Isolamento e analisi funzionale dei mitocondri da cellule in coltura e Tissue mouse

Biology

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Lampl, T., Crum, J. A., Davis, T. A., Milligan, C., Del Gaizo Moore, V. Isolation and Functional Analysis of Mitochondria from Cultured Cells and Mouse Tissue. J. Vis. Exp. (97), e52076, doi:10.3791/52076 (2015).

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Abstract

Introduction

Le cellule viventi Energy Bank metabolica sotto forma di grassi e carboidrati e utilizzare questa energia per biosintesi, trasporto di membrana e movimento. Alcuni energia viene ottenuta nel citosol attraverso la conversione di zuccheri alimentari direttamente in ATP durante glicolisi. Tuttavia, la principale fonte di produzione di ATP in una cella è sfruttata all'interno dei mitocondri attraverso la catena respiratoria mitocondriale 1. L'architettura dei mitocondri fornisce l'orientamento spaziale necessaria per la produzione di ATP efficace ed efficiente. I mitocondri possiedono una doppia membrana separati da uno spazio intermembrane e insieme con la matrice, il compartimento mitocondriale interna, Casa componenti e coordinare le reazioni chimiche coinvolte nella produzione di ATP. La membrana interna contiene una serie di complessi proteina di membrana che compongono la catena respiratoria, nonché la ATP sintasi, il complesso proteico che porta ADP e Pi insieme per la formazione di ATP. La locandaer membrana viene ripiegato creste e gli elettroni passano attraverso la complessi della catena respiratoria attraverso il citocromo c, un vettore di elettroni solubile che si muove tra complessi all'interno dello spazio intermembrane. Come gli elettroni si muovono, ossidazione di riduzione equivalenti verifica e ioni idrogeno vengono pompati dalla matrice allo spazio intermembrane. Come conseguenza della elevata concentrazione di ioni all'interno dello spazio intermembrane, un gradiente elettrochimico costruisce un conseguente potenziale di membrana attraverso la membrana mitocondriale interna (Δψ) 2. L'ossigeno è l'elettrone accettore finale della catena di trasporto degli elettroni e gli ioni idrogeno fluire attraverso i sintasi ATP dallo spazio intermembrana torna alla matrice, e così facendo direttamente provoca la formazione di ATP. Questo processo come descritto nella sua interezza è noto come fosforilazione ossidativa. Le pieghe creste aumentano la superficie della membrana interna, consentendo il trasporto di elettroni massima e la produzione di ATP all'internoogni mitocondrio. Le proteine, enzimi e altre molecole coinvolte nella fosforilazione ossidativa sono derivati ​​da entrambi i geni nucleari e mitocondriali. I mitocondri contengono un proprio DNA circolare, codifica per 13 proteine ​​e tRNA e mRNA necessari per la produzione di ATP 3. Tuttavia, molte più proteine ​​sono necessari e quindi sono codificati nucleare. La maggior parte di queste proteine ​​codificate dal nucleo sono mirati alla matrice mitocondriale mediante l'uso di presequenze al N-terminale della proteina precursore, e la loro importazione è guidato in parte da Δψ 4,5.

Oltre contribuendo alle bioenergetica di una cella, mitocondri influenzano anche importanti processi metabolici come TCA e beta-ossidazione, segnalazione cellulare tramite regolazione del calcio, come pure un ruolo chiave nell'apoptosi 6. In particolare, durante i periodi di stress cellulare, proteine ​​BCL-2 familiari che risiedono o interagiscono a livello della membrana mitocondriale esterna può causare mitocondrialepermeabilità della membrana esterna (MOMP) 7,8. Durante MOMP, citocromo c e altre proteine ​​vengono rilasciati nel citoplasma, e insieme a diverse proteine ​​citosoliche formano un complesso chiamato apoptosoma 9,10. Il apoptosoma attiva caspasi che vanno a fendere proteine ​​e DNA cellulare durante la fase di esecuzione di apoptosi. Non appena si verifica MOMP, ΔΨ è crollato e la produzione di ATP si fermò. Funzione mitocondriale Così, come apoptosi è avviato viene compromessa e variazioni ΔΨ può essere correlato ad mitocondriale e cellule salute 12. Mentre l'apoptosi è un endpoint in molti modelli di malattia, la funzione mitocondriale e modifiche ΔΨ può anche fornire informazioni preziose sulla origine e / o la progressione della malattia. Per esempio, cambiamenti strutturali e funzionali mitocondriali sono state documentate nel corso di malattie neurodegenerative 13,14.

Nella prima parte del protocollo, isozione di mitocondri intatti che mantengono la loro ΔΨ è descritto. Cellule HEK-293T sono stati esposti a diverse concentrazioni e combinazioni di TNF-α ricombinante, IL1-β e IFN-γ di indurre apoptosi. Queste citochine sono stati scelti perché sono frequentemente segnalati per essere elevato in campioni settiche umani primari 15 e la via estrinseca di apoptosi può essere innescato da interazioni di legame al suo recettore TNF-α 6. Dato che ci sono sottili variazioni necessarie per isolare i mitocondri funzionale da tessuti primari rispetto alle cellule in coltura, e perché molte ricerche utilizza gli animali, il protocollo descrive anche come isolare i mitocondri dal fegato e midollo spinale di anteriore sclerosi laterale (ALS) modello di topo.

La seconda parte del protocollo è stato sviluppato per monitorare perturbazioni al potenziale di membrana mitocondriale utilizzando un colorante fluorescente potenziale sensibile con un lettore di piastre a fluorescenza. Differenzas tra lo stato cellulare (cioè, sano vs malsana) si differenziano per la forza di quantificazione ΔΨ di mitocondri isolati in combinazione con agenti di disaccoppiamento, inibitori della catena respiratoria, inibitori e ionofori complessi, i quali provocano dissipazione del potenziale di membrana mitocondriale. Il sano mitocondri, maggiore è la variazione ΔΨ seguito al trattamento con inibitori mitocondriali, quindi la risposta dei mitocondri può essere usata come indicatore di (dis) funzione mitocondriale.

L'utilizzo di mitocondri isolati piuttosto che nella valutazione situ della funzione offre la prova definitiva che una patologia o trattamento modula direttamente modifiche alla organello 16-18. Mentre ci sono metodi in letteratura per isolare mitocondri da cellule in coltura, sono vaghi 17 e / o di utilizzare attrezzature specializzate 16. Questo protocollo descrive in dettaglio il metodo di isolamento ed èfacilmente adattabile ad altre linee cellulari, incluse tessuto primario e culture 13,14,19,20. Molti studi mitocondri isolati utilizzano gli stessi uncouplers mitocondriali e inibitori utilizzati in questo protocollo, ma con un elettrodo di Clark (21 è un esempio rappresentativo di numerose pubblicazioni in letteratura), che è ancora un pezzo molto specifico e specializzato di apparecchiature. Inoltre, questo metodo tradizionale ha limitazioni come la bassa velocità e di elevata complessità 22,23 e richiede una notevole quantità di mitocondri (~ 500 ug / reazione). In questo protocollo, la fluorescenza membrana sensing potenziale TMRE sonda viene usata in combinazione con un lettore di piastre a fluorescenza, che è una macchina standard in molti laboratori. TMRE è considerato poiché entra rapidamente cellule e mitocondri isolati e può essere utilizzato a basse concentrazioni 24. Le reazioni multiple possono rapidamente essere impostati in tandem e lotti analizzati con questo protocollo. Inoltre, la reaziones richiedono un gran piccola quantità di mitocondri isolati (~ 10 ug / reazione). Richiedendo meno materiale, campioni di tessuto o di colture cellulari più piccole possono essere utilizzate come punto di partenza per l'isolamento mitocondri, più repliche o reazioni possono essere impostati e materiale potenzialmente sufficiente per altri esperimenti mitocondri isolati come la produzione di ATP, consumo di ossigeno, o l'importazione saggi sono possibili.

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Protocol

Tutti gli esperimenti sugli animali conformi alle linee guida del National Institutes of Salute e sono state approvate dalla Wake Forest University Animal Care and Use Committee. Coppie nidificanti di SOD1G93A [B6SJL-TGN (SOD1-G93A) 1Gur] modello di topo sono stati ottenuti da The Jackson Laboratory (Bar Harbor, ME). Wild-type (WT) femmine e maschi SOD1G93A nontransgenic [B6SJL-TGN (SOD1-G93A) 1Gur] sono stati allevati per generare topi SOD1G93A e nontransgenic fratellini WT che sono stati utilizzati negli esperimenti.

1. Modelli per Investigation

  1. Colture cellulari
    1. Mantenere cellule renali di embrioni umani (HEK-T293) cellule in DMEM supplementato con 10% di calore inattivato siero fetale bovino, 1% di penicillina-streptomicina e 1% L-glutammina, a 37 ° C in 5% di CO 2.
    2. Crescere cellule in fiasche T75 e consentire loro di raggiungere il 90% di confluenza.
    3. Effettuare splitting cellulare tramite tripsinizzazione (0,25% tripsina-EDTA) per 3-5 minuti a 37 ° C in 5% CO 2
    4. Aspirare i media e risospendere il pellet cellulare in coltura.
    5. Cellule seme nel pallone o sulla piastra 7 x 10 4 cellule in un T75 boccetta 48 ore prima del trattamento con citochine. Questo dovrebbe dare ~ 70% di densità al momento del trattamento.
    6. Cellule priveranno siero 24 ore dopo aspirando media e sostituendolo con lo stesso volume di mezzi privi di siero (DMEM, sterile).
    7. Preparare TNF-α, β-IL1, e IFN-γ, dalla polvere liofilizzata con acqua ultra-pura a concentrazioni di lavoro di 5 pg / ml, 10 ng / ml, e 10 ng / ml, rispettivamente, e aggiungerli ai pozzetti / fiaschi.
    8. Siero Treat cellule fame mediante aggiunta di citochine solubilizzate direttamente al mezzo di coltura cellulare di flaconi appropriati. Trattamenti consisteva di singoli citochine, un cocktail di tutti e 3 (denominato "* 3"), o steracqua ile come controllo (denominato "0").
    9. Incubare cellule trattate per 24, 48 o 72 ore prima della valutazione e la raccolta.
  2. Valutazione vitalità cellulare
    1. Fare una soluzione 5 mg / ml di 3- (4,5-dimetiltiazol-2-il) -2,5-difeniltetrazolio bromuro (MTT) in PBS 1x.
    2. Per piastre da 12 pozzetti, aggiungere 100 ml di soluzione MTT ad ogni pozzetto e mescolare delicatamente per assicurare una distribuzione uniforme.
    3. Incubare le piastre per 15 min-1 ora a 37 ° C in 5% CO 2, e controllare al microscopio per la presenza di una colorazione viola. Se non è un viola presente, agitare di nuovo e consentono alle cellule di incubare in intervalli di 5 min fino viola si osserva. La quantità di tempo necessario deve essere determinato da ciascun ricercatore.
    4. Utilizzando un pipettatore a ripetizione, aggiungere 700 ml di solvente MTT (HCl 4 mM e 0,1% NP40 in isopropanolo) a ciascun pozzetto e la piastra di roccia (s) a temperatura ambiente per 5-10 minuti, o fino a quando tutto il colore viola aveva lasciato le cellule . Se violacolore non esce di cellule, aggiungere altri 200 ml di solvente e continuare a turbinare.
    5. Per l'analisi, prendere 100 ml di ogni bene e mettere in una piastra a 96 pozzetti e leggere su un lettore di piastre con 570 nm e una lunghezza d'onda di riferimento di 630 nm, ma 595 nm è accettabile a condizione che le letture sono prese a impostazioni coerenti.
  3. Modello animale di SLA
    1. Tutti gli esperimenti sugli animali conformi alle linee guida del National Institutes of Salute e sono state approvate dalla Wake Forest University Animal Care and Use Committee. Coppie nidificanti di SOD1G93A [B6SJL-TGN (SOD1-G93A) 1Gur] modello di topo sono stati ottenuti da The Jackson Laboratory (Bar Harbor, ME). Wild-type (WT) femmine e maschi SOD1G93A nontransgenic [B6SJL-TGN (SOD1-G93A) 1Gur] sono stati allevati per generare topi SOD1G93A e nontransgenic fratellini WT che sono stati utilizzati negli esperimenti.
    2. Eseguire genotipizzazione con primer standard, contro SOD1 mutante 25.

2. Isolamento dei mitocondri

NOTA: E 'importante lavorare velocemente e tenere tutto in ghiaccio durante tutta la procedura.

  1. Preparazione del tampone di isolamento mitocondriale (MIB), midollo spinale buffer di isolamento (SC MIB) e tampone sperimentale (EB)
    1. Preparare le seguenti soluzioni madre prima del tempo per MIB e EB.
    2. Fare 1 M Tris / MOPS sciogliendo 12,1 g di base di Tris in 70 ml di H 2 O. Aggiungi MOPS secco per arrivare a pH 7,4. Regolare il volume a 100 ml finale. Filtro sterilizzare e conservare a 4 ° C.
    3. Fare 1 M Kphos mescolando 80,2 ml di K 2 HPO 4 e 19,8 ml di KH 2 PO 4. Conservare a temperatura ambiente.
    4. Rendere 0,2 M EGTA / Tris aggiungendo 3,8 g di EGTA a 10 ml di H 2 O. Aggiungere 1 M Tris / MOPS fino disciolti, ~ 30-40 ml. Regolare a 50 ml, filtro sterile e conservare a temperatura ambiente. Si noti che il pH sarà ~ 6,7.
    5. Fare 1 M glutammato facendo 10 ml diSoluzione 1 M di acido glutammico. Filtro sterilizzare e conservare a 4 ° C.
    6. Fare 1 M Malate facendo 10 ml di soluzione 1 M di acido malico. Aggiungi Tris / MOPS a 50 mm. Filtro sterilizzare e conservare a 4 ° C.
    7. Effettuare MIB ad una concentrazione di saccarosio 200 mM, Tris 10 mM / MOPS, pH 7,4, e 1 mM EGTA / Tris. Filtro sterilizzare e conservare a 4 ° C.
    8. Rendere SC MIB ad una concentrazione di saccarosio 250 mM, 20 mM HEPES-KOH pH 7,5, KCl 10 mM, 1,5 mM MgCl 2, 1 mM EDTA, 1 mM EGTA, 1 mM DTT, e cocktail inibitore di proteasi.
    9. Effettuare EB ad una concentrazione di 125 mM KCl, 10 mM Tris / MOPS, pH 7,4, 5 mM glutammato, malato 2,5 mM, 1 K mM fosfato, pH 7,4, e 10 mM EGTA / Tris. Filtro sterilizzare e conservare a 4 ° C.
  2. Preparazione apparecchiature prima raccolta delle cellule.
    1. Risciacquare un piccolo recipiente di vetro e omogeneizzazione pestello tre volte con acqua sterile e disporli sul ghiaccio.
    2. Raccogliere gli elementi necessari, ad esempio drill standard, SCRA cellularepers, 1,5 ml, 15 ml e 50 ml provette e soluzioni.
  3. I mitocondri Isolation
    1. Cellule in coltura
      1. Per ogni tipo di campione, utilizzare due palloni T175 di cellule.
      2. Assicurarsi che le cellule sono ~ 90% confluenti e utilizzare in esperimenti di controllo, o piastra e trattare come descritto nel passaggio 1.2.
      3. Sulla parte superiore del banco, i media aspirare e lavare le cellule aderenti due volte con 15 ml di 1x PBS ogni volta.
      4. Aspirare il tampone e raschiare flaconi per rimuovere le cellule aderenti dal fondo del pallone.
      5. Aggiungere 15 ml di PBS 1x per ogni pallone, turbine, e trasferire ai singoli 15 ml provette coniche e posto sul ghiaccio.
      6. Una volta raschiatura è fatto, centrifugare le provette per 5 minuti a 700 xg, a 4 ° C utilizzando una centrifuga da tavolo utilizzando un rotore oscillante secchio.
      7. Supernatanti Aspirare e risospendere ogni pellet in 1 ml di MIB.
      8. Combinare entrambe le sospensioni e il trasferimento di un piccolo recipiente di vetro per omogeneizzazione.
      9. Aggiungi MIBal recipiente fino buffer raggiunge la prima riga. Omogeneizzare cellule con il pestello collegati ad un trapano a velocità media per tre passaggi. Assicurarsi che la nave è in ghiaccio durante questa fase, non rimuovere il pestello sopra il liquido e di utilizzare una velocità costante con continui passaggi.
      10. Trasferire la soluzione omogeneizzato in una provetta conica da 50 ml.
      11. Aspirare la soluzione in una siringa da 3 ml con un calibro 18 1 ½ pollice ago e di espellere di nuovo nel tubo conico sul ghiaccio con una calibro 27 ½ ago pollici. Fare attenzione per espellere la soluzione contro la parete interna del tubo da utilizzare quella forza di sconvolgimento membrana cellulare.
      12. Ripetere le fasi siringa per un totale di cinque volte.
      13. Trasferire la soluzione in un tubo da 15 ml e centrifugare per 5 min a 600 xg, a 4 ° C in una centrifuga da tavolo utilizzando un rotore oscillante secchio.
      14. Rimuovere con attenzione il surnatante e distribuire tra tre 1,5 ml provette.
        NOTA: Mitochondria sono nel supernatante dopo questo primo, rotazione a bassa velocità, mentre le membrane cellulari e cellule intatte sono pellettizzati.
      15. Provette per centrifuga in un rotore ad angolo fisso a 10.000 xg, a 4 ° C per 5 min.
      16. Surnatanti Aspirare e combinano il pellet in 100 ml MIB e mettono immediatamente in ghiaccio.
        NOTA: mitocondri sono nel pellet dopo questa rotazione ad alta velocità. I mitocondri in genere a mantenere il loro potenziale di membrana per ~ 2-3 ioni di ghiaccio dopo l'isolamento e sono più stabili come una soluzione madre concentrata in MIB.
    2. I mitocondri isolamento dal tessuto del mouse
      1. Anestetizzare il mouse secondo il protocollo IACUC. Impostare un vaporizzatore al 5,0% per indurre l'anestesia. Confermato che l'animale è anestetizzato da una mancanza di riflessione per pizzico piedi o riflesso corneale quando l'occhio si avvicina o sfruttato con un batuffolo di cotone. Mantenere il mouse sotto anestesia per tutta la procedura chirurgica mantenendo il vaporizzatore tra 1,5% e 2,0%.
      2. Excise il fegato e il midollo spinale di ogni animale e luogo separatamente nel freddo ghiaccio 1x PBS - / - per lavare via il sangue.
      3. Per il fegato, trasferire il tessuto ad un piatto pesare su ghiaccio e tagliare a pezzi sottili usando una lama di rasoio fresco per 1 min.
      4. Aggiungere tessuti e tampone appropriato (MIB per il fegato o SC MIB per il midollo spinale) al recipiente fino buffer raggiunge la prima riga. Omogeneizzare il tessuto con il pestello a mano per cinque passaggi. Assicurarsi che la nave è in ghiaccio durante questa fase, non rimuovere il pestello sopra il liquido e di utilizzare una velocità costante con continui passaggi.
      5. Trasferimento omogenati per pulire 15 ml provette.
      6. Provette per centrifuga in un rotore ad angolo fisso a 750 xg, a 4 ° C per 10 min.
      7. Salvare il surnatante in provette pulite e disporli sul ghiaccio.
        NOTA: mitocondri sono nel supernatante dopo questo primo, rotazione a bassa velocità, mentre le membrane cellulari e cellule intatte sono pellettizzati.
      8. Risospendere il pellet midollo spinale in 500 ml di SC MIB.
      9. Re-omogeneizzare ogni tre volte, riempiendo solo la metà nave con SC MIB questa volta.
      10. Trasferire il nuovo omogeneizzato in una nuova provetta.
      11. Centrifugare la in un rotore ad angolo fisso a 750 xg, a 4 ° C per 10 min.
      12. Combinare questi nuovi surnatanti, che contengono più mitocondri, con il primo supernatante da ogni campione.
      13. Provette per centrifuga in un rotore ad angolo fisso a 10.000 xg, a 4 ° C per 5 min.
      14. Supernatanti Aspirare e risospendere il pellet fegato in 500 ml di MIB e pellet del midollo spinale in 50 microlitri SC MIB e collocare immediatamente su ghiaccio.
        NOTA: mitocondri sono nel pellet dopo questa rotazione ad alta velocità. I mitocondri in genere a mantenere il loro potenziale di membrana per ~ 2-3 ioni di ghiaccio dopo l'isolamento e sono più stabili come una soluzione madre concentrata in MIB.
      15. Effettuare un saggio concentrazione proteica di stimare la concentrazione di mitocondri in soluzione. Seguire istruzionis per l'utilizzo di un kit commerciale Protein Assay o metodo simile 26. Tipici concentrazioni di mitocondri sono: fiasche T175 rendimenti 2 ~ 2 mg / ml, 1 fegato di topo ~ 3-5 mg / ml e 1 midollo spinale di topo ~ 1-3 mg / ml.
  4. Citocromo c test utilizzando un progetto di R & S Rat / Mouse citocromo c Quantikine ELISA Kit (adattato dal protocollo fornito dal produttore).
    1. Immediatamente prima di impostare le reazioni, diluire mitocondri a 0,5 mg / ml concentrazione di lavoro con EB e distribuire mitocondri diluiti in 1,5 ml provette per le reazioni (di solito 30-50 ml di mitocondri per provetta).
    2. Aggiungere sia EB o DMSO, all'1% del volume totale, ai mitocondri diluito e incubare le reazioni sul banco per 7-10 min. Queste reazioni sono stabili per un massimo di 30 minuti a temperatura ambiente, se è necessario un periodo di tempo più lungo.
    3. Mitocondri pellet per centrifugazione in un rotore ad angolo fisso a 10.000 xg, a 4 ° C per 5 min e accurataly separare il surnatante e mettere ciascuno in separata provette da 1,5 ml.
      NOTA: Tubes può o essere congelato a -20 ° C per un'analisi successiva o utilizzato immediatamente.
    4. Determinare rilascio del citocromo c da un confrontando la concentrazione del citocromo c nel pellet e supernatante 27.
      1. Preparare campioni solubilizzando il pellet nel volume originale della reazione con 0,5% Tx-100 in PBS 1x.
      2. Per ogni campione, preparare 2 pozzetti della piastra ELISA, uno per il pellet ora solubilizzato e uno per il supernatante dalla reazione mediante aggiunta di 100 ml di citocromo c coniugato (utilizzare direttamente dalla bottiglia) più 100 ml di 0,5% Tx- 100 in PBS 1x e quindi il campione di pellet o surnatante.
      3. Vortice delicatamente la piastra di un livello basso (livello 2-4) per 20 secondi per mescolare, coprire e incubare per 1 ora, 37 ° C.
      4. Avanti, lavare la piastra quattro volte con tampone di lavaggio diluito secondo il manufacturistruzioni di Er. Rimuovere qualsiasi eccesso di soluzione picchiettando i pozzetti su carta assorbente.
      5. Successivamente, aggiungere 150 ml di 1: 1 A + B soluzione di sviluppo a ciascun pozzetto ed incubare la piastra per 20-30 minuti al buio a temperatura ambiente.
      6. Infine, aggiungere 50 ml di soluzione di stop in tutti i pozzetti e le letture di assorbanza a 540 nm con un lettore di micropiastre. Calcolare la quantità di rilascio del citocromo c confrontando la quantità di citocromo c nel pellet vs supernatante per ogni reazione.

3. Valutazione della funzione mitocondriale (Dys)

  1. Immediatamente prima reazioni sono impostati, diluire mitocondri a 0,5 mg / ml di concentrazione lavorare con EB e poste in provette da 1,5 ml per le reazioni (tipicamente 30-50 ml di mitocondri sono utilizzati per provetta).
  2. Trattamenti mitocondriali
    1. Aggiungere trattamenti appropriati (controllo EB, 1 micron FCCP mescolato con 50 Nm Valinomicina, 10 micron rotenone, 5 mM oligomicina, 2 mM KCN, o 200 mM di ADP, concentrazioni finali) per separare reazioni a 1/10 del volume totale dei mitocondri diluiti. Incubare le reazioni sul banco per 7 min.
      NOTA: Si deve prestare attenzione quando si maneggiano tali sostanze come l'ingestione accidentale o assorbimento attraverso la pelle potrebbe essere dannoso.
    2. Diluire TMRE, ricostituito in acqua sterile alla concentrazione di lavoro di 100 mM e conservati a -20 ° C, a 2 mM e aggiungere un volume pari al volume di reazione mitocondriale.
    3. Incubare le reazioni sul banco per 7 min.
    4. Mitocondri pellet per centrifugazione in un rotore ad angolo fisso a 10.000 xg, a 4 ° C per 5 min.
    5. Carico metà del volume supernatante di ciascun campione su una piastra 396 pozzetti e leggere la fluorescenza.
      NOTA: eccitazione e di emissione di TMRE devono essere ottimizzati in base alle istruzioni del fabbricante, con il volume e la piastra che verrà utilizzato per lail dosaggio. Utilizzando una piastra standard 384 pozzetti nero con 25 ml di 1 micron TMRE (concentrazione di reazione finale) il segnale più forte è stata ottenuta usando lunghezze d'onda di eccitazione / emissione   485 nm / 535 nm.
    6. Calcolare la piega-differenza tra il controllo della fluorescenza (EB) e ogni trattamento dividendo il valore di fluorescenza relativa (RFU) ottenuto dal lettore di piastre per il campione sperimentale dal RFU dal campione di controllo.

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Representative Results

Il trattamento di cellule HEK-293T con 200 pg / ml TNF-α, 40 ng / ml IL1-β, e 75 ng / ml di IFN-γ (* 3) per 24-48 ore porta a quantità progressive di morte cellulare (Figura 1A ). La vitalità cellulare è stata valutata utilizzando test MTT e dimostra costantemente che non vi è ~ 10% di diminuzione della vitalità cellulare al trattamento con 24 ore e ~ 20% di diminuzione con il trattamento 48 ore. Le cellule trattate con concentrazioni simili (100 pg / ml TNF-α, 40 ng / ml IL1-β, e 75 ng / ml IFN-γ) portare a risultati di morte cellulare simili a 48 ore, e il trattamento con i singoli citochine rivela che il calo redditività è dovuto alla combinatoria colpisce (Figura 1B). I dati di redditività presso Figura 1B rappresentano la media +/- deviazione standard di 3 esperimenti separati ogni esecuzione in triplice copia, e la tenuta delle barre di errore dimostrano la riproducibilità dei dati. La quantità di citochine può essere regolata in questo protocollo di trattamento per ulteriori elucidatall'e il contributo di ciascun citochine sulla morte cellulare, e citochine addizionali o altri fattori possono anche essere inclusi, fintanto controlli appropriati vengono eseguiti.

Isolamento dei mitocondri da cellule e tessuti è stata descritta in letteratura dal 1940 28,29. La premessa per la procedura è la distruzione cellulare seguito da centrifugazione differenziale, dove sono noti mitocondri greggio a pellet a ~ 10.000 x g. Molti protocolli che utilizzano mitocondri isolati richiedono membrane intatte doppie che possono mantenere la loro potenziale di membrana, e quindi è necessario valutare l'integrità volta isolamento è completa. Durante lo sviluppo del protocollo di isolamento mitocondri da cellule HEK coltivate, un saggio citocromo c è stato usato per indicare se sono stati ottenuti mitocondri intatti. Utilizzando disponibile in commercio citocromo c kit ELISA, i mitocondri sono stati quantificati dopo l'isolamento e diluiti in EB, e poi o EB o DMSOaggiunte e le reazioni di incubare sul banco. Poi, separando mitocondri dal surnatante circostante, analisi del citocromo c contenuto di entrambe le frazioni è stata usata come indicatore per la membrana mitocondriale integrità; se la maggioranza del citocromo c viene mantenuto nel pellet mitocondriale poi i mitocondri sono da considerare intatte, mentre se più del 15% del citocromo c si trova nel surnatante, poi mitocondri sono stati considerati inadatti per studi funzionali. Come si vede nella tabella 1, il protocollo descritto rendimenti ~ 12% citocromo c rilascio e ~ 15% quando mitocondri isolati vengono pre-trattati con DMSO. Risultati simili sono stati riportati in precedenza per i mitocondri isolati da altre linee cellulari o tessuti animali 19,20,27. In alternativa, l'integrità mitocondriale può essere valutata con TMRE, che è stato utilizzato durante l'isolamento di fegato mouse e mitocondri del midollo spinale. Durante iniziale DEVELOPME protocollo isolamentont, studi hanno valutato i mitocondri isolati da fegato e midollo spinale di sani, normali mitocondri topi. Per ogni campione, ΔΨ stata valutata confrontando il segnale fluorescente da mitocondri isolati trattati con EB a quelli incubate con FCCP + Valinomicina (Tabella 2). Un rapporto di fluorescenza tra i mitocondri trattati e non trattati di> 1 è stato usato come indicazione di sani, mitocondri intatti.

Una volta che sono stati sviluppati protocolli di isolamento mitocondri di successo, i mitocondri isolati dal controllo, cellule non trattate e * 3 citochine trattati cellule, o topi normali e SOD1 sono stati analizzati. Mitocondri HEK di entrambi i gruppi sono stati trattati con vari uncouplers e inibitori e ΔΨ misurate dai cambiamenti TMRE assorbimento. La differenza di volte nel controllo EB trattati mitocondri a sganciamento / inibitore mitocondri trattati indica una differenza nella forza delle ΔΨ tra i due gruppi (dati rappresentativi e calcal- nella Tabella 3). Inoltre, la diminuzione per cento da cellule non trattate a * 3 cellule trattate significano che la salute mitocondriale risente trattamenti citochine, corroborando di vitalità cellulare (Figura 2). Valutazione della forza ΔΨ via TMRE assorbimento con mitocondri isolati da fegato e midollo spinale di quattro singoli topi normali, di controllo rispetto a quattro topi SLA indica che la salute dei tessuti può anche essere valutato utilizzando questo protocollo. Come illustrato dalle differenze di piegatura e diminuzioni percentuali ΔΨ, confronto di EB-trattamento e FCCP + Valinomicina-trattamento dei mitocondri dal controllo e gli animali la malattia progredita sono significativamente differenti (tabella 4, fa riferimento a vedere anche 13 e 14).

Figura 1
Figura 1: La morte cellulare indottod by * 3 trattamento è progressiva nel tempo e maggiore con trattamenti citochine individuali. (A), le cellule HEK-293T sono stati trattati per 24 o 48 ore e morte cellulare è stata misurata con un saggio MTT. I valori sono stati normalizzati per il controllo, i campioni non trattati e dati rappresentano misurazioni in triplicato per n = 3, +/- deviazione standard. (B), le cellule HEK-293T sono stati trattati con singole citochine o un cocktail (* 3) per 48 ore e la morte cellulare valutato via saggio MTT. I dati rappresentano n = 5 per ciascuna delle citochine individuale e n = 6 per * 3, +/- deviazione standard.

Pellet (AU) Surnatante (AU) % Citocromo c rilascio
0 0,818 0,115 12.6 ± 2.27
DMSO 0,793 0,142 15.3 ±; 2.23

Tabella 1:. Ritenzione di citocromo c in mitocondri isolati da cellule coltivate dati rappresentano la media di n = 4, +/- deviazione standard.

fegato 1 fegato 2 midollo spinale 1 midollo spinale 2
RFU EB 97.830 94.132 339.716 290.154
F / V 435.188 461.299 385.366 482.480
rapporto 4.45 4.9 1.13 1.66
EB = tampone sperimentale e F / V = ​​FCCP + valinomicina.

Tabella 2:. Misura di ΔΨ dai mitocondri isolati da normali tessuti di topo Due animali separate sono stati utilizzati per isolare fegato e midollo spinale mitocondri in tandem (ad esempio il fegato 1 e del midollo spinale 1 sono dello stesso animale).

EB oligo marciume KCN ADP F / V
RFU 0 4.844 12.507 12.734 9925 10.892 4.844
* 3 6517 13.639 12.435 10.235 13.154 6517
Differenza Fold 0 N / A 2.58 2.63 2.05 2.25 2.65
* 3 N / A 2.09 1.91 1.57 2.02 2.18
% Diminuzione 0 vs 3 * 18.94 27.41 23.35 10.24 17.67
EB = tampone sperimentale; oligo = oligomicina; rot = rotenone; KCN = cianuro di potassio, e F / V = ​​FCCP + valinomicina.

Tabella 3: dati grezzi ei calcoli di Cell Culture isolato esperimenti mitocondri.

Figura 2
Figura 2: mitocondri isolati da cellule citochine trattate sono diminuite potenziale di membrana. Diminuzione percentuale di ΔΨ per 0 vs. * 3 per ogni trattamento rispetto al controllo, come calcolato nella tabella 2. I dati rappresentano valori medi di reazioni duplicati per n = 3 (oligomicina, rotenone, e FCCP / Valinomicina) o n = 2 ( KCN e ADP) +/- deviazione standard. * = Statisticamente significativi valori di p basati su calcoli di differenza piega; p = 0,03, 0,01 e 0,05 per oligomicina, rotenone e FCCP / Valinomicina rispettivamente.

Midollo spinale Fegato
Fold Difference Controllo 1.54 ± 0.48 3.20 ± 1.56
SOD1 1.10 ± 0.30 3.12 ± 1.75
% Diminuzione 28.1 2.48
p-value 0.03 0.41

Tabella 4: mitocondri isolati dal midollo spinale di topi SOD1 sono diminuiti potenziale di membrana, come valutato dal FCCP + Valinomicina dati rappresentano la media di 4 animali per gruppo..

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Discussion

Il trattamento di cellule HEK-293T con citochine ricombinanti provoca una moderata quantità di morte cellulare oltre 48 ore (Figura 1). La quantità di morte cellulare indotta da TNF-alfa è simile agli studi precedentemente riportati 30 e vitalità cellulare diminuisce dopo la co-somministrazione di molteplici citochine che sono maggiori di quantità sommativi con qualsiasi citochine solo è anche coerente con la letteratura 31,32. La possibilità di modulare gli importi e tipi di trattamenti citochine e confronto dei cocktail a singoli citochine rendono questo modello di coltura cellulare interessante per studiare gli effetti specifici di esposizione citochine in cellule renali. Inoltre, i risultati sono molto riproducibili e facilmente conseguito (Figura 2). Considerazioni da tenere a mente sono la confluenza delle cellule. Per esempio, cellule trattate a 100% di confluenza non rispondono così alle stesse concentrazioni di citochine quando trattati al 70-80% confluenza. Inoltre, il numero di passaggi delle cellule sono passati attraverso dovrebbe essere monitorato, come la risposta delle cellule potrebbe essere influenzato dopo essere stato in cultura per troppo tempo (più di 8-12 settimane da scongelamento). Mentre il trattamento di cellule in coltura con citochine diminuita vitalità cellulare e la salute successivamente mitocondriale, è affatto un modello per sepsi per sé. Tuttavia, l'uso di un modello più clinicamente rilevanti, come ad esempio impiegando cellule renali primarie isolate da topi e / o trattamento con citochine naturalmente secreta dalle cellule stimolate THP1 33, è una naturale estensione di questo lavoro. Dato il deficit di comprensione di insufficienza renale durante la sepsi, tali modelli di coltura cellulare e la valutazione dei mitocondri potrebbe fornire una conoscenza iniziale dei meccanismi e piattaforma preliminare per testare l'efficacia di composti farmaceutici come trattamenti preventivi o intervento.

I mitocondri isolati da cellule in coltura o tessuti animalipermettere la capacità di valutare rapidamente l'impatto dei trattamenti cellulari o progressione della malattia sulla salute mitocondriale. I protocolli di isolamento e di valutazione non sono tecnicamente impegnativo per eseguire, e potrebbe essere facilmente modificati per l'uso con altre linee cellulari o tessuti primari. Il MIB e EB utilizzata per ogni tipo di campione sono buone ricette di partenza che possono essere regolati come necessario se una cellula o di un tessuto particolare tipo ha esigenze diverse. Ad esempio, l'aggiunta di BSA libera acidi grassi è di solito necessario per l'uso con i neuroni, come incluso con il protocollo del midollo spinale 15,34. Il metodo distruzione cellulare può anche essere modificata utilizzando più espulsioni siringa o modificando a mano omogeneizzazione invece di utilizzare un trapano o viceversa. Inoltre, ri-omogeneizzazione del primo pellet centrifugazione, come fatto nella procedura cavo mitocondri spinale, può essere necessaria per ottenere una quantità soddisfacente di mitocondri. Un buon indicatore che un protocollo di isolamento produce mitochondri vitalia è l'uso del citocromo c ELISA. Questo test è un semplice e veloce alternativa al blot occidentale del citocromo c rilascio ed è anche una valutazione utile del citocromo c rilascio dopo il trattamento dei mitocondri con peptidi o altri composti 19,27. In alternativa, TMRE può essere usato durante lo sviluppo del protocollo, ma è importante valutare mitocondri isolati da un campione che è noto per essere sano. Inoltre, quando isolando mitocondri di topo tessuti che non sono ordinariamente descritti in letteratura, mitocondri di fegato possono servire come controllo positivo e utilizzato per impostare una linea di base. Per esempio, come in questo protocollo, fegati da ogni animale, sia durante lo sviluppo protocollo nonché esperimenti sono stati asportati e utilizzati per l'isolamento mitocondri. Un'altra considerazione per un preparato è la quantità di mitocondri ottenuti al termine della procedura di isolamento. Se la concentrazione di mitocondri è 1 mg / ml o meno,i risultati del test possono rivelarsi inaffidabili (osservazioni non pubblicate VDGM). Sia la quantità di materiale di partenza, MIB ricetta o il metodo di interruzione deve essere ottimizzata prima di passare a saggi funzionali. Una volta che un protocollo di isolamento successo è raggiunto, i mitocondri possono essere utilizzati anche in altri test come contenuto di ATP totale e la produzione di ATP 13,14.

Il protocollo funzione dei mitocondri qui descritta consente la misurazione indiretta della captazione mitocondriale del potenziale rilevamento TMRE tintura utilizzando un lettore standard di piastra fluorescente. Dopo mitocondri sono stati isolati e le sostanze chimiche adeguate aggiunto, sono incubati con TMRE e poi pellet. Trattando le cellule intere o animali e isolando mitocondri prima di ΔΨ valutazione, confondendo variabili come il trasporto multi-resistente ai farmaci o flusso di ATP sono evitati. La quantità di fluorescenza nel supernatante viene quindi analizzato con la comprensione che il sano mitocondriil più forte la loro ΔΨ e quindi più assorbimento di TMRE. Come risultato, la quantità di fluorescenza nel supernatante dovrebbe essere meno nei mitocondri sani e più in mitocondri sani. Includendo un EB-unico trattamento, la differenza piega della fluorescenza tra questo comando e mitocondri disaccoppiati può essere calcolato. Un altro importante controllo di ogni serie di reazioni a conduzione è solo TMRE. Il risultato di questo controllo fornisce una lettura massima possibile fluorescente. Poiché la TMRE aggiunto reazioni è appena diluito, c'è variabilità intrinseca. Ad esempio, TMRE sola lettura di ~ 20.000, 25.000 e 30.000 sono stati raggiunti in diversi momenti durante lo sviluppo del protocollo. Se l'TMRE solo segnale è molto maggiore rispetto a qualsiasi dei mitocondri campioni trattati e / o se mitocondri trattate non sono significativamente diversi da greggia, allora l'isolamento dei mitocondri accoppiato era molto probabilmente non riuscita. La diminuzione ΔΨ misurata da un rapporto ottenutoquando a seguito di questo protocollo è simile a quelli già segnalati per il controllo, le cellule sane 2,35. Confronto di modifiche ΔΨ dai mitocondri isolati da controllo, cellule HEK-293T non trattati e * 3 celle citochine trattati ha dimostrato che la vitalità cellulare diminuita osservato in saggi MTT si traduce in una riduzione della funzione dei mitocondri. Questo test lettore di piastre potrebbe essere facilmente utilizzato con mitocondri isolati da qualsiasi fonte e utilizzati per esaminare i modelli di malattia come la SLA, come dimostrato qui 13,14.

Diversi studi hanno utilizzato coloranti fluorescenti specifici mitocondri per rilevare MOMP, che sono stati importanti nella genesi di questo saggio lettore di piastre. Tuttavia, questi studi utilizzare cellule intere per lo screening di composti che bloccano o indurre MOMP 35,36, esplorare nuovi ΔΨ rilevamento coloranti 2 o individuare altri formati quali citometria a flusso su un microchip 37. Questo protocollo è unico in quanto descrive annuncioMetodo Nell'odontoiatria per isolare e utilizzare mitocondri di indagare rapidamente effetti del trattamento a cellule attraverso la risposta a composti ΔΨ alterano noti. Questo protocollo utilizza una varietà di uncouplers e inibitori, e indica che nessuno di loro sarebbe adatto per valutare la salute mitocondriale. Così, mentre questo particolare centri di ricerca sulle modifiche mitocondriali dovuti a stress cellulare o disfunzione cellulare progressiva, il protocollo potrebbero essere utilizzati anche per esplorare variazioni del metabolismo mitocondriale attraverso l'uso di composti specifici e / o l'aggiunta di sorgenti di elettroni come succinato e NADH .

Considerazioni importanti quando effettuano la valutazione mitocondri isolati includono consistenza dei volumi di trattamento, mantenendo i mitocondri in MIB e diluendo in EB immediatamente prima dei trattamenti stanno per essere istituito, e l'utilizzo di mitocondri nel raggio di 3 ore di isolamento per garantire la loro ΔΨ è ancora mantenimento. Ilscelta di TMRE su altri coloranti fluorescenti specifici mitocondri come JC-1 è dovuto alla capacità di utilizzare piccole concentrazioni e semplicità di analisi di fluorescenza con una sola lunghezza d'onda. Questo metodo potrebbe parimenti essere effettuata utilizzando la microscopia a fluorescenza o 2,38 citometria a flusso 37, tuttavia l'uso di un lettore di piastre richiede meno tempo e richiede meno ottimizzazione 35. Inoltre, questo protocollo è molto meno tecnicamente impegnativo, veloce da eseguire, e più facilmente riproducibili rispetto all'utilizzo di un elettrodo di Clark 22 (Del Gaizo Moore, osservazioni non pubblicate). Titolazione quantità di ogni trattamento mitocondriale può fornire ulteriori indicazioni circa la funzione mitocondriale e l'ottimizzazione delle operazioni di concentrazione deve essere eseguita. Il volume totale delle reazioni mitocondriali può essere regolata internet la quantità di campione ottenuto durante l'isolamento e il numero di reazioni di trattamento necessarie. Se possibile, un importo forfettario di 50 μ; Viene utilizzato l; Tuttavia, appena il 20 microlitri di mitocondri produce risultati affidabili.

Mentre ΔΨ correlato al consumo di ossigeno, il saggio presentato non misurare direttamente consumo di ossigeno. Mentre ossigeno fluorescente sonda di rilevamento come MitoExpress sono stati sviluppati, presumibilmente per evitare alcune delle cadute di utilizzare un elettrodo Clark citata, il prezzo per reazione e l'esigenza di una maggiore quantità di mitocondri per dosaggio rimangono limitante. Pertanto, l'uso di TMRE e uncouplers ΔΨ classiche o inibitori ha diversi vantaggi. Anche in questo caso, l'analisi lotto di campioni multipli o trattamenti multipli / campione, riproducibilità, basso fabbisogno di materiale di partenza e / o minore quantità di mitocondri isolati necessaria per reazione rendono questo protocollo attraente.

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Materials

Name Company Catalog Number Comments
L-glutamic acid Sigma G1251 Can use the potassium salt instead.
malic acid Sigma M8304 Can use the potassium salt instead.
KH2PO4 Sigma P0662
K2HPO4 Sigma P3786
EGTA Sigma E3889
Trisma base Sigma T6066
MOPS Sigma M3183
CCCP Sigma C2920 Dilute down to 100 μM as a working stock in ethanol and store at -20 °C.
Valinomycin Sigma V0627 Make in DMSO and use as a 5 μM working stock. Store at -20 °C.
sucrose Fisher S5-500
KCN Mallinckrodt 6379 Make a concentrated stock in ethanol and then dilute with water 
rotenone Sigma R8875 Highly toxic. Made in ethanol.
oligomycin Sigma O4876 Highly toxic. Made in ethanol.
ADP Sigma A2754
TMRE Sigma 8717-25mg Dilute 100 μM stock with EB immediatley before use.
DMEM Gibco 11965-084 1x regular (high glucose).
Pen/Strep Invitrogen 15140-155
L-glutamine Fisher SH3002101 Store aliquots at -20 °C
FBS Lonza 14-501F US origin, premium quality. Heat inactivate and store aliquots at -20 °C.
Trypsin-EDTA Sigma T4049
DMSO SIgma D2650
Protien Assay Dye (5x) Bio-Rad 500-0006 Any protein assay can substitute.
BSA Fisher BP1600-100 Make 2 mg/ml stock in water for protein assay.
MTT powder Sigma M2128 Filter sterlize 5 mg/ml stock made in PBS. Store aliquots at -20 °C; store at 4 °C for up to 1 week.
Tergitol solution (NP-40) Sigma NP40S
Recombinant Human IL-1B Gibco PCH08014 Once opened store aliquots at -20 °C
Recombinant Human TNF-alpha Gibco PHC3015L
Recombinant Human IFN-gamma Gibco PHC4031
Dulbeccos PBS (-/-) Sigma D8537 Make sure it is without Mg2+ and Ca2+ ions.
Cytochrom c ELISA kit R&D systems DTC0 Human for HEK-293T cells. 

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