İzolasyon ve Kültür Hücrelerinin ve Fare Doku gelen Mitokondri Fonksiyonel Analizi

Biology

Your institution must subscribe to JoVE's Biology section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Lampl, T., Crum, J. A., Davis, T. A., Milligan, C., Del Gaizo Moore, V. Isolation and Functional Analysis of Mitochondria from Cultured Cells and Mouse Tissue. J. Vis. Exp. (97), e52076, doi:10.3791/52076 (2015).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Introduction

Yaşayan hücreler yağ ve karbonhidrat şeklinde metabolik enerjiyi banka ve biyosentezi, membran taşıma ve hareket için bu enerjiyi kullanır. Bazı enerji glikoliz sırasında doğrudan ATP içine beslenme şekerlerin dönüşüm yoluyla sitosol içinde elde edilmektedir. Bununla birlikte, bir hücre ATP üretiminin başlıca kaynağı mitokondriyal solunum zincirinde 1 ile mitokondri içinde yararlanır. mitokondri yapısı, etkili ve verimli bir ATP üretimi için gerekli olan uzaysal yönlendirilmesini sağlar. Mitokondri bileşenleri bir zarlar arası boşluk ve birlikte matris içteki mitokondriyal bölme, ev ile ayrılmış bir çift zar sahip ve ATP üretimi dahil kimyasal reaksiyonları koordinat. iç zarı solunum zinciri gibi ATP sintaz, ATP oluşumu için bir araya ADP ve Pi getiren protein kompleksi ihtiva zara bağlı protein komplekslerinin bir dizi içerir. haner membran kristalı içine katlanmış ve elektronlar sitokrom-c, zarlar arası alanı içinde kompleksleri arasında hareket eden bir çözünür elektron taşıyıcı aracılığıyla solunum zinciri kompleksleri boyunca iletilir. Elektronlar hareket ettikçe, indirgeyici eşdeğerleri oksidasyon oluşur ve hidrojen iyonları zarlar arası boşluğa matristen pompalanır. Zarlar arası alanı içinde yüksek iyon konsantrasyonunun bir sonucu olarak, bir elektrokimyasal gradyan iç mitokondriyal zarın (Δψ) 2 üzerinde bir zar potansiyeli elde oluşturur. Oksijen elektron taşıma zincirinin son elektron alıcısı ve hidrojen iyonları matriks geri arası boşluğa ATP sentezler akan ve bunu doğrudan yaparken ATP oluşumuna neden olur. Bütünüyle tarif edildiği gibi bu işlem, oksidatif fosforilasyon gibi bilinmektedir. krista kıvrımlar maksimal elektron taşıma ve ATP üretimi içinde sağlayan, iç zarı yüzey alanını arttırmakHer mitokondri. proteinler, enzimler ve oksidatif fosforilasyon ile ilgili diğer moleküller, nükleer ve mitokondriyal genlerin elde edilir. Mitokondri 13 protein olarak tRNA'ların ve ATP üretimi için gerekli olan 3 mRNA için kendi dairesel DNA kodlama içerir. Bununla birlikte, çok daha fazla protein gereklidir ve böylece kodlanan nükleer bulunmaktadır. Bu, nükleer-şifrelenmiş proteinlerin çoğunluğu ön-madde proteininin N-terminalinde presequences kullanımı ile mitokondrial matris hedeflenir ve bunların alma Δψ 4,5 kısmen tahrik edilir.

Bir hücrenin Biyoenerjetiğin katkıda ötesinde, mitokondri, aynı zamanda, TCA ve beta-oksidasyon düzenleyen kalsiyum yoluyla hücresel sinyal, aynı zamanda apoptoz 6 önemli bir rol olarak önemli metabolik süreçleri de etkilemektedir. Özellikle, hücresel stres zamanlarında, üzerinde ikamet veya BCL-2 ailesi proteinleri mitokondriyal neden olabilir mitokondriyal dış membran etkileşimdış membran geçirgenliği (MOMP) 7,8. MOMP sırasında, sitokrom C ve diğer proteinlerin çeşitli sitosolik proteinler ile birlikte karmaşık bir apopitozom 9,10 adı oluşturan sitozolüne yayımlanan ve edilmektedir. apopitozom apoptoz yürütme aşamasında hücresel proteinler ve DNA parçalamak için gitmek kaspazlan harekete geçirir. MOMP meydana bitmez, ΔΨ çöktü ve ATP üretimi durdurdu. Bu nedenle, apoptoz gibi başlatılır mitokondriyal fonksiyonu ele geçirilmiş ve ΔΨ değişiklikler mitokondriyal ve hücre sağlık 12 ile korele edilebilir. Apoptoz da hastalık oluşmasından ve / veya ilerlemesi hakkında değerli bilgiler elde edebilirsiniz birçok hastalık modelleri, ΔΨ için mitokondriyal fonksiyon ve değişiklikler bir son nokta iken. Örneğin, mitokondriyal yapısal ve fonksiyonel değişiklikler nörodejeneratif hastalıkların 13,14 sırasında belgelenmiştir.

Protokol, iso ilk bölümündeonların ΔΨ muhafaza sağlam mitokondri lation tarif edilmektedir. HEK-293T hücreleri apoptozisini sağlamak için farklı konsantrasyonlarda ve yeniden birleştirici TNF-α, IL1-β ve IFN-γ kombinasyonlarına maruz bırakıldı. Sık sık kendi reseptörüne bağlanmasının 6, TNF-α etkileşimi tarafından tetiklenebilir primer insan septik örnekleri 15 ve apoptoz harici yolunun yüksek olduğu rapor edilmiştir, çünkü bu sitokinler seçilmiştir. Kültürlenmiş hücreler ile karşılaştırıldığında, primer dokulardan işlevsel mitokondria izole etmek için gerekli ince varyasyonlar olduğundan çok fazla araştırma hayvanları kullandığı için, ve protokol, aynı zamanda, karaciğer ve lateral skleroz (ALS) fare modeli ön omurilik ile ilgili mitokondri izole açıklamaktadır.

protokolü ikinci bölümü bir flüoresan plaka okuyucusu ile potansiyel duyarlı fluoresan boya kullanılarak mitokondriyal membran potansiyeli düzensizlikler izlemek için geliştirilmiştir. FarkHücresel durumu (sağlıksız vs yani, sağlıklı) arasındaki ın mitokondrial membran potansiyelinin dağılımı neden bütün bunlar ayrılması ajanlar, solunum zinciri inhibitörleri, karmaşık inhibitörleri ve iyonoforlar ile birlikte izole mitokondri ΔΨ gücünü nicelleştirilmesiyle ayırt edilir. Bu nedenle mitokondri tepki mitokondriyal (dis) fonksiyonunun bir göstergesi olarak kullanılabilir mitokondriyal inhibitörleri ile tedavi üzerine ΔΨ değişimi geniş, mitokondri sağlıklı.

Yerine fonksiyonunun yerinde değerlendirilmesi daha izole mitokondri kullanımı patoloji veya tedavi doğrudan organele 16-18 değişiklikleri modüle kesin kanıt sunmaktadır. Kültürlü hücrelerden mitokondri izole etmek literatürde yöntemler varken, bunlar belirsizdir 17 ve / veya özel ekipman 16 kullanmaktadır. Bu protokol detaylı izolasyon yöntem açıklanır ve birbirincil doku ve kültürler 13,14,19,20 dahil olmak üzere diğer hücre çizgileri, kolayca uyarlanabilir. Birçok izole mitokondri çalışmaları bu protokolde ama Clark elektrodu ile kullanılan aynı mitokondriyal eşleşmeyenler ve inhibitörleri tekrar ekipman çok özel ve özel parça, (21 literatürde birçok kağıtları temsili bir örnektir) kullanmaktadır. Ayrıca, bu, geleneksel bir yöntem, düşük verim ve yüksek bir karmaşıklık 22,23 gibi sınırlılıklara sahiptir ve mitokondri önemli miktarda (~ 500 ug / reaksiyon) gerektirir. Bu protokol, floresan zara algılama potansiyel sistemi TMRE standart makine birçok laboratuvarda bir floresan plaka okuyucu ile birlikte kullanılır. Bu hızlı bir şekilde hücreler ve izole mitokondri girer ve düşük konsantrasyonlarda 24 kullanılabilir çünkü TMRE yaygın olarak kabul edilmektedir. Çoklu reaksiyonlar hızla tandem kurulabilir ve toplu bu protokolü kullanılarak analiz. Ayrıca, reaksiyonin izole edilmiş bir mitokondri (~ / reaksiyon, 10 ug) 'in bir çok küçük bir miktar gerekmektedir. Daha az malzeme gerektiren, daha küçük doku ya da hücre kültürü numuneleri mitokondri izolasyonu için bir başlangıç ​​noktası olarak kullanılabilir, daha çok kez tekrarlandı ve reaksiyon kurmak ve ATP üretimi, oksijen tüketimi, ithal gibi izole edilmiş bir mitokondri deneyleri için potansiyel olarak yeterince malzeme olabilir tahliller yapılabilir.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Tüm hayvan deneyleri Sağlık kurallar National Institutes uymakta ve Wake Forest Üniversitesi Hayvan Bakım ve Kullanım Kurulu tarafından kabul edildi. SOD1G93A [B6SJL-TgN (SOD1-G93A) 1Gur] fare modeli için üreyen Jackson Laboratory (Bar Harbor, ME) elde edilmiştir. Vahşi tip (WT) kadın, SOD1G93A erkek transjenik olmayan [B6SJL-TgN (SOD1-G93A) 1Gur] SOD1G93A fareler ve deneylerde kullanılan transjenik olmayan WT yavruları oluşturmak için üretildi.

Soruşturma için 1. Modelleri

  1. Hücre kültürü
    1. % 5 CO2 içinde 37 ° C 'de, insan embriyonik böbrek hücreleri (HEK-T293),% 10 ısı ile inaktive edilmiş fetal büyükbaş hayvan serumu,% 1 penisilin-streptomisin ve% 1 L-glutamin ile takviye edilmiş DMEM içinde hücreler, muhafaza edin.
    2. T75 matara hücreleri büyümek ve onları% 90 izdiham ulaşmak için bekleyin.
    3. % 5 CO2 içinde 37 ° C'de 3-5 dakika boyunca, tripsinizasyon (% 0.25 Tripsin-EDTA) vasıtasıyla hücre bölme yapın
    4. Medya aspire ve kültür ortamında hücre pelletini.
    5. 7 x 10 4 hücreleri T75 içinde uygun bir şişe ya da levha tohum hücreleri tedavi sitokin önce 48 saat şişe. Bu tedavi sırasında% 70 ~ yoğunluğu vermelidir.
    6. Serum açlıktan ölüyor hücreleri, 24 saat sonra ortam aspire edilmesiyle ve serumsuz ortam, aynı hacimde (DMEM, steril) ile değiştirerek.
    7. 5 ug / ul, 10 ng / ul çalışma konsantrasyonlarda ultra saf su ile liyofilize edilmiş toz, TNF-α, IL1-β ve IFN-γ, hazırlama, ve 10 ng / ml, sırasıyla ve çukurlara eklemek / matara.
    8. Tedavi, serum, doğrudan uygun şişe hücre kültür ortamına çözünür sitokinlerin ilave edilerek hücreler aç. Tedaviler, tek tek sitokinlerin her bir 3 kokteyl oluşuyordu (şekilde "* 3" olarak anılacaktır) ya da sterBir kontrol olarak Ile su ("0" olarak anılacaktır).
    9. Değerlendirme ve hasattan önce 24, 48 ya da 72 saat tedavi hücreleri inkübe.
  2. Hücre canlılığı değerlendirmesi
    1. 1x PBS içinde 3- (4,5-dimetiltiazol-2-il) 'in bir 5 mg / ml solüsyon -2,5-difeniltetrazolyum bromid (MTT) konur.
    2. 12 oyuklu plakalar için, her bir göze MTT çözeltisi 100 ul ve hafifçe eşit dağılımını sağlamak için girdap.
    3. % 5 CO2 içinde 37 ° C 'de 15 dakika ila 1 saat boyunca inkübe edin ve mor renk değişikliği için bir mikroskop altında bakın. Mor bir mevcut ise, yeniden girdap ve mor gözlenene kadar, hücreler 5 dakika aralıklarla inkübasyona izin verin. Gerekli olan zaman miktan, her bir araştırmacı tarafından belirlenmelidir.
    4. Tüm mor renk hücreleri bıraktığı kadar tekrar pipet kullanarak, her bir MTT çözücü (izopropanol içinde 4 mM HCl ve% 0.1 NP-40), 700 ul ve 5-10 dakika boyunca, oda sıcaklığında bir plaka (lar) kaya ya da . Mor iserenk, hücre çıkan çözücü ilave 200 ul ve girdap devam etmez.
    5. Kaynaklar tutarlı ayarlar alındığı gibi, ancak 595 nm sürece, aynı zamanda kabul edilebilir olduğu, analiz için, her bir gözden 100 ul alır ve bir 96-çukurlu plaka içine koyun ve 570 nm kullanılarak bir plaka okuyucusu ile 630 nm'lik bir referans dalga boyu ile oku.
  3. ALS Hayvan Modeli
    1. Tüm hayvan deneyleri Sağlık kurallar National Institutes uymakta ve Wake Forest Üniversitesi Hayvan Bakım ve Kullanım Kurulu tarafından kabul edildi. SOD1G93A [B6SJL-TgN (SOD1-G93A) 1Gur] fare modeli için üreyen Jackson Laboratory (Bar Harbor, ME) elde edilmiştir. Vahşi tip (WT) kadın, SOD1G93A erkek transjenik olmayan [B6SJL-TgN (SOD1-G93A) 1Gur] SOD1G93A fareler ve deneylerde kullanılan transjenik olmayan WT yavruları oluşturmak için üretildi.
    2. Mutant SOD1 25 karşı standart primerler ile genotiplendirmesi gerçekleştirin.

Mitokondri 2. izolasyonu

NOT: Bu hızlı çalışır ve işlem boyunca buz üzerinde her şeyi tutmak için önemlidir.

  1. Mitokondriyal yalıtım tamponu (MIB), omurilik yalıtım tamponu (SC MIB) ve deney tampon hazırlanması (EB)
    1. Öncesinde MIB ve EB için zaman aşağıdaki stok çözümleri hazırlayın.
    2. H2O, 70 ml Tris baz, 12.1 g çözülmesiyle 1 M Tris / MOPS yapmak 7.4 pH almak için kuru MOPS ekleyin. 100 ml finale ses seviyesini ayarlayın. 4 ° C'de sterilize Filtresi ve mağaza.
    3. 80.2 K 2 HPO 4 ml ve KH 2 PO 4 19.8 ml karıştırarak 1 M Kphos olun. Oda sıcaklığında saklayınız.
    4. H2O ile 10 ml EGTA, 3.8 g eklenmesi ile 0.2 M EGTA / Tris yapmak Çözülmüş, ~ 30-40 ml kadar 1 M Tris / MOPS ekleyin. 50 ml oda sıcaklığında steril filtre ve saklamak için ayarlayın. PH ~ 6.7 olacağını unutmayın.
    5. 10 ml yaparak, 1 M Glutamat yapmakGlutamik asit 1 M çözelti. Filtre sterilize ve mağaza 4 ° C.
    6. Malik asit, 1 M solüsyon, 10 ml yaparak, 1 M MAlate'I sağlayın. 50 mM Tris / MOPS ekleyin. 4 ° C'de sterilize Filtresi ve mağaza.
    7. 200 mM sükroz, 10 mM Tris / MOPS, pH 7.4, 1 mM EGTA / Tris bir konsantrasyonda MIB sağlayın. 4 ° C'de sterilize Filtresi ve mağaza.
    8. 250 mM sükroz, 20 mM HEPES-KOH, pH 7.5, 10 mM KCI, 1,5 mM MgCl2, 1 mM EDTA, 1 mM EGTA, 1 mM DTT ve proteaz inhibitörü kokteyli bir konsantrasyonda SC MIB olun.
    9. 125 mM KCl bir konsantrasyonda EB yapmak, 10 mM Tris / MOPS, pH 7.4, 5 mM glutamat, 2.5 mM malat, 1 mM K fosfat, pH 7.4 ve 10 mM EGTA / Tris yer alır. 4 ° C'de sterilize Filtresi ve mağaza.
  2. Hücrelerin hasat öncesinde Ekipmanları hazırlık.
    1. Küçük bir cam kap ve homojenleştirme havaneli steril su ile üç kez durulanır ve buz üzerine yerleştirin.
    2. Böyle bir standart matkap, hücre scra gerekli öğeleri toplayınpers, 1.5 mi, 15 ml ve 50 ml tüpler ve çözeltiler.
  3. Mitokondri İzolasyon
    1. Kültür Hücreler
      1. Her bir numune tipi için, hücreler iki T175 şişelerde.
      2. Hücrelerdir ~% 90 konfluent sağlanması ve kontrol deneyi, ya da levha olarak kullanmak ve adım 1.2, yukarıda tarif edildiği gibi tedavi etmek.
      3. Ve tezgah üstüne, aspirat ortam üzerinde 1x PBS ve her seferinde 15 ml iki kez yapışkan hücreleri yıkayın.
      4. Tampon aspire ve şişenin tabanından yapışmayan hücreler giderilmiş şişeler kazıyın.
      5. Her bir şişeye, girdap 1x PBS 15 ml ilave edilir, ve buz üzerinde tek tek 15 ml konik tüp ve yer aktarın.
      6. Kazıma bir sallanan kepçeli rotor kullanılarak bir masa üstü santrifüj kullanılarak 700 x g'de, 4 ° C'de 5 dakika boyunca santrifüj tüpleri yapıldıktan sonra.
      7. Aspire süpernatantlar ve MIB 1 ml her pelletini.
      8. Her iki süspansiyonlar birleştirin ve homojenizasyon için, küçük bir cam kabına transfer edilir.
      9. MIB Eklegeminin tampon ilk satırı ulaşana kadar. Üç kez geçirilerek orta hızda bir uçlu havan tokmağı ile homojenize hücreleri. Damar sıvının üzerinde tokmağı kaldırmak ve sürekli paslar ile bir sabit hız kullanmak için değil, bu adımı sırasında buz üzerinde olduğundan emin olun.
      10. 50 ml'lik bir konik tüp homojenleştirilir çözeltisini.
      11. 18 gauge 1 ½ inç iğne kullanılarak bir 3 ml'lik enjektöre çözüm çizin ve bir 27 ölçü ½ inç iğne ile buz üzerinde tekrar konik tüp içine sınırdışı. Hücre zarı bozulması için o gücü kullanmak için tüpün iç duvarına karşı çözüm sınırdışı etmeye özen gösterin.
      12. Beş kez toplam şırınga adımları tekrarlayın.
      13. Sallanan kovalı rotor kullanılarak bir masa üstü santrifüjü içinde 600 x g'de, 4 ° C'de 5 dakika boyunca 15 ml konik bir tüp ve santrifüje çözeltisini.
      14. Dikkatle süpernatant kaldırmak ve üç 1.5 ml tüpler arasında dağıtmak.
        NOT: Mitochohücre zarları ve kesintisiz hücreleri topaklanır ise ndria, bu birinci, düşük hızlı bir dönüş sonra süpernatan içinde bulunmaktadır.
      15. 10.000 x g'de 5 dakika 4 ° C 'de sabit açılı rotor Santrifüj tüpleri.
      16. Aspire süpernatanları 100 ul MIB pelet birleştirmek ve hemen buz üzerine yerleştirin ve.
        Not: Mitokondri bu yüksek hızlı bir dönüş sonra pelet içindedir. Mitokondri tipik olarak izole edildikten sonra 2-3 iyon buz ~ onların membran potansiyeline sahiptirler ve MIB içinde konsantre edilmiş bir stok çözeltisi olarak en kararlı olacaktır.
    2. Fare dokularından Mitokondri izolasyon
      1. IACUC protokole göre fare anestezisi. Anestezi ikna etmek için% 5,0 bir buharlaştırıcı ayarlayın. Göz yaklaştı veya bir pamuklu çubukla vurdu zaman hayvan ayak tutam veya kırpma refleksinin için refleksi eksikliği ile anestezi olduğunu doğruladı. % 1.5 ile% 2.0 arasında Buharlaştırıcı'yı tutarak tüm cerrahi prosedür için anestezi altında fare tutun.
      2. Hariçimkb PBS 1x buz soğuk ayrı ayrı hayvan ve yerden karaciğer ve spinal kord - / - herhangi bir kan uzakta durulayın.
      3. Karaciğer için, buz üzerinde bir ağırlık çanak doku transferi ve 1 dakika boyunca taze jilet kullanarak ince parçalar halinde doğrayın.
      4. Tampon ilk satırı ulaşıncaya kadar kaba doku ve (omurilik için karaciğer ya da SC MIB için MIB) uygun tampon ekleyin. Beş geçer elle havan ile doku homojenize. Damar sıvının üzerinde tokmağı kaldırmak ve sürekli paslar ile bir sabit hız kullanmak için değil, bu adımı sırasında buz üzerinde olduğundan emin olun.
      5. Homojenatlar 15 ml tüpler temizlemek için aktarın.
      6. 750 x g'de, 10 dakika süre ile 4 ° C 'de sabit açılı rotor Santrifüj tüpleri.
      7. Temiz tüpler içine Süpernatantlar kaydedin ve buz üzerine koyun.
        Not: hücre zarları ve kesintisiz hücreleri topaklanır ise mitokondri, bu birinci, düşük hızlı bir dönüş sonra süpernatan içinde bulunmaktadır.
      8. Omurilik pelet yeniden askıya in SC MIB 500 ul.
      9. Sadece SC MIB ile damar yarım bu kez dolum, her üç kez yeniden homojenize.
      10. Taze tüp yeni Homojenat aktarın.
      11. Santrifüj 750 x g'de, 10 dakika süre ile 4 ° C 'de sabit açılı rotor.
      12. Her örnekten ilk süpernatant ile, daha fazla mitokondri içeren bu yeni süpernatanlan, birleştirin.
      13. 10.000 x g'de 5 dakika 4 ° C 'de sabit açılı rotor Santrifüj tüpleri.
      14. Aspire süpernatanları 500 MIB ul ve 50 ul SC MIB omurilik peletler karaciğer pelet tekrar süspansiyon ve hemen buz üzerine yerleştirin.
        Not: Mitokondri bu yüksek hızlı bir dönüş sonra pelet içindedir. Mitokondri tipik olarak izole edildikten sonra 2-3 iyon buz ~ onların membran potansiyeline sahiptirler ve MIB içinde konsantre edilmiş bir stok çözeltisi olarak en kararlı olacaktır.
      15. Çözelti içinde mitokondri konsantrasyonunu tahmin etmek için bir protein konsantrasyonu analizi gerçekleştirir. Talimatı uygulayınticari bir Protein Deney Kiti veya benzer bir yöntemle 26 ile s. Mitokondri tipik konsantrasyonlar şunlardır: 2 T175 şişesi verim ~ 2 mg / ml, 1 fare karaciğer ~ 3-5 mg / ml ve 1 fare omurilik ~ 1-3 mg / ml olmuştur.
  4. (Üretici tarafından sağlanan protokol uyarlanmış) Quantikine ELISA Kit c bir Ar-Ge Sıçan / Fare Sitokrom kullanarak sitokrom-c tahlil.
    1. Hemen tepkileri kurmadan önce, EB ile 0.5 mg / ml çalışma konsantrasyonu mitokondri sulandırarak reaksiyonları (tüp başına mitokondri tipik haliyle 30-50 ul) 1.5 ml tüpler içinde seyreltilmiştir mitokondri dağıtın.
    2. Seyreltilmiş mitokondri, toplam hacminin% 1, EB veya DMSO ya ekleyin ve 7-10 dakika tezgah üstünde tepkileri kuluçkaya yatmaktadır. Daha uzun bir zaman diliminde gerekli olup olmadığını Bu reaksiyonlar, oda sıcaklığında 30 dakika boyunca stabildir.
    3. 10.000 x g'de 5 dakika ve dikkatli bir 4 ° C 'de sabit açılı rotor içinde santrifüjlemek suretiyle pelet mitokondrily süpernatant ayrı ve ayrı bir 1.5 ml tüpler her koyun.
      Not: tüpler her iki sonraki analiz için -20 ° C'de donduruldu ya da hemen kullanılabilir.
    4. Bir pelet ve süpernatan 27 sitokrom c konsantrasyonunun karşılaştırarak sitokrom c salınmasını belirler.
      1. 1x PBS içinde% 0.5 TX-100 ile reaksiyonun orijinal hacminin pelet çözündürülmesi ile örnekleri hazırlanır.
      2. Her numune için, ELISA plakasına 2 kuyu, hemen çözündürülmüş pelet için bir sitokrom C bitişik 100 ul ilave edilerek tepkime üstte yüzen madde için bir hazırlama (şişeden doğrudan kullanımı) artı% 0.5 Tx 100 ul 1x PBS içinde 100 ve daha sonra, tüm topak ya da süpernatan numunesi arasında.
      3. Yavaşça, Kapağı karıştırın ve 1 saat, 37 ° C inkübe 20 saniye plaka düşük ayar (seviye 2-4) girdap.
      4. Daha sonra, üretici göre plaka seyreltilmiş yıkama tamponu ile dört kez yıkayıner talimatları. Kağıt havlu üzerine kuyu dokunarak herhangi bir aşırı çözüm çıkarın.
      5. Her bir çukura 1 A + B geliştirme çözeltisi ve karanlıkta, oda sıcaklığında 20-30 dakika süre ile plaka inkübe: Daha sonra, 1 150 ul ilave edin.
      6. Son olarak, her bir durdurma çözeltisi 50 ul ve bir mikro-plaka okuyucusu kullanılarak 540 nm de absorbans okumaları alır. Her reaksiyon için yüzer genel peletindeki sitokrom c değeri ile karşılaştırılması suretiyle sitokrom C salınımı miktarını hesaplayın.

Mitokondriyal (Dys) fonksiyonu 3. Değerlendirme

  1. Reaksiyonları ayarlanır hemen önce, 0.5 mg mitokondri seyreltik / ml EB konsantrasyonu çalışma ve (mitokondri tipik haliyle 30-50 ul tüp başına kullanılır) reaksiyonlar için 1.5 ml'lik tüplere yerleştirildi.
  2. Mitokondriyal tedaviler
    1. 50 nM Valinomycin ile karıştırılır FCCP uygun tedavinin ekleyin (EB kontrol, 1 uM, 10 uM rotenon, 5 uM oligomycin, 2 mM KCN ya da 200 uM ATP, nihai konsantrasyon) ile seyreltildi mitokondri toplam hacmine inci 10/01 reaksiyonu da ayırmak için. 7 dakika tezgah üstünde reaksiyonları inkübe.
      NOT: zararlı olabilir deri yoluyla kazara yutulması veya emilim gibi bu maddeleri kullanırken dikkatli alınmalıdır.
    2. 100 uM'lik bir çalışma konsantrasyonunda steril su içinde yeniden teşekkül ettirilmiş ve 2 uM, -20 ° C'de saklandı, TMRE seyreltin ve mitokondriyal reaksiyon hacmine eşit bir hacim ilave edin.
    3. 7 dakika tezgah üstünde reaksiyonları inkübe.
    4. 10.000 x g'de 5 dakika 4 ° C 'de sabit açılı rotor içinde santrifüjlemek suretiyle pelet mitokondri.
    5. Yük, bir 396-kuyulu bir levha üzerine, her numune süpernatanı hacminin yarısı floresan okuyun.
      NOT: TMRE uyarma ve emisyon dalga boyları için kullanılacak hacim ve plaka kullanılarak, üreticinin talimatlarına uygun olarak optimize edilmelidirdeneyi. Uyarım / emisyon dalga boyları kullanılarak 1 uM TMRE 25 ul standart 384 oyuklu siyah plaka (nihai reaksiyon konsantrasyon) ve en yüksek sinyal elde edildi kullanılarak   485 nm / 535 nm.
    6. Kontrol (EB) ve kontrol örneğinden RFU deneysel örnek için plaka okuyucu elde edilen göreceli floresan değerini (RFU) bölünmesi ile her tedavi arasında floresan kat-farkını hesaplayın.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

200 pg / ml TNF-α, 40 ng / ml, IL1-β ve 75 ng / ml IFN-γ ile HEK-293T hücrelerinin tedavisi (x 3), 24-48 saat boyunca hücre ölümü aşamalı miktarlarda (Şekil 1A yol açar ). Hücre canlılığı MTT denemesi kullanarak değerlendirilmiştir ve sürekli olarak ~ 24 saat, tedaviden hücre canlılığını% 10 azalma ve 48 saat tedavi ile ~% 20'lik bir düşüş olduğunu göstermektedir edildi. Bireysel sitokinler ile benzer konsantrasyonlarda (100 ug / ml TNF-α, 40 ng / ml, IL1-β ve 75 ng / ml IFN-γ), 48 saat sonra benzer bir hücre ölümü sonuçlar ve tedavi ile tedavi edilen hücreler ortaya koymaktadır düşüş, canlılığı Kombinatoryal için (Şekil 1B) etki kaynaklanmaktadır. Şekil 1B canlılığı veriler 3 ayrı deneyde üç kopya halinde her bir çalışma ortalama +/- standart sapmasını temsil eder ve hata çubukları, sıkılığı veri tekrarlanabilirlik göstermektedir. sitokinlerin miktarı daha elucidat bu tedavi protokolünde ayarlanabilirhücre ölümü üzerindeki her bir sitokin katkı e ve ilave sitokinler veya diğer faktörler aynı zamanda şu şekilde sürece uygun kontrollerin yürütülür, dahil edilebilir.

Hücrelerden ve dokulardan mitokondri izolasyonu 1940 28,29 beri literatürde tarif edilmiştir. işlem için öncül ham mitokondri ~ 10,000 x g'de topak haline bilinmektedir diferansiyel santrifüjleme, ardından hücre bozulmasıdır. İzole mitokondri kullanan birçok protokoller kendi membran potansiyelini sürdürebilir sağlam çift membranlar gerektirir, ve bu nedenle izolasyon tamamlandıktan sonra bütünlüğünü değerlendirmek gereklidir. Kültürlenmiş HEK hücrelerinden mitokondri izolasyon protokolünün geliştirilmesi sırasında, bir sitokrom C deney sağlam mitokondri elde edilmiştir olmadığını belirtmek için kullanılmıştır. ELISA kitleri edilen ticari olarak satılan sitokrom kullanarak, mitokondri sonra izole edildikten sonra ölçülmesi ve EB seyreltildi ve ya her EB ya da DMSOeklenmiş ve reaksiyonları tezgah üstünde kuluçkaya için. Daha sonra üstte kalan sıvı kısmın çevreleyen mitokondri ayırarak, her iki fraksiyondan sitokrom C içeriğinin aşağıdaki şekilde analiz mitokondriyal membran bütünlüğü için ve bir göstergesi olarak kullanılmıştır; sitokrom c çoğunluğu sonra mitokondriyal pelet içinde tutulan sitokrom c fazla% 15 süpernatan içinde bulunursa, o zaman mitokondri fonksiyonel çalışmalar için uygun olmadığı ise mitokondri, bozulmamış olarak kabul edilmektedir. Tablo 1 'de görüldüğü gibi, izole edilmiş mitokondri ön işlemden DMSO ile olduğunda, protokol verimi ~% 12 sitokrom c salınımı ve ~% 15 tanımlamıştır. Benzer sonuçlar diğer hücre çizgileri ya da hayvan dokuları 19,20,27 izole mitokondri için daha önce rapor edilmiştir. Seçenek olarak ise, mitokondriyal bütünlüğünü de fare karaciğer ve omurilik mitokondri izolasyonu sırasında kullanılan TMRE ile değerlendirilebilir. İlk izolasyon protokolü developme sırasındant çalışmalar karaciğer ve sağlıklı, normal farelerin mitokondri omurilik izole mitokondri değerlendirildi. Her numune için, ΔΨ FCCP + Valinomycin (Tablo 2) ile inkübe kişilerce EB ile muamele izole mitokondri floresan sinyalinin karşılaştırılması suretiyle değerlendirildi. 1>, işlenmiş ve işlenmemiş Mitokondri arasındaki floresans bir oran sağlıklı, dokunulmamış mitokondri bir gösterge olarak kullanıldı.

Başarılı mitokondri izole etme protokolleri geliştirilmiştir sonra, mitokondri kontrol, işlem görmemiş hücrelerden izole edilir ve * 3 sitokin ile işlenen hücrelerde ya da normal ve SOD1 fareler analiz edilmiştir. Her iki gruptan HEK mitokondri TMRE alımına değişiklikleri ile ölçülen çeşitli eşleşmeyenler ve inhibitörleri ve ΔΨ ile muamele edildi. Kontrol EB kat farkı, yerel (/ tedavi edilen mitokondri inhibitör iki grup arasında ΔΨ mukavemetinde bir fark olduğunu gösterir uncoupler temsili veriler ve mitokondri tedaviTablo 3'te culations). Ayrıca, 3 tedavi hücreleri (Şekil 2) hücre canlılığı verileri doğrulayan, mitokondriyal sağlık sitokin tedavileri etkilenmiş olduğunu belirtmek * ile tedavi edilmemiş hücrelerden yüzde azalma. Dört ALS farelere göre karaciğer ve dört ayrı normal kontrol farelerinin omurilik izole mitokondri ile TMRE alımı ile ΔΨ gücünün değerlendirilmesi doku sağlık bu protokol kullanılarak tayin edilebilir olduğunu göstermektedir. ΔΨ kat farklılık ve yüzde azaldığı gösterildiği gibi, EB-muamele ve FCCP + kontrol ve hastalık ilerledikçe hayvanlardan mitokondri Valinomycin muamele karşılaştırılması önemli ölçüde farklı olduğu (Tablo 4, bakınız, aynı zamanda 13 ve 14 referanslar).

Şekil 1,
Şekil 1: Hücre ölümü teşvik* 3 işlenmesi suretiyle D'nin (a) HEK-293T hücreleri, 24 veya 48 saat ve hücre ölümü ile tedavi edilmiştir. zamanla progresif ve bireysel sitokin tedavisi ile daha büyük olan, bir MTT testi ile ölçülür. Değerler kontrol ile normalize edilmiştir, işlem görmemiş örnekler ve veriler n için üçlü ölçümleri temsil etmektedir: = 3 +/- standart sapma. (B), HEK-293T hücreleri bireysel sitokinler veya bir kokteyl (* 3) 48 saat süre ile ve hücre ölümü değerlendirildi ile muamele edildi MTT tahlili ile. Veriler, tek tek sitokin ve n = 6 her biri için n = 5 * 3 temsil eder +/- standart sapma.

Pelet (AU) Üst faz, (AU) % Sitokrom c salınımı
0 0,818 0.115 12.6 ± 2.27
DMSO 0,793 0.142 15.3 ±; 2.23

Tablo 1:. Kültürlenmiş hücrelerden izole mitokondri sitokrom c Alıkonma Veriler, n = 4 ortalamasını temsil +/- standart sapma.

Karaciğer 1 Karaciğer 2 Omurilik 1 Omurilik 2
RFU EB 97.830 94.132 339.716 290.154
F / V 435.188 461.299 385.366 482.480
oran 4.45 4.9 1.13 1.66
EB = Deneysel tampon ve F / V = ​​FCCP + Valinomycin.

Tablo 2:., Normal fare dokularından izole mitokondri ΔΨ ölçümü iki ayrı hayvanlar (örneğin, karaciğer, 1 ve omurilik 1 aynı hayvan vardır) tandem karaciğer ve omurilik mitokondri izole etmek için kullanılmıştır.

EB oligo çürüme KCN ADP F / V
RFU 0 4844 12.507 12.734 9925 10.892 4844
* 3 6517 13.639 12.435 10,235 13.154 6517
Katlama Fark 0 NA 2.58 2.63 2.05 2.25 2.65
* 3 NA 2.09 1.91 1.57 2.02 2.18
% Düşüş 0 vs * 3 18.94 27.41 23.35 10.24 17.67
EB = Deneysel tampon; oligo = oligomycin; = rotenone çürümeye; KCN potasyum siyanür ve F / V = ​​FCCP + Valinomycin =.

Tablo 3: Hücre c Ham veriler ve hesaplamalarulture mitokondri deneyleri izole.

Şekil 2,
Şekil 2: Mitokondri sitokin ile muamele edilmiş hücrelerden izole edilmiş zar potansiyeli azalmıştır. Tablo 2'de hesaplanan her bir muamele için 0 vs * 3 ΔΨ yüzdesi azalma, kontrol ile karşılaştırmalı olarak göstermektedir. Veriler ya da n = 2 (= 3 (oligomycin, rotenon, ve FCCP / Valinomycin) n çift reaksiyonlarda ortalamasını temsil etmektedir KCN ADP) +/- standart sapma. Kat fark hesaplamalara dayalı * = istatistiksel olarak anlamlı p-değerleri; p = 0.03, sırasıyla oligomycin, rotenone ve FCCP / Valinomycin, 0.01 ve 0.05.

Omurilik Karaciğer
Fark katlayın Kontrol 1.54 ± 0.48 3.20 ± 1.56
SOD1 1.10 ± 0.30 3.12 ± 1.75
% Düşüş 28.1 2.48
p değeri 0.03 0.41

. Tablo 4: grup başına 4 hayvanların ortalamasını temsil FCCP + Valinomycin Data tarafından değerlendirilen Mitokondri SOD1 farelerin omurilik izole potansiyel membran azalmıştır.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Rekombinant sitokinler ile HEK-293T hücrelerinin tedavisi 48 saat (Şekil 1) üzerine hücre ölümü orta miktarda neden olur. TNF-alfa, muamele ile uyarılan hücre ölümünün miktarı önceki çalışmalara 30 benzer ve hücre canlılığı, tek başına de literatürde 31,32 ile uyumlu olan herhangi bir sitokin olan belirleyici miktarda daha büyük olan çok sayıda sitokin birlikte uygulanmasından sonra azalır. miktarları ve sitokin tedavileri türleri yanı sıra bireysel sitokinler kokteyller karşılaştırmasını ayarlamak için yeteneği böbrek hücreleri sitokin maruz belirli etkilerini incelemek için, bu hücre kültürü modeli cazip kılmaktadır. Ayrıca, sonuçlar, çok tekrarlanabilir ve kolayca (Şekil 2) elde bulunmaktadır. Akılda tutulması gereken hususlar hücrelerin izdiham içerir. % 70-80 con tedavi, örneğin,% 100 izdiham tedavi hücreler, sitokinlerin aynı konsantrasyonlarda için iyi cevap vermezlerakıcılık. Hücre yanıtı muhtemelen (eritme çok daha fazlasını 8-12 hafta) çok uzun kültür yapılmış olan etkilenebilir Bundan başka, hücrelerin aracılığıyla gitti geçitlerinin sayısı, takip edilmelidir. Sitokinler ile kültür hücreleri tedavi hücre canlılığı ve daha sonra mitokondriyal sağlığı azalırken, hiçbir sepsis başına bir modeli anlamına gereğidir. Bununla birlikte, klinik olarak daha anlamlı bir modelinin kullanılması, örneğin uyarılmış THP1 hücreleri 33 doğal olarak salgılanan sitokinler ile fare ve / veya tedavisi izole primer böbrek hücrelerini kullanmak gibi, bu işin doğal bir uzantısıdır. Mekanizmaların içine ilk fikir yanı sıra önleyici veya müdahale tedavileri gibi ilaç bileşiklerin etkinliğini test etmek için bir ön platformu sağlayabilir mitokondri sepsis sırasında böbrek yetmezliği anlayış boşluğu, bu tür hücre kültürü modelleri ve değerlendirme göz önüne alındığında.

Mitokondri kültürlenmiş hücreler ya da hayvan dokularından izolehızla mitokondriyal sağlığı üzerindeki hücre tedavileri veya hastalığın ilerlemesi etkisini değerlendirmek için kapasitesini göze. İzolasyon ve değerlendirme protokolleri teknik gerçekleştirmek için talep değildir ve kolayca diğer hücre çizgileri veya birincil dokular ile kullanılmak üzere modifiye edilebilir. Her numune türü için kullanılan MIB ve EB belirli bir hücre veya doku tipi farklı gereksinimleri varsa gerekli ayarlanabilir iyi bir başlangıç ​​tarifleri vardır. Omurilik protokolü 15,34 ile birlikte Örneğin, yağlı asitsiz BSA ek olarak, nöronlar kullanım için genellikle gereklidir. hücre parçalama yöntemi de tam tersi daha fazla şırınga sınırdışı kullanarak veya el değiştirme homojenizasyon yerine bir matkap kullanarak veya tarafından değiştirilebilir. Omurilik mitokondri prosedürü olarak yapıldığı gibi Ayrıca, ilk santrifüj pelet yeniden homojenizasyon, mitokondri, tatmin edici bir miktarda elde etmek için gerekli olabilir. Bir izolasyon protokolü uygulanabilir mitochondri üreten iyi bir göstergeBir ELISA c sitokrom kullanılmasıdır. Bu deney, sitokrom C salınımı batı leke analizi için hızlı ve kolay bir alternatif olabilir ve ayrıca, peptitler veya başka bileşikler 19,27 ile mitokondri tedaviden sonra sitokrom C salınımı için faydalı bir değerlendirmesidir. Seçenek olarak ise, TMRE protokol geliştirme sırasında kullanılabilir, ancak sağlıklı olmak için bilinen bir numuneden izole mitokondri değerlendirmek için önemlidir. Rutin olarak literatürde tarif olmayan fare dokularından mitokondri izole ederken temel oluşturulması için kullanılan başka, karaciğer mitokondri de bir pozitif kontrol olarak hizmet edebilir. Örneğin, bu protokolde olduğu gibi, her hayvandan, hem protokol geliştirme yanı sıra deneyler sırasında karaciğerleri de çıkarıldı ve mitokondri izolasyonu için kullanılan. Bir hazırlanması için diğer bir husus izolasyon prosedürü sonunda elde edilen mitokondri miktarıdır. Mitokondri konsantrasyonu daha sonra 1 mg / ml veya daha az iseTahlil sonuçları güvenilmez (yayınlanmamış gözlemler VDGM) ispat edebilir. Her iki başlangıç ​​malzemesi, MIB tarifi veya bozulma yöntemi miktarı fonksiyonel deneyleri geçmeden önce optimize edilmelidir. Başarılı bir izolasyon protokolü ulaşıldıktan sonra, mitokondri, aynı zamanda, toplam ATP içeriğine ve ATP üretimi 13,14 gibi tahlillerde de kullanılabilir.

Burada açıklanan mitokondri fonksiyonu protokolü standart floresan plaka okuyucu kullanarak potansiyel algılama boya TMRE mitokondriyal alımı dolaylı ölçümü sağlar. Mitokondri izole edilmiş ve uygun bir kimyasal ilave edildikten sonra, bu TMRE ile inkübe edilir ve ardından tane haline getirilmiştir. Bu tür multi-ilaça dirençli taşıma ATP akı gibi değişkenler karıştırıcı, bütün hücreler veya hayvanların tedavi edilmesi ve değerlendirme ΔΨ önce mitokondri izole edilmesi ile önlenir. süpernatant floresan miktarı daha sonra mitokondri sağlıklı anlayışı ile analiz edilirgüçlü bunların ΔΨ ve TMRE bu nedenle daha alımı. Sonuç olarak, üstte kalan sıvı floresan miktarı sağlıksız mitokondrilerde sağlıklı mitokondrilerde daha az, daha fazla olmalıdır. EB-tek tedavi, bu kontrol ve bağlanmamış mitokondri arasındaki floresan kat fark olmak üzere hesaplanabilir. Run reaksiyonların her set ile diğer önemli kontrol yalnız TMRE olduğunu. Bu kumanda sonucu mümkün olan en yüksek floresan okunmasını sağlar. TMRE Yeni seyreltilmiş olan reaksiyonlara ilave yana doğal farklılıklar bulunmaktadır. Örneğin, ~ 20.000, 25.000 ve 30.000 TMRE sadece okuma protokol gelişimi sırasında çeşitli zamanlarda elde edildi. Tedavi mitokondri muamele edilmemiş önemli ölçüde farklı değildir ve / veya, eğer TMRE sadece sinyal tedavi mitokondri örneklerin herhangi bir daha büyük ise, daha sonra birleştirilmiş mitokondri izolasyon başarılı muhtemelen değildi. ΔΨ azalma elde edilen bir oranı ile ölçüldüğü haliyleBu protokol zaman kontrolü için daha önce rapor miktarlarda, sağlıklı hücrelere 2,35 benzer. Kontrol izole mitokondri, muamele edilmemiş HEK-293T hücreleri ve * 3 sitokin ile muamele edilmiş hücrelerden ΔΨ değişikliklerin karşılaştırması MTT testinin gözlenen azalma hücre canlılığı mitokondri fonksiyonlarında azalma çevirir gösterdi. Burada 13,14 gösterildiği gibi bu levha okuyucu deneyi kolaylıkla herhangi bir kaynaktan izole edilmiş ve ALS gibi hastalık modellerinde incelemek için kullanılan mitokondri ile kullanılabilir.

Çeşitli çalışmalar, bu plaka okuyucu testinin oluşumunda önemli olduğunu MOMP, algılamak için mitokondri özel floresan boyalar kullanılmıştır var. Ancak, bu çalışmalar bloke bileşikler ekran veya MOMP 35,36 neden, keşfetmek, yeni ΔΨ algılama boyalar 2 ya da böyle bir mikroçip 37 flow sitometri gibi diğer formatları tanımlamak için tüm hücreleri kullanmak ya. O reklamı açıklar ki bu protokol benzersizetailed yöntem izole ve hızla bilinen ΔΨ değiştiren bileşikleri yanıt yoluyla tüm hücre tedavisinin etkilerini araştırmak için mitokondri kullanmak için. Bu protokol, eşleşmeyenler ve önleyicilerinin çeşitli kullanır, ve bunların herhangi bir mitokondriyal durumunu değerlendirmek için uygun olacağını gösterir. Dolayısıyla, hücre stres veya artan hücre fonksiyon bozukluğu mitokondriyal değişiklikler bu özel araştırma merkezleri, protokol, spesifik bileşikler ve / veya süksinat ve NADH elektron kaynaklarının eklenmesi aracılığıyla olan mitokondrial metabolizmanın değişiklikleri keşfetmek için kullanılabilir iken .

İzole mitokondri değerlendirmesini gerçekleştiren Önemli hususlar tedavi hacimleri tutarlılık, MIB mitokondri tutmak ve tedaviler kurmak olacak hemen önce EB onları seyreltilmesi ve onların ΔΨ hala emin olmak için izolasyon 3 saat içinde mitokondri kullanarak içerir korunur.örneğin JC-1 gibi diğer mitokondriye özgü floresan boyalar üzerinde TMRE seçimi küçük konsantrasyonlarda ve tek bir dalga boyu kullanılarak floresan analizi basitliği kullanma yeteneği kaynaklanmaktadır. Bu yöntem benzer ancak plaka okuyucu kullanımı daha az zaman alır ve daha az optimizasyon 35 gerektirir, floresan mikroskopi kullanılarak 2,38 veya sitometri 37 akış yapılabilir olabilir. Clark elektrodu 22 (Del Gaizo Moore, yayınlanmamış gözlemler) ile karşılaştırıldığında ek olarak, bu protokol çok daha az teknik olarak zor, daha hızlı gerçekleştirmek için, ve daha kolay tekrarlanabilir. Her bir mitokondriyal tedavi miktarda titre mitokondriyal fonksiyonu ve konsantrasyonlarının optimum hakkında daha ileri bilgi sağlayabilir yapılmalıdır. Mitokondriyal reaksiyonların toplam hacmi izolasyonu olarak gerekli tedavi reaksiyonlarının sayısı sırasında elde edilen örnek miktarı uygun olarak ayarlanabilir. 50 μ mümkün değilse, standart bir miktarL kullanılır; Bununla birlikte, mitokondri uygun olarak yaklaşık 20 ul güvenilir sonuçlar verir.

ΔΨ oksijen tüketimi korelasyon olsa, tahlil doğrudan oksijen tüketimini ölçmek değil sundu. Örneğin MitoExpress floresan oksijen algılama sistemi geliştirilmiştir birlikte, muhtemelen bir Clark elektrodu yukarıda anılan kullanarak yukarda bazı önlemek için, reaksiyon başına fiyat ve deney başına mitokondri büyük miktarlarda gereklilik sınırlayıcı sorun olarak kalmaktadır. Bu nedenle, TMRE ve klasik ΔΨ eşleşmeyenler ya da inhibitörlerin kullanılmasının birçok avantajı vardır. Yine, birden çok numune ya da çok sayıda tedavinin / numune, yeniden üretilebilirlik, düşük miktarda başlangıç ​​malzemesi ihtiyaç ve / veya reaksiyon başına gerekli olan izole edilmiş bir mitokondri daha az miktardaki küme analizi, bu protokol, ilgi çekici hale getirmektedir.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
L-glutamic acid Sigma G1251 Can use the potassium salt instead.
malic acid Sigma M8304 Can use the potassium salt instead.
KH2PO4 Sigma P0662
K2HPO4 Sigma P3786
EGTA Sigma E3889
Trisma base Sigma T6066
MOPS Sigma M3183
CCCP Sigma C2920 Dilute down to 100 μM as a working stock in ethanol and store at -20 °C.
Valinomycin Sigma V0627 Make in DMSO and use as a 5 μM working stock. Store at -20 °C.
sucrose Fisher S5-500
KCN Mallinckrodt 6379 Make a concentrated stock in ethanol and then dilute with water 
rotenone Sigma R8875 Highly toxic. Made in ethanol.
oligomycin Sigma O4876 Highly toxic. Made in ethanol.
ADP Sigma A2754
TMRE Sigma 8717-25mg Dilute 100 μM stock with EB immediatley before use.
DMEM Gibco 11965-084 1x regular (high glucose).
Pen/Strep Invitrogen 15140-155
L-glutamine Fisher SH3002101 Store aliquots at -20 °C
FBS Lonza 14-501F US origin, premium quality. Heat inactivate and store aliquots at -20 °C.
Trypsin-EDTA Sigma T4049
DMSO SIgma D2650
Protien Assay Dye (5x) Bio-Rad 500-0006 Any protein assay can substitute.
BSA Fisher BP1600-100 Make 2 mg/ml stock in water for protein assay.
MTT powder Sigma M2128 Filter sterlize 5 mg/ml stock made in PBS. Store aliquots at -20 °C; store at 4 °C for up to 1 week.
Tergitol solution (NP-40) Sigma NP40S
Recombinant Human IL-1B Gibco PCH08014 Once opened store aliquots at -20 °C
Recombinant Human TNF-alpha Gibco PHC3015L
Recombinant Human IFN-gamma Gibco PHC4031
Dulbeccos PBS (-/-) Sigma D8537 Make sure it is without Mg2+ and Ca2+ ions.
Cytochrom c ELISA kit R&D systems DTC0 Human for HEK-293T cells. 

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Madeira, V. M. Overview of mitochondrial bioenergetics. Methods In Molecular Biology. 810, 1-6 (2012).
  2. Sakamuru, S., et al. Application of a homogenous membrane potential assay to assess mitochondrial function. Physiological Genomics. 44, 495-503 (2012).
  3. Clayton, D. A. Structure and function of the mitochondrial genome. Journal Of Inherited Metabolic Disease. 15, 439-447 (1992).
  4. Schatz, G. The protein import system of mitochondria. The Journal of Biological Chemistry. 271, 31763-31766 (1996).
  5. Mayer, A., Neupert, W., Lill, R. Mitochondrial protein import: reversible binding of the presequence at the trans side of the outer membrane drives partial translocation and unfolding. Cell. 80, 127-137 (1995).
  6. Green, D. R., Kroemer, G. The pathophysiology of mitochondrial cell death. Science. 305, 626-629 (2004).
  7. Shamas-Din, A., Kale, J., Leber, B., Andrews, D. W. Mechanisms of action of Bcl-2 family proteins. Cold Spring Harbor Perspectives In Biology. 5, a008714 (2013).
  8. Hardwick, J. M., Youle, R. J. SnapShot: BCL-2 proteins. Cell. 138, 404 (2009).
  9. Zoratti, M., Szabo, I. The mitochondrial permeability transition. Biochimica et Biophysica Acta. 1241, 139-176 (1995).
  10. Wu, C. C., Bratton, S. B. Regulation of the intrinsic apoptosis pathway by reactive oxygen species. Antioxidants & Redox Signaling. 19, 546-558 (2013).
  11. Kuwana, T., et al. BH3 domains of BH3-only proteins differentially regulate Bax-mediated mitochondrial membrane permeabilization both directly and indirectly. Molecular Cell. 17, 525-535 (2005).
  12. Joshi, D. C., Bakowska, J. C. Determination of mitochondrial membrane potential and reactive oxygen species in live rat cortical neurons. Journal Of Visualized Experiments. (2011).
  13. Vinsant, S., et al. Characterization of early pathogenesis in the SOD1(G93A) mouse model of ALS: part I, background and methods. Brain and Behavior. 3, 335-350 (2013).
  14. Vinsant, S., et al. Characterization of early pathogenesis in the SOD1(G93A) mouse model of ALS: part II, results and discussion. Brain and Behavior. 3, 431-457 (2013).
  15. Rajapakse, N., Shimizu, K., Payne, M., Busija, D. Isolation and characterization of intact mitochondria from neonatal rat brain. Brain research. Brain Research Protocols. 8, 176-183 (2001).
  16. Schmitt, S., et al. A semi-automated method for isolating functionally intact mitochondria from cultured cells and tissue biopsies. Analytical Biochemistry. 443, 66-74 (2013).
  17. Frezza, C., Cipolat, S., Scorrano, L. Organelle isolation: functional mitochondria from mouse liver, muscle and cultured fibroblasts. Nature Protocols. 2, 287-295 (2007).
  18. Debatin, K. M., Poncet, D., Kroemer, G. Chemotherapy: targeting the mitochondrial cell death pathway. Oncogene. 21, 8786-8803 (2002).
  19. Del Gaizo Moore, V., et al. Chronic lymphocytic leukemia requires BCL2 to sequester prodeath BIM, explaining sensitivity to BCL2 antagonist ABT-737. The Journal of Clinical Investigation. 117, 112-121 (2007).
  20. Del Gaizo Moore, V., Schlis, K. D., Sallan, S. E., Armstrong, S. A., Letai, A. BCL-2 dependence and ABT-737 sensitivity in acute lymphoblastic leukemia. Blood. 111, 2300-2309 (2008).
  21. Li, N., et al. Mitochondrial complex I inhibitor rotenone induces apoptosis through enhancing mitochondrial reactive oxygen species production. The Journal of Biological Chemistry. 278, 8516-8525 (2003).
  22. Hynes, J., et al. Investigation of drug-induced mitochondrial toxicity using fluorescence-based oxygen-sensitive probes. Toxicological Sciences : An Official Journal Of The Society of Toxicology. 92, 186-200 (2006).
  23. Papkovsky, D. B. Methods in optical oxygen sensing: protocols and critical analyses. Methods in enzymology. 381, 715-735 (2004).
  24. Galluzzi, L., et al. Methods for the assessment of mitochondrial membrane permeabilization in apoptosis. Apoptosis : An International Journal On Programmed Cell Death. 12, 803-813 (2007).
  25. Gurney, M. E., et al. Motor neuron degeneration in mice that express a human Cu,Zn superoxide dismutase mutation. Science. 264, 1772-1775 (1994).
  26. Smith, P. K., et al. Measurement of protein using bicinchoninic acid. Analytical Biochemistry. 150, 76-85 (1985).
  27. Certo, M., et al. Mitochondria primed by death signals determine cellular addiction to antiapoptotic BCL-2 family members. Cancer Cell. 9, 351-365 (2006).
  28. Hogeboom, G. H., Schneider, W. C., Pallade, G. E. Cytochemical studies of mammalian tissues; isolation of intact mitochondria from rat liver; some biochemical properties of mitochondria and submicroscopic particulate material. The Journal Of Biological Chemistry. 172, 619-635 (1948).
  29. Hogeboom, G. H., Claude, A., Hotch-Kiss, R. D. The distribution of cytochrome oxidase and succinoxidase in the cytoplasm of the mammalian liver cell. The Journal of Biological Chemistry. 165, 615-629 (1946).
  30. Marques-Fernandez, F., et al. TNFalpha induces survival through the FLIP-L-dependent activation of the MAPK/ERK pathway. Cell Death & Disease. 4, e493 (2013).
  31. Chao, C. C., Hu, S., Ehrlich, L., Peterson, P. K. Interleukin-1 and tumor necrosis factor-alpha synergistically mediate neurotoxicity: involvement of nitric oxide and of N-methyl-D-aspartate receptors. Brain, Behavior, And Immunity. 9, 355-365 (1995).
  32. Downen, M., Amaral, T. D., Hua, L. L., Zhao, M. L., Lee, S. C. Neuronal death in cytokine-activated primary human brain cell culture: role of tumor necrosis factor-alpha. Glia. 28, 114-127 (1999).
  33. Schildberger, A., Rossmanith, E., Weber, V., Falkenhagen, D. Monitoring of endothelial cell activation in experimental sepsis with a two-step cell culture model. Innate Immunity. 16, 278-287 (2010).
  34. Brown, M. R., et al. Nitrogen disruption of synaptoneurosomes: an alternative method to isolate brain mitochondria. Journal Of Neuroscience Methods. 137, 299-303 (2004).
  35. Wong, A., Cortopassi, G. A. High-throughput measurement of mitochondrial membrane potential in a neural cell line using a fluorescence plate reader. Biochemical and Biophysical Research Communications. 298, 750-754 (2002).
  36. Blattner, J. R., He, L., Lemasters, J. J. Screening assays for the mitochondrial permeability transition using a fluorescence multiwell plate reader. Analytical Biochemistry. 295, 220-226 (2001).
  37. Kataoka, M., Fukura, Y., Shinohara, Y., Baba, Y. Analysis of mitochondrial membrane potential in the cells by microchip flow cytometry. Electrophoresis. 26, 3025-3031 (2005).
  38. Del Gaizo Moore, V., Payne, R. M. Transactivator of transcription fusion protein transduction causes membrane inversion. The Journal of Biological Chemistry. 279, 32541-32544 (2004).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics