転写分析のための大規模ゼブラフィッシュ胚心臓解剖

1Max Delbrück Center for Molecular Medicine, 2Institute of Biochemistry and Biology, University of Potsdam, 3Institute of Molecular Biology, Medizinische Hochschule Hannover
* These authors contributed equally
Developmental Biology

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Summary

ゼブラフィッシュの心臓発生中の心臓遺伝子発現プロファイルを分析するために、総RNAを単離した心臓から抽出されなければならない。ここでは、心臓特異的mRNAを得るために、ゼブラフィッシュの胚からの迅速な手動の切開によって、機能/鼓動心を収集するためのプロトコルを提示する。

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Lombardo, V. A., Otten, C., Abdelilah-Seyfried, S. Large-scale Zebrafish Embryonic Heart Dissection for Transcriptional Analysis. J. Vis. Exp. (95), e52087, doi:10.3791/52087 (2015).

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Abstract

ゼブラフィッシュ胚の心臓は胚全体のごく一部を表す、わずか数百の細胞から構成されている。したがって、グローバル胚トランスクリプトによってマスクされているから心臓のトランスクリプトームを防止するためには、さらなる分析のために心臓の十分な数を収集する必要がある。ゼブラフィッシュの心臓の開発が急速に進行していくまた、心臓の収集およびRNA抽出方法は、サンプルの均一性を確保するために迅速である必要がある。ここでは、ゼブラフィッシュの胚から機能/鼓動心を収集するための迅速な手動の解剖プロトコルを提示する。これは、トランスクリプトーム解析によって、このような定量的リアルタイムポリメラーゼ連鎖反応(RT-qPCRの)として、心臓特異的な遺伝子発現レベルを決定するために、後続の心臓特異的RNA抽出のための必須の前提条件である。この方法は、他の組織と比較して、ゼブラフィッシュ胚の心臓の差動接着特性に基づいている。これは、迅速なPHYが可能になり流体せん断力の中断、段階的にろ過およびトランスジェニック、蛍光標識された心のマニュアルコレクションの組み合わせによる心外組織から心臓のsical分離。

Introduction

ゼブラフィッシュ( ゼブラフィッシュ広くによりサイズが小さく、蛍光タンパク質の組織特異的な発現を有するトランスジェニックレポーターラインの利用可能性と合わせて、高速で透明かつ子宮外胚発生、 インビボでの器官形成を研究するために発生生物学で使用されている。初期のゼブラフィッシュ胚の酸素は、心拍、血流に依存しないので、この小さな脊椎動物は、心臓発生を研究するために特に適している。これらの機能は、心血管の変異体1,2の多数の特徴付けを可能にしたとゼブラフィッシュは現在、心疾患3を研究するための広く認識モデル生物である。

胚発生の間の遺伝子発現を研究するために、転写物は一般にホールマウントin situハイブリダイゼーション (WISH)4によって分析され、RT-qPCRを5、マイクロアレイ6、または次世代シークエンシング(RNA配列)7。同時にWISHは全体胚内の遺伝子発現の空間的·時間的な分析を可能にする、転写レベルは通常、RT-qPCRを、マイクロアレイまたはRNA-配列アプローチによって評価される。しかしながら、これらの方法は、特異的な遺伝子発現プロファイリングのための組織の濃縮を必要とする。

ゼブラフィッシュ胚の心臓は全体の胚のごく一部を表すので、心臓の開発中にトランスクリプトーム研究は心の解剖と濃縮のためのプロトコルが必要。また、生理学的に関連するデータを得るためには、RNA抽出まで、完全に機能的心臓組織を維持することが重要である。ここでは、急速に生理的に通常の単離及び効率的にさらなる分析のための高品質なRNAサンプルを得るために、ゼブラフィッシュの胚の数百人から心を打つためのプロトコルを記述します。本発明の方法は、バーンズとマクレー、2006年8によって報告されたプロトコルに基づいています。心臓組織の充実のために、両方の方法は、トランスジェニック心筋のレポーターラインを使用する他の組織に対するゼブラフィッシュ胚の心臓の差動接着特性を利用する。簡単に言えば、狭いピペットチップを通して上下に多くの胚をピペッティングすることにより、心臓を同時に胚の体から解放され、その後、2急速ろ過段階で胚の破片から分離。蛍光標識した心は、手動で残りの破片から選別し、さらなる処理のために収集されます。

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Protocol

このプロトコルは、ドイツのベルリン州法の動物のケアのガイドラインに従います。ゼブラフィッシュの取り扱いは、動物保護のための地方自治体(LaGeSo、ベルリン·ブランデンブルク)によりモニターした。

1.ハート抽出のためのゼブラフィッシュ胚の取得

  1. そのようなTgは(myl7:EGFP)などのクロス心臓レポーターゼブラフィッシュtwu34ジェニックライン9ハート固有のGFP発現を持つ胚を得るために。
  2. 希望胚段階10,11まで28.5℃で、卵の水で胚を維持する。収集された胚の集団が遺伝子発現の変動を制限するために、両方の遺伝的および発達段階によって均質であることを確認してください。
  3. 手動で胚をDechorionate。

2.解剖ゼブラフィッシュ胚ハーツ

注:氷の上のすべてのソリューションを保管してください。可能な場合は、チームワークを行います。1人はEMBから心を解剖ryos別の人は、蛍光実体顕微鏡下で心をソートしながら。これは、数時間で胚の数百の処理を可能にする。

  1. 1.5ミリリットルの遠心チューブに約100の胚を転送します。トリカイン(E3培地中0.16 mg / mlで)で胚を麻酔。胚を明確に麻酔をされると進みます(彼らは泳ぐとチューブの底に沈殿物が、その心はまだ暴行されていません)。
  2. トリカイン/ E3ソリューションを削除し、1ミリリットルL-15/10%FBS培地で1回の胚を洗浄し、氷上で維持する。
    注:L-15/10%FBS培地の心はをRNAlaterまたはトリゾールに移されるまで、全体の解剖手順の間に生きている臓器や細胞を維持することが重要である。
  3. 卵黄が完全に破壊されるまで、ラウンドゲルローディングチップで胚およびピペット上下に5-8回に1ミリリットルL-15/10%FBS培地を追加します。胚が滴下溶液の表面上に、ドロップが破裂するように、ピペット胚を穏やかに破壊される。
    注:どのように積極的に、どのくらいの頻度胚が上下にピペッティングしなければならないことは胚の発達段階に依存し、 すなわちより多くのピペット操作( 例えば 56 HPFで)後期段階で必要とされている。
  4. 解剖胚の最初のバッチのために、あまりにも静かにピペットであれば、いくつかの心は胚に付着したままかもしれないので、胚の整合性と実体顕微鏡下で解剖の心の割合を評価する。それに応じて解剖の次のラウンドのためにピペット操作の仕方を調整します。
    プラスチック製にこだわり心を最小限に抑えるために、低保持ピペットチップとマイクロチューブを使用してください。
  5. 50ミリリットルの遠心チューブに置か100μmのフィルター上にサンプルを適用します。 1ミリリットルL-15/10%FBS培地で1.5mlチューブをすすぎ、その後(いくつかの心臓は、チューブの壁に付着しているかもしれません)サンプルの損失を最小にするために、フィルタにこれを適用する。 1ミリリットルLで二回フィルターを洗浄-15 / 10%FBS。このステップでは、心臓は、フィルターを通過し、50 mlチューブに回収する。
  6. 15ミリリットルの遠心チューブの上に配置さ30μmフィルター上にフロースルーを適用し、1ミリリットルL-15/10%FBS培地で1回フィルターをすすぐ。この第2の濾過工程においては、心臓は、フィルタ内に保持され、より小さな破片を洗い流す。
  7. 逆さまにフィルターを回して、1ミリリットルL-15/10%FBSで3つの連続した​​回の洗浄を適用することにより、1%アガロースでコーティングされたシャーレにフィルタの外心をフラッシュする。
  8. 蛍光実体顕微鏡下にピンセットで非蛍光胚破片( 例えばアイレンズ)から手動で独立したGFP陽性心と皿の中央でそれらを集中する。ステップ3に従ってそれらを収集します。
    注:胚が24 HPFよりも古い場合は、心は組織がまだ生理的に正常であることを示す、暴行されるべきである。

3. DissecからmRNAを単離しテッドハーツ

  1. 0.75ミリリットルのRNAlater(氷上)を含む1.5ミリリットルチューブに可能な限り最小容量( 例えば 、10μL)で心とピペットを収集します。何の心は、蛍光実体顕微鏡下でそれを見ることによって、ピペットチップに残っていないことを確認します。
  2. あるいは、化学フードは蛍光顕微鏡のすぐ近くに利用可能である場合、化学フードの下のTrizol(注意)に集め心を移す。これはピペットチップにし、また心の遠心分離中にこだわりの心の損失の可能性を回避する(3.4、3.5および3.7ステップ)。トリゾールと同じチューブに分離のいくつかのラウンドからの心をプールし、3.8のステップに直接進む。最終体積は元のトリゾール容積の10%を超えてはならない。
    注:使用前にトリゾール製品安全データシート(MSDS)をお読みください。ボンネットの下にTrizol試薬を処理し、推奨される個人用保護具を着用する。皮膚、目やclothiとの接触を避けてくださいNG。発火のすべてのソースを削除します。
  3. RNA単離の効率が採取した組織の量を使用すると向上として、(氷上)RNAlaterで同じチューブに分離のいくつかのラウンドからの心をプール。全試料体積は、元のRNAlater体積の10%を超えると、(氷上で)保存のために0.75ミリリットルRNAlaterで追加のチューブを使用する。
  4. 遠心機で4℃で20分間15700×gで試料は心を沈降する。
  5. 蛍光実体顕微鏡下では、3ミリリットルL-15/10%FBS培地を含む1%アガロースでコーティングされたシャーレにできるだけ丁寧に限り多くの上清を回収したが、遠心分離管の底に沈殿し、心を乱すことがありません。心の最大15%がRNAlaterでの高粘度のために上清中に残ることができるのでステップ3.7で説明したように、それらを取得。
  6. 化学フードの下で、沈降した心を含むチューブに0.5ミリリットルのTrizolを追加し、氷上に保つ。
  7. 蛍光microscoの下でPEの、希釈する3ミリリットルL-15/10%FBSを有する別の1%アガロースでコーティングされた皿にRNAlater中/ L-15/10%FBS溶液を含む1%アガロースでコーティングされた皿から(ステップ3.5)からの心臓を転送RNAlaterを出。ペトリ皿の中央に心を収集し、化学フードの下のTrizol中で沈降した心のチューブに小さな音量でそれらを転送する。
  8. 心を破壊し、室温で5分間インキュベートし、トリゾールで心を含む渦1.5mlチューブ。
  9. 化学フードの下で、100μlのクロロホルム(注意)を追加し、完全に混合し、1.5ミリリットルに事前に紡糸しPLGチューブ(使用前に最大速度で遠心30秒)をトリゾール/クロロホルム溶液を転送する。室温で3分間インキュベートする。
    注:使用前にクロロホルムのMSDSを参照してください。ボンネットの下にクロロホルム試薬を処理し、推奨される個人用保護具を着用する。皮膚、眼、そして衣服との接触を避ける。金属、アルカリなどの非互換性から遠ざけること。
  10. Centrifugeと4℃で15分間15700×gでのサンプルと新しい1.5mlチューブへ水相を転送する。
  11. 5〜10μgのグリコーゲンとイソプロパノール(-20℃で)予冷250μlのを追加します。よく混ぜ、-20℃で一晩インキュベートする。
  12. 遠心機で4℃で30分間15700×gでサンプルし、上清を廃棄する。
  13. 、1ミリリットルを75%エタノールでペレットを洗浄し、4℃で15分間15700×gで遠心分離し、上清を捨てる。
  14. それは(10〜15分間、例えば )の白色になるまで室温でペレットを乾燥させてエタノールを蒸発さう。
  15. ペレットに20μlのRNaseフリーのddH 2 Oを追加し、RNAを溶解させ、55℃で10〜15分間インキュベート。その後氷上に保つ。
  16. 吸光度測定によってRNA濃度および純度を評価。 1%アガロースゲル上でサンプルを実行して、RNAの完全性を評価する。

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Representative Results

独占的に心筋(図1)内twu34トランスジェニック系統9、緑色蛍光タンパク質(GFP)を発現するここでは、ゼブラフィッシュのTg(GFP myl7)を使用して、代表的な心臓の解剖実験について説明します。我々は、解剖心、それらが心臓サンプルの純度を評価するために誘導された胚の両方を収集した。簡単に言えば、ホモ接合のTg(myl7:GFP)は、すべての胚の心臓をGFP標識したように、ゼブラフィッシュ9は 、野生型と外部交配しtwu34。いくつかの500の胚(56ゼブラ)を1.5 mlチューブに移した(約100の胚を各)(図1A1、図1B)。プロトコルセクション(ステップ2)および図1(a)に記載したように各チューブを加工した。ハーツは、ピが発表し、上下に数回(図1A2)した後、100μmのフィルターに塗布した(図1A3)。胚組織の大きな部分は、このフィルターに保持された。この画分を取得し、foをトリゾールに入れ「胚心なし」のRNAサンプル(図1A3)を取得するには、r RNA抽出。心を含むフロースルーは、同様の大きさの心組織の破片を保持し30μmのフィルター(図1A4)、塗布した。 GFP陽性心臓を迅速に蛍光実体顕微鏡下皿の真ん中に集まり、0.75ミリリットルのRNAlater(図1A6)中に移し、アガロースでコーティングされたシャーレ(図1A5、1C)にフィルタの外に流した。 RNAlaterでこのチューブの中で、私たちは5解剖ラウンド(約60%の抽出効率を表す500胚から約300の心)に由来する心をプールした。前36ゼブラ(図1C ')対56ゼブラ(図1C)で胚から破片から選別する心臓サンプルの比較は、(胚の破壊がより胚の破片を生じ、56ゼブラで図1に示されている。そのような30μmの濾過工程(図1C ')次の36ゼブラよりもレンズ、矢印、図1C)など。

56 HPF「心」のサンプルの純度を決定するために、我々は、RT-qPCRによりサンプル」心なし胚「「心」と内に追加可能な心臓転写産物に対する心臓の発現レベルを比較した。この目的のために、我々は、これら2つのサンプルからmRNAを抽出し、プロトコル手段(ステップ3)に記載の吸光度測定(表1)RNAのアガロースゲル(図2A)上の質と量を評価した。約。 300心は660 ngのRNAが得られた。 Manufacturer'sの指示に従って、ランダムヘキサマー、および12に記載ようにRT-qPCR実験を行った( - )次に、cDNAは、M-MLV逆転写酵素のRNase Hを用いて合成した。相対的な遺伝子発現レベルは、例えば、 ミオシン軽ポリペプチド7 [myl7、心筋マーカー] 9 [kdrl、内皮/心内膜マーカー] 13、 ヘモグロビンβ胚-1様キナーゼ挿入ドメイン受容体の異なる組織特異的マーカーについて計算した1 [hbbe1.1、赤血球マーカー] 14、 クリスタリンアルファA [cryaa、アイレンズマーカー] 15、およびグリア線維性酸性タンパク質[GFAP、中枢神経系マーカー] 16(図2B)。 [eif1b] 12は 、内部参照遺伝子として使用したゼブラフィッシュの真核生物翻訳開始因子1B(各遺伝子のGenBank ID番号、プライマー配列は、PCR産物のサイズおよび組織特異性については表2を参照のこと)。予想されるようにサンプル(図2B)」心なし胚」と比べて、myl7は非常に「心臓」は、試料中に富んでいた。内皮細胞マーカーkdrlは、予想通り、適度(56ゼブラにおける心臓細胞の約40%がkdrl発現性心内膜細胞である)(図2B)、心臓サンプルにおいて濃縮されることが見出された。赤血球マーカーhbbe1.1は心は、STたにもかかわらず、「心」は、試料中の過剰表現した心臓(図2B)から赤血球を追放すべき解剖後に病気に暴行、。対照的に、CNSおよびレンズマーカー(それぞれGFAPおよびcryaa)の発現レベルは、「心臓」サンプル(図2B)に非常に低かった。全体として、我々は全体のゼブラフィッシュ胚から心臓解剖プロトコルの収量、高品質と心臓特異的RNAと結論付けている。

図1
ゼブラフィッシュ胚から図1ハート抽出心臓抽出手順を示す(A)のスキーム。約100生きた胚を、麻酔した1.5​​ミリリットルチューブ(A1、B、B ​​')に回収し、その後の心(A2)を解放するために、狭いピペットチップを介して上下に数回ピペッティングしている。胚組織(A2)を含有する得られた溶液を100μmのフィルター(A3)を塗布する。卵黄とhのない胚組織earts、大きな胚の残骸は、フィルター(A3)に残っている。フロースルーを50mlチューブ(A3)中に回収し、次いで、30ミクロンフィルタ(A4)上に塗布される。心と小さな破片を30μmフィルターに保持され、小さなアガロースでコーティングされたシャーレ(A5、C、C ')に移す。 EGFP標識心(C、C ';矢印)は、手動で、レンズ(C、矢印)として、残りの破片から選別され、RNAlaterで(A6)に回収される。この手順は、少なくとも5回繰り返し、全ての心臓は、さらなる処理のために一緒にプールされている。 (BC ')蛍光のオーバーレイ(緑色EGFP)及びDIC生トランスジェニックのTg(myl7:EGFP)の画像twu34胚56ゼブラ(B、C)および36ゼブラにおける(B'、C ')は、心臓の二つのステップで解剖の手順:胚解剖(B、B ')の前と直前にペトリ皿(C、C言語で破片から心を仕分けし、30μmのフィルターからフラッシュした後')。スケールバー:500μmの。

図2
それぞれ電気泳動およびRT-qPCRによりRNAの品質と純度の図2の分析、。(A)の全RNA「心」のサンプル(2μL)から56由来の試料(1μl)を「心のない胚」、から1%アガロースゲル上で分離ゼブラ胚。顕著S18及びS28のrRNAのバンドは、RNAが分解されないことを示している。 (B)組織特異的マーカーmyl7(心筋)、kdrl(内皮)、hbbe1.1(赤血球)、cryaa(レンズ)、およびGFAP(CNS)の相対的発現レベルを、「心」のサンプルについてRT-qPCRにより決定されるサンプル「心なし胚」に正規したRT-qPCR実験は、技術的な三連のように実施し、データを平均±SEMとして示す。対応のないt検定分析を行った。 **** P <0,0001。 ** P <0005。 BP、塩基対。

サンプルID ng /μLで A260 A280 280分の260 230分の260 腹筋をカーソル。 340生
ハーツ 32.97 0.82 0.41 2.01 0.35 2.355 0.031
心なし胚 568.82 14.22 7.00 2.03 2.04 6.965 0.018

分光光度測定により、表1 RNAの量と質」心なし胚」「心」とのRNAの量と質分光光度法により測定される56ゼブラ胚から得られた試料。

GENE のGenBank# プライマー配列 PCR産物のサイズ(bp)の組織特異的なマーカー
myl7 BX248505 F:5'-ACAGCAAAGCAGACAGTGAA-3 ' 163 心筋
R:5'-TAACTCCATCCCGGTTCTGA-3 '
kdrl CR759732 F:5'-ACAACGACACTGGCATCTAC-3 ' 170 内皮/心内膜
R:5'-TGTTCTACAGGGGACCACAA-3 '
GFAP BX324157 F:5'-AGACAACTTGGCCTCAGAC-3 ' 247 中枢神経系
R:5'-ATCCACATGAACCTGTTGGG-3 '
cryaa BX248514 190 接眼レンズ
R:5'-TCAGACCTCACCTCAGAGAC-3 '
hbbe1.1 BC095024 F:5'-TGGTTGTGTGGACAGACTTCGA-3 '8 102 赤血球
R:5'-CGATAAGACACCTTGCCAGAGC-3 '8
eif1b BX323079 F:5'-CAGAACCTCCAGTCCTTTGATC-3 '12 195 参照遺伝子
R:5'-GCAGGCAAATTTCTTTTTGAAGGC-3 '12

RT-qPCR実験のために使用される表2のプライマー 。名前、GenBankアクセッション番号、シーケンス、PCR産物のサイズおよび組織特異性を分析した全ての遺伝子について示されている。

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Discussion

このプロトコルは、遺伝子発現解析のためのゼブラフィッシュ胚の心臓組織の迅速な濃縮を可能にする。 RNA精製だけで十分で動作しますので、心の喪失は、プロトコルのすべての段階で阻止される場合は、最初の、試料の量が大幅に改善されている:心臓特異的RNAサンプルの量と質が大幅にいくつかの重要なステップに依存します出発材料。次に、実験者に完全に依存したサンプルの純度は、ソートや厳密に他の組織を除外して、ペトリ皿内の心臓を収集することにより決定される。第三に、サンプルの品質は、批判的に胚の破壊の際に発生する可能性がRNAの分解を制限することに依存します。これは、細胞死を回避するために、細胞培養培地を使用し、サンプルを氷上で維持することによって達成される。心をRNAlaterまたはトリゾールに転送された後にRNAの分解が停止される。心はシャーレに暴行されていることを強力に実証する心臓トン問題は、解剖後に生理的に正常です。

私たちは、十分なRNAが安全に(一緒に5〜10μgのグリコーゲンと)沈殿させることができる、そこから少なくとも300の心( すなわち約500胚)で始まることをお勧めします。しかし、少数の心は小規模実験のために十分であろうよりも、除外することはできません。これは、試料の濃度、純度及び完全性を決定するための十分なRNAを有することが単に重要である。 、RNA内容が発達段階にと(異常な心を持つ変異体の場合など )胚の遺伝的背景によって異なる場合がありますのでご注意ください。したがって、実験に必要な胚の最小量は、個々のケースで決定されなければならない。

そこにこのプロトコルとバーンズとマクレーによる初期のプロトコルとの間、いくつかの技術的な違いがあり、我々は2つ​​のプロトコル間の効率や速度に大きな差があるとは思わない。しかし、改良を導入している最も重要なことは、RNAlaterで安定化溶液の使用を示唆している。まず、RNAlaterではすぐにRNアーゼを不活性化し、組織または細胞内のRNAを安定化するように、最小限にRNAの分解を減少させることによってそのようなRT-qPCRを、さらなる実験のための高品質のRNAを収集する:これは、2つの理由から重要である。第二に、RNAlaterでは、胚の数が制限要因である場合に重要である別の日に心のコレクションを、許可するために重要です。また、トリゾール高品質のRNAの効率的な単離のための出発物質の十分な量を得るために必要であり得る心臓のプーリングを可能にする。トリゾールに直接心を転送するのRNAlaterの使用を回避できると考えられるが、健康上の危険のために、このステップは、すべての実験者のための蛍光顕微鏡の直接近傍に配置されると仮定することができない化学フード下で行われなければならない。

我々はトンを発見した帽子心臓解剖が20から72 HPF [12間の胚とうまく動作します。 72 HPFのための未発表データ]。付加的な、より強力なペッティング首尾長い先端に胚を導入し、他の胚組織から得た心臓を分離するために必要とされる。しかしながら、抽出手順は、胚の年齢と長さが増加するにつれてより困難になる。その結果、より多くの胚の破片が試料調製中に存在している( 図1C、C 'を参照)、実験者は、ペトリ皿に心を並べ替え、より注意する必要があります。

ここに提示心臓切開プロトコルは心筋および心内膜を含む異なる細胞型、全体の心臓発現プロファイルの分析を可能にする。心臓細胞型のさらなる分離はendocardial-心筋特異的レポーター株を使用することによって達成することができる[ 例えば、Tg(myl7:GFP)twu34及びTg(kdrl:mCherryを EM>)IS5] 9、FACSソーティングと組み合わせた心臓抽出のための17。組織を切開することなく組織特異的転写分析を可能にする翻訳リボソームアフィニティー精製(TRAP)法18,19とは対照的に、我々のアプローチは、能動的に翻訳されたmRNAに限定ならず、積極的に翻訳されたmRNAまたは非コードRNAも含まれる。心臓の解剖プロトコルの代替アプリケーションは心内タンパク質発現を分析することである:心臓の解剖学的構造を解剖手順中に保存されるように、タンパク質レベルをウェスタンブロットおよびタンパク質局在化によって評価することができるが、免疫組織化学によって分析することができる。

要約すると、我々はここで、さらなる分析のために、高純度の心臓特異的RNA(またはタンパク質)のサンプルを得るために使用することができ、短時間での胚の数百から、機能/拍動心臓を解剖するための詳細なプロトコルを提示する。

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Materials

Name Company Catalog Number Comments
Equipment for raising fish and collecting eggs  see the Zebrafish Book11 for details
Fluorescence stereomicroscope
Refrigerated Microcentrifuge
UV-Spectrophotometer e.g. Thermo Scientific Nanodrop 2000
Nucleic acid electrophoresis chamber
Petri dishes 4 cm Ø, coated with 1% agarose in E3 medium
Micropipettes and tips (P20, P100, P1000)
1.5 ml centrifugation tubes
15 ml and 50 ml centrifugation tubes
Pair of Dumont #5 forceps
ExactaCruz™ Round Gel Loading Tips in Sterile Rack, 1-200μl  Santa Cruz sc-201732
100 μm filter (BD Falcon 100 mm Cell Strainer) BD Biosciences 352360
30 μm filter (Pre-Separation Filters-30 µm) Miltenyi Biotec 130-041-407
Phase lock gel, heavy, 1.5 ml tubes  Prime 2302810
Egg water medium 60 μg/ml Instant Ocean Sea Salts in ddH2O, 0.00001% (w/v) Methylene Blue
E3 medium  5 mM NaCl, 0.17 mM KCl, 0.33 mM CaCl2, 0.33 mM MgSO4
Tricaine (3-amino benzoic acidethylester) Sigma-Aldrich A-5040 4 mg/ml Tricaine stock solution, pH 7
1% agarose (in E3 medium)
1% agarose gel (in TBE buffer)
Leibovitz´s L-15 medium  Gibco 21083-027
FBS (Fetal Bovine Serum) Sigma F4135
RNAlater Ambion AM7020
Trizol Ambion 1559606
Glycogen  Invitrogen 10814-010 20 µg/µl in RNase-free water
chloroform
isopropanol
75% ethanol (in DEPC-ddH2O)
Nuclease-free water or sterilized DEPC treated ddH2O
Nucleic acid loading buffer
TBE (Tris/Borate/EDTA) buffer for electrophoresis

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References

  1. Stainier, D. Y., et al. Mutations affecting the formation and function of the cardiovascular system in the zebrafish embryo. Development. 123, 285-292 (1996).
  2. Chen, J. N., et al. Mutations affecting the cardiovascular system and other internal organs in zebrafish. Development. 123, 293-302 (1996).
  3. Bakkers, J. Zebrafish as a model to study cardiac development and human cardiac disease. Cardiovasc Res. 91, 279-288 (2011).
  4. Jowett, T., Lettice, L. Whole-mount in situ hybridizations on zebrafish embryos using a mixture of digoxigenin- and fluorescein-labelled probes. Trends Genet. 10, 73-74 (1994).
  5. Gibson, U. E., Heid, C. A., Williams, P. M. A novel method for real time quantitative RT-PCR. Genome Res. 6, 995-1001 (1996).
  6. Epstein, C. B., Butow, R. A. Microarray technology - enhanced versatility, persistent challenge. Curr Opin Biotechnol. 11, 36-41 (2000).
  7. Qian, X., Ba, Y., Zhuang, Q., Zhong, G. RNA-Seq Technology and Its Application in Fish Transcriptomics. OMICS. 18, 98-110 (2014).
  8. Burns, C. G., MacRae, C. A. Purification of hearts from zebrafish embryos. Biotechniques. 40, 274-278 (2006).
  9. Huang, C. J., Tu, C. T., Hsiao, C. D., Hsieh, F. J., Tsai, H. J. Germ-line transmission of a myocardium-specific GFP transgene reveals critical regulatory elements in the cardiac myosin light chain 2 promoter of zebrafish. Dev Dyn. 228, 30-40 (2003).
  10. Kimmel, C. B., Ballard, W. W., Kimmel, S. R., Ullmann, B., Schilling, T. F. Stages of embryonic development of the zebrafish. Dev Dyn. 203, 253-310 (1995).
  11. Westerfield, M. The zebrafish book. A guide for the laboratory use of zebrafish (Danio rerio). 4th, University of Oregon Press. Eugene. (2000).
  12. Veerkamp, J., et al. Unilateral dampening of Bmp activity by nodal generates cardiac left-right asymmetry). Dev Cell. 24, 660-667 (2013).
  13. Jin, S. W., Beis, D., Mitchell, T., Chen, J. N., Stainier, D. Y. Cellular and molecular analyses of vascular tube and lumen formation in zebrafish. Development. 132, 5199-5209 (2005).
  14. Brownlie, A., et al. Characterization of embryonic globin genes of the zebrafish. Dev Biol. 255, 48-61 (2003).
  15. Marvin, M., et al. Developmental expression patterns of the zebrafish small heat shock proteins. Dev Dyn. 237, 454-463 (2008).
  16. Lam, C. S., Marz, M., Strahle, U. gfap and nestin reporter lines reveal characteristics of neural progenitors in the adult zebrafish brain. Dev Dyn. 238, 475-486 (2009).
  17. Wang, Y., et al. Moesin1 and Ve-cadherin are required in endothelial cells during in vivo tubulogenesis. Development. 137, 3119-3128 (2010).
  18. Heiman, M., et al. A translational profiling approach for the molecular characterization of CNS cell types. Cell. 135, 738-748 (2008).
  19. Tryon, R. C., Pisat, N., Johnson, S. L., Dougherty, J. D. Development of translating ribosome affinity purification for zebrafish. Genesis. 51, 187-192 (2013).

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