Storskala Sebrafisk Embryonic Hjerte Dissection for Transkripsjonell Analysis

1Max Delbrück Center for Molecular Medicine, 2Institute of Biochemistry and Biology, University of Potsdam, 3Institute of Molecular Biology, Medizinische Hochschule Hannover
* These authors contributed equally
Developmental Biology

Your institution must subscribe to JoVE's Developmental Biology section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

Welcome!

Enter your email below to get your free 10 minute trial to JoVE!





We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.

If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.

 

Summary

Å analysere hjerte genekspresjonsprofiler under sebrafisk hjerte utvikling, total RNA har å være hentet fra isolerte hjerter. Her presenterer vi en protokoll for å samle inn funksjonelle / bankende hjerter ved rask manuell disseksjon fra sebrafisk embryo for å få hjertespesifikke mRNA.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Lombardo, V. A., Otten, C., Abdelilah-Seyfried, S. Large-scale Zebrafish Embryonic Heart Dissection for Transcriptional Analysis. J. Vis. Exp. (95), e52087, doi:10.3791/52087 (2015).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Sebrafisk embryoniske hjertet er sammensatt av bare noen få hundre celler, representerer bare en liten brøkdel av hele embryoet. Derfor, for å forhindre hjerte transkriptomet fra å bli maskert av den globale embryoniske transkriptomet, er det nødvendig å samle inn et tilstrekkelig antall hjerter for videre analyser. Videre, som sebrafisk hjerte utviklingen går raskt, hjerte samling og RNA utvinning metoder må være rask for å sikre homogeniteten av prøvene. Her presenterer vi en rask manuell disseksjon protokoll for å samle inn funksjonelle / bankende hjerter fra sebrafisk embryo. Dette er en viktig forutsetning for påfølgende hjerte-spesifikk RNA-ekstraksjon for å bestemme hjertespesifikke genekspresjon nivåer ved transkriptomet analyser, slik som kvantitative sanntid polymerase kjedereaksjon (RT-qPCR). Metoden er basert på differensial adhesive egenskaper av sebrafisk embryonale hjertet sammenlignet med annet vev; Dette gjør det mulig for den raske grafiSical separasjon av hjerte fra ekstrakardiale vev ved en kombinasjon av fluidic skjærkraft avbrudd, trinnvis filtrering og manuell innsamling av transgene fluorescensmerkede hjerter.

Introduction

Sebrafisk (Danio rerio) er mye brukt i utviklingsbiologi å studere organogenesen in vivo på grunn av sin raske, gjennomsiktig og extrauterine embryoutvikling, kombinert med liten størrelse og tilgjengeligheten av transgene reporter linjer med vev-spesifikk uttrykk for fluorescerende proteiner. Dette lille virveldyr er spesielt godt egnet til å studere hjerte utvikling fordi oksygenopptaket i tidlig sebrafisk embryo ikke stole på hjerterytme og blodstrøm; disse funksjonene har tillatt karakterisering av et stort antall kardiovaskulære mutanter 1,2 og sebrafisk er nå en anerkjent modell organisme for å studere hjerte sykdommer 3.

Å studere genekspresjon under embryonal utvikling, er transkripsjoner vanligvis analysert av hel-mount in situ hybridisering (WISH) 4, RT-qPCR 5, mikromatriser 6 eller neste generasjons sekvensering (RNA-Seq) 7. MensWISH gir en romlig-temporal analyse av genuttrykk i hele embryo, er transkripsjonsnivåer vanligvis vurdert av RT-qPCR, mikromatriser eller RNA-Seq tilnærminger. Men disse metodene krever vev berikelse for spesifikk genekspresjon profilering.

Siden sebrafisk embryonale hjerte utgjør en liten brøkdel av hele embryoet, transkriptom studier under kardial utvikling krever en protokoll for disseksjon og anrikning av hjerter. I tillegg, for å oppnå fysiologisk relevante data, er det viktig å opprettholde hjertevevet fullt ut funksjonell til RNA-ekstraksjon. Her beskriver vi en protokoll for raskt isolere fysiologisk normal og slo hjerter fra hundrevis av sebrafisk embryo for å effektivt oppnå høy kvalitet RNA prøver for videre analyser. Den foreliggende fremgangsmåte er basert på protokollen beskrevet av Burns og MacRae, 2006 8. For anrikning av hjertevev, begge metoder brukes en transgen myokardial reporter linjeog dra nytte av de differensial vedheftingsegenskaper av sebrafisk embryonale hjerter versus andre vev. I korthet, ved å pipettere mange embryoer opp og ned gjennom en smal pipettespissen, hjerter samtidig frigjøres fra embryoniske legemer og deretter separert fra embryonisk rusk i to rask filtrering trinn; fluorescensmerkede hjertene blir deretter manuelt sortert fra gjenværende rester og oppsamles for videre behandling.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Denne protokollen følger retningslinjene til den tyske og Berlin statlige loven dyr omsorg; sebrafisk håndtering ble overvåket av kommunen for dyrevern (LaGeSo, Berlin-Brandenburg).

1. Innhenting Sebrafisk embryoer for Hjerte Extraction

  1. Cross kardial reporter sebrafisk som for eksempel Tg (myl7: EGFP) twu34 transgen linje 9 for å oppnå embryoer med hjertespesifikk GFP-ekspresjon.
  2. Opprettholde embryoene i egg vann ved 28,5 ° C til ønsket fosterstadiet 10,11. Sørg for at de innsamlede embryo befolkningen er homogen både genetisk og av utviklingsstadiet for å begrense variasjoner i genekspresjon.
  3. Dechorionate embryoene manuelt.

2. dissekere Sebrafisk Embryonic Hearts

MERK: Hold alle løsningene på is. Hvis det er mulig, gjør teamarbeid: en person dissekerer hjertene fra embryos mens en annen person sorterer hjertene under fluorescens stereomikroskop. Dette gjør behandlingen av flere hundrevis av embryoer i noen timer.

  1. Overfør 100 embryoer i et 1,5 ml rør sentrifugering. Bedøve embryoene med Tricaine (0,16 mg / ml i E3 medium). Går frem når embryoene er tydelig bedøvet (de ikke svømme og sediment til bunnen av røret, men deres hjerter er fortsatt juling).
  2. Fjern det Tricaine / E3 løsningen og vask embryoene en gang med 1 ml L-15/10% FBS medium og vedlikeholde på is.
    MERK: L-15/10% FBS medium er viktig å holde organer og celler i live under hele disseksjon prosedyren til hjertene har blitt overført til RNAlater eller Trizol.
  3. Tilsett 1 ml L-15/10% FBS medium til embryoene og pipette opp og ned 5-8 ganger med en Round Gel Laster Tips til plommen er helt forstyrret. Pipette embryoene drop-klok på overflaten av løsningen, slik at fallet vil sprekke ogembryoene er forsiktig forstyrret.
    MERK: Hvor kraftig og hvor ofte embryoene må pipetteres opp og ned avhengig av utviklingsstadiet av embryoene, dvs. mer pipettering er nødvendig på sene stadier (f.eks ved 56 HPF).
  4. For første batch av dissekert embryoer, vurdere integriteten av embryoene og andelen dissekert hjerter under en stereomikroskop, siden noen hjerter kan forbli festet til embryoene hvis altfor forsiktig pipetteres. Juster den måten av pipettering for de neste rundene av disseksjon tilsvarende.
    MERK: Bruk lav oppbevaring pipettespisser og mikrosentrifugerør å minimere hjerter stikker til plast.
  5. Påføre prøven på et 100 um filter plassert på en 50 ml sentrifuge rør; skylle 1,5 ml rør med 1 ml L-15/10% FBS medium, og deretter bruke dette til filteret for å minimalisere tap av prøven (noen hjerter kan holde seg til veggene av røret). Vask filteret to ganger med 1 ml L-15/10% FBS. I dette trinn hjertene passerer gjennom filteret og blir samlet i 50 ml rør.
  6. Påfør gjennomstrømning på en 30 mikrometer filter plassert på en 15 ml sentrifugerøret og skyll filter en gang med 1 ml L-15/10% FBS-medium. I denne andre filtreringstrinn, blir hjertene holdt tilbake i filteret, og mindre avfall er vasket av.
  7. Snu den opp ned og tømme hjertene ut av filteret i en 1% agarose-belagte petriskål ved å anvende tre etterfølgende vaskinger med 1 ml L-15/10% FBS.
  8. Manuelt skille GFP-positive hjerter fra den ikke-fluorescerende embryonale rusk (f.eks eye linser) med en pinsett under en fluorescens stereomikroskop og konsentrere dem i midten av fatet. Samle dem i henhold til trinn 3.
    MERK: Hvis embryoene er eldre enn 24 HPF, bør hjertene bli banket, noe som indikerer at vevet fortsatt er fysiologisk normalt.

3. Isolere mRNA fra Dissected Hearts

  1. Samle hjerter i minst mulig volum (f.eks 10 mL) og pipette i en 1,5 ml tube som inneholder 0,75 ml RNAlater (på is). Kontroller at ingen hjerter forbli i pipettespissen ved å vise den under en fluorescens stereomikroskop.
  2. Alternativt, hvis en kjemisk hette er tilgjengelig i umiddelbar nærhet av fluorescens mikroskop, overføre de innsamlede hjerter i Trizol (OBS) under den kjemiske panseret. Dette omgår mulig tap av hjerter stikker i pipettespissen og også under sentrifugering av hjerter (trinn 3.4, 3.5 og 3.7). Pool hjertene fra flere runder med isolasjon i samme rør med Trizol og gå direkte til trinn 3.8; sluttvolumet bør ikke overstige 10% av den opprinnelige Trizol volum.
    MERK: Les Trizol sikkerhetsdatablad (HMS) før bruk. Håndtere Trizol reagens under en hette og slitasje anbefales personlig verneutstyr. Unngå kontakt med hud, øyne og klær;ng. Fjern alle antennelseskilder.
  3. Pool hjertene fra flere runder med isolering i samme rør med RNAlater (på is), og effektiviteten av RNA-isolering øker med mengden av vev oppsamlet. Hvis den totale prøvevolumet overstiger 10% av den opprinnelige RNAlater volum, bruke et ekstra rør med 0,75 ml RNAlater for lagring (på is).
  4. Sentrifuger prøvene ved 15 700 xg i 20 min ved 4 ° C for å sedimentere de hjerter.
  5. Under en fluorescens-stereomikroskop, samle nøye så mye som mulig supernatanten til en 1% agarose-belagte petriskål inneholdende 3 ml L-15/10% FBS medium, men ikke forstyrrer den sedimenterte hjerter i bunnen av sentrifugerøret. Da opptil 15% av hjertene kan forbli i supernatanten på grunn av den høye viskositet av RNAlater, hente dem som er beskrevet i trinn 3.7.
  6. Under en kjemisk hette, tilsett 0,5 ml Trizol til røret som inneholder sedimentert hjerter og holde på is.
  7. Under fluorescerende mikroskoppe, overføre hjerter (fra trinn 3.5) fra 1% agarose-belagt fatet inneholder RNAlater / L-15/10% FBS løsning til en annen 1% agarose-belagt tallerken med 3 ml L-15/10% FBS å fortynne ut RNAlater. Samle hjertene i midten av petriskålen og overføre dem i et lite volum i røret fra sedimenterte hjerter i Trizol under en kjemisk hette.
  8. Vortex i 1,5 ml rør inneholdende hjertene i Trizol å forstyrre hjertene og inkuberes i 5 minutter ved romtemperatur.
  9. Under en kjemisk hette, tilsett 100 ul kloroform (OBS), bland godt og overføre Trizol / kloroform løsning i en 1,5 ml ferdigspunnet PLG tube (sentrifuge 30 sek med maksimal hastighet før bruk). Inkuber i 3 min ved romtemperatur.
    MERK: Les kloroform datablad før bruk. Håndtere kloroform reagens under en hette og slitasje anbefales personlig verneutstyr. Unngå kontakt med hud, øyne og klær. Holdes vekk fra uforenlige stoffer som metaller, baser.
  10. Centrifuge prøven ved 15 700 xg i 15 min ved 4 ° C og overføre den vandige fase inn i et nytt 1,5 ml rør.
  11. Legg 5-10 ug glykogen og 250 ul foravkjølt (-20 ° C) isopropanol; Bland godt og inkuber over natten ved -20 ° C.
  12. Sentrifugere prøven ved 15 700 xg i 30 min ved 4 ° C, og supernatanten kastes.
  13. Vask pelleten med 1 ml 75% etanol, sentrifuger ved 15 700 xg i 15 min ved 4 ° C, og supernatanten kastes.
  14. La etanol fordampe ved tørking av pellets ved romtemperatur inntil det blir hvit (for eksempel i 10-15 minutter).
  15. Tilsett 20 ul RNase-fritt DDH 2 O til pelleten og inkuberes i 10-15 minutter ved 55 ° C for å oppløse RNA; deretter holde på is.
  16. Vurdere RNA-konsentrasjon og renhet ved absorbans måling. Vurdere RNA integritet ved å kjøre prøven på en 1% agarosegel.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Her beskriver vi en representant hjerte disseksjon eksperiment ved hjelp av sebrafisk Tg (myl7: GFP) twu34 transgen linje 9, som uttrykker grønt fluorescerende protein (GFP) utelukkende innenfor hjertemuskelen (Fig. 1). Vi samlet begge de dissekerte hjerter og embryoene fra hvilke de ble utledet å bedømme renheten av hjerte prøven. Kort, homozygot Tg (myl7: GFP) ble twu34 sebrafisk 9 outcrossed med villtype slik at alle embryonale hjerter ble GFP merket. Noen 500 embryoer (56 HPF) ble overført til 1,5 ml rør (ca. 100 embryoer i hver) (Fig. 1A1, 1B). Hvert rør ble bearbeidet som beskrevet i protokollen seksjonen (trinn 2), og i figur 1A. Hjerter ble frigjort ved å pipettere opp og ned flere ganger (fig. 1A2) og deretter påført på en 100 mikrometer filter (fig. 1A3). Store stykker av embryonale vev ble holdt tilbake i filteret; denne fraksjonen ble hentet og satt i Trizol for RNA ekstraksjon for å få en "embryo uten hjerte" RNA prøve (Fig. 1A3). Gjennomstrømningsholdige hjerter ble deretter påført på en 30 mikrometer filter (fig. 1A4), som beholdt hjerter og vev rester av tilsvarende størrelse. GFP-positive hjerter ble spylt ut av filteret inn i en agarose-belagte petriskål (fig. 1A5, 1 C), raskt samlet seg i midten av tallerken under en fluorescerende stereomikroskop og overført til 0,75 ml RNAlater (fig. 1A6). Innenfor dette rør med RNAlater, vi sammenslåtte hjerter avledet fra 5 disseksjon runder (ca. 300 hjerter fra 500 embryoer som representerer en ekstraksjonseffektivitet på ca. 60%). En sammenligning av hjerteprøver før sortering av avfallet fra embryoer ved 56 HPF (Fig. 1C) versus 36 HPF (Fig. 1C ') er vist i figur 1. Ved 56 HPF, avbrudd av embryoer gitt mer embryonale rusk ( for eksempel objektiver, pilspiss, Fig. 1C) enn ved 36 HPF etter 30 mikrometer filtrerings trinn (Fig. 1C ').

Å bestemme renheten av 56 HPF "hjertet" sample, sammenlignet vi uttrykket nivåer av hjerte versus ekstra hjerte transkripsjoner i "hjertet" og "embryo uten hjerte" prøver ved RT-qPCR. For dette formål, ekstrahert vi mRNA fra disse to prøvene og vurderes RNA kvalitet på en agarosegel (figur 2A) og kvantitet ved absorbans måling (tabell 1) som beskrevet i protokollen seksjonen (trinn 3). Den ca. 300 hjerter ga 660 ng RNA. Deretter cDNA ble syntetisert ved anvendelse av M-MLV revers transkriptase RNase H (-) og tilfeldige heksamerer ifølge Produsentens instruksjoner, og RT-qPCR eksperimenter ble utført som beskrevet 12. Relative genekspresjon nivåer ble beregnet for forskjellige vevs-spesifikke markører så som myosin light polypeptid 7 [myl7, et myokardialt markør] 9, kinase innsats domene-reseptor-lignende [kdrl, en endothelial / endokardiale markør] 13, hemoglobin-beta embryonale-1.1 [hbbe1.1, en ​​rød blodcelle markør] 14 Krystallin-alfa A [cryaa, et øye linse markør] 15, og glial fibrillært surt protein [GFAP, et sentralnervesystem markør] 16 (figur 2B). Sebrafisk eukaryote translasjonsinitieringssete faktor 1B [eif1b] 12 ble benyttet som en intern referanse-genet (se tabell 2 for GenBank ID-numre, primer-sekvenser, PCR-produktstørrelser og vev-spesifisitet for hvert gen). Som ventet ble myl7 høyanriket i "hjertet" sample i forhold til "embryo uten hjerte" sample (Fig. 2B). Den endotel-cellemarkør kdrl ble funnet å være moderat anriket på hjertet prøven, som forventet (ca. 40% av de kardiale celler ved 56 HPF er kdrl -expressing endokardiale celler) (fig. 2B). Erytrocytt markør hbbe1.1 ble overrepresentert i "hjertet" prøven, selv om hjertene var still juling etter disseksjon, som bør utvise røde blodceller fra hjertet (Fig. 2B). I motsetning til dette uttrykket nivåer av CNS og linse markører (GFAP og cryaa, henholdsvis) var ekstremt lav i "hjertet" sample (fig. 2B). Helt, vi konkludere med at hjertet disseksjon protokollen gir høy kvalitet og hjertespesifikk RNA fra hele sebrafisk embryo.

Figur 1
Figur 1. Hjerte utvinning fra sebrafisk embryo. (A) Scheme skildrer hjertet utvinning prosedyre. Rundt 100 levende embryoer er samlet i et 1,5 ml rør (A1, B, B '), bedøves og deretter pipettert opp og ned flere ganger gjennom en smal pipette for å frigjøre hjertene (A2). Den resulterende oppløsning inneholdende de embryonale vev (A2) blir deretter påført på en 100 mikrometer filter (A3). Embryonale vev uten eggeplomme og hearts, og store embryonale rester forblir i filteret (A3). Gjennomstrømnings samles opp i en 50 ml rør (A3) og deretter påført på en 30 mikrometer filter (A4). Hjertene og små rusk beholdes i 30 mikrometer filter og overført til en liten agarose-overtrukket petriskål (A5, C, C '). EGFP merket hjerter (C, C '; pil) blir manuelt sortert fra den gjenværende rusk, for eksempel objektiver (C, pilspiss), og er samlet i RNAlater (A6). Denne prosedyren blir gjentatt minst 5 ganger, og alle hjerter er slått sammen for videre behandling. (BC ') Overlegg av fluorescens (EGFP i grønt) og DIC bilder av levende transgene Tg (myl7: EGFP) twu34 embryoer ved 56 HPF (B, C) ​​og 36 HPF (B', C ') ved to trinn på hjertet Disseksjon prosedyre: før embryoet disseksjon (B, B '), og bare etter spyling fra 30 um filter, før sortering hjertene fra avfallet i petriskål (C, C'). Skala bar: 500 mikrometer.

Figur 2
Figur 2. Analyse av RNA kvalitet og renhet ved elektroforese og RT-qPCR, henholdsvis. (A) Total RNA fra "hjertet" sample (2 mL) og fra "embryo uten hjerte" sample (1 pl), avledet fra 56 HPF embryoer, oppløst på en 1% agarosegel. Prominent S18 og S28 rRNA band indikerer at RNA ikke blir degradert. (B) Relative uttrykk nivåer av vev spesifikke markører myl7 (myokard), kdrl (endotelet), hbbe1.1 (erytrocytter), cryaa (objektiv), og GFAP (CNS) som bestemmes av RT-qPCR for "hjertet" sample normalisert til "embryo uten hjerte" sample. RT-qPCR eksperimenter ble utført som tekniske triplikater, og data er angitt som middel ± SEM. En uparet t-test analyse ble utført. **** P <0,0001; ** P <0,005. bp, basepar.

sample ID ng / mL A260 A280 260/280 260/230 markør abs. 340 rå
hjerter 32.97 0.82 0.41 2.01 0.35 2,355 0.031
embryoer uten hjerter 568,82 14.22 7,00 2.03 2.04 6,965 0,018

Tabell 1. RNA kvantitet og kvalitet ved spektrofotometrisk måling. Mengden og kvaliteten på RNA av "hjertet" og "embryo uten hjerte" eksempler hentet fra 56 HPF embryoer målt ved spektrofotometri.

gene GenBank # primersekvens PCR produktstørrelse (bp) Vev-spesifikk markør
myl7 BX248505 F: 5'-ACAGCAAAGCAGACAGTGAA-3 ' 163 myokard
R: 5'-TAACTCCATCCCGGTTCTGA-3 '
kdrl CR759732 F: 5'-ACAACGACACTGGCATCTAC-3 ' 170 endotelet / endocardium
R: 5'-TGTTCTACAGGGGACCACAA-3 '
GFAP BX324157 F: 5'-AGACAACTTGGCCTCAGAC-3 ' 247 sentralnervesystemet
R: 5'-ATCCACATGAACCTGTTGGG-3 '
cryaa BX248514 190 eye linse
R: 5'-TCAGACCTCACCTCAGAGAC-3 '
hbbe1.1 BC095024 F: 5'-TGGTTGTGTGGACAGACTTCGA-3 '8 102 erytrocytt
R: 5'-CGATAAGACACCTTGCCAGAGC-3 '8
eif1b BX323079 F: 5'-CAGAACCTCCAGTCCTTTGATC-3 '12 195 referanse genet
R: 5'-GCAGGCAAATTTCTTTTTGAAGGC-3 '12

Tabell 2. Primere som brukes til de RT-qPCR eksperimenter. Navn, GenBank tiltredelse nummer, sekvens, PCR produktstørrelser og vev-spesifisitet vises for alle gener analysert.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Denne protokollen tillater rask berikelse av sebrafisk embryonale hjerte vev for genekspresjon analyser. Kvantitet og kvalitet av hjertespesifikke RNA prøve avhenger i stor grad på noen viktige trinn: først, er mengden av prøven kraftig forbedret hvis tap av hjerter er forhindret på alle trinn av protokollen, siden RNA rensing vil bare fungere med tilstrekkelig utgangsmateriale. Sekund, renheten av prøven, som er helt avhengig experimenter, blir bestemt ved å sortere og samle hjerter i petriskålen, mens strengt utelukke andre vev. Tredje, kritisk avhengig prøvekvalitet på å begrense RNA degradering som kan oppstå ved avbrudd av embryoene; Dette oppnås ved hjelp av cellekulturmedium for å unngå celledød, og ved å holde prøvene på is. RNA degradering blir stoppet når hjertene er blitt overført til RNAlater eller Trizol. At hjerter er juling i petriskålen kraftfullt viser at hjerte tproblemet er fysiologisk normalt etter disseksjon.

Vi anbefaler at du starter med minst 300 hjerter (dvs. rundt 500 embryo), som nok RNA kan trygt utfelte (sammen med 5-10 mikrogram glykogen). Men vi kan ikke utelukke enn færre hjerter ville nok for eksperimenter småskala. Det er bare viktig å ha tilstrekkelig RNA til å bestemme konsentrasjonen, renhet og integritet av prøven. Vennligst merk at RNA-innholdet kan variere avhengig av utviklingstrinnet og på den genetiske bakgrunn av embryoet (for eksempel i tilfelle av mutanter med unormale hjerter). Derfor ville det minimalt med embryoer som kreves for et eksperiment må avgjøres i hvert enkelt tilfelle.

Det er få tekniske forskjeller mellom denne protokollen og en tidligere protokoll av Burns og MacRae, og vi tror ikke at det er en betydelig forskjell i effektivitet eller hastighet mellom de to protokollene.Imidlertid har vi innført forbedringer: Viktigst, foreslår vi at du bruker RNAlater stabilisering løsning. Dette er viktig av to grunner: For det første, for å samle høy kvalitet RNA for videre eksperimenter som RT-qPCR ved å redusere RNA-nedbrytning til et minimum, da RNAlater inaktiverer umiddelbart RNases og stabiliserer RNA i vev eller celler. For det andre er RNAlater avgjørende for å tillate oppsamling av hjerter på forskjellige dager, noe som er viktig når antall embryoer er en begrensende faktor. Den gjør det også pooling av hjertene som kan være nødvendig for å oppnå en tilstrekkelig mengde av utgangsmateriale for effektiv isolering av høy kvalitet RNA med Trizol. Overføring av hjertene direkte inn Trizol omgår bruken av RNAlater, men på grunn av helsefare, dette trinnet må utføres under en kjemisk hette, som ikke kan forutsettes å være lokalisert i umiddelbar nærhet av fluorescensmikroskop for alle forskere .

Vi fant tlue hjertet disseksjon fungerer godt med embryoer mellom 20-72 HPF [12; upubliserte data for 72 HPF]. Imidlertid blir ekstraksjonsprosedyren vanskeligere med økende embryonisk alder og lengde: ytterligere og mer kraftfull pipettering er nødvendig for å kunne innføre embryoene inn i den lange spiss, og å separere de hjerter fra andre embryonale vev. Som et resultat, er mer embryonale rester tilstede i prøvepreparering (se figur 1C, C ') og experimenter har til å være mer forsiktig i sortering hjertene i petriskål.

Hjertet disseksjon protokoll som presenteres her muliggjør en analyse av hele den kardiale ekspresjonsprofilen av forskjellige celletyper, inkludert myokardium og endocardium. Videre separasjon av hjertecelletyper kan oppnås ved bruk av endocardial- og hjerteinfarkt spesifikke-reporter linjer [f.eks Tg (myl7: GFP) twu34 og Tg (kdrl: mCherry is5] 9, 17 for hjerte ekstraksjon kombinert med FACS sortering. I motsetning til den Sette ribosom Affinitetsrensing (TRAP) -metoden 18,19, som tillater vev-spesifikk transkripsjons analyse uten vev disseksjon, er vår tilnærming ikke begrenset til aktivt-oversatte mRNA, men omfatter også ikke-aktivt-oversatte mRNA eller ikke-kodende RNA. En alternativ anvendelse av hjertet disseksjon protokollen er å analysere protein ekspresjon i hjerter: proteinnivåer kan bli vurdert ved Western blot og protein lokalisering kan analyseres ved immunhistokjemi, som anatomi av hjertet er bevart under disseksjonen prosedyren.

Som en oppsummering presenterer vi her en detaljert protokoll for å dissekere funksjonelle / bankende hjerter fra hundrevis av embryoene i løpet av kort tid, som kan anvendes for oppnåelse av hjerte-spesifikk RNA (eller protein) prøver av høy renhet for videre analyser.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Equipment for raising fish and collecting eggs  see the Zebrafish Book11 for details
Fluorescence stereomicroscope
Refrigerated Microcentrifuge
UV-Spectrophotometer e.g. Thermo Scientific Nanodrop 2000
Nucleic acid electrophoresis chamber
Petri dishes 4 cm Ø, coated with 1% agarose in E3 medium
Micropipettes and tips (P20, P100, P1000)
1.5 ml centrifugation tubes
15 ml and 50 ml centrifugation tubes
Pair of Dumont #5 forceps
ExactaCruz™ Round Gel Loading Tips in Sterile Rack, 1-200μl  Santa Cruz sc-201732
100 μm filter (BD Falcon 100 mm Cell Strainer) BD Biosciences 352360
30 μm filter (Pre-Separation Filters-30 µm) Miltenyi Biotec 130-041-407
Phase lock gel, heavy, 1.5 ml tubes  Prime 2302810
Egg water medium 60 μg/ml Instant Ocean Sea Salts in ddH2O, 0.00001% (w/v) Methylene Blue
E3 medium  5 mM NaCl, 0.17 mM KCl, 0.33 mM CaCl2, 0.33 mM MgSO4
Tricaine (3-amino benzoic acidethylester) Sigma-Aldrich A-5040 4 mg/ml Tricaine stock solution, pH 7
1% agarose (in E3 medium)
1% agarose gel (in TBE buffer)
Leibovitz´s L-15 medium  Gibco 21083-027
FBS (Fetal Bovine Serum) Sigma F4135
RNAlater Ambion AM7020
Trizol Ambion 1559606
Glycogen  Invitrogen 10814-010 20 µg/µl in RNase-free water
chloroform
isopropanol
75% ethanol (in DEPC-ddH2O)
Nuclease-free water or sterilized DEPC treated ddH2O
Nucleic acid loading buffer
TBE (Tris/Borate/EDTA) buffer for electrophoresis

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Stainier, D. Y., et al. Mutations affecting the formation and function of the cardiovascular system in the zebrafish embryo. Development. 123, 285-292 (1996).
  2. Chen, J. N., et al. Mutations affecting the cardiovascular system and other internal organs in zebrafish. Development. 123, 293-302 (1996).
  3. Bakkers, J. Zebrafish as a model to study cardiac development and human cardiac disease. Cardiovasc Res. 91, 279-288 (2011).
  4. Jowett, T., Lettice, L. Whole-mount in situ hybridizations on zebrafish embryos using a mixture of digoxigenin- and fluorescein-labelled probes. Trends Genet. 10, 73-74 (1994).
  5. Gibson, U. E., Heid, C. A., Williams, P. M. A novel method for real time quantitative RT-PCR. Genome Res. 6, 995-1001 (1996).
  6. Epstein, C. B., Butow, R. A. Microarray technology - enhanced versatility, persistent challenge. Curr Opin Biotechnol. 11, 36-41 (2000).
  7. Qian, X., Ba, Y., Zhuang, Q., Zhong, G. RNA-Seq Technology and Its Application in Fish Transcriptomics. OMICS. 18, 98-110 (2014).
  8. Burns, C. G., MacRae, C. A. Purification of hearts from zebrafish embryos. Biotechniques. 40, 274-278 (2006).
  9. Huang, C. J., Tu, C. T., Hsiao, C. D., Hsieh, F. J., Tsai, H. J. Germ-line transmission of a myocardium-specific GFP transgene reveals critical regulatory elements in the cardiac myosin light chain 2 promoter of zebrafish. Dev Dyn. 228, 30-40 (2003).
  10. Kimmel, C. B., Ballard, W. W., Kimmel, S. R., Ullmann, B., Schilling, T. F. Stages of embryonic development of the zebrafish. Dev Dyn. 203, 253-310 (1995).
  11. Westerfield, M. The zebrafish book. A guide for the laboratory use of zebrafish (Danio rerio). 4th, University of Oregon Press. Eugene. (2000).
  12. Veerkamp, J., et al. Unilateral dampening of Bmp activity by nodal generates cardiac left-right asymmetry). Dev Cell. 24, 660-667 (2013).
  13. Jin, S. W., Beis, D., Mitchell, T., Chen, J. N., Stainier, D. Y. Cellular and molecular analyses of vascular tube and lumen formation in zebrafish. Development. 132, 5199-5209 (2005).
  14. Brownlie, A., et al. Characterization of embryonic globin genes of the zebrafish. Dev Biol. 255, 48-61 (2003).
  15. Marvin, M., et al. Developmental expression patterns of the zebrafish small heat shock proteins. Dev Dyn. 237, 454-463 (2008).
  16. Lam, C. S., Marz, M., Strahle, U. gfap and nestin reporter lines reveal characteristics of neural progenitors in the adult zebrafish brain. Dev Dyn. 238, 475-486 (2009).
  17. Wang, Y., et al. Moesin1 and Ve-cadherin are required in endothelial cells during in vivo tubulogenesis. Development. 137, 3119-3128 (2010).
  18. Heiman, M., et al. A translational profiling approach for the molecular characterization of CNS cell types. Cell. 135, 738-748 (2008).
  19. Tryon, R. C., Pisat, N., Johnson, S. L., Dougherty, J. D. Development of translating ribosome affinity purification for zebrafish. Genesis. 51, 187-192 (2013).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics