분리 및 배양 세포 및 마우스 조직에서 미토콘드리아의 기능적 분석

Biology

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Lampl, T., Crum, J. A., Davis, T. A., Milligan, C., Del Gaizo Moore, V. Isolation and Functional Analysis of Mitochondria from Cultured Cells and Mouse Tissue. J. Vis. Exp. (97), e52076, doi:10.3791/52076 (2015).

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Abstract

Introduction

살아있는 세포는 지방과 탄수화물의 형태로 대사 에너지를 은행 및 생합성, 막 수송 및 이동이 에너지를 사용합니다. 일부 에너지는 당분 해 동안 직접적으로 ATP식이 당의 전환을 통해 세포질에서 얻어진다. 그러나, 셀의 ATP 생산의 주요 공급원은 미토콘드리아 호흡 사슬 1 통하여 미토콘드리아 내 동력화된다. 미토콘드리아의 구조는 효과적이고 효율적인 ATP 생산에 필요한 공간의 방향을 제공한다. 미토콘드리아는 구성 요소 막간 공간으로 함께 행렬, 가장 안쪽의 미토콘드리아 구획, 집으로 분리 된 이중 막을 소유하고 ATP 생성에 관여하는 화학 반응을 좌표입니다. 내막은 호흡 쇄뿐만 아니라 ATP 합성 효소, ATP의 형성과 함께 ADP 파이 가져온다 단백질 복합체를 포함하는 막 결합 단백질 복합체의 시리즈를 포함한다. 여관어 막은의 cristae로 접 히고 전자는 시토크롬 C, 막간 공간 내에서 단지 사이에 이동 가용성 전자 캐리어를 통해 호흡 사슬 복합체를 따라 전달됩니다. 전자가 이동함에 따라 감소 등가물의 산화가 발생하고 수소 이온이 막간 공간으로 매트릭스에서 펌핑. 막간 공간 내에서 높은 이온 농도의 결과로서, 전기 화학적 구배는 미토콘드리아 내막 (Δψ)이 걸쳐 막 전위의 결과로 만든다. 산소는 전자 수송 체인의 최종 전자 수용체이고, 수소 이온은 매트릭스로 다시 막간 공간에서 ATP 신타 흐르 그렇게 하므로써 직접 ATP 형성을 야기한다. 그 전체에 기재된 바와 같이이 과정은 산화 적 인산화로 알려져있다. 의 cristae의 주름은 최대 전자 수송 및 내 ATP 생산을 허용 내막의 표면적을 증가각각의 미토콘드리아. 단백질, 효소와 산화 적 인산화에 관여하는 다른 분자는 핵과 미토콘드리아 유전자 모두에서 파생됩니다. 미토콘드리아는 13 단백질뿐만 아니라의 tRNA와 ATP 생산 3에 필요한 mRNA에 대한 자신의 원형 DNA, 인코딩을 포함하고있다. 그러나, 더 많은 단백질이 필요하므로 인코딩 핵이다. 이러한 핵 부호화 대부분의 단백질은 전구 단백질의 N 말단에 presequences의 사용에 의해 미토콘드리아 타겟팅 행렬이며, 그들의 수입은 4,5- Δψ에 의해 부분적으로 구동된다.

세포의 생체 에너지에 기여 외에도 미토콘드리아 또한 TCA 베타 산화 칼슘 조절을 통해 세포 신호 전달, 세포 자멸사뿐만 아니라 6에서 중요한 역할로서 중요한 대사 과정에 영향을 미친다. 특히, 세포 스트레스의시기에 거주하거나 BCL-2 가족 단백질은 미토콘드리아를 일으킬 수있는 미토콘드리아 외막에 상호 작용외막 투과성 (MOMP) 7,8. MOMP 동안, 시토크롬 c와 다른 단백질은 여러 세포질 단백질과 함께 복잡한 apoptosome을 9,10이라고 형성 세포질로 방출하고있다. apoptosome을 세포 사멸의 실행 단계에서 세포 단백질과 DNA를 절단에 갈 카스파을 활성화합니다. MOMP가 발생하자마자 ΔΨ가 붕괴되고, ATP 생산은 중단. 따라서, 세포 사멸로 시작되는 미토콘드리아의 기능이 손상되고 ΔΨ의 변화는 미토콘드리아와 세포 건강 (12)에 상관 관계가 될 수있다. 아폽토시스는 또한 질병의 개시 및 / 또는 진행에 대한 중요한 정보를 얻을 수있는 다수의 질병 모델, ΔΨ 미토콘드리아 기능 변화 점이된다. 예를 들어, 미토콘드리아의 구조적 및 기능적 변화는 신경 퇴행성 질환 (13, 14)의 도중에 기록되었다.

프로토콜, ISO의 첫 번째 부분에서자신의 ΔΨ을 유지 그대로 미토콘드리아 만큼은 설명한다. HEK-293T 세포는 아폽토시스를 유도하는 다른 농도의 재조합 TNF-α, IL1-β와 IFN-γ의 조합에 노출시켰다. 그들이 자주 수용체 (6)에 결합하는 TNF-α의 상호 작용에 의해 트리거 될 수 있습니다 차 인간의 오수 샘플 (15)과 세포 사멸의 외부 경로에서 높은 것으로보고 있기 때문에 이러한 사이토 카인이 선택되었다. 배양 된 세포에 비해 기본 조직에서 기능 미토콘드리아를 분리하는 데 필요한 미묘한 변화가 있기 때문에 많은 연구가 동물을 이용하기 때문에, 그리고 프로토콜은 간 및 측삭 경화증 (ALS) 마우스 모델을 전방의 척수에서 미토콘드리아를 분리하는 방법에 대해 설명합니다.

프로토콜의 두번째 부분은 형광 플레이트 판독기로 전위 성 형광 색소를 이용하여 미토콘드리아 막 전위에 섭동을 모니터링하기 위해 개발되었다. 차휴대 상태 (비정상 대 즉, 건강) 간의들 미토콘드리아 막전위의 손실을 야기 모두 언 커플 링제, 호흡 쇄 억제제 복합체 억제제 및 이오 노 포어와 함께 격리 미토콘드리아 ΔΨ의 강도를 정량에 의해 구별된다. 따라서 미토콘드리아의 응답이 미토콘드리아 (DYS) 기능의 지표로 사용할 수 있습니다 미토콘드리아 억제제로 치료시 ΔΨ의 변화에​​ 더 큰, 미토콘드리아 건강.

오히려 기능의 현장 평가에 비해 고립 된 미토콘드리아의 사용은 병리 또는 치료를 직접 세포 소기관 16-18 변경을 조절한다는 결정적인 증거를 제공합니다. 배양 된 세포에서 미토콘드리아를 분리 할 수있는 문학의 방법이 있지만, 그들은 모호 (17) 및 / 또는 특수 장비 (16)을 사용한다. 이 프로토콜은 상세히 분리 방법을 기술하고있다조직 배양 및 주 13,14,19,20 포함한 다른 세포주 쉽게 구성. 많은 고립 미토콘드리아 연구는이 프로토콜뿐만 클락 전극에 사용되는 동일한 미토콘드리아 uncouplers 및 억제제를 다시 장비의 매우 구체적인 전문 조각 (21 문헌에서 많은 논문의 대표적인 예입니다) 사용합니다. 또한,이 전통적인 방법은 낮은 처리량과 높은 복잡성 22, 23 등의 제한이 미토콘드리아의 상당한 양 (~ 500 ㎍ / 반응)가 필요합니다. 이 프로토콜에서, 형광 막 전위 감지 프로브 TMRE는 많은 표준 실험실 기계 인 형광 플레이트 판독기와 함께 사용된다. 신속 세포 및 절연 미토콘드리아 들어가고 저농도 24에서 사용될 수 있기 때문에 TMRE 널리 간주된다. 여러 반응이 신속 탠덤 설정할 수 및 배치는이 프로토콜을 이용하여 분석 하였다. 또한, 반응의 격리 된 미토콘드리아 (~ / 반응 10 μg의)의 매우 적은 양이 필요합니다. 덜 재료를 요구함으로써, 작은 조직 또는 세포 배양 샘플 미토콘드리아 격리를위한 출발점으로 사용될 수있다, 이상의 복제물이나 반응은 설정 및 ATP 생산, 산소 소비량, 또는 임포트와 같은 다른 절연 미토콘드리아 실험 잠재적 충분한 재료 일 수있다 분석이 가능하다.

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Protocol

모든 동물 실험은 건강 지침의 국립 연구소를 본 및 웨이크 포레스트 대학 동물 관리 및 사용위원회에 의해 승인되었습니다. SOD1G93A [B6SJL-TGN (SOD1-G93A) 1Gur] 마우스 모델의 번식 쌍은 잭슨 연구소 (바 하버, ME)에서 얻었다. 야생형 (WT) 여성과 SOD1G93A 남성 비 형질 [B6SJL-TGN (SOD1-G93A) 1Gur] SOD1G93A 마우스와 실험에 사용 된 비 형질 WT 한배 새끼를 생성하기 위해 사육되었다.

조사 1. 모델

  1. 세포 배양
    1. 5 % CO 2에서 37 ° C에서 인간 배아 신장 세포 (HEK-T293), 10 % 열 불 활성화 소 태아 혈청, 1 % 페니실린 - 스트렙토 마이신, 1 % L- 글루타민이 보충 된 DMEM에서 세포를 유지한다.
    2. T75 플라스크에 세포를 성장하고 그들이 90 % 컨 플루 언스에 도달 할 수있다.
    3. 5 % CO 2, 37 ℃에서 3 ~ 5 분 동안 트립신 (0.25 % 트립신 - EDTA)를 통해 세포 분할을 수행
    4. 미디어를 기음 문화 매체에서 세포 펠렛을 resuspend.
    5. 7 × 10 4 세포 T75에 해당 플라스크 또는 판에 씨앗 세포 치료 사이토 카인하기 전에 48 시간 플라스크. 이는 치료시 70 %에게 ~ 밀도를 제공해야합니다.
    6. 혈청 굶어 셀 24 시간 후 매체를 흡인하고 혈청이없는 배지의 동일한 양 (DMEM, 멸균)로 교체하여.
    7. 5 페이지 / μL, 10 NG / μL의 작업 농도로 초순수와 동결 건조 된 분말에서 TNF-α, IL1-β와 IFN-γ를 준비, 10 NG / μL, 각각 및 우물에 추가 / 플라스크.
    8. 치료는 혈청 직접 해당 플라스크의 세포 배양 배지에 가용화 된 사이토 카인을 첨가하여 세포를 결핍. 치료는 각각의 사이토 카인의 3의 칵테일을 구성 (같은 "* 3"이라한다), 또는 아이돌대조군으로서 ILE 물 ( "0"이라한다).
    9. 평가 및 수확 전 24, 48 또는 72 시간 동안 처리 한 세포를 품어.
  2. 세포 생존 능력 평가
    1. 1X PBS에서 3- (4,5- 디메틸 티아 졸 -2- 일)의 5 ㎎ / ㎖ 용액 -2,5- 디 페닐 테트라 졸륨 브로마이드 (MTT)를 만든다.
    2. 12 웰 플레이트를 들면, 각 웰에 MTT 용액 100 ㎕를 추가하고 부드럽게 고른 분포를 보장하도록 소용돌이 친다.
    3. 5 % CO 2, 37 ℃에서 15 분-1의 시간에 대 한 번호판을 품어, 보라색 착색의 존재에 대한 현미경으로 확인합니다. 더 퍼플가 없으면 다시 소용돌이 보라색이 관측 될 때까지 세포를 5 분 간격으로 인큐베이션 할 수있다. 필요한 시간의 양은 각각의 연구자에 의해 결정되어야한다.
    4. 모든 자색 셀을 떠났다까지 반복 피펫을 사용하여, 각 웰에 MTT 용매 (이소프로판올 4mm의 HCl 및 0.1 % NP40) 700 μL를 추가하고 50-10 분 동안 실온에서 플레이트 (들)를 흔들거나 . 보라색 ​​경우색상은 세포에서 나오는 용매의 추가 200 μl를 추가하고 소용돌이를 계속하지 않습니다.
    5. 측정 값이 일치하는 설정으로 촬영 그러나 595 nm의 한도 가능, 분석을 위해, 잘 각각 100 μl를 타고 96 웰 플레이트에 배치하고 570 nm ()을 사용 플레이트 리더 및 630 nm의 기준 파장에서 읽을.
  3. ALS의 동물 모델
    1. 모든 동물 실험은 건강 지침의 국립 연구소를 본 및 웨이크 포레스트 대학 동물 관리 및 사용위원회에 의해 승인되었습니다. SOD1G93A [B6SJL-TGN (SOD1-G93A) 1Gur] 마우스 모델의 번식 쌍은 잭슨 연구소 (바 하버, ME)에서 얻었다. 야생형 (WT) 여성과 SOD1G93A 남성 비 형질 [B6SJL-TGN (SOD1-G93A) 1Gur] SOD1G93A 마우스와 실험에 사용 된 비 형질 WT 한배 새끼를 생성하기 위해 사육되었다.
    2. 돌연변이 SOD1 (25)에 대한 표준 프라이머 유전자형을 수행합니다.

미토콘드리아 2. 분리

참고 : 빠르게 작업이 절차가 끝날 때까지 얼음에 모든 것을 유지하는 것이 중요합니다.

  1. 미토콘드리아 분리 완충액 (MIB), 척수 분리 완충액 (SC의 MIB) 및 실험 완충액의 제조 (EB)
    1. 앞서 MIB와 EB 시간의 다음 원액을 준비합니다.
    2. H 2 O 70 ㎖의 트리스 염기 12.1 g을 용해시켜 1 M 트리스 / MOPS 만들기 pH 7.4까지를 얻기 위해 건조 MOPS를 추가합니다. 100 ml의 결승전에 볼륨을 조정합니다. 4 ° C에서 필터 소독 및 저장.
    3. 80.2 K 2 HPO 4 ml의 KH 2 PO 4의 19.8 ml를 혼합하여 1 M Kphos을 확인합니다. 실온에서 보관하십시오.
    4. H 2 O 10 ㎖에 EGTA 3.8 g을 첨가하여 0.2 M EGTA / 트리스 만들기 용해 ~ 30 ~ 40 ml의 때까지 1 M 트리스 / MOPS를 추가합니다. 50 ㎖, 실온에서 살균 필터 및 저장소에 조정합니다. pH가 6.7 ~ 일 것이다합니다.
    5. 10 ㎖함으로써 1 M 글루타메이트 만들기글루탐산 1 M 용액. 필터 소독 및 저장 4 ° C에서.
    6. 사과산의 1 M 용액 10 ㎖를하여 1 M 말라 테를 확인합니다. 50 mm로 트리스 / MOPS를 추가합니다. 4 ° C에서 필터 소독 및 저장.
    7. 200 MM의 자당, 10 mM 트리스 / MOPS, 산도 7.4, 1 mM의 EGTA / 트리스의 농도로 MIB을 확인합니다. 4 ° C에서 필터 소독 및 저장.
    8. 250 MM의 자당, 20 mM의 HEPES-KOH의 pH 7.5, 10 mM의 KCl을, 1.5 mM의의 MgCl 2, 1 mM의 EDTA, 1 mM의 EGTA, 1 mM의 DTT 및 프로테아제 억제제 칵테일의 농도 SC의 MIB을 확인합니다.
    9. 125 mM의의 KCl 농도 EB하기 위해선, 10 mM 트리스 / MOPS, pH가 7.4, 5 mM의 글루타민, 2.5mM의 사과산, 1 mM의 K 포스페이트, pH가 7.4, 10 mM의 EGTA / 트리스. 4 ° C에서 필터 소독 및 저장.
  2. 세포를 수확하기 전에 장비 준비.
    1. 작은 유리 용기 및 균질화 갈리고을 멸균 수로 3 회 씻어 얼음에 배치합니다.
    2. 이러한 표준 드릴, 휴대 scra으로 필요한 물품을 준비인사과, 1.5 ml의 15 및 50ml 튜브 및 솔루션을 제공합니다.
  3. 미토콘드리아 격리
    1. 배양 된 세포
      1. 각각의 샘플 유형의 경우, 세포의 두 T175 플라스크를 사용합니다.
      2. 세포가 있는지 ~ 90 %의 합류를 확인하고 제어 실험, 또는 판에 사용하고 단계 1.2에서 상기와 같이 취급합니다.
      3. 및 벤치 탑, 기음 미디어에 1X PBS의 15 ml의 때마다 두 번 부착 세포를 씻는다.
      4. 버퍼 대기음 플라스크의 바닥으로부터 부착 세포를 제거하기 위해 플라스크를 긁어.
      5. 각 플라스크, 소용돌이에 1X PBS의 15 mL를 넣어 얼음에 각각 15 ml의 원뿔 튜브와 장소를 전송합니다.
      6. 스크랩은 스윙 버킷 로터를 사용하여 테이블 상단 원심 분리기를 사용하여 700 XG, 4 ° C에서 5 분 동안 원심 분리기 튜브를 완료되면.
      7. 기음 상층 액과 MIB 1 ml의 각 펠렛을 재현 탁.
      8. 현탁액을 모두 합하고 균질화 작은 유리 용기에 옮긴다.
      9. MIB 추가용기 버퍼는 첫 번째 라인에 도달 할 때까지. 세 패스에 대한 중간 속도에서 드릴에 부착 된 유 봉 세포를 균질화. 용기는 액체 위의 유봉을 제거하고 연속 패스와 안정된 속도를 사용하지 않는,이 단계에서 얼음에 있는지 확인하십시오.
      10. 50 ML 원뿔 튜브에 균질 솔루션을 전송합니다.
      11. 18 게이지 1 ½ 인치 바늘을 사용하여 3 ML의 주사기에 솔루션을 그리고 27 게이지 ½ 인치 바늘로 얼음에 다시 원뿔 튜브로 추방. 세포막 파쇄 그 힘을 이용하도록 상기 튜브의 내벽에 대해 용액을 배출하도록주의한다.
      12. 합계 5 회 주사기 단계를 반복한다.
      13. 스윙 버킷 로터를 사용하여 테이블 상단 원심 분리기 600 XG, 4 ° C에서 5 분 동안 15 ML 원뿔 튜브와 원심 분리기에 솔루션을 전송합니다.
      14. 조심스럽게 상층 액을 제거하고 세 1.5 ml의 튜브들 사이에서 배포합니다.
        참고 : Mitocho세포막과 세포 펠렛 깨지지 동안 ndria이 먼저, 저속 회전 후에 상청액에있다.
      15. 10,000 XG, 5 분 동안 4 ° C에서 고정 된 각도 로터의 원심 분리기 튜브.
      16. 대기음 상층 액 100 μL MIB의 알약을 결합하고 즉시 얼음에 배치합니다.
        주 : 미토콘드리아이 고속 회전 후의 펠릿에있다. 미토콘드리아는 일반적으로 분리 후 2-3 이온 얼음 ~에 대한 자신의 막 잠재력을 유지하고 MIB의 농축 원액으로 가장 안정됩니다.
    2. 마우스 조직으로부터 단리 미토콘드리아
      1. IACUC 프로토콜에 따라 마우스를 마취. 마취를 유도하기 위해 5.0 %로 기화기를 설정합니다. 눈에 접근 또는 면봉으로 도청 할 때 동물이 발 핀치 또는 깜박임 반사에 대한 반사의 부족으로 마취가 있음을 확인. 1.5 %와 2.0 % 사이 기화기를 유지하여 전체 수술을위한 마취 마우스를 유지합니다.
      2. EXC이세 PBS 1X 얼음 추위 별도로 각 동물과 장소에서 간 및 척수는 - / - 어떤 피를 멀리 씻어합니다.
      3. 간은, 얼음에 무게를 접시에 조직을 전송하고 1 분 동안 신선한 면도날을 사용하여 미세한 조각으로 잘라.
      4. 버퍼가 첫 번째 줄에 도달 할 때까지 용기에 조직과 (척수에 대한 간 또는 SC MIB에 대한 MIB) 적절한 버퍼를 추가합니다. 오 패스에 대한 손으로 갈리고와 조직을 균질화. 용기는 액체 위의 유봉을 제거하고 연속 패스와 안정된 속도를 사용하지 않는,이 단계에서 얼음에 있는지 확인하십시오.
      5. 균질 15 ml의 튜브를 청소 전송합니다.
      6. 750 XG, 10 분 동안 4 ° C에서 고정 된 각도 로터의 원심 분리기 튜브.
      7. 깨끗한 튜브에 상층 액을 저장하고 얼음에 배치합니다.
        주 : 세포막 및 세포 펠릿 깨지지 동안 미토콘드리아이 먼저, 저속 회전 후에 상청액에있다.
      8. 척수 펠렛을 다시 중단 전N SC의 MIB의 500 μL.
      9. 단지 SC MIB와 용기 반쯤 이때 충전 각각 세 번 다시 균질화.
      10. 신선한 튜브에 새로운 균질을 전송합니다.
      11. 원심 분리기 750 XG, 10 분 동안 4 ° C에서 고정 된 각도 로터.
      12. 각 샘플에서 첫 번째 상층 액으로, 더 미토콘드리아를 포함하는 새로운 상층 액을 결합합니다.
      13. 10,000 XG, 5 분 동안 4 ° C에서 고정 된 각도 로터의 원심 분리기 튜브.
      14. 기음 상층 액 500 MIB의 μL, 50 μL 사우스 캐롤라이나 MIB의 척수 펠릿에 간 펠렛을 재현 탁하고 즉시 얼음에 놓습니다.
        주 : 미토콘드리아이 고속 회전 후의 펠릿에있다. 미토콘드리아는 일반적으로 분리 후 2-3 이온 얼음 ~에 대한 자신의 막 잠재력을 유지하고 MIB의 농축 원액으로 가장 안정됩니다.
      15. 미토콘드리아 용액의 농도를 추정하기 위해 단백질 농도 분석을 수행한다. 지침에 따라상업용 단백질 분석 키트 (26) 또는 유사한 방법을 사용하기위한 S. 미토콘드리아의 전형적인 농도는 2 T175 플라스크 수익률 ~ 2 ㎎ / ㎖, 1 마우스 간 ~ 3 ~ 5 ㎎ / ㎖, 1 마우스 척수 ~ 1-3 ㎎ / ㎖.
  4. (제조업체가 제공하는 프로토콜에서 적응) Quantikine ELISA 키트 C R & D 쥐 / 마우스 사이토 크롬을 사용하여 시토크롬 C 분석.
    1. 즉시 반응을 설정하기 전에, EB 0.5 ㎎ / ㎖ 작업 농도로 미토콘드리아를 희석 반응 (관 당 미토콘드리아의 일반적으로 30 ~ 50 μL) 1.5 ml의 튜브에 희석 미토콘드리아를 배포 할 수 있습니다.
    2. 희석 된 미토콘드리아에, 전체 부피의 1 %에서, EB 또는 DMSO를 추가하고 7-10 분 동안 벤치 위에 반응을 배양한다. 긴 시간 프레임은 필요한 경우에 이들 반응은 실온에서 30 분 동안 안정하다.
    3. 10,000 XG, 5 분 및주의 4 ° C에서 고정 된 각도 로터에서 원심 분리하여 펠렛의 미토콘드리아해동 상층 액을 분리하고 별도의 1.5 ml의 튜브에 각각 배치합니다.
      참고 : 튜브는 하나 나중에 분석을 위해 -20 ℃에서 냉동 또는 즉시 사용할 수 있습니다.
    4. 이 펠릿 상등액 27 시토크롬 C의 농도를 비교하여 사이토 크롬 C의 방출을 결정한다.
      1. 1X PBS에서 0.5 % TX-100 반응의 원래 볼륨에서 펠렛을 용해하여 샘플을 준비합니다.
      2. 각 샘플의 경우, ELISA 플레이트에 2 우물, 지금 가용화 펠릿에 대한 하나의 사이토 크롬 C 복합체를 100 ㎕를 첨가하여 반응에서 뜨는 하나를 준비 (병에서 바로 사용) 플러스 0.5 % TX- 100 ㎕ 1X PBS 100, 다음 모든 펠렛 또는 상층 액 샘플.
      3. 조심스럽게 커버를 혼합하고 1 시간, 37 ° C 부화 20 초 동안 판을 낮은 설정 (레벨 2-4) 와동.
      4. 다음에, manufactur의에 따른 희석 플레이트를 세척 완충제로 4 회 세척어의 지시. 종이 타월에 우물을 눌러 초과 솔루션을 제거합니다.
      5. 각 웰에 1 A + B 현상액 실온에서 어두운 곳에서 20 ~ 30 분 동안 플레이트를 인큐베이션 : 다음에, (1)의 150 μl를 추가.
      6. 마지막으로, 각 웰에 스톱 용액 50 μL를 추가 한 마이크로 플레이트 리더를 사용하여 540 nm에서 흡광도 판독 값을 취. 각 반응 대 상등액 펠릿 시토크롬 C의 양을 비교하여 사이토 크롬 C의 방출 정도를 계산한다.

미토콘드리아 (DYS) 함수 3. 평가

  1. 반응이 설정되어 직전, 0.5 mg의 미토콘드리아를 희석 / ㎖ EB와 농도를 작업하고 (미토콘드리아의 일반적으로 30 ~ 50 μL가 튜브 당 사용되는) 반응에 1.5 ml의 튜브에 배치.
  2. 미토콘드리아 치료
    1. 50 nM의 발리 노마 이신 (Valinomycin)와 혼합 FCCP 적절한 치료를 추가 (EB 제어, 1 μM, 10 μM 로테 논5 μM의 oligomycin, 2 mM의 KCN, 또는 200 μM ADP, 최종 농도)로 희석 미토콘드리아의 총 부피의 1/10 번째에서 반응을 분리한다. 7 분 동안 벤치 위에 반응을 품어.
      참고 : 해가 될 수있는 피부를 통해 실수로 섭취 또는 흡수 이러한 물질을 취급 할 경우주의가 취해 져야한다.
    2. 100 μM의 농도로 작동 멸균 재구성 및 2 μM로, -20 ℃에서 보관, TMRE 희석시키고 미토콘드리아 반응 부피와 동일한 부피를 추가한다.
    3. 7 분 동안 벤치 위에 반응을 품어.
    4. 10,000 XG, 5 분 동안 4 ° C에서 고정 된 각도 로터에서 원심 분리하여 펠렛의 미토콘드리아.
    5. 로드 396 웰 판에 각 시료의 상등액 볼륨의 절반 형광을 읽어보십시오.
      주 : TMRE의 여기 및 방출 파장에 사용되는 양과 플레이트를 이용하여 제조사의 지침에 따라 최적화되어야분석. 여기 / 방출 파장을 이용하여 1 μM TMRE 25 μL와 표준 384- 웰 블랙 플레이트 (최종 반응 농도) 강한 신호 얻었다 사용   485 나노 미터 / 535 nm의.
    6. 제어부 (EB) 및 대조군 샘플로부터 RFU 의한 실험 샘플 플레이트 판독기로부터 얻어지는 상대 형광 값 (RFU)를 분할하여 각각의 처리 사이에 형광 접이식 차이를 계산.

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Representative Results

200 pg / ml이다 TNF-α 40 ng의 / ㎖ IL1-β, 75 NG / ㎖의 IFN-γ와 함께 HEK-293T 세포의 치료 (* 3) 24 내지 48 시간 동안 세포 사멸의 양 시브 (도 1a에 이르게 ). 세포 생존은 MTT 분석을 사용하여 평가하고 일관성 ~ 24 시간 처리와 세포 생존율의 10 % 감소 시간 및 48 치료와 ~ 20 % 감소가 있음을 입증 하였다. 개인 사이토 카인과 유사한 농도 (100 페이지 / ㎖의 TNF-α, 40 NG / ㎖ IL1-β, 75 NG / ml의 IFN-γ) 48 시간에서 유사한 세포 사멸 결과를 얻을, 치료로 치료 세포 보여 그 감소에 가능성은 조합에 (그림 1B)에 영향을 때문이다. 도 1b에 생존 데이터는 3 중으로 별도 실험에서 각 런의 평균 +/- 표준 편차를 나타내는 것으로, 오차 막대의 기밀성은 상기 데이터의 재현성을 입증한다. 사이토 카인의 양을 더욱 elucidat이 치료 프로토콜에서 조정될 수있다세포사 각 사이토 카인의 기여 즉, 사이토 카인 및 추가 또는 다른 인자도만큼 적절한 관리가 실행되고, 포함될 수있다.

세포 및 조직에서 미토콘드리아의 분리 이후 1940 28,29 문헌에 설명되었다. 절차의 전제는 원유 미토콘드리아가 ~ 10,000 X g에서 펠렛 것으로 알려져있다 차등 원심 분리, 다음 세포 파괴입니다. 절연 미토콘드리아를 활용하는 프로토콜은 막 전위를 그대로 유지할 수있는 이중 막을 필요로하며, 그러므로 아이솔레이션이 완료되면 무결성을 평가할 필요가있다. HEK 세포 배양에서 미토콘드리아 분리 프로토콜의 개발 과정에서, 시토크롬 C 분석은 미토콘드리아 손상을 얻었다 경우 나타 내기 위해 사용되었다. ELISA 키트 C 시중에서 판매하는 사이토 크롬을 사용하여, 미토콘드리아 후 분리 한 후 정량 및 EB에 희석하고, 어느 쪽 EB 또는 DMSO추가 반응은 벤치 위에 품어. 이어서, 상등액을 둘러싼 미토콘드리아로부터 분리하여, 두 분획의 시토크롬 C 함유량의 분석은 미토콘드리아 막 intactness 용 게이지를 사용 하였다; 시토크롬 C의 대부분이어서 미토콘드리아 펠릿 유지되어 시토크롬 C의 15 % 이상이 상등액에서 발견되면, 미토콘드리아 기능 연구에 부적합한 것으로 간주 동안 미토콘드리아는 그대로, 고려되는 경우. 표 1에서 알 수있는 바와 같이, 고립 된 미토콘드리아 전처리 DMSO와 함께있을 때, 프로토콜 수율 ~ 12 % 시토크롬 C 분리 및 ~ 15 %를 설명했다. 유사한 결과가 다른 세포주 또는 동물의 조직으로부터 분리 19,20,27 미토콘드리아 대해 이전에보고되었다. 또한, 미토콘드리아의 무결성은 마우스 간, 척수 미토콘드리아의 분리시 사용 TMRE로 평가 될 수있다. 초기 분리 프로토콜 developme에 중NT, 시험은 간 건강, 정상 마우스의 미토콘드리아의 척수에서 분리 된 미토콘드리아를 평가했다. 각 샘플에 대해, ΔΨ는 FCCP + 발리 노마 이신 (Valinomycin) (표 2)와 함께 배양에게 EB 처리 절연 미토콘드리아로부터 형광 신호를 비교함으로써 평가 하였다. 1>의 처리 및 비 처리 된 미토콘드리아와 형광의 비는 건강, 미토콘드리아 손상의 지표로서 사용 하였다.

성공적인 미토콘드리아 분리 프로토콜이 개발되자, 미토콘드리아 제어, 미처리 세포로부터 단리 * 3 사이토 카인을 처리 한 세포 혹은 정상 SOD1 생쥐 분석 하였다. 두 그룹 모두에서 HEK 미토콘드리아는 TMRE 흡수에 변화에 의해 측정 된 다양한 uncouplers 및 억제제와 ΔΨ 처리 하였다. 제어 EB의 배 차이가 CAL (/ 처리 미토콘드리아 억제제는 두 그룹 사이의 ΔΨ의 강도의 차이를 나타냅니다 uncoupler 대표 데이터와하는 미토콘드리아를 처리표 3에서 culations). 또한, 3 처리 된 세포 (그림 2) 세포 생존 데이터를 확증 미토콘드리아 건강 사이토 카인 치료에 의해 ​​영향을 것을 의미 *로 처리하지 않은 세포 % 감소. 네 ALS 마우스에 비해 간 네 개인 정상 대조군 마우스의 척수에서 분리하여 미토콘드리아 TMRE ΔΨ 통해 흡수 강도의 평가는 조직 상태는이 프로토콜을 이용하여 평가 될 수 있다는 것을 나타낸다. ΔΨ에서 배 차이와 비율 감소에 의해 도시 된 바와 같이, EB-처리 및 FCCP + 제어 및 질병 진행 동물의 미토콘드리아의 발리 노마 이신 (Valinomycin) 처리의 비교는 유의 한 차이가있다 (표 4, 볼도 13 및 14 참조).

그림 1
그림 1 : 세포 사멸 유도* (3) 처리에 의한 D는 (A) HEK-293T 세포는 24 시간 또는 48 및 세포 죽음을 처리 하였다. 시간의 경과와 프로그레시브 개별 사이토킨 트리트먼트보다 큰 MTT 분석을 사용하여 측정 하였다. 값은 제어로 표준화했다 미처리 샘플 및 데이터 n에 대해 삼중 측정치 = 3, +/- 표준 편차. (B) HEK-293T 세포는 개개의 사이토 카인 칵테일 (* 3) 48 시간 동안 세포 사멸을 평가 처리 하였다 MTT 분석을 통해. 데이터는, 개별 사이토킨 및 N = 6의 각각에 대한 N = 5 * 3을 나타내는 +/- 표준 편차.

펠렛 (AU) 상층 (AU) % 시토크롬 C 릴리스
0 0.818 0.115 12.6 ± 2.27
DMSO 0.793 0.142 15.3 ±; 2.23

표 1. 배양 된 세포로부터 격리 미토콘드리아 시토크롬 C의 보존 데이터는, N = 4의 평균을 나타내는 표준 편차를 +/-.

간 1 간 2 척수 1 척수 2
RFU EB 97830 94132 339716 290154
F / V 435188 461299 385366 482480
4.45 4.9 1.13 1.6(6)
EB = 실험 버퍼와 F / V =​​ FCCP + 발리 노마 이신 (Valinomycin).

표 2 :. 마우스 정상 조직에서 분리 된 미토콘드리아의 측정 ΔΨ 별도의 두 동물 (예, 간, 척수 및 하나 하나가 동일한 동물로부터 임) 탠덤 간과 척수 미토콘드리아를 분리하는데 사용 하였다.

EB 올리고 썩음 KCN ADP F / V
RFU 0 4,844 12507 12734 9,925 10892 4,844
* 3 6,517 13639 12435 10235 13154 6,517
배 차이 0 NA 2.58 2.63 2.05 2.25 2.65
* 3 NA 2.09 1.91 1.57 2.02 2.18
% 감소 0 대 * 3 18.94 27.41 23.35 10.24 17.67
EB = 실험 버퍼; 올리고 = oligomycin; = 로테 논을 썩; KCN는 시안화 칼륨, 및 F / V =​​ FCCP를 발리 노마 이신 (Valinomycin) = +.

표 3 : 셀 (C)에서 원시 데이터와 계산ulture는 미토콘드리아 실험입니다.

그림 2
그림 2 : 미토콘드리아는 사이토 카인 - 처리 된 세포로부터 분리는 막 잠재력 감소했다. 표 2에서 계산 된 각각의 치료에 0 대 * 3 ΔΨ의 비율 감소가, 제어에 비해. 데이터 또는 n = 2 (= 3 (oligomycin, 로테 논, 및 FCCP / 발리 노마 이신 (Valinomycin)) n의 중복 반응의 평균을 나타냅니다 KCN과 ADP) +/- 표준 편차. 배 차이 계산에 기초하여 통계적으로 유의 * = P-값; P = 0.03, 각각 oligomycin, 로테 논 및 FCCP / 발리 노마 이신 (Valinomycin), 0.01, 0.05.

척수
차이를 접어 제어 1.54 ± 0.48 3.20 ± 1.56
SOD1 1.10 ± 0.30 3.12 ± 1.75
% 감소 28.1 2.48
p- 값 0.03 0.41

. 표 4 : 그룹 당 4 동물의 평균을 나타내는 FCCP + 발리 노마 이신 (Valinomycin) 데이터에 의해 평가로 미토콘드리아가 SOD1 쥐의 척수에서 고립 가능성 막 감소했다.

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Discussion

재조합 사이토 카인과 HEK-293T 세포의 치료는 48 시간 (그림 1)를 통해 세포 사멸의 적당한 양을 발생합니다. TNF-α 처리에 의해 유도 된 세포 사멸의 정도는 이전에보고 된 연구 (30)과 유사하고, 세포 생존율은 단독 또한 문헌 (31, 32)와 일치하는 사이토 카인과 총괄적 양보다 많은 여러 사이토 카인의 공동 투여 후에 감소한다. 금액과 사이토 카인 치료의 종류뿐만 아니라 개별 사이토 카인에 칵테일의 비교를 조정하는 능력은 신장 세포에서 사이토 카인 노출의 특정 효과를 연구하는데이 세포 배양 모델이 매력적. 더욱이, 결과는 재현성이 매우 쉽고 (도 2)를 얻을 수있다. 명심해야 할 사항은 세포의 합류를 포함한다. 70-80% 콘에서 열처리 할 때 예를 들어, 100 % 합류에 처리 된 세포는 사이토 카인의 동일한 농도뿐만 아니라 반응하지 않은플루 언스. 세포 반응이 가능 (해동 이후 이상 8~12주) 너무 오래 문화 되었기에 영향을받을 수 있기 때문에 또한, 세포가 겪은 통로의 수를 추적해야합니다. 사이토 카인과 함께 배양 된 세포의 치료는 세포 생존이어서 미토콘드리아 건강 감소하지만, 더 패혈증 자체에 대한 모델는 아니다. 그러나,보다 임상 적으로 관련된 모델의 사용은 이러한 자극 THP1 세포 (33)에서 자연적으로 분비되는 사이토 카인과 마우스 및 / 또는 치료에서 고립 된 차 신장 세포를 사용,이 작품의 자연스러운 확장이다. 메커니즘에 통찰력 초기뿐만 아니라 예방 또는 치료 개입 약학 화합물의 효능을 테스트하기위한 예비 플랫폼을 제공 할 수 미토콘드리아 패혈증 동안 신부전 이해 갭, 예컨대 세포 배양 모델 및 평가를 부여.

미토콘드리아는 배양 된 세포 또는 동물의 조직으로부터 분리급속 미토콘드리아 건강에 세포 치료 또는 질병 진행에 미치는 영향을 평가하기위한 용량을 수득 하였다. 분리 및 평가 프로토콜은 기술적으로 수행하도록 요구되지 않고, 용이하게 다른 세포주 또는 일차 조직의 사용을 위해 변형 될 수있는. 각각의 샘플 유형을 사용할 MIB 및 EB는 특정 세포 또는 조직 유형의 다양한 요구가 있으면 필요한만큼 조절 될 수 좋은 시작 레시피이다. 척수 프로토콜 15,34 포함 예를 들어, 지방산없는 BSA의 첨가는 신경 세포와 함께 사용하기위한 일반적으로 필요하다. 세포 파괴 방법은 또한 그 반대의 경우도 마찬가지 더 주사기 퇴학을 사용하거나 손에 변경 균질화를 대신 드릴을 사용하거나에 의해 변경 될 수 있습니다. 척수 미토콘드리아 절차에서 수행 게다가, 제 원심 펠릿을 다시 균질화는 미토콘드리아의 만족스러운 양을 얻을 필요가있다. 격리 프로토콜이 가능한 mitochondri를 생성 좋은 지표이 ELISA C 사이토 크롬의 사용이다. 이 분석은 시토크롬 C 릴리스의 웨스턴 블롯 분석에 빠르고 쉬운 대안이며, 또한 펩티드 또는 다른 화합물 19,27와 미토콘드리아의 치료 후 시토크롬 C 릴리스의 유용한 평가입니다. 대안 적으로, TMRE 프로토콜 개발 중에 사용될 수 있지만, 그것은 건강한 것으로 알려진 시료로부터 단리 미토콘드리아를 평가하는 것이 중요하다. 통상적으로 문헌에 기재되지 않은 마우스 조직으로부터 단리 미토콘드리아 때 기준선을 설정하기 위해 사용되는 또, 간 미토콘드리아뿐만 아니라 양성 대조군으로서 제공 할 수있다. 예를 들어,이 프로토콜에서와 같이, 모든 동물에서, 두 프로토콜 개발뿐만 아니라 실험 동안 간 또한 적출 미토콘드리아 분리를 위해 사용된다. 제조를위한 또 다른 고려 사항은 분리 과정의 끝에서 얻어진 미토콘드리아의 양이다. 미토콘드리아의 농도는 1 ㎎ / ㎖ 이하이면분석 결과는 신뢰할 수없는 (관찰되지 않은 VDGM)을 증명할 수 있습니다. 어느 출발 물질 MIB 레시피 또는 파쇄 방법의 양은 기능 분석으로 이동하기 전에 최적화되어야한다. 성공적인 분리 프로토콜이 달성되면, 미토콘드리아는 또한 총 ATP 및 ATP 생성 콘텐츠 (13, 14)과 같은 다른 분석에 사용될 수있다.

여기에 설명 된 미토콘드리아 기능 프로토콜은 표준 형광 플레이트 판독기를 사용하여 전위 감지 TMRE 염료의 흡수 미토콘드리아의 간접 측정을 허용한다. 미토콘드리아는 단리 및 적절한 화학 물질을 첨가 한 후, 이들은 TMRE 함께 배양 한 다음 펠렛 화한다. 이러한 다중 약제 내성 전송 또는 ATP 플럭스 등의 변수를 교란, 전체 세포 또는 동물의 치료 및 평가를 ΔΨ하기 전에 미토콘드리아를 분리함으로써 피할 수있다. 상등액의 형광 양이어서 미토콘드리아 건강한 것을 이해 분석강한 자신의 ΔΨ 및 TMRE의 그러므로 더 흡수. 결과적으로, 상등액 형광의 양은 미토콘드리아에서 건강에 해로운 미토콘드리아 이하이어야한다. EB 전용 처리 제어 및 비 결합이 미토콘드리아 간의 형광의 배 차이 등으로 계산 될 수있다. 실행 반응의 모든 세트와 또 다른 중요한 제어 혼자 TMRE입니다. 이 컨트롤의 결과는 가능한 최대 형광 판독을 제공합니다. TMRE 갓 희석 반응에 추가하기 때문에, 내재 변동성이 있습니다. 예를 들어, ~ 20000, 25000 및 30000의 TMRE 전용 판독 프로토콜 개발 과정에서 여러 번 달성했다. 치료 치료는 미토콘드리아와 크게 다르지 않다 및 / 또는 경우 TMRE 전용 신호 처리 미토콘드리아 샘플들보다 훨씬 크다면, 결합 미토콘드리아의 절연은 대부분 성공하지 않았다. ΔΨ의 감소는 수득 비율에 의해 측정되는이 프로토콜을 다음과 같은 경우에하는 제어 이전에보고 된 양, 건강한 세포 2,35 유사하다. 제어로부터 격리 미토콘드리아 미처리 HEK-293T 세포 및 사이토 카인 * 3 - 처리 된 세포로부터 ΔΨ 변화의 비교 MTT 분석에서 관찰 된 감소 된 세포 생존 능력은 미토콘드리아 기능 감소 변환되는 것으로 보였다. 여기에서 입증 된 바와 같이 (13, 14)이 플레이트 판독기 분석은 쉽게, 어느 소스로부터 단리 및 ALS 등의 질병 모델을 시험하는 데 사용 미토콘드리아로 사용될 수있다.

몇몇 연구는이 플레이트 리더 분석의 기원에 중요했다 MOMP을 감지하는 미토콘드리아 특이 형광 염료를 사용했다. 그러나, 그 연구하는 화합물을 스크리닝 또는 MOMP (35, 36)을 유도, 탐구 새로운 ΔΨ 감지 염료 (2) 또는 마이크로 칩 (37)에 유동 세포 계측법로 다른 형식을 식별하는 전체 세포를 사용 하나. 이 광고를 설명한다는 점에서이 프로토콜은 고유etailed 방법은 격리하고 신속하게 알려진 ΔΨ 바꾸는 화합물에 대한 응답을 통해 전체 세포 치료의 효과를 조사하기 위해 미토콘드리아를 사용합니다. 이 프로토콜은 uncouplers 및 억제제의 다양한 활용, 그 중 하나가 미토콘드리아의 건강을 평가하기에 적합 한 것을 나타냅니다. 그러므로 인하여 셀룰러 스트레스 또는 진보적 셀룰러 부전 미토콘드리아 변화에 특정 연구 센터는, 프로토콜은 특정한 화합물 및 / 또는 숙신산 NADH 같은 전자 공급원의 첨가를 사용하여 미토콘드리아 대사의 변화를 탐색하는 데 사용될 수 있지만 .

격리 된 미토콘드리아 평가를 수행하는 중요한 고려 사항은 치료 볼륨의 일관성, MIB의 미토콘드리아를 유지하고 치료가 설정 될 예정 직전 EB에서 그들을 희석, 그들의 ΔΨ 여전히 확인하기 위해 분리의 3 시간 내 미토콘드리아를 사용하여 포함 유지되고.이러한 JC-1과 같은 다른 미토콘드리아 특정 형광 염료 위에 TMRE의 선택은 작은 농도 만 1 파장을 이용하여 형광을 분석의 단순성을 사용할 수있는 능력 때문이었다. 이 방법은 유사하지만 플레이트 리더의 사용 시간이 덜 걸리며 덜 최적화 (35)을 필요로 형광 현미경 2,38를 사용하거나 세포 계측법 (37) 흐름을 실시 할 수있다. 클락 전극 (22) (DEL Gaizo 무어, 관찰되지 않은)를 사용하여 비교하여 또한,이 프로토콜은 기술적으로 훨씬 덜 까다로운 빠르게 수행하는,보다 용이하게 재현 할 수있다. 각 미토콘드리아 치료의 양을 적정하는 미토콘드리아의 기능과 농도의 최적화에 더 통찰력을 제공 할 수있다이 수행되어야한다. 미토콘드리아 반응의 총 부피는 분리뿐만 아니라 필요한 치료 반응의 횟수 동안 획득 시료량 벌에 조정될 수있다. 50 μ의 가능하면 표준 양; 리터가 사용됩니다; 그러나, 미토콘드리아의 적은 20 μl의 신뢰할 수있는 결과를 얻을 수 있습니다.

ΔΨ 산소 소비량과 상관 동안, 분석은 직접 산소 소비량을 측정하지 않은 것을. 예컨대 MitoExpress 형광 산소 감지 탐침이 개발되었지만, 아마도 클락 전극은 상기 인용 사용 낙하의 일부를 피하기 위하여, 반응 당 가격 및 분석 미토콘드리아 당 더 많은 양의 제한 요건은 남아있다. 따라서 TMRE 고전 ΔΨ의 uncouplers 또는 억제제의 사용은 몇 가지 장점을 갖는다. 다시, 복수의 샘플 또는 다중 처리 / 샘플, 재현성, 저급 원료 요건 및 / 또는 반응 당 필요한 절연 미토콘드리아의 하부 양의 배치 분석이 프로토콜은 매력적인 렌더링.

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Materials

Name Company Catalog Number Comments
L-glutamic acid Sigma G1251 Can use the potassium salt instead.
malic acid Sigma M8304 Can use the potassium salt instead.
KH2PO4 Sigma P0662
K2HPO4 Sigma P3786
EGTA Sigma E3889
Trisma base Sigma T6066
MOPS Sigma M3183
CCCP Sigma C2920 Dilute down to 100 μM as a working stock in ethanol and store at -20 °C.
Valinomycin Sigma V0627 Make in DMSO and use as a 5 μM working stock. Store at -20 °C.
sucrose Fisher S5-500
KCN Mallinckrodt 6379 Make a concentrated stock in ethanol and then dilute with water 
rotenone Sigma R8875 Highly toxic. Made in ethanol.
oligomycin Sigma O4876 Highly toxic. Made in ethanol.
ADP Sigma A2754
TMRE Sigma 8717-25mg Dilute 100 μM stock with EB immediatley before use.
DMEM Gibco 11965-084 1x regular (high glucose).
Pen/Strep Invitrogen 15140-155
L-glutamine Fisher SH3002101 Store aliquots at -20 °C
FBS Lonza 14-501F US origin, premium quality. Heat inactivate and store aliquots at -20 °C.
Trypsin-EDTA Sigma T4049
DMSO SIgma D2650
Protien Assay Dye (5x) Bio-Rad 500-0006 Any protein assay can substitute.
BSA Fisher BP1600-100 Make 2 mg/ml stock in water for protein assay.
MTT powder Sigma M2128 Filter sterlize 5 mg/ml stock made in PBS. Store aliquots at -20 °C; store at 4 °C for up to 1 week.
Tergitol solution (NP-40) Sigma NP40S
Recombinant Human IL-1B Gibco PCH08014 Once opened store aliquots at -20 °C
Recombinant Human TNF-alpha Gibco PHC3015L
Recombinant Human IFN-gamma Gibco PHC4031
Dulbeccos PBS (-/-) Sigma D8537 Make sure it is without Mg2+ and Ca2+ ions.
Cytochrom c ELISA kit R&D systems DTC0 Human for HEK-293T cells. 

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