Silicium poreux microparticules pour la livraison de siRNA Therapeutics

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Bioengineering

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Summary

Livraison reste le principal défi pour la mise en œuvre thérapeutique de petits ARN interférents (siRNA). Ce protocole implique l'utilisation d'une plate-forme de délivrance de siRNA biocompatible et multifonctionnel, constitué par l'arginine et polyéthylènimine greffé microparticules de silicium poreux.

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Shen, J., Wu, X., Lee, Y., Wolfram, J., Yang, Z., Mao, Z. W., Ferrari, M., Shen, H. Porous Silicon Microparticles for Delivery of siRNA Therapeutics. J. Vis. Exp. (95), e52075, doi:10.3791/52075 (2015).

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Abstract

Introduction

Les petits ARN interférents (siRNA) sont des molécules d'ARN double brin qui peuvent supprimer l'expression des gènes. Au cours des dernières années, siRNA ont été développés comme une nouvelle génération de biomédicaments qui montrent un potentiel thérapeutique pour une utilisation future dans les applications cliniques 1-5. Cependant, la mise en œuvre réussie de la thérapie siRNA reste un défi considérable, en raison de la dégradation par les nucléases, une mauvaise absorption intracellulaire, la faible efficacité de transfection et la libération inefficace de l'endosome / 5 lysosome. Beaucoup de ces obstacles peuvent être surmontés par le développement de plates-formes de livraison, qui peuvent en toute sécurité et efficacement offrir siRNA pour les tissus malades. Comparé aux transporteurs virales, les plates-formes non-virales offrent plusieurs avantages, tels que la sécurité, le faible coût et la facilité d'adaptation. En particulier, les nanoparticules cationiques, tels que des polymères et des lipides, se sont révélés utiles pour la délivrance de siRNA 3.

Auparavant, nous avons développé un dr discoïdeug système de distribution, appelé le vecteur à plusieurs étages (MSV). Cette plate-forme est basée sur les étapes séquentielles, dans lequel un véhicule est libéré à partir de l'autre. Le premier véhicule de l'étape est un microparticules biodégradables fabriqués à partir de silicium poreux (PSI), tandis que les secondes véhicules de scène sont des nanoparticules chargées de médicaments ou d'agents de contraste 6,7. Les nanoparticules qui sont noyés dans le matériau de PSI sont progressivement libérés comme le Si dégrade 8. Un avantage d'utiliser des particules de Si est que les caractéristiques de morphologie et de surface peuvent être facilement adaptées pour réaliser la biodistribution et la libération du médicament optimal. Récemment, l'utilisation réussie de la plate-forme MSV pour la fourniture de liposomes à siARN tissu tumoral a été démontré dans un modèle de souris de l'ovaire et le cancer du sein 9, 10.

Dans ce travail, nous avons fabriqué un système de distribution universel pour siRNA basée sur les principes de la plate-forme de MSV. L'efficacité de ce système de livraison a déjà été démontré nousment différente des molécules de siRNA 11. Le système est un silicium poreux (PCPS) porte-polycation-fonctionnalisé, comprenant des ISP greffé avec la polyéthylèneimine (PEI) et l'arginine (Arg). PEI peut aider à former des interactions électrostatiques avec des siRNA, tandis que Arg et psi peuvent servir à réduire la toxicité de PEI, comme précédemment demonstarted 11. En outre, la présence de PEI peut aider à l'absorption intracellulaire et endosomal évasion, tandis que les microparticules de l'ISP permettent la protection de siRNA et la libération prolongée. Les particules de l'ISP dégradent peu à peu dans des conditions physiologiques, ce qui conduit à la formation de nanoparticules Arg-PEI / siRNA (figure 1), qui ont une morphologie distincte et une distribution de taille étroite 11. Pour plus de détails au sujet de la stabilité du système PCPS / siRNA, se il vous plaît se référer à l'étude de Shen et al. 11. Cette plate-forme de PCPS diffère de la MSV classique, puisque les secondes nanoparticules de scène ne sont pas initialement Present dans le support, mais sont formées au fil du temps que le support de premier étage dégrade 11, 12. L'efficacité siRNA chargement efficacité, la cytotoxicité et silençage génique du système PCPS a été évaluée in vitro. L'efficacité de transfection a été mesurée en utilisant le siRNA contre l'ataxie télangiectasie mutée (ATM) oncogene, qui est impliqué dans la réparation de l'ADN 10. Auparavant, la suppression de l'ATM a été montré pour diminuer la croissance tumorale dans un modèle de cancer du sein 10.

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Protocol

1. Préparation de particules PCPS

  1. Oxyder les particules de silicium poreux non-fonctionnalisés dans une solution à 30% de peroxyde d'hydrogène à 95 ° C pendant 2 heures. Aminer les particules oxydées dans 2% (3- aminopropyl) triéthoxysilane solution dans l'alcool isopropylique pendant 2 jours à 65 ° C sous agitation douce.
  2. Centrifuger la solution pendant 30 min à 18 800 xg et laver les particules deux fois dans de l'alcool isopropylique et trois fois dans de l'éthanol, en utilisant brève sonication de suspendre le culot. Laisser les particules dans une solution d'éthanol quand on effectue l'étape 1.3 et 1.4.
  3. Ajouter un volume connu de suspension de particules (par exemple, 10 ul) au diluant de 10 ml et compter les particules avec un comptage de particules analyseur pour déterminer la concentration de particules dans la solution mère.
  4. Activer le groupe acide de L-arginine (0,1 nmol) de N - (3-diméthylaminopropyl) - chlorhydrate -ethylcarbodiimide N '(EDC, 0,1 nmol) / N
  5. Soniquer brièvement la solution particules de stock et ajouter 1 milliard de particules à la solution de L-arginine et de laisser la réaction pendant 18 heures à température ambiante avec agitation douce.
  6. Activer le premier groupe de l'acide aspartique de la N - (tert-butoxycarbonyl) -L-aspartique (Boc-Asp-OH, 1 nmol) avec du EDC (0,1 nmol) / NHS (0,1 nmol) dans 20 ml d'éthanol pendant 4 heures à 4 ° C avec agitation douce.
  7. Dissoudre 50 mg de polyéthylène-imine dans 10 ml d'éthanol et ajouter la solution au mélange de Boc-Asp-OH. Que la réaction se déroule pendant 24 heures à température ambiante avec agitation douce.
  8. Activez le deuxième groupe d'acide aspartique de la solution Boc-Asp-OH / PEI avec EDC (0,1 nmol) / NHS (0,1 nmol) à 4 ° C pendant 6 heures sous agitation douce.
  9. Pour obtenir des particules, PCP, ajouter la solution de particules de l'étape 1.5 dans la solution de Boc-Asp-OH / PEI de l'étape 1.8. Laisser la réaction se dérouler pendant 18 heures à température ambiante avec douceur st irring.
  10. Centrifuger la solution pendant 30 min à 18 800 xg et laver la solution de particules à trois reprises avec de l'éthanol, en utilisant brève sonication à suspendre la pastille.

2. PCPS caractérisation des particules

  1. Mesure de la taille des particules en utilisant un microscope électronique à balayage (MEB).
    1. Placez une goutte de suspension de particules (10 000 particules / ul dans de l'éthanol) sur un échantillon de silice propre SEM talon et laisser sécher à température ambiante sous vide.
    2. Mesurer images MEB à 8 kV avec une distance de travail de 3-5 mm en utilisant un détecteur de lentille.
  2. Mesurer le potentiel zêta des particules en utilisant un système d'analyse de particules.
    1. Mélanger 10 pl de suspension de particules (10 000 particules / ul) dans de l'éthanol avec 1 ml de 10 mM de tampon phosphate (pH 7,4).
    2. Chargez l'échantillon dans les cellules capillaires plié et en mesurer le potentiel zêta selon les instructions du fabricant.
le "> 3. Chargement de siRNA dans des particules PCPS

  1. Sécher les particules PCPS (PCPS de particules étape de préparation 1,9) sous vide O / N.
  2. Ajouter siRNA (4 pg) dans l'eau sans nucléase (20 pi) pour les particules PCPS secs et brièvement sonicat. Utilisez la particule rapports suivants siARN: 2 × 10 5 particules / 0,2 pg siRNA, 4 × 10 5 particules / 0,2 pg siARN, 6 × 10 5 particules / 0,2 pg siRNA, 8 × 10 5 particules / 0,2 pg siARN, 10 × 10 5 particules / 0,2 ug siRNA et 12 × 10 5 particules / 0,2 ug siARN.
  3. Incuber pendant 3 heures à 4 ° C sur un agitateur (1000 rpm) pour permettre la liaison des particules de siRNA.

4. Optimisation du ratio des particules siRNA / PCPS

  1. Ajouter ADN colorant de charge à 20 pi de particules de siARN PCPS / de contrôle avec particules différents rapports siARN (voir Chargement de siRNA en particules PCPS).
  2. Chargez le sampes dans un gel d'agarose à 2% contenant du gel de l'ADN tache.
  3. Effectuer l'électrophorèse à une tension constante de 120 V pendant 20 min dans un tampon en cours d'exécution.
  4. Analyser le gel avec l'acquisition de l'image et des logiciels d'analyse.

5. Libération de siRNA de PCPS particules

  1. Mélanger 20 pi de particules de siARN PCPS / de contrôle avec particules différents rapports siRNA (voir l'étape 3) en dodécylsulfate de sodium (SDS, 2%) et laisser reposer pendant 1 heure à température ambiante.
  2. Ajouter ADN colorant de charge pour les échantillons.
  3. Charger les échantillons dans un gel agarose à 2% contenant du gel de l'ADN tache.
  4. Effectuer l'électrophorèse à une tension constante de 120 V pendant 20 min dans un tampon en cours d'exécution en utilisant un équipement d'électrophorèse de l'ADN et une alimentation électrique.
  5. Analyser le gel avec l'acquisition de l'image et des logiciels d'analyse.

6. microscopie confocale de PCPS particules

  1. Ajouter 5 ul de particules fluorescentes de siARN de contrôle PCPS / (10 × 10 5 particules / 0.2 pg siRNA / 20 pi) à une lamelle de verre.
  2. Visualiser couches de particules par microscopie confocale.

7. Caractérisation de Arg-PEI / siRNA contrôle nanoparticules

  1. À dégrader le matériau de silicium et former Arg-PEI nanoparticules / contrôle de siARN, ajouter des particules PCPS / siRNA (10 × 10 6 particules PCPS / 2 pg siARN) à 100 pi de tampon phosphate salin et secouer (1000 rpm) à 37 ° C pendant 2 jours.
  2. Centrifuger l'échantillon pendant 30 min à 18 800 xg et récupérer le surnageant.
  3. Mesurer la taille des nanoparticules formées Arg-PEI / siARN avec diffusion de la lumière dynamique (DLS).
    1. Mélanger 10 pi du surnageant avec 1 ml de tampon phosphate 10 mM (pH 7,4) et le placer dans une cuvette en matière plastique.
    2. Mesure de la taille des particules en utilisant un système d'analyse de particules selon les instructions du fabricant.
  4. Déterminer la taille et la morphologie du Arg / PEI-siRNA forménanoparticules avec la microscopie à force atomique.
    1. Prenez 10 pi du surnageant et déposer sur une plaquette de silicium.
    2. Visualisez les particules avec la microscopie à force atomique (AFM).

8. Culture Cellulaire

  1. Culture MDA-MB-231 cellules de cancer du sein humain dans un milieu de culture cellulaire supplémenté avec 10% de sérum bovin fœtal et 1% de pénicilline-streptomycine à 5% de CO2, 95% d'humidité et 37 ° C.

9. microscopie confocale de cellules vivantes avec PCPS particules

  1. cellules de la plaque dans la culture deux puits diapositives à une densité de semis de 3 x 10 5 cellules / puits pendant 24 heures.
  2. Ajouter particules PCPS chargés de siRNA contrôle fluorescent (10 × 10 5 particules / 0,2 pg particules rapport siRNA, 50 nM siRNA) pour les cellules.
  3. Enregistrer un film des cellules avec un microscope confocal (fourni avec une chambre, 5% de CO 2, 95% d'humidité et 37 ° C) pendant 12 heures suivant expo de particulesassurer.

10. microscopie confocale de cellules fixes avec PCPS particules

  1. cellules de la plaque dans la culture deux puits diapositives à une densité de semis de 3 x 10 5 cellules / puits pendant 24 heures.
  2. Ajouter PCPS particules chargées avec l'ARNsi de contrôle fluorescent (10 x 10 5 particules / particules de 0,2 ug rapport siRNA, 50 nM de siRNA) aux cellules et incuber pendant 1 jour, 7 jours et 10 jours.
  3. Laver les cellules deux fois avec une solution saline tamponnée au phosphate, puis les fixer avec une solution de paraformaldehyde à 4% pendant 10 min.
  4. Laver les cellules avec du tampon phosphate salin.
  5. Perméabiliser les cellules avec 0,1% d'octyl phénol éthoxylate pendant 10 min, puis les laver trois fois avec du tampon phosphate salin.
  6. Bloquer les cellules avec de l'albumine de sérum bovin (10 mg / ml) dans une solution saline tamponnée au phosphate pendant 10 min à température ambiante avec agitation douce.
  7. Pour visualiser l'actine filamenteuse, incuber les cellules avec fluorescence phalloïdine marquée (1 pi / 40 piune solution de blocage) pendant 20 min à température ambiante avec agitation douce, puis lavez en tampon phosphate salin.
  8. Retirer les glissières du cadre et ajouter antifade réactif avec 4 ', 6-diamidino-2-phénylindole (DAPI) pour visualiser le noyau.
  9. Ajouter un verre de couverture sur le dessus et prendre des images de cellules avec la microscopie confocale.

11. cytométrie en flux des cellules avec PCPS / fluorescentes contrôle Particules siARN

  1. cellules de la plaque dans une plaque à 6 puits à une densité d'ensemencement de 3 x 10 5 cellules / puits pendant 24 h.
  2. Ajouter PCPS particules chargées avec l'ARNsi de contrôle fluorescent (10 x 10 5 particules / particules de 0,2 ug rapport siRNA, 50 nM de siRNA) aux cellules et incuber pendant 24 heures.
  3. Laver les cellules avec une solution saline tamponnée au phosphate et les gratter avec un grattoir à cellules.
  4. Stocker les cellules dans une solution saline tamponnée au phosphate avec 2% de sérum bovin foetal avant l'analyse. Utilisation des cellules non traitées comme témoin négatif.
  5. Effectuer cy de fluxtometry.

12. viabilité cellulaire des cellules avec des particules et PCPS PCPS / commande particules siARN

  1. cellules de la plaque dans une plaque à 96 puits à une densité cellulaire de 3 × 10 3 cellules / puits pendant 24 heures.
  2. Traiter les cellules avec des particules PCPS (1,5 x 10 5 / puits et 6 × 10 5 / puits) ou des particules de siARN PCPS / de commande (10 x 10 5 particules / 0,2 ug particules rapport siRNA, 10 nM et 100 nM d'ARNsi) de 48 h et 72 h. Utilisation des cellules non traitées et des cellules traitées avec une solution saline tamponnée phosphate (même volume que les particules ajoutées) comme témoins. Doser chaque échantillon en triple exemplaire.
  3. Effectuer un essai de prolifération de cellules selon les instructions du fabricant.
  4. Représenter des données comme la moyenne ± écart-type.

13. Western Blot de cellules avec PCPS / ATM mutées particules siARN

  1. cellules de la plaque dans une plaque à 6 puits à une densité de cellules de 2 x 10 5 cellules / well pendant 24 heures.
  2. Incuber les cellules avec siRNA PCPS / de commande (50 nM) de particules ou PCPS / ATM siRNA (50 nM) particules pour 72 h. Utilisation des cellules non traitées comme témoin.
  3. Lyse des cellules en utilisant un réactif d'extraction de protéine additionné d'un cocktail d'inhibiteurs de protease.
  4. Centrifuger les lysats cellulaires pendant 10 min à 14 000 xg et récupérer le surnageant.
  5. Déterminer la concentration en protéine par un dosage de protéine de quantification selon les instructions du fabricant.
  6. Ajouter tampon de charge d'échantillon (avec 5 pi 2-mercaptoéthanol / ml de tampon) pour les échantillons et les chauffer pendant 6 min à 99 ° C.
  7. Charger les échantillons de protéine (20 ug / ul) dans un gel de SDS-polyacrylamide 12% en tampon en cours d'exécution et exécuter une électrophorèse sur gel de Polyacrylamide (1 h, 120 V) en utilisant un équipement d'électrophorèse et une alimentation électrique.
  8. Transvaser le gel dans un tampon de transfert (avec 20% de methanol) à une membrane de nitrocellulose (1 h, 100 V) en utilisant un équipement d'électrophorèse etune alimentation électrique.
  9. Bloquer la membrane avec 5% de lait en poudre pendant 1 h.
  10. Incuber la membrane avec l'anticorps primaire ATM (de lapin) dans une solution de blocage (à partir de l'étape 13.9) à une dilution de 1: O / N 1000.
  11. Laver la membrane avec du tampon phosphate salin contenant 0,1% de polyethylene glycol sorbitan monolaurate, puis incuber avec l'anticorps secondaire (anti-lapin) dans une solution de blocage (à partir de l'étape 13.9) à une dilution de 1: 2500 pendant 1 heure.
  12. Laver la membrane avec du tampon phosphate salin contenant 0,1% de polyéthylène glycol monolaurate de sorbitan et de détecter les bandes de protéines par Western blot avec un réactif de détection à l'aide de l'acquisition d'image et un logiciel d'analyse.
  13. Pour le contrôle de chargement, laver la membrane et répétez les étapes de 13,9 à 13,12 utilisant un anticorps primaire β-actine (de la souris, 1: 10,000 dilution) et un anticorps secondaire (anti-souris 1: 4000 dilution).

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Representative Results

Ce protocole décrit l'utilisation d'un système de distribution non viral sûr et efficace pour la transfection de siRNA. Les résultats de SEM montrent que les particules PCPS sont de forme cylindrique et ont un diamètre de 2,6 um (figure 2A). Les particules sont chargées positivement à un potentiel zêta d'environ 8,21 (figure 2B), ce qui permet la liaison électrostatique avec des nucleotides chargés négativement. Les images confocales de différentes couches de particules PCPS démontrent que les siRNA contrôle fluorescent est chargé à l'intérieur des particules de silicium poreux (figure 2C). La formation et le rejet de nanoparticules Arg-PEI / siARN des particules de l'ISP a été confirmée avec DLS et l'AFM. La distribution de taille des particules varie de 70 à 120 nm, avec une taille moyenne de 94 nm (Figure 2D). AFM images illustrer le fait que les nanoparticules ont une forme sphérique (figure 2E).

La ratificationo de particules de siRNA a été optimisé par électrophorèse sur gel d'agarose afin de se assurer affinité de liaison élevée (figure 3A). Un large éventail de particules de ratios siARN a été utilisée (2 × 10 5, 4 × 10 5, 6 × 10 5, 8 × 10 5, 10 × 10 5 et 12 × 10 5 ug /0.2 siRNA). Les résultats indiquent que l'ARNsi peut se lier fortement aux particules lorsque la quantité de particules est supérieure à 8 x 10 5. Un rapport de 10 × 10 5 PCPS / 0,2 ug siRNA a été choisi pour les expériences ultérieures. En outre, l'ARNsi a été libéré avec succès à partir du support lors d'un traitement avec du SDS, comme illustré sur la figure 3B.

Ensuite, l'internalisation de cave de particules fluorescentes de siARN de contrôle de PCPS / a été évaluée chez MDA-MB-231 cellules. Les images confocales prises après 24 h de traitement montrent que les particules soient effectivement intégrées dans les cellules (Figure 4 la figure 5 montre que 89% des cellules ont intériorisé PCPS / particules siARN après 24 h d'incubation. En outre, le processus d'internalisation a été enregistrée pendant 12 heures (une vidéo). Ces résultats indiquent que les particules peuvent efficacement délivrer PCPS siRNA dans les cellules. L'accumulation à long terme de l'ARNsi dans les cellules a également été évaluée par microscopie confocale. Au jour 7 jours 10 et l'ARNsi était encore détectable à l'intérieur des cellules (Figure 6).

Un des facteurs les plus importants à considérer lors de l'élaboration d'un système de livraison de siRNA est la sécurité du transporteur 13. PEI est connu de former polyplexes avec siRNA, l'aide de l'absorption cellulaire et déclenchement de presse de l'endosome / lysosome. Cependant, PEI peut avoir des effets toxiques, en raison de la présence de groupes amino primaires chargées positivement dans le squelette 14,15. Par exemple, la liaison de la PEI sur la surface du glycocalyx des cellules peut se traduire par la formation de grandes grappes 16. Afin d'éliminer cette toxicité induite de charge, PEI a été conjugué de manière covalente à l'arginine par l'intermédiaire d'un lieur de pont, afin de réduire le nombre de groupes amino primaires. La viabilité cellulaire est restée supérieure à 95% après 48 h et 72 h lorsque les particules et les ARNsi ont été utilisés à une concentration allant jusqu'à 6 x 10 5 / puits et 100 nM, respectivement (figure 7A). Ensuite, l'efficacité de transfection de siRNA contre l'oncogène ATM a été évaluée dans des cellules MDA-MB-231 cellules. Résultats de Western blot démontrent que les niveaux de protéine de l'ATM sont diminués après le traitement avec PCPS / ATM siRNA (figure 7B). Les résultats suggèrent la plate-forme PCPS est un système de livraison sûre et efficace pour siRNA.

Figure 1
Figure 1. Représentation schématique de silicium poreux (PCPS) particules de polycation-fonctionnalisé. strong> Arginine (Arg) -polyethylenimine (PEI) / nanoparticules petits ARN interférents (siRNA) sont formés suite à la dégradation de silicium (Si).

Figure 2
Figure 2. Caractérisation des particules PCPS. D'image (A) microscopie électronique à balayage (SEM) de particules PCPS. (B) de potentiel Zeta de particules PCPS. (C) images confocale de différentes couches de particules de contrôle de siARN de PCPS / fluorescent. Répartition (D) de la taille des nanoparticules de siARN arginine Arg-PEI / contrôle libérés à partir des microparticules de silicium poreux. (E) la microscopie à force atomique (AFM) images de Arg-PEI / contrôle nanoparticules siARN. Se il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

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Figure 3. Gel d'agarose pour l'optimisation du système de distribution PCPS / de siRNA. (A) L'affinité de liaison entre les particules et PCPS siRNA contrôle. Les bandes représentent non liée siRNA. (B) siRNA presse après incubation avec 2% de SDS pendant 1 heure. Les bandes représentent totale siRNA (traitées et non traitées). Exemple 1: siRNA; Extrait 2: 2 × 10 5 particules PCPS / 0,2 ug siRNA; Extrait 3: 4 × 10 5 particules PCPS / 0,2 ug siRNA; Extrait 4: 6 × 10 5 particules PCPS / 0,2 ug siRNA; Extrait 5: 8 × 10 5 particules PCPS / 0,2 ug siRNA; Extrait 6: 10 × 10 5 particules PCPS / 0,2 ug siRNA; Extrait 7: 12 × 10 5 particules PCPS / 0,2 ug siARN.

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Figure 4. images confocale au microscope de particules / de PCPS fluorescentes siRNA (en rouge) dans MDA-MB-231 cellules (24 heures d'incubation). Le noyau et l'actine filamenteuse a été visualisées avec 4 ', 6-diamidino-2-phénylindole (DAPI, bleu ) et phalloïdine (vert), respectivement. Trois couches différentes ont été imagées (haut, moyen et de base). Se il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Figure 5
Figure 5. d'écoulement de l'analyse par cytométrie quantitative fluorescentes MDA-MB-231 cellules après incubation avec des particules de siARN fluorescent PCPS / de contrôle. Des cellules non traitées ont été utilisées comme témoin négatif. 89% des cellules avait intériorisé les particules.

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Figure 6. images confocale de contrôle fluorescente siRNA (rouge) à l'intérieur MDA-MB-231 cellules. Les cellules ont été incubées avec PCPS / fluorescentes particules de contrôle de siARN pour 1 jour, 7 jours et 10 jours. Les cellules ont été ensuite visualisées par microscopie confocale. Le noyau et filamenteuses actine a été visualisée avec 4 ', 6-diamidino-2-phénylindole (DAPI, bleu) et phalloïdine (vert), respectivement. Se il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Figure 7
Figure 7. La viabilité des cellules et le silençage de gènes in vitro. (A) un essai de viabilité cellulaire de cellules incubées avec des particules et des particules PCPS PCPS / contrôle d'ARNsi (SCR). L'expérience a été réalisée en voyagelicate et les résultats sont présentés en moyenne ± écart-type. Des cellules non traitées (en blanc) et les cellules incubées avec du PBS ont été utilisés comme témoins. (B) de Western blot de PCPS / ataxie télangiectasie muté (ATM) siARN particules. Les cellules ont été exposées à PCPS / contrôle siRNA (SCR) des particules et les particules PCPS / ATM siARN. Cellules non traitées (de maquettes) ont été utilisés comme témoin. β-actine a été utilisée comme témoin de chargement.

Vidéo 1 absorption. dépendant du temps de PCPS / fluorescentes particules de siARN de contrôle en direct des cellules MDA-MB-231. La vidéo a été enregistrée pendant 12 heures après l'exposition des cellules à des particules.

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Discussion

Ce protocole décrit un procédé pour le succès de livraison de siRNA et la transfection dans les cellules. En particulier, la délivrance de siRNA est obtenue en utilisant une plate-forme multifonctionnelle constituée de particules de l'ISP polycation-fonctionnalisé. L'utilisation de la thérapie siRNA a un grand potentiel, par exemple, le traitement du cancer, que divers oncogènes peuvent être ciblées avec une grande spécificité. Par conséquent, il existe une demande pour développer des véhicules de livraison de siRNA, qui peut atténuer les défis de la thérapie siRNA. En conclusion, nous avons décrit un protocole qui est prometteur pour la prestation sécuritaire et efficace de siRNA. Cependant, il ya certains facteurs clés qui devraient être prises en compte lors de l'exécution de la technique décrite. Par exemple, un facteur important lors de la préparation des particules PCPS est de traiter le siRNA soin, afin d'éviter la dégradation par les nucleases. En particulier, des gants propres et RNAse tubes gratuits et de l'eau devraient être utilisés en tout temps lorsque vous travaillez avecsiRNA. Si l'efficacité de transfection de siRNA est faible, un spray qui écarte RNAse contamination peut être utilisé pour pulvériser des gants et des zones de travail. En outre, si la transfection est infructueuse, le siRNA doit être testé avec un réactif de transfection commerciaux, pour déterminer si le problème est provoqué par l'ARNsi ou des particules. Un autre élément clé pour la mise en œuvre réussie du système de livraison / siRNA de PCPS est de prendre soin lors de l'exécution de centrifugation et de lavage étapes. A savoir, le surnageant doit être entièrement écartés afin d'éliminer l'excès de réactifs qui sont nécessaires tout au long des étapes de préparation de particules.

Un avantage important du système PCPS / de délivrance de siRNA est la sécurité. Plusieurs agents de transfection siARN ont une charge cationique élevée, ce qui contribue à la toxicité cellulaire 13,15. En effet, la plupart des protocoles commerciaux indiquent que les réactifs doivent être incubées avec les cellules pendant quelques heures, afin d'éviter la mort cellulaire. Au contraire, CElls peuvent être exposés à des particules PCPS pendant plusieurs jours sans aucun signe de toxicité, comme il est évident à partir des résultats de viabilité cellulaire. Les particules peuvent se lier PCPS siRNA avec une affinité élevée en raison de la présence de PEI. Cependant la toxicité de charge induite par de PEI est empêché par la configuration unique de la plate-forme de livraison. Surtout la liaison de Arg à l'Île covalente et l'encapsulation de l'intérieur de la PEI Si pores contribuer à une toxicité réduite. Un autre avantage de la plate-forme qui est PCPS siRNA transfection peut avoir lieu en présence de sérum. D'autres procédés existants nécessitent généralement l'utilisation de milieux de culture cellulaire exempt de sérum, ce qui ajoute des étapes supplémentaires dans le processus de transfection et potentiellement interférer avec les voies de signalisation réguliers cellulaire.

Un avantage supplémentaire du système PCPS est qu'il ne nécessite pas de modification des molécules d'ARNsi. Alors que certaines méthodes actuelles nécessitent des étapes de conjugaison complexes pour stabiliser le siRNA ou pour permettre à cinternalisation ellular 13, le système se appuie sur PCPS simple mélange pour siRNA chargement. La liaison de PEI et les pores dans le matériau de Si fournir un environnement protecteur pour l'ARNsi, réduisant ainsi le contact avec des nucleases. Les particules PCPS peuvent être stockés pendant de longues périodes de temps que la matière séchée ou dans l'alcool isopropylique. De plus, si les particules PCPS / ARNsi sont lyophilisées ils peuvent être stockés pendant au moins trois mois à 4 ° C. Les particules PCPS lyophilisées devraient être suspendues dans RNase eau libre juste avant la transfection, et ne devraient pas être entreposés dans une solution. Enfin, les permis de plate-forme de PCPS libération prolongée de siRNA, comme indiqué précédemment 11, augmentant par conséquent la période de temps dans laquelle gènes cibles demeurent supprimées. En conséquence, après internalisation cellulaire, les particules de silicium se dégradent progressivement, résultant en la formation de nanoparticules Arg-PEI / ARNsi. Par la suite, l'ARNsi est lentement libéré dans le cytoplasme, où elle peut se lier à messedoigt ARN (ARNm), exerçant ainsi une activité biologique. Bien que, les particules PCPS offrent plusieurs avantages par rapport aux méthodes existantes de délivrance d'ARNi, une limitation de la technique est que les microparticules non fonctionnalisés PSI sont nécessaires comme matériau de départ. Alors que les particules peuvent être synthétisés en utilisant la photolithographie et gravure électrochimique 17, ces techniques ne sont pas disponibles dans tous les établissements.

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Materials

Name Company Catalog Number Comments
Polyethylenimine (PEI), branched Sigma-Aldrich 408727 Average molecular weight ~25,000 Da
L-Arginine Sigma-Aldrich A5006 Reagent grade, ≥98%
Boc-Asp-OH Sigma-Aldrich 408-468 99%
Hydrogen peroxide solution Sigma-Aldrich 216763 30 wt. % in H2O
Sulfuric acid Sigma-Aldrich 339741 100.00%
Isopropyl alcohol Sigma-Aldrich W292907 ≥99.7%
Ethanol Sigma-Aldrich 459844 ≥99.5% 
N-(3-Dimethylaminopropyl)-N′-ethylcarbodiimide hydrochloride (EDC) Sigma-Aldrich 03449 ≥99%
Albumin from bovine serum Sigma-Aldrich A7030-10G Blocking agent
Ataxia-telangiectasia mutated siRNA  Sigma-Aldrich Designed in-house
Tris Acetate-EDTA buffer Sigma-Aldrich T9650 For DNA agarose gel electrophoresis
Penicillin-Streptomycin Sigma-Aldrich P4333
Fetal Bovine Serum Sigma-Aldrich F2442
TWEEN 20 Sigma-Aldrich P1379 Polyethylene glycol sorbitan monolaurate
2-Mercaptoethanol Sigma Aldrich M6250 For Western blot
Sodium dodecyl sulfate Sigma-Aldrich L3771
Sodium phosphate monobasic Sigma-Aldrich 71496 For making phosphate buffer 
Sodium phosphate dibasic Sigma-Aldrich 71640 For making phosphate buffer
Anti-Mouse IgG Sigma-Aldrich A4416 Secondary antibody (anti-mouse) for Western blot
N-Hydroxysuccinimide (NHS) Sigma-Aldrich 130672 98%
CELLSTAR 96W Microplate Tissue Culture Treated Clear w/ Lid Greiner Bio-One 655182 96-well plate
10x Tris-Glycine Liquid Li-Cor  928-40010 Transfer buffer for Western blot
Paraformaldehyde solution 4% in PBS  Santa Cruz Sc-281692 Fixation of cells
CellTiter 96 AQueous Non-Radioactive Cell Proliferation Assay (MTS) Promega G5421 Proliferation assay
Phosphate buffered saline Fisher Scientific BP399-500 10x Solution
Corning cellgro Dulbecco's Modification of Eagle's (Mod.) Fisher Scientific  MT-15-017-CM Cell culture media, 1x solution
Triton X-100 Fisher Scientific AC21568-2500 Octyl phenol ethoxylate, permeabilization agent
Cover glass Fisher Scientific 12-530C 
Methanol Fisher Scientific  A412-1 For Western blot transfer buffer
Plastic Cuvettes Fisher Scientific  14-377-010  For size measurements using Zetasizer Nano ZS
Molecular BioProducts RNase AWAY Surface Decontaminant Fisher Scientific 14-754-34 Spray for removing RNAse contamination
Agarose Fisher Scientific BP165-25 Low melting point, for running RNA samples
ProLong Gold Antifade Reagent with DAPI  Invitrogen P36935 Antifade reagent with DAPI, nucelus detection
Alexa Fluor 488 Phalloidin Invitrogen A12379 Dissolve 300 units in 1.5 ml methanol, detection of filamentous actin
SYBR Safe DNA Gel Stain Invitrogen S33102 Visualization of RNA
Negative Control siRNA Qiagen 1022076 Control siRNA
AllStars Neg. siRNA AF 555 Qiagen 1027294 Fluorescent control siRNA
Cell scraper Celltreat 229310
BioLite Multidishes and Microwell Plates Thermo Scientific 130184 6-well plate
Pierce LDS Sample Loading Buffer (4x) Thermo Scientific 84788 Sample loading buffer for Western blot
Pierce BCS Protein Assay Kit Thermo Scientific 23227 Protein quantification assay
Halt Protease Inhibitor Single-Use Cocktails (100x) Thermo Scientific 78430 Protease inhibitor cocktail, use at 1x
M-PER Mammalian Protein Extraction Reagent Thermo Scientific  78501 Protein extraction reagent
Sorvall Legend Micro 21R Thermo Scientific 75002440 Centrifuge
Beta Actin Antibody  Thermo Scientific  MA1-91399 β-actin primary antibody (from mouse) for western blot
6x TriTrack DNA Loading Dye Thermo Scientific R1161 DNA loading dye
Nuclease-Free Water  Life Technologies AM9938
Non-Fat Dry Milk Lab Scientific M0841 For Western blot
2-well BD Falcon culture slides  BD Biosciences 354102 2-well culture slides
Amersham ECL Western blot detection reagent GE Healthcare Life Sciences RPN2106 Western blot detection reagent
BA Membranes GE Healthcare Life Sciences 10402096 Nitrocellulose membrane for Wester blot
ATM (D2E2) Rabbit mAb Cell Signaling 2873S ATM primary antibody (from rabbit) for Western blot
Anti-rabbit IgG, HRP-linked Antibody Cell Signaling  7074 Secondary antibody (anti-rabbit) for Western blot 
Folded capillary cells Malvern  DTS 1061 For zeta potentail measurements using Zetasizer Nano ZS
MDA-MB-231 cell line ATCC HTB-26 Mammary Gland/Breast
12% Mini-PROTEAN TGX Gel Bio-rad 456-1043  For Western blot
Biorad PowerPac HC Bio-rad 164-5052 Power supply for electrophoresis
10x Tris/Glycine/SDS Buffer Bio-rad 161-0732 Running buffer for Western blot
Wide Mini-Sub Cell GT Cell Bio-rad 170-4405 Electrophoresis equipment for DNA agarose gel 
Mini-PROTEAN Tetra cell Bio-rad 165-8000 Electrophoresis equipment for Western blot
ChemiDoc XRS+ System with Image Lab Software Bio-rad 170-8265 Image acquisition and analysis software for gels and blots
4" (10 cm) dia., 5 x 7 mm diced Silicon Wafer Ted Pella  16007 Silicon waferfor scanning electron microscopy and atomic force microscopy
Thermomixer R Eppendorf 22670107 Shaker 
Isoton II diluent Beckman Coulter 8546719 Isoton diluent
Multisizer 4 Coulter Counter Beckman Coulter A63076 Particle counting analyzer
Non-functionalized porous silicon particles  Microelectronics Research Center, University of Texas at Austin Dicoidal shape. 2.6 μm (diameter) x 0.7 μm (height), provided in isopropyl alcohol
Zetasizer Nano ZS Malvern Particle analyzer system for size and zeta potential 
Scanning Electron Microscope FEI Particle size and shape 
Atomic Force Microscope Bruker Particle size and shape
Fluo ViewTM 1000 Confocal Microscope Olympus Visualization of fixed and live cells

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References

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