siRNAの治療を送達するための多孔質シリコンマイクロ粒子

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Summary

配信は、低分子干渉RNA(siRNA)の治療的実施のための主要な課題である。このプロトコルは、アルギニン及びポリエチレンイミングラフト化多孔質シリコン微粒子からなる多機能性および生体適合性siRNA送達プラットフォームの使用を含む。

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Shen, J., Wu, X., Lee, Y., Wolfram, J., Yang, Z., Mao, Z. W., Ferrari, M., Shen, H. Porous Silicon Microparticles for Delivery of siRNA Therapeutics. J. Vis. Exp. (95), e52075, doi:10.3791/52075 (2015).

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Abstract

Introduction

低分子干渉RNA(siRNA)は、遺伝子の発現を抑制することができる二本鎖RNA分子である。近年では、siRNAは、臨床応用1-5将来の使用のための治療の可能性を示してbiodrugsの新世代として開発されている。しかし、siRNAの治療の成功の実装が原因ヌクレアーゼ、貧しい細胞内取り込み、低トランスフェクション効率およびエンドソーム/リソソーム5から非効率的なリリースによる分解に、かなりの課題である。これらの障害の多くは、安全かつ効率的に病変組織にsiRNAを送達することができ、配信プラットフォームの開発によって克服することができる。ウイルスのキャリアと比較して、非ウイルスプラットフォームは、安全性、低コスト、調整の容易さなどのいくつかの利点を提供する。特に、このようなポリマーおよび脂質などの陽イオン性ナノ粒子は、siRNA送達のために有用3が証明されている。

以前、我々は、円盤状のDRを開発したUG送達システム、多段ベクトル(MSV)と呼ばれる。このプラットフォームは、1つの車両が別のから解放されているシーケンシャルな段階に基づいている。第二段目の車両が薬物または造影剤6,7を装填したナノ粒子である一方、第段階車両は、生分解性の多孔質シリコン(のpSi)から作られたマイクロ粒子である。 Siは8を分解するのpSi材料に埋め込 ​​まれたナノ粒子は、徐々に放出される。 Si粒子を使用する利点は、形態および表面特性を容易に最適な生体内分布および薬物放出を達成するように調整することができることである。最近、腫瘍組織へのsiRNAのリポソームの送達のためのMSVプラットホームの使用の成功は、卵巣癌および乳癌のマウスモデル9、10に示した。

本研究では、MSVプラットフォームのプリンシパルに基づいてsiRNAのための普遍的なデリバリーシステムを作製した。この送達システムの有効性は、以前に我々を実証されている異なるsiRNA分子11をる。システムは、ポリエチレンイミン(PEI)およびアルギニン(Argで)でグラフトされたpSiからなる、ポリカチオン官能化多孔質シリコン(PCPS)担体である。以前に11 demonstartedとしてArgおよびのpSiが、PEIの毒性を減少するために役立つことができるが、PEIは、siRNAとの静電相互作用を形成するのを助けることができる。のpSi微粒子がsiRNAの保護と持続的な放出を可能にしながら、また、PEIの存在は、細胞内取り込みとエンドソーム脱出を支援することができます。のpSi粒子が徐々に異なる形態および狭いサイズ分布11を有しているのArg-PEI / siRNAのナノ粒子( 図1)の形成をもたらす、生理学的条件下で分解する。 PCPS / siRNAのシステムの安定性に関する詳細については、シェンの研究を参照してください。11。第二段階のナノ粒子は最初にpresaの複数形ではないので、このPCPSプラットフォームは、従来のMSVとは異なるntのキャリアであるが、第一段階キャリヤ11、12を劣化させるような時間をかけて形成されている。PCPSシステムのsiRNA積載効率、細胞毒性および遺伝子サイレンシング効率は、 インビトロで評価されている。トランスフェクション効率は、DNA修復10に関与する突然変異した毛細血管拡張性運動失調(ATM)癌遺伝子に対するsiRNAを用いて測定した。以前に、ATMの抑制は乳癌モデル10における腫瘍増殖を減少させることが示されている。

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Protocol

1. PCPS粒子の準備

  1. 2時間、95℃での過酸化水素の30%溶液中の非官能化多孔質シリコン粒子を酸化する。緩やかに攪拌しながら65℃で2日間、イソプロピルアルコール2%(3-アミノプロピル)トリエトキシシランの溶液中で酸化された粒子をアミノ化。
  2. ペレットを懸濁する短時間の超音波処理を使用して、18,800×gで30分間溶液を遠心し、イソプロピルアルコールとエタノールで3回二粒子を洗浄する。ステップ1.3および1.4を実行する際にエタノール溶液中の粒子のままにしておきます。
  3. アイソトン希釈液10mlに粒子懸濁液( 例えば 、10μl)を既知の容量を追加し、ストック溶液中の粒子の濃度を決定するために、粒子計数分析装置の粒子を数える。
  4. (3-ジメチルアミノプロピル) - - N 'エチルカルボジイミド塩酸塩(EDC、0.1ナノモル)/ N NとL-アルギニン(0.1ナノモル)の酸基を活性
  5. 簡単に言えば、粒子原液を超音波処理し、L-アルギニン溶液に10億粒子を添加し、緩やかに攪拌しながら室温で18時間反応を残す。
  6. で4時間エタノール20mlにEDC(0.1ナノモル)/ NHS(0.1ナノモル)と(tert-ブトキシカルボニル)-L-アスパラギン酸カルボニル(Boc-ASP-OH、1ナノモル) - Nの最初のアスパラギン酸グループをアクティブ化緩やかに攪拌しながら4℃。
  7. 10ミリリットルのエタノール中50 mgのポリエチレンイミンを溶解及びBoc-ASP-OH混合物にソリューションを追加します。反応を穏やかに撹拌しながら室温で24時間進行しましょう​​。
  8. 緩やかに攪拌しながら6時間4℃でEDC(0.1ナノモル)/ NHS(0.1ナノモル)とのBoc-ASP-OH / PEI溶液の第二アスパラギン酸基をアクティブにします。
  9. PCPS粒子を得るためには、ステップ1.8からのBoc-ASP-OH / PEI溶液にステップ1.5から粒子溶液を追加。反応は穏やかST RTで18時間進行させる irring。
  10. ペレットを懸濁する短時間の超音波処理を使用して、18,800×gで30分間溶液を遠心し、エタノールで粒子溶液を3回洗浄する。

2. PCPS粒子特性評価

  1. 走査型電子顕微鏡(SEM)を用いて、粒子のサイズを測定する。
    1. きれいなシリカのSEMサンプルスタブ上の粒子懸濁液を一滴(エタノール中万個/μl)を配置し、真空下、室温で乾燥させてください。
    2. レンズ内検出器を用いての3-5mm作業距離8 15kVでSEM画像を測定する。
  2. 粒子アナライザーシステムを用いて、粒子のゼータ電位を測定する。
    1. 1ミリリットルの10mMリン酸緩衝液(pH7.4)で、粒子懸濁液10μl(エタノール中万個/μl)を混ぜる。
    2. 折り畳まれた毛細管細胞にサンプルをロードし、製造者の指示に従ってゼータ電位を測定する。
ル "> 3。PCPS粒子へのsiRNAのロード中

  1. 真空O / Nの下(PCPS粒子作製工程1.9から)PCPS粒子を乾燥させます。
  2. 乾燥したPCPS粒子と超音波処理を簡単にヌクレアーゼフリー水(20μL)中のsiRNA(4μgの)を追加します。 siRNAの比率に次粒子を使用してください:2×10 5個/ 0.2μgのsiRNAを、4×10 5個/ 0.2μgのsiRNAを、6×10 5個/ 0.2μgのsiRNAを、8×10 5個/ 0.2μgのsiRNAを、10× 10 5個/ 0.2μgのsiRNAおよび12×10 5個/ 0.2μgのsiRNAを。
  3. siRNAは、粒子への結合を可能にするためにシェーカー上で4℃で3時間(1,000 rpm)でインキュベートする。

のsiRNA / PCPSパーティクル比の4の最適化

  1. siRNAの比が異なる粒子(PCPS粒子へのsiRNAのロードを参照)PCPS /コントロールsiRNA粒子の20μlにDNAローディング色素を追加します。
  2. SAMのロードDNAゲル染色を含む2%アガロースゲルに公正妥当。
  3. ランニング緩衝液中で20分間120 Vの定電圧で電気泳動を行います。
  4. 画像取得と解析ソフトウェアでゲルを分析します。

PCPS粒子からのsiRNAの5リリース

  1. ドデシル硫酸ナトリウム(SDS、2%)中のsiRNA比(ステップ3を参照)とは異なる粒子とPCPS /対照siRNA粒子の20μLを混合し、室温で1時間放置する。
  2. サンプルにDNAローディング色素を追加します。
  3. DNAゲル染色を含む2%アガロースゲルにロードしたサンプル。
  4. DNAの電気泳動装置と電源を用いてランニング緩衝液中で20分間、120 Vの定電圧で電気泳動を行う。
  5. 画像取得と解析ソフトウェアでゲルを分析します。

PCPS粒子の6。共焦点顕微鏡

  1. PCPS /蛍光コントロールsiRNA粒子(10×10 5個/ 0の5μlを添加する。ガラスカバースリップへの2μgのsiRNA / 20μL)。
  2. 共焦点顕微鏡により粒子層を可視化。

のArg-PEI /コントロールsiRNAナノ粒子の7キャラ

  1. シリコン材料を分解およびArg-PEI /対照siRNAナノ粒子を形成するために、リン酸緩衝生理食塩水100μlにPCPS / siRNAの粒子(10×10 6 PCPS粒子/2μgのsiRNA)を追加し、37℃で(1,000 rpm)で振る2日。
  2. 18800×gで30分間サンプルを遠心し、上清を収集します。
  3. 動的光散乱(DLS)による形成のArg-PEI / siRNAのナノ粒子のサイズを測定する。
    1. 1ミリリットルの10mMリン酸緩衝液(pH7.4)で10μlの上清を混合し、プラスチック製キュベットに配置します。
    2. 製造業者の説明書に従って粒子アナライザーシステムを用いて粒子のサイズを測定する。
  4. 形成されたのArg / PEI-siRNAのサイズと形態を決定します原子間力顕微鏡のナノ粒子。
    1. シリコンウエハー上に上清と場所の10μlのを取る。
    2. 原子間力顕微鏡(AFM)を有する粒子を可視化する。

8.細胞培養

  1. 細胞培養培地中で培養MDA-MB-231ヒト乳癌細胞を、10%ウシ胎児血清および1%ペニシリン-ストレプトマイシン、5%CO 2、湿度95%及び37℃で補充した。

PCPS粒子との生細胞の9共焦点顕微鏡

  1. 2ウェル培養プレート中で細胞を24時間/ウェルの3×10 5細胞の播種密度でスライドする。
  2. 細胞に蛍光対照siRNAを搭載しPCPS粒子(10×10 5個/ siRNAの比に0.2μgの粒子、50 nMのsiRNA)を追加します。
  3. 12時間後の粒子博覧会のために(チャンバに付属、5%CO 2、湿度95%、37℃)、共焦点顕微鏡で細胞の映画を記録確認してください。

PCPS粒子との固定された細胞の10共焦点顕微鏡

  1. 2ウェル培養プレート中で細胞を24時間/ウェルの3×10 5細胞の播種密度でスライドする。
  2. 細胞に蛍光対照siRNA(10×10 5個/ siRNAの比に0.2μgの粒子、50 nMのsiRNA)をを搭載しPCPS粒子を追加し、1日、7日間と10日間インキュベートする。
  3. リン酸緩衝生理食塩水で細胞を2回洗浄し、その後、10分間、4%パラホルムアルデヒド溶液で固定します。
  4. リン酸緩衝生理食塩水で細胞を洗浄。
  5. 10分間0.1%のオクチルフェノールエトキシレートと細胞を透過した後、それらをリン酸緩衝生理食塩水で三回洗浄する。
  6. 穏やかに攪拌しながら室温で10分間、リン酸緩衝生理食塩水、ウシ血清(10 mg / ml)でのアルブミンで細胞をブロックする。
  7. 繊維状アクチンを可視化するために、蛍光標識したファロイジン(1μL/ 40μlの細胞をインキュベート穏やかに攪拌しながら室温で20分間この溶液)をブロックした後、リン酸緩衝生理食塩水で洗う。
  8. フレームからスライドを削除し、核を可視化するために4 '、6-ジアミジノ-2-フェニルインドール(DAPI)で抗退色試薬を加える。
  9. 上にカバーガラスを追加し、共焦点顕微鏡を用いた細胞の画像を撮影する。

PCPS /蛍光コントロールsiRNA粒子を用いた細胞の11。フローサイトメトリー

  1. 24時間/ウェルの3×10 5細胞の播種密度で、6ウェルプレート中の細胞をプレート。
  2. 細胞に蛍光対照siRNAを搭載しPCPS粒子(10×10 5個/ siRNAの比に0.2μgの粒子、50 nMのsiRNA)を追加し、24時間インキュベートする。
  3. リン酸緩衝生理食塩水で細胞を洗浄し、細胞スクレーパーでそれらをこすり。
  4. 分析前に、2%ウシ胎児血清を含むリン酸緩衝生理食塩水で細胞を保存する。ネガティブコントロールとして未処理細胞を使用してください。
  5. 流れCYを実行しますtometry。

PCPS粒子およびPCPS /コントロールsiRNA粒子を用いた細胞の12細胞の生存率

  1. 24時間/ウェルの3×10 3個の細胞密度で96ウェルプレート中の細胞をプレート。
  2. PCPS粒子で細胞を処理(1.5×10 5 /ウェルおよび6×10 5 /ウェル)またはPCPS /コントロールsiRNA粒子48(10×10 5個/ siRNAの比に0.2μgの粒子、10および100nMのsiRNA)時間と72時間。対照としてリン酸緩衝生理食塩水(追加粒子と同じ体積)で処理した未処理細胞および細胞を使用する。三連で各サンプルをアッセイ。
  3. 製造業者の説明書に従って細胞増殖アッセイを行う。
  4. 平均±標準偏差としてデータを表す。

PCPS / ATM変異のsiRNA粒子を用いた細胞の13ウエスタンブロット

  1. 細胞密度で6ウェルプレート中の細胞をプレートに2×10 5細胞/ワット24時間のエル。
  2. PCPS /コントロールsiRNA(50 nM)の粒子またはPCPS / ATM siRNAを72時間(50 nM)の粒子で細胞をインキュベートする。コントロールとして未処理細胞を使用してください。
  3. 溶解プロテアーゼ阻害剤カクテルを補充したタンパク質抽出試薬を用いて細胞。
  4. 14000×gで10分間の細胞溶解物を遠心し、上清を回収する。
  5. 製造業者の説明書に従ってタンパク質定量アッセイを用いてタンパク質濃度を決定する。
  6. (5μlの2-メルカプトエタノール/ mlのバッファーで)サンプルローディングバッファーをサンプルに添加し、99℃で6分間、それらを加熱する。
  7. ランニング緩衝液中で12%SDSポリアクリルアミドゲル中のタンパク質サンプル(20μgの/μl)をロードし、電気泳動装置と電源を用いてポリアクリルアミドゲル電気泳動(1時間、120 V)を行う。
  8. 電気泳動装置を用いてニトロセルロース膜(1時間、100 V)を(20%メタノール)転写バッファーでゲルを転送し電源。
  9. 1時間5%ドライミルクで膜をブロックします。
  10. 千希釈O / N:1で(ステップ13.9)からブロッキング溶液中で(ウサギから)ATM一次抗体で膜をインキュベートする。
  11. 1時間2500希釈:1、0.1%ポリエチレングリコールソルビタンモノラウレートを含有するリン酸緩衝生理食塩水でメンブレンを洗浄した後(ステップ13.9)から、ブロッキング溶液中で二次抗体(抗ウサギ)と一緒にインキュベートする。
  12. 0.1%ポリエチレングリコールソルビタンモノラウレートを含有するリン酸緩衝生理食塩水でメンブレンを洗浄し、画像取得及び解析ソフトウェアを用いてウェスタンブロット検出試薬を有するタンパク質バンドを検出する。
  13. 二次抗体(抗マウス1:4000希釈):ローディングコントロールのために、膜と繰り返し(10,000希釈マウスから、1)βアクチン一次抗体を使用して13.9から13.12ステップ洗う。

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Representative Results

このプロトコルは、安全で効率的なsiRNAトランスフェクションのための非ウイルス送達システムの使用を記載する。 SEMの結果は、PCPS粒子の形状は円筒形であり、2.6ミクロン( 図2A)の直径を有することが明らかになった。粒子は、正にそれによって負に帯電したヌクレオチドと結合静電が可能約8.21のゼータ電位( 図2B)が充電される。 PCPS粒子の異なる層の共焦点画像は、蛍光対照siRNAは、多孔質シリコン粒子( 図2C)内に読み込まれたことを示している。のpSi粒子からのArg-PEI / siRNAのナノ粒子の形成及び放出は、DLSおよびAFMで確認した。粒子のサイズ分布は、94ナノメートル( 図2D)の平均サイズは、70〜120ナノメートルの範囲であった。 AFM画像は、ナノ粒子は球状( 図2E)を有することを示す。

RATIsiRNAと粒子のoが高い結合親和性( 図3A)を確保するために、アガロースゲル電気泳動によって最適化した。siRNAの比は粒子の広い範囲(2×10 5を使用し、4×10 5、6×10 5、8×10 5、10×10 5および12×10 5もウイルス力価μgのsiRNA)を。結果は、粒子の量は8×10 5以上であるとき、siRNAは、粒子に強固に結合することができることを示す。10×10 5 PCPS /0.2μgのsiRNAの比率がさらなる実験のために選択した。 SDSで処理した場合にさらに、siRNAは、成功して、図3(b)に示すように、キャリアから発売された。

次に、PCPS /蛍光対照siRNA粒子のセラー内在化は、MDA-MB-231細胞で評価した。共焦点画像は、粒子が効果的に細胞内に内在化される治療のショーの24時間( 図4の後に撮影し図5は、細胞の89%インキュベーションの24時間後にPCPS / siRNAの粒子を内部化していることを示している。また、内在化プロセスは12時間( ビデオ1)を記録した。これらの結果は、PCPS粒子が効率的に細胞内にsiRNAを送達できることを示している。細胞内でsiRNAの長期蓄積はまた、共焦点顕微鏡により評価した。 7日目と10日目にsiRNAは、まだ細胞( 図6)の内側に検出可能であった。

siRNA送達系を開発する際に考慮すべき最も重要な要素の一つは、キャリア13の安全性である。 PEIはsiRNAを、細胞取り込みおよびエンドソーム/リソソームからのトリガリリースの助けを借りて、ポリプレックスを形成することが知られている。しかし、PEI起因バックボーン14,15における正に荷電した第一級アミノ基の存在のために、毒性効果を有することができる。例えば、PEIは、foのをもたらすことができる細胞表面上の糖衣に結合大規模なクラスタ16のrmation。この電荷誘起毒性を排除するために、PEIは、共有一級アミノ基の数を減らすために、ブリッジのリンカーを介してアルギニンに結合させた。粒子およびsiRNAは、最大6×10 5 /ウェルで100 nMのそれぞれ、( 図7A)の濃度で使用した場合、細胞生存率を48時間後および72時間後に95%の上に残った。次に、癌遺伝子ATMに対するsiRNAのトランスフェクション効率は、MDA-MB-231細胞で評価した。ウェスタンブロットの結果は、ATMのタンパク質レベルは、PCPS / ATMのsiRNA( 図7B)で処理した後に減少することを示している。結果は、PCPSプラットフォームがsiRNAのための安全で効率的な配信システムであることを示唆している

図1
ポリカチオン官能化多孔質シリコン(PCPS)粒子の1模式図。 strong>のアルギニン(Argで)-polyethylenimine(PEI)は/低分子干渉RNA(siRNA)のナノ粒子は、シリコン(Si)の分解後に形成されている。

図2
PCPS粒子の図2キャラ。PCPS粒子(A)の走査型電子顕微鏡(SEM)画像。 (B)PCPS粒子のゼータ電位。 (C)PCPS /蛍光対照siRNA粒子の異なる層の共焦点画像。 (D)多孔質シリコンマイクロ粒子から放出されたアルギニンはArg-PEI /対照siRNAナノ粒子のサイズ分布。のArg-PEI /コントロールsiRNAナノ粒子の(E)原子間力顕微鏡(AFM)像。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。

常に ">:" =キープtogether.withinページFO」ve_content 図3
PCPS / siRNA送達システムの最適化のための図3.アガロースゲル。(A)PCPS粒子間の結合親和性及びコントロールsiRNA。バンドは、結合していないのsiRNAを表します。 1時間、2%SDSとのインキュベーション後(B)のsiRNAの放出。バンドは(非結合および結合)の合計のsiRNAを表す。サンプル1:siRNAは、サンプル2:2×10 5 PCPS粒子/ 0.2μgのsiRNAは、サンプル3:4×10 5 PCPS粒子/ 0.2μgのsiRNAは、サンプル4:6×10 5 PCPS粒子/ 0.2μgのsiRNAは、サンプル5:8×10 5 PCPS粒子/ 0.2μgのsiRNAは、サンプル6:10×10 5 PCPS粒子/ 0.2μgのsiRNAは、サンプル7:12×10 5 PCPS粒子/ 0.2μgのsiRNAを。

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MDA-MB-231細胞(24時間インキュベーション)における図PCPS /蛍光のsiRNA粒子(赤)の4共焦点顕微鏡像。核糸状アクチン4で可視化した'、6-ジアミジノ-2-フェニルインドール(DAPI、青それぞれ)とファロイジン(緑)、。三つの異なる層は(上、中·基礎)画像化した。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。

図5
図5 PCPS /対照の蛍光siRNAの粒子とのインキュベーション後の蛍光MDA-MB-231細胞の定量的フローサイトメトリー分析を。未処理細胞を陰性対照として使用した。細胞の89%が粒子を内部移行していた。

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図MDA-MB-231細胞内で蛍光対照siRNA(赤)の6の共焦点画像。細胞PCPS /蛍光対照siRNAで1日間粒子、7日およ ​​び10日でインキュベートした。次いで、細胞を共焦点顕微鏡で可視化した。核と繊維状アクチンは、4 '、6-ジアミジノ-2-フェニルインドール(DAPI、青)とファロイジン(緑色)で可視化し、それぞれ。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。

図7
図7細胞の生存率およびin vitroでの遺伝子サイレンシング。(A)PCPS粒子およびPCPS /対照siRNA粒子(Scrの)と共にインキュベートした細胞の細胞生存率アッセイ。実験は旅行で行ったlicate、結果は平均±標準偏差として提示されている。 PBSと共にインキュベートし、未処理細胞(ブランク)と細胞を対照として使用した。 (B)変異したPCPS /毛細血管拡張性運動失調(ATM)のsiRNA粒子のウエスタンブロット。細胞は、PCPS /対照siRNA(Scrの)粒子とPCPS / ATM siRNAの粒子に曝露した。未処理の細胞(モック)を対照として使用した。 βアクチンをローディング対照として使用した。

映像1ライブMDA-MB-231細胞におけるPCPS /蛍光対照siRNA粒子。時間依存性の取り込みは、ビデオが粒子に細胞を曝露した後12時間記録した。

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Discussion

このプロトコルは、細胞へのsiRNAの配信の成功とトランスフェクションのための方法を説明します。具体的には、siRNAの送達は、カチオン官能化されたpSi粒子からなる多機能プラットフォームを使用することによって達成される。様々な癌遺伝子は高い特異性で標的化することができるようにするsiRNA療法の使用は、大きな可能性、 例えば 、癌治療を有する。したがって、siRNAの治療の課題を軽減することができるsiRNA送達ビヒクルを開発する要望が存在する。結論として、我々は、siRNAの安全かつ効率的な配信のための約束を示しているプロトコルを概説している。しかし、記載された技術を実行する際に考慮すべきいくつかの重要な要因がある。例えば、PCPS粒子を調製する重要な考慮事項は、ヌクレアーゼによる分解を避けるために、慎重なsiRNAを処理することである。で作業する場合、特に、清潔な手袋およびRNAseを含まないチューブおよび水を常に使用されるべきであるsiRNAを。 siRNAトランスフェクション効率が低い場合には、RNアーゼ汚染を除去するスプレーは、手袋、作業領域を噴霧するために使用することができる。トランスフェクションが失敗した場合に加えて、siRNAは、問題がsiRNAまたは粒子によって引き起こされるかどうかを決定するために、商業的なトランスフェクション試薬を用いて試験されるべきである。 PCPS / siRNA送達システムの実装を成功させるためのもう一つの重要な考慮事項は、遠心分離および洗浄の手順を実行する際には注意して取ることです。すなわち、上清を完全に粒子の調製工程全体で必要とされる過剰な試薬を除去して廃棄してください。

PCPS / siRNA送達系の重要な利点は、安全性である。いくつかのsiRNAトランスフェクション剤は、細胞毒性13,15に寄与する高いカチオン電荷を有する。実際、ほとんどの市販のプロトコルは、試薬が細胞死を回避するために、ほんの数時間、細胞とともにインキュベートされるべきであることを示す。逆に、CE細胞生存率の結果から明らかなように、LLSは、毒性の徴候なしに数日間PCPS粒子に曝露することができる。 PCPSの粒子は、PEIの存在のために高い親和性を有するsiRNAに結合することができる。しかし、PEIの電荷誘起毒性は、送達プラットホームの固有の設定によって防止される。特に、PEIへのArgの共有結合とSi空孔内部のPEIのカプセル化は、毒性の減少に貢献しています。 PCPSプラットフォームの別の利点は、siRNAトランスフェクションは、血清の存在下で行うことができることである。他の既存の方法は、通常、それによって、トランスフェクションプロセスに追加のステップを追加して、潜在的に規則的な細胞シグナル伝達経路に干渉する、無血清細胞培養培地の使用を必要とする。

PCPSシステムのさらなる利点は、siRNA分子の任意の修飾を必要としないことである。いくつかの現在の方法は、siRNAを安定化させる、またはcを可能にするために複雑なコンジュゲーション手順を必要とするellularナリ13は 、PCPSシステムは、siRNAロードのための単純な混合に依存しています。 PEIに結合し、Si材料の細孔は、それによってヌクレアーゼとの接触を低減するsiRNAの保護環境を提供する。 PCPS粒子は、乾燥材料として、イソプロピルアルコール中で長期間保存することができる。 PCPS / siRNAの粒子が凍結乾燥される場合にはさらに、それらは4℃で少なくとも3ヶ月間保存することができる。凍結乾燥したPCPS粒子がちょうどトランスフェクションの前にRNaseを含まない水に懸濁されるべきであり、溶液中に保存してはならない。以前は、その結果遺伝子が抑制残る標的する期間を増加さ11を報告したように、最終的に、PCPSプラットフォーム許可は、siRNAの放出を持続。したがって、細胞内在化の後、Si粒子は次第にのArg-PEI / siRNAのナノ粒子の形成をもたらす、分解する。その後、siRNAは、ゆっくりとそれがメッセに結合することができ、細胞質、年にリリースされているnger RNA(mRNA)が、それによって生物学的活性を発揮する。 PCPS粒子は、siRNA送達のための既存の方法に比べていくつかの利点を提供するが、技術の限界は、非官能化されたpSi微粒子を出発物質として必要とされることである。粒子は、フォトリソグラフィ及び電気化学エッチング17を用いて合成することができるが、これらの技術は、すべての施設で容易に入手できない。

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Materials

Name Company Catalog Number Comments
Polyethylenimine (PEI), branched Sigma-Aldrich 408727 Average molecular weight ~25,000 Da
L-Arginine Sigma-Aldrich A5006 Reagent grade, ≥98%
Boc-Asp-OH Sigma-Aldrich 408-468 99%
Hydrogen peroxide solution Sigma-Aldrich 216763 30 wt. % in H2O
Sulfuric acid Sigma-Aldrich 339741 100.00%
Isopropyl alcohol Sigma-Aldrich W292907 ≥99.7%
Ethanol Sigma-Aldrich 459844 ≥99.5% 
N-(3-Dimethylaminopropyl)-N′-ethylcarbodiimide hydrochloride (EDC) Sigma-Aldrich 03449 ≥99%
Albumin from bovine serum Sigma-Aldrich A7030-10G Blocking agent
Ataxia-telangiectasia mutated siRNA  Sigma-Aldrich Designed in-house
Tris Acetate-EDTA buffer Sigma-Aldrich T9650 For DNA agarose gel electrophoresis
Penicillin-Streptomycin Sigma-Aldrich P4333
Fetal Bovine Serum Sigma-Aldrich F2442
TWEEN 20 Sigma-Aldrich P1379 Polyethylene glycol sorbitan monolaurate
2-Mercaptoethanol Sigma Aldrich M6250 For Western blot
Sodium dodecyl sulfate Sigma-Aldrich L3771
Sodium phosphate monobasic Sigma-Aldrich 71496 For making phosphate buffer 
Sodium phosphate dibasic Sigma-Aldrich 71640 For making phosphate buffer
Anti-Mouse IgG Sigma-Aldrich A4416 Secondary antibody (anti-mouse) for Western blot
N-Hydroxysuccinimide (NHS) Sigma-Aldrich 130672 98%
CELLSTAR 96W Microplate Tissue Culture Treated Clear w/ Lid Greiner Bio-One 655182 96-well plate
10x Tris-Glycine Liquid Li-Cor  928-40010 Transfer buffer for Western blot
Paraformaldehyde solution 4% in PBS  Santa Cruz Sc-281692 Fixation of cells
CellTiter 96 AQueous Non-Radioactive Cell Proliferation Assay (MTS) Promega G5421 Proliferation assay
Phosphate buffered saline Fisher Scientific BP399-500 10x Solution
Corning cellgro Dulbecco's Modification of Eagle's (Mod.) Fisher Scientific  MT-15-017-CM Cell culture media, 1x solution
Triton X-100 Fisher Scientific AC21568-2500 Octyl phenol ethoxylate, permeabilization agent
Cover glass Fisher Scientific 12-530C 
Methanol Fisher Scientific  A412-1 For Western blot transfer buffer
Plastic Cuvettes Fisher Scientific  14-377-010  For size measurements using Zetasizer Nano ZS
Molecular BioProducts RNase AWAY Surface Decontaminant Fisher Scientific 14-754-34 Spray for removing RNAse contamination
Agarose Fisher Scientific BP165-25 Low melting point, for running RNA samples
ProLong Gold Antifade Reagent with DAPI  Invitrogen P36935 Antifade reagent with DAPI, nucelus detection
Alexa Fluor 488 Phalloidin Invitrogen A12379 Dissolve 300 units in 1.5 ml methanol, detection of filamentous actin
SYBR Safe DNA Gel Stain Invitrogen S33102 Visualization of RNA
Negative Control siRNA Qiagen 1022076 Control siRNA
AllStars Neg. siRNA AF 555 Qiagen 1027294 Fluorescent control siRNA
Cell scraper Celltreat 229310
BioLite Multidishes and Microwell Plates Thermo Scientific 130184 6-well plate
Pierce LDS Sample Loading Buffer (4x) Thermo Scientific 84788 Sample loading buffer for Western blot
Pierce BCS Protein Assay Kit Thermo Scientific 23227 Protein quantification assay
Halt Protease Inhibitor Single-Use Cocktails (100x) Thermo Scientific 78430 Protease inhibitor cocktail, use at 1x
M-PER Mammalian Protein Extraction Reagent Thermo Scientific  78501 Protein extraction reagent
Sorvall Legend Micro 21R Thermo Scientific 75002440 Centrifuge
Beta Actin Antibody  Thermo Scientific  MA1-91399 β-actin primary antibody (from mouse) for western blot
6x TriTrack DNA Loading Dye Thermo Scientific R1161 DNA loading dye
Nuclease-Free Water  Life Technologies AM9938
Non-Fat Dry Milk Lab Scientific M0841 For Western blot
2-well BD Falcon culture slides  BD Biosciences 354102 2-well culture slides
Amersham ECL Western blot detection reagent GE Healthcare Life Sciences RPN2106 Western blot detection reagent
BA Membranes GE Healthcare Life Sciences 10402096 Nitrocellulose membrane for Wester blot
ATM (D2E2) Rabbit mAb Cell Signaling 2873S ATM primary antibody (from rabbit) for Western blot
Anti-rabbit IgG, HRP-linked Antibody Cell Signaling  7074 Secondary antibody (anti-rabbit) for Western blot 
Folded capillary cells Malvern  DTS 1061 For zeta potentail measurements using Zetasizer Nano ZS
MDA-MB-231 cell line ATCC HTB-26 Mammary Gland/Breast
12% Mini-PROTEAN TGX Gel Bio-rad 456-1043  For Western blot
Biorad PowerPac HC Bio-rad 164-5052 Power supply for electrophoresis
10x Tris/Glycine/SDS Buffer Bio-rad 161-0732 Running buffer for Western blot
Wide Mini-Sub Cell GT Cell Bio-rad 170-4405 Electrophoresis equipment for DNA agarose gel 
Mini-PROTEAN Tetra cell Bio-rad 165-8000 Electrophoresis equipment for Western blot
ChemiDoc XRS+ System with Image Lab Software Bio-rad 170-8265 Image acquisition and analysis software for gels and blots
4" (10 cm) dia., 5 x 7 mm diced Silicon Wafer Ted Pella  16007 Silicon waferfor scanning electron microscopy and atomic force microscopy
Thermomixer R Eppendorf 22670107 Shaker 
Isoton II diluent Beckman Coulter 8546719 Isoton diluent
Multisizer 4 Coulter Counter Beckman Coulter A63076 Particle counting analyzer
Non-functionalized porous silicon particles  Microelectronics Research Center, University of Texas at Austin Dicoidal shape. 2.6 μm (diameter) x 0.7 μm (height), provided in isopropyl alcohol
Zetasizer Nano ZS Malvern Particle analyzer system for size and zeta potential 
Scanning Electron Microscope FEI Particle size and shape 
Atomic Force Microscope Bruker Particle size and shape
Fluo ViewTM 1000 Confocal Microscope Olympus Visualization of fixed and live cells

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References

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