol siRNA Partikler

  1. Plate celler i en plade med 96 brønde ved en celledensitet på 3 × 10 3 celler / brønd i 24 timer.
  2. Behandl cellerne med PCPS partikler (1,5 × 10 5 / godt og 6 × 10 5 / brønd) eller PCPS / kontrol siRNA partikler (10 × 10 5 partikler / 0,2 ug partikel til siRNA-forhold, 10 Nm og 100 nM siRNA) i 48 time og 72 timer. Brug ubehandlede celler og celler behandlet med phosphatbufret saltvand (samme volumen som de tilsatte partikler) som kontroller. Bestem hver prøve i tre eksemplarer.
  3. Udfør en celleproliferationsassay i henhold til producentens anvisninger.
  4. Repræsentere data som middelværdi ± standardafvigelse.

13. Western Blot af celler med PCPS / ATM Muterede siRNA Partikler

  1. Plate celler i en 6-brønds plade ved en celletæthed 2 × 10 5 celler / well i 24 timer.
  2. Inkubér cellerne med PCPS / kontrol siRNA (50 nM) partikler eller PCPS / ATM siRNA (50 nM) partikler til 72 timer. Brug ubehandlede celler som en kontrol.
  3. Lyse cellerne under anvendelse af et protein ekstraktion reagens suppleret med en protease-inhibitor cocktail.
  4. Centrifuger cellelysaterne i 10 minutter ved 14.000 xg og inddrive supernatanten.
  5. Bestem proteinkoncentrationen med et protein kvantificering assay ifølge producentens anvisninger.
  6. Tilføj prøve påsætningsbuffer (med 5 pi 2-mercaptoethanol / ml buffer) til prøverne og varme dem i 6 minutter ved 99 ° C.
  7. Indlæs proteinprøver (20 pg / pl) i en 12% SDS-polyacrylamidgel i rindende puffer og udføre polyacrylamidgelelektroforese (1 time, 120 V) ved hjælp af elektroforese udstyr og en strømforsyning.
  8. Overfør gel i transfer-buffer (med 20% methanol) til en nitrocellulosemembran (1 time, 100 V) ved hjælp af elektroforese udstyr ogen strømforsyning.
  9. Bloker membranen med 5% tørmælk i 1 time.
  10. Inkuber membranen med ATM primære antistof (fra kanin) i blokerende opløsning (fra trin 13.9) ved en 1: 1000 fortynding O / N.
  11. Vask membranen med phosphatbufret saltvand indeholdende 0,1% polyethylenglycol sorbitanmonolaurat og derefter inkubere det med det sekundære antistof (anti-kanin) i blokerende opløsning (fra trin 13.9) ved en 1: 2500 fortynding i 1 time.
  12. Vask membranen med phosphatbufret saltvand indeholdende 0,1% polyethylenglycol sorbitanmonolaurat og påvise proteinbåndene med Western blot detektionsreagens hjælp erhvervelse billede og analysesoftware.
  13. For lastning kontrol vaske membranen, og gentag trin 13,9-13,12 anvendelse af en β-actin-primært antistof (fra mus, 1: 10.000 fortynding) og et sekundært antistof (anti-muse 1: 4.000 fortynding).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Denne protokol beskriver anvendelsen af ​​et ikke-viralt afgivelsessystem til sikker og effektiv siRNA transfektion. SEM resultater viser, at PCPS partiklerne er cylindrisk i form og har en diameter på 2,6 um (figur 2A). Partiklerne er positivt ladede med en zetapotentiale på ca. 8,21 (figur 2B), hvorved elektrostatisk binding med negativt ladede nukleotider. Konfokale billeder af forskellige lag af PCPS partikler viser, at fluorescerende kontrol siRNA er lagt inde i porøst silicium partikler (figur 2C). Dannelse og udslip af Arg-PEI / siRNA nanopartikler fra PSI-partikler blev bekræftet med DLS og AFM. Størrelsesfordelingen af partiklerne varierede fra 70 til 120 nm, med en gennemsnitlig størrelse på 94 nm (figur 2D). AFM billeder viser, at nanopartiklerne har en sfærisk form (figur 2E).

Den ratio af partikler til siRNA blev optimeret ved agarosegelelektroforese for at sikre høj bindingsaffinitet (figur 3A). En bred vifte af partikel til siRNA forhold blev anvendt (2 x 10 5, 4 × 10 5, 6 × 10 5, 8 × 10 5, 10 × 10 5 og 12 × 10 5 /0.2 ug siRNA). Resultaterne indikerer, at siRNA kan binde tæt til partiklerne, når partiklen beløb er over 8 × 10 5. Et forhold på 10 × 10 5 PCPS / 0,2 ug siRNA blev udvalgt til yderligere forsøg. Endvidere blev siRNA succes frigivet fra bæreren ved behandling med SDS, som illustreret i figur 3B.

Dernæst blev kælder internalisering af PCPS / fluorescerende kontrol siRNA partikler evalueres i MDA-MB-231-celler. Konfokale billeder taget efter 24 timers behandling viser, at partiklerne er effektivt internaliseres i cellerne (Figur 4 Figur 5 viser, at 89% af cellerne har internaliseret PCPS / siRNA partikler efter 24 timers inkubation. Desuden blev internalisering proces registreret for 12 timer (Video 1). Disse resultater indikerer, at PCPS partikler effektivt kan levere siRNA i celler. Ophobningen af ​​siRNA langsigtet inde i cellerne blev også evalueret ved konfokal mikroskopi. På dag 7 og dag 10 var siRNA stadig påviselig inde i cellerne (figur 6).

En af de vigtigste faktorer til at overveje, når de udvikler et siRNA leveringssystem er sikkerheden for bæreren 13. PEI er kendt for at danne polyplekser med siRNA, støtte i cellulær optagelse og udløser frigivelse fra endosomet / lysosomet. Imidlertid kan PEI har toksiske virkninger på grund af tilstedeværelsen af positivt ladede primære aminogrupper i rygraden 14,15. For eksempel PEI binding til glycocalyx på celleoverfladen kan resultere i FOrmation af store klynger 16. For at eliminere denne charge-induceret toksicitet blev PEI kovalent konjugeret til arginin gennem en bro linker, for at reducere antallet af primære aminogrupper. Cellelevedygtigheden forblev over 95% efter 48 timer og 72 timer, når partikler og siRNA blev anvendt ved en koncentration på op til 6 × 10 5 / brønd og 100 nM (figur 7A). Dernæst blev transfektion effekten af ​​siRNA mod onkogenet ATM evalueret i MDA-MB-231-celler. Western blot-resultaterne viser, at de proteinniveauer ATM sænkes efter behandling med PCPS / ATM siRNA (figur 7B). Resultaterne tyder på, at PCPS platformen er et sikkert og effektivt system til siRNA levering.

Figur 1
Figur 1. Skematisk repræsentation af polykation-funktionaliserede porøse silicium (PCPS) partikler. strong> arginin (Arg) -polyethylenimine (PEI) / dannes små interfererende RNA (siRNA) nanopartikler efter nedbrydningen af ​​silicium (Si).

Figur 2
Figur 2. Karakterisering af PCPS partikler. (A) Scanning elektronmikroskopi (SEM) billede af PCPS partikler. (B) Zetapotentialet PCPS partikler. (C) Konfokale billeder af forskellige lag af PCPS / fluorescerende kontrol siRNA partikler. (D) størrelsesfordelingen af arginin Arg-PEI / kontrol siRNA nanopartikler frigivet fra de porøse silicium mikropartikler. (E) Atomic force mikroskopi (AFM) billeder af Arg-PEI / kontrol siRNA nanopartikler. Klik her for at se en større udgave af dette tal.

ve_content "FO: keep-together.within-side =" altid "> Figur 3
Figur 3. Agarose gel til optimering af PCPS / siRNA delivery system. (A) binding affinitet mellem PCPS partikler og kontrollere siRNA. Båndene repræsenterer ubundet siRNA. (B) siRNA frigørelse efter inkubering med 2% SDS i 1 time. Båndene repræsenterer total siRNA (ubundet og bundet). Prøve 1: siRNA; Prøve 2: 2 × 10 5 PCPS partikler / 0,2 ug siRNA; Prøve 3: 4 × 10 5 PCPS partikler / 0,2 ug siRNA; Prøve 4: 6 × 10 5 PCPS partikler / 0,2 ug siRNA; Prøve 5: 8 × 10 5 PCPS partikler / 0,2 ug siRNA; Prøve 6: 10 × 10 5 PCPS partikler / 0,2 ug siRNA; Prøve 7: 12 × 10 5 PCPS partikler / 0,2 ug siRNA.

75 / 52075fig4.jpg "/>
Figur 4. konfokalt mikroskop billeder af PCPS / fluorescerende siRNA partikler (rød) i MDA-MB-231-celler (24 timers inkubation). Kernen og filamentøse actin blev visualiseret med 4 ', 6-diamidino-2-phenylindol (DAPI, blue ) og phalloidin (grøn), hhv. Tre forskellige lag blev afbildet (top, midt og basal). Klik her for at se en større udgave af dette tal.

Figur 5
Figur 5. Kvantitativ flowcytometri analyse af fluorescerende MDA-MB-231-celler efter inkubering med PCPS / kontrol fluorescerende siRNA partikler. Ubehandlede celler blev anvendt som en negativ kontrol. 89% af cellerne var internaliseret partiklerne.

igur 6 "src =" / files / ftp_upload / 52075 / 52075fig6.jpg "/>
Figur 6. Konfokale billeder af fluorescerende kontrol siRNA (rød) inde MDA-MB-231-celler. Celler blev inkuberet med PCPS / fluorescerende kontrol siRNA partikler i 1 dag, 7 dage og 10 dage. Cellerne blev derefter visualiseret med konfokal mikroskopi. Kernen og trådformede actin blev visualiseret med 4 ', 6-diamidino-2-phenylindol (DAPI, blå) og phalloidin (grøn), henholdsvis. Klik her for at se en større udgave af dette tal.

Figur 7
Figur 7. Cellelevedygtighed og gendæmpning in vitro. (A) En celle levedygtighed assay af celler inkuberet med PCPS partikler og PCPS / kontrol siRNA partikler (SCR). Forsøget blev udført i tripeksemplarer og resultaterne præsenteres som middelværdi ± standardafvigelse. Ubehandlede celler (blank) og celler inkuberet med PBS blev anvendt som kontroller. (B) Western blot af PCPS / ataksi telangiectasia muteret (ATM) siRNA partikler. Celler blev eksponeret for PCPS / kontrol siRNA (SCR) partikler og PCPS / ATM siRNA partikler. Ubehandlede celler (mock) blev anvendt som en kontrol. β-actin blev anvendt som en loading kontrol.

Video 1 . Tidsafhængig optagelse af PCPS / fluorescerende kontrol siRNA partikler i levende MDA-MB-231-celler. Videoen er optaget i 12 timer efter udsættelse af cellerne for partikler.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Denne protokol beskriver en fremgangsmåde til vellykket levering og transfektion af siRNA i celler. Især er levering af siRNA opnås ved anvendelse af en multifunktionel platform bestående af polykation-funktionaliserede psi partikler. Brugen af siRNA terapi har stort potentiale, f.eks kræftbehandling, som forskellige onkogener kan målrettes med høj specificitet. Der er derfor et behov for at udvikle siRNA levering køretøjer, der kan afbøde de udfordringer siRNA terapi. Afslutningsvis har vi skitseret en protokol, der viser lovende for en sikker og effektiv levering af siRNA. Men der er nogle vigtige faktorer, der bør tages i betragtning, når du udfører den beskrevne teknik. For eksempel, en vigtig overvejelse, når fremstilling af PCPS partikler er at håndtere siRNA omhyggeligt, for at undgå nedbrydning af nukleaser. Især, rene handsker og RNAse bør anvendes gratis rør og vand på alle tidspunkter, når du arbejder medsiRNA. Hvis siRNA transfektion effektivitet er lav, kan en spray, der fjerner RNAse kontaminering anvendes til at sprøjte handsker og arbejdsområder. Desuden, hvis transfektionen er mislykket, siRNA bør afprøves med et kommercielt transfektionsreagens at afgøre, om problemet er forårsaget af siRNA eller partiklerne. En anden kritisk overvejelse for en vellykket gennemførelse af PCPS / siRNA levering er at passe på, når du udfører centrifugering og vasketrin. Nemlig, bør supernatanten fuldt bortkastes for at fjerne overskydende reagenser, der er nødvendige i hele præparatet partikel trin.

En vigtig fordel ved PCPS / siRNA delivery system er sikkerhed. Adskillige siRNA transfektion midler har en høj kationisk ladning, hvilket bidrager til cellulær toksicitet 13,15. Faktisk fleste kommercielle protokoller viser, at reagenserne skal inkuberes med cellerne i kun et par timer, for at undgå celledød. Tværtimod ceLLS kan blive udsat for de PCPS partikler til flere dage uden tegn på toksicitet, som det fremgår af cellelevedygtigheden resultater. De PCPS partikler kan binde siRNA med høj affinitet på grund af tilstedeværelsen af ​​PEI. Men charge-induceret toksicitet af PEI forhindres af den unikke opsætning af levering platform. Især den kovalente binding af Arg til PEI og indkapslingen af ​​PEI inde Si porer bidrage til reduceret toksicitet. En anden fordel ved PCPS platformen er at siRNA transfektion kan finde sted i nærvær af serum. Andre eksisterende fremgangsmåder kræver sædvanligvis anvendelse af serum-frit celledyrkningsmedier, derved at tilføje yderligere trin til transfektion processen og potentielt interfererende med regelmæssige celle signalveje.

En yderligere fordel ved PCPS system er, at det ikke kræver nogen ændring af siRNA-molekyler. Mens nogle af de nuværende metoder kræver komplicerede konjugering skridt til at stabilisere siRNA eller aktivere cellular internalisering 13, det PCPS system er baseret på simpel blanding for siRNA læsning. Bindingen til PEI og porerne i Si materiale giver et beskyttende miljø for siRNA, hvorved kontakt med nukleaser. De PCPS partikler kan opbevares i længere tidsperioder såsom tørret materiale eller i isopropylalkohol. Desuden, hvis PCPS / siRNA partikler frysetørres de kan lagres i mindst tre måneder ved 4 ° C. De lyofiliserede PCPS partikler bør suspenderes i RNase-frit vand lige før transfektion, og må ikke opbevares i opløsning. Endelig PCPS platform tillader langvarig frigivelse af siRNA, som tidligere rapporteret 11 dermed øge den periode, hvor målgener forbliver undertrykt. Følgelig efter cellulær internalisering, Si partikler gradvist nedbrydes, hvilket resulterer i dannelsen af ​​Arg-PEI / siRNA nanopartikler. Efterfølgende siRNA langsomt frigives i cytoplasmaet, hvor det kan binde til messenger RNA (mRNA), hvorved det biologisk aktivitet. Selv PCPS partikler giver adskillige fordele i forhold til eksisterende metoder til siRNA levering, en begrænsning af den teknik er, at ikke-funktionaliseret PSI mikropartikler er påkrævet som et udgangsmateriale. Mens partikler kan syntetiseres under anvendelse af fotolitografi og elektrokemisk ætsning 17, er disse teknikker ikke let tilgængelige på alle institutioner.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Polyethylenimine (PEI), branched Sigma-Aldrich 408727 Average molecular weight ~25,000 Da
L-Arginine Sigma-Aldrich A5006 Reagent grade, ≥98%
Boc-Asp-OH Sigma-Aldrich 408-468 99%
Hydrogen peroxide solution Sigma-Aldrich 216763 30 wt. % in H2O
Sulfuric acid Sigma-Aldrich 339741 100.00%
Isopropyl alcohol Sigma-Aldrich W292907 ≥99.7%
Ethanol Sigma-Aldrich 459844 ≥99.5% 
N-(3-Dimethylaminopropyl)-N′-ethylcarbodiimide hydrochloride (EDC) Sigma-Aldrich 03449 ≥99%
Albumin from bovine serum Sigma-Aldrich A7030-10G Blocking agent
Ataxia-telangiectasia mutated siRNA  Sigma-Aldrich Designed in-house
Tris Acetate-EDTA buffer Sigma-Aldrich T9650 For DNA agarose gel electrophoresis
Penicillin-Streptomycin Sigma-Aldrich P4333
Fetal Bovine Serum Sigma-Aldrich F2442
TWEEN 20 Sigma-Aldrich P1379 Polyethylene glycol sorbitan monolaurate
2-Mercaptoethanol Sigma Aldrich M6250 For Western blot
Sodium dodecyl sulfate Sigma-Aldrich L3771
Sodium phosphate monobasic Sigma-Aldrich 71496 For making phosphate buffer 
Sodium phosphate dibasic Sigma-Aldrich 71640 For making phosphate buffer
Anti-Mouse IgG Sigma-Aldrich A4416 Secondary antibody (anti-mouse) for Western blot
N-Hydroxysuccinimide (NHS) Sigma-Aldrich 130672 98%
CELLSTAR 96W Microplate Tissue Culture Treated Clear w/ Lid Greiner Bio-One 655182 96-well plate
10x Tris-Glycine Liquid Li-Cor  928-40010 Transfer buffer for Western blot
Paraformaldehyde solution 4% in PBS  Santa Cruz Sc-281692 Fixation of cells
CellTiter 96 AQueous Non-Radioactive Cell Proliferation Assay (MTS) Promega G5421 Proliferation assay
Phosphate buffered saline Fisher Scientific BP399-500 10x Solution
Corning cellgro Dulbecco's Modification of Eagle's (Mod.) Fisher Scientific  MT-15-017-CM Cell culture media, 1x solution
Triton X-100 Fisher Scientific AC21568-2500 Octyl phenol ethoxylate, permeabilization agent
Cover glass Fisher Scientific 12-530C 
Methanol Fisher Scientific  A412-1 For Western blot transfer buffer
Plastic Cuvettes Fisher Scientific  14-377-010  For size measurements using Zetasizer Nano ZS
Molecular BioProducts RNase AWAY Surface Decontaminant Fisher Scientific 14-754-34 Spray for removing RNAse contamination
Agarose Fisher Scientific BP165-25 Low melting point, for running RNA samples
ProLong Gold Antifade Reagent with DAPI  Invitrogen P36935 Antifade reagent with DAPI, nucelus detection
Alexa Fluor 488 Phalloidin Invitrogen A12379 Dissolve 300 units in 1.5 ml methanol, detection of filamentous actin
SYBR Safe DNA Gel Stain Invitrogen S33102 Visualization of RNA
Negative Control siRNA Qiagen 1022076 Control siRNA
AllStars Neg. siRNA AF 555 Qiagen 1027294 Fluorescent control siRNA
Cell scraper Celltreat 229310
BioLite Multidishes and Microwell Plates Thermo Scientific 130184 6-well plate
Pierce LDS Sample Loading Buffer (4x) Thermo Scientific 84788 Sample loading buffer for Western blot
Pierce BCS Protein Assay Kit Thermo Scientific 23227 Protein quantification assay
Halt Protease Inhibitor Single-Use Cocktails (100x) Thermo Scientific 78430 Protease inhibitor cocktail, use at 1x
M-PER Mammalian Protein Extraction Reagent Thermo Scientific  78501 Protein extraction reagent
Sorvall Legend Micro 21R Thermo Scientific 75002440 Centrifuge
Beta Actin Antibody  Thermo Scientific  MA1-91399 β-actin primary antibody (from mouse) for western blot
6x TriTrack DNA Loading Dye Thermo Scientific R1161 DNA loading dye
Nuclease-Free Water  Life Technologies AM9938
Non-Fat Dry Milk Lab Scientific M0841 For Western blot
2-well BD Falcon culture slides  BD Biosciences 354102 2-well culture slides
Amersham ECL Western blot detection reagent GE Healthcare Life Sciences RPN2106 Western blot detection reagent
BA Membranes GE Healthcare Life Sciences 10402096 Nitrocellulose membrane for Wester blot
ATM (D2E2) Rabbit mAb Cell Signaling 2873S ATM primary antibody (from rabbit) for Western blot
Anti-rabbit IgG, HRP-linked Antibody Cell Signaling  7074 Secondary antibody (anti-rabbit) for Western blot 
Folded capillary cells Malvern  DTS 1061 For zeta potentail measurements using Zetasizer Nano ZS
MDA-MB-231 cell line ATCC HTB-26 Mammary Gland/Breast
12% Mini-PROTEAN TGX Gel Bio-rad 456-1043  For Western blot
Biorad PowerPac HC Bio-rad 164-5052 Power supply for electrophoresis
10x Tris/Glycine/SDS Buffer Bio-rad 161-0732 Running buffer for Western blot
Wide Mini-Sub Cell GT Cell Bio-rad 170-4405 Electrophoresis equipment for DNA agarose gel 
Mini-PROTEAN Tetra cell Bio-rad 165-8000 Electrophoresis equipment for Western blot
ChemiDoc XRS+ System with Image Lab Software Bio-rad 170-8265 Image acquisition and analysis software for gels and blots
4" (10 cm) dia., 5 x 7 mm diced Silicon Wafer Ted Pella  16007 Silicon waferfor scanning electron microscopy and atomic force microscopy
Thermomixer R Eppendorf 22670107 Shaker 
Isoton II diluent Beckman Coulter 8546719 Isoton diluent
Multisizer 4 Coulter Counter Beckman Coulter A63076 Particle counting analyzer
Non-functionalized porous silicon particles  Microelectronics Research Center, University of Texas at Austin Dicoidal shape. 2.6 μm (diameter) x 0.7 μm (height), provided in isopropyl alcohol
Zetasizer Nano ZS Malvern Particle analyzer system for size and zeta potential 
Scanning Electron Microscope FEI Particle size and shape 
Atomic Force Microscope Bruker Particle size and shape
Fluo ViewTM 1000 Confocal Microscope Olympus Visualization of fixed and live cells

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. De Fougerolles, A., Vornlocher, H. P., Maraganore, J., Lieberman, J. Interfering with disease: a progress report on siRNA-based therapeutics. Nat Rev Drug Discov. 6, (6), 443-453 (2007).
  2. Rolland, A. Gene medicines: the end of the beginning. Adv Drug Deliv Rev. 57, (5), 669-673 (2005).
  3. Oh, Y. K., Park, T. G. siRNA delivery systems for cancer treatment. Adv Drug Deliv Rev. 61, (10), 850-862 (2009).
  4. Mintzer, M. A., Simanek, E. E. Nonviral vectors for gene delivery. Chem Rev. 109, (2), 259-302 (2009).
  5. Whitehead, K. A., Langer, R., Anderson, D. G. Knocking down barriers: advances in siRNA delivery. Nat Rev Drug Discov. 8, (2), 129-138 (2009).
  6. Decuzzi, P., et al. Size and shape effects in the biodistribution of intravascularly injected particles. J Control Release. 141, (3), 320-327 (2010).
  7. Decuzzi, P., Ferrari, M. Design maps for nanoparticles targeting the diseased microvasculature. Biomaterials. 29, (3), 377-384 (2008).
  8. Martinez, J. O., Evangelopoulos, M., Chiappini, C., Liu, X., Ferrari, M., Tasciotti, E. Degradation and biocompatibility of multistage nanovectors in physiological systems. J Biomed Mater Res A. 102, (10), 3540-3549 (2014).
  9. Shen, H., et al. Enhancing chemotherapy response with sustained EphA2 silencing using multistage vector delivery. Clin Cancer Res. 19, (7), 1806-1815 (2013).
  10. Xu, R., et al. Multistage vectored siRNA targeting ataxia-telangiectasia mutated for breast cancer therapy. Small. 9, (9-10), 1799-1808 Forthcoming.
  11. Shen, J., et al. High capacity nanoporous silicon carrier for systemic delivery of gene silencing therapeutics. ACS Nano. 7, (11), 9867-9880 (2013).
  12. Zhang, M., et al. Polycation-functionalized nanoporous silicon particles for gene silencing on breast cancer cells. Biomaterials. 35, (1), 423-431 (2014).
  13. Ozpolat, B., Sood, A. K., Lopez-Berestein, G. Nanomedicine based approaches for the delivery of siRNA in cancer. J Intern Med. 267, (1), 44-53 (2010).
  14. Philipp, A., Dehshahri, A., Wagner, A., E, Simple modifications of branched PEI lead to highly efficient siRNA carriers with low toxicity. Bioconjug Chem. 19, (7), 1448-1455 (2008).
  15. Hunter, A. C. Molecular hurdles in polyfectin design and mechanistic background to polycation induced cytotoxicity. Adv Drug Deliv Rev. 58, (14), 1523-1531 (2006).
  16. Andrews, P. M., Bates, S. B. Dose-dependent movement of cationic molecules across the glomerular wall. Anat Rec. 212, (3), 223-231 (1985).
  17. Ananta, J. S., et al. Geometrical confinement of gadolinium-based contrast agents in nanoporous particles enhances T1 contrast. Nat Nanotechnol. 5, (11), 815-821 (2010).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics