Transcriptional विश्लेषण के लिए बड़े पैमाने पर Zebrafish भ्रूण दिल विच्छेदन

1Max Delbrück Center for Molecular Medicine, 2Institute of Biochemistry and Biology, University of Potsdam, 3Institute of Molecular Biology, Medizinische Hochschule Hannover
* These authors contributed equally
Published 1/12/2015
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Developmental Biology

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Summary

Zebrafish दिल के विकास के दौरान हृदय जीन की अभिव्यक्ति प्रोफाइल का विश्लेषण करने के लिए, कुल शाही सेना पृथक दिल से निकाला जा चुका है। यहाँ, हम हृदय-विशिष्ट mRNA के प्राप्त करने के लिए zebrafish भ्रूण से तेजी से मार्गदर्शन विच्छेदन द्वारा कार्यात्मक / पिटाई दिलों इकट्ठा करने के लिए एक प्रोटोकॉल प्रस्तुत करते हैं।

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Lombardo, V. A., Otten, C., Abdelilah-Seyfried, S. Large-scale Zebrafish Embryonic Heart Dissection for Transcriptional Analysis. J. Vis. Exp. (95), e52087, doi:10.3791/52087 (2015).

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Abstract

zebrafish भ्रूण दिल पूरे भ्रूण का केवल एक छोटा सा अंश का प्रतिनिधित्व केवल कुछ सौ कोशिकाओं से बना है। इसलिए, वैश्विक भ्रूण transcriptome नकाबपोश द्वारा किया जा रहा से हृदय transcriptome को रोकने के लिए, यह आगे विश्लेषण के लिए दिल की पर्याप्त संख्या इकट्ठा करने के लिए आवश्यक है। Zebrafish हृदय विकास तेजी से आय के रूप में इसके अलावा, दिल के संग्रह और शाही सेना निकासी तरीकों नमूनों की एकरूपता सुनिश्चित करने के क्रम में जल्दी करने की जरूरत है। यहाँ, हम zebrafish भ्रूण से कार्यात्मक / पिटाई दिलों इकट्ठा करने के लिए एक तेजी से मार्गदर्शन विच्छेदन प्रोटोकॉल उपस्थित थे। इस transcriptome विश्लेषण करती द्वारा इस तरह के मात्रात्मक वास्तविक समय पोलीमरेज़ चेन रिएक्शन (आरटी-qPCR) के रूप में, हृदय-विशिष्ट जीन की अभिव्यक्ति का स्तर निर्धारित करने के लिए बाद में हृदय-विशिष्ट शाही सेना निकासी के लिए एक अनिवार्य शर्त है। विधि अन्य ऊतकों के साथ तुलना में zebrafish भ्रूण दिल का अंतर चिपकने वाला गुणों के आधार पर किया जाता है; इस तेजी से बनावट के लिए अनुमति देता हैfluidic कतरनी बल व्यवधान, stepwise निस्पंदन और ट्रांसजेनिक fluorescently लेबल दिलों का मार्गदर्शन संग्रह का एक संयोजन द्वारा extracardiac ऊतक से हृदय की सिसल जुदाई।

Introduction

जेबराफिश (देनियो rerio) व्यापक रूप से की वजह से छोटे आकार और फ्लोरोसेंट प्रोटीन के ऊतक विशेष अभिव्यक्ति के साथ ट्रांसजेनिक संवाददाता लाइनों की उपलब्धता के साथ संयुक्त अपनी तेजी से, पारदर्शी और extrauterine भ्रूण विकास के लिए vivo में जीवोत्पत्ति के अध्ययन करने के लिए विकासात्मक जीव विज्ञान में प्रयोग किया जाता है। इस छोटे से कशेरुकी विशेष रूप से अच्छी तरह से जल्दी zebrafish भ्रूण की oxygenation दिल की धड़कन और रक्त के प्रवाह पर निर्भर नहीं करता है, क्योंकि दिल विकास का अध्ययन करने के लिए अनुकूल है; इन सुविधाओं के हृदय म्यूटेंट 1,2 की बड़ी संख्या के लक्षण वर्णन की अनुमति दी है और zebrafish अब हृदय रोगों तीन अध्ययन करने के लिए एक व्यापक रूप से मान्यता प्राप्त मॉडल जीव है।

भ्रूण के विकास के दौरान जीन की अभिव्यक्ति का अध्ययन करने के लिए, टेप सामान्यतः पूरे माउंट स्वस्थानी संकरण में (इच्छा) 4 से विश्लेषण कर रहे हैं, आरटी-qPCR के 5, प्रोटीन 6, या अगली पीढ़ी के अनुक्रमण (आरएनए Seq) 7। जबकिइच्छा पूरी भ्रूण के भीतर जीन अभिव्यक्ति का एक स्थानिक-लौकिक विश्लेषण, प्रतिलेख के स्तर आमतौर पर आर टी-qPCR, प्रोटीन या शाही सेना Seq दृष्टिकोण से मूल्यांकन कर रहे हैं अनुमति देता है। हालांकि, इन तरीकों विशिष्ट जीन अभिव्यक्ति की रूपरेखा के लिए ऊतक संवर्धन की आवश्यकता होती है।

Zebrafish भ्रूण दिल पूरे भ्रूण का एक छोटा सा अंश का प्रतिनिधित्व करता है के बाद से, हृदय विकास के दौरान transcriptome पढ़ाई विच्छेदन और दिल के संवर्धन के लिए एक प्रोटोकॉल की आवश्यकता होती है। इसके अलावा, physiologically प्रासंगिक डेटा प्राप्त करने के लिए, यह शाही सेना निकासी जब तक पूरी तरह कार्यात्मक हृदय के ऊतकों को बनाए रखने के लिए महत्वपूर्ण है। यहाँ, हम तेजी से physiologically सामान्य अलग और कुशलता से आगे के विश्लेषण के लिए उच्च गुणवत्ता शाही सेना के नमूने प्राप्त करने के लिए zebrafish भ्रूण के सैकड़ों से दिल की धड़कन के लिए एक प्रोटोकॉल का वर्णन है। वर्तमान विधि बर्न्स और मॅकरै, 2006 8 द्वारा रिपोर्ट प्रोटोकॉल पर आधारित है। हृदय के ऊतकों के संवर्धन के लिए, दोनों तरीकों एक ट्रांसजेनिक दौरे संवाददाता लाइन का उपयोगऔर अन्य ऊतकों बनाम zebrafish भ्रूण दिल का अंतर आसंजन गुण का लाभ ले। संक्षेप में, एक संकीर्ण विंदुक टिप के माध्यम से ऊपर और नीचे कई भ्रूण pipetting द्वारा, दिल एक साथ भ्रूण निकायों से जारी किया जाता है और बाद में दो तेजी से छानने का काम चरणों में भ्रूण मलबे से अलग; fluorescently लेबल दिल तो स्वयं शेष मलबे से हल और आगे की प्रक्रिया के लिए एकत्र कर रहे हैं।

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Protocol

इस प्रोटोकॉल जर्मन और बर्लिन राज्य के कानून के जानवरों की देखभाल दिशा निर्देशों के बाद; zebrafish हैंडलिंग पशु संरक्षण (LaGeSo, बर्लिन-ब्रांडेनबर्ग) के लिए स्थानीय प्राधिकारी द्वारा नजर रखी थी।

1. हार्ट निष्कर्षण के लिए zebrafish भ्रूण प्राप्त

  1. ट्रांसजेनिक लाइन 9 twu34 दिल-विशिष्ट GFP अभिव्यक्ति के साथ भ्रूण को प्राप्त करने के क्रम में: इस तरह के टीजी (EGFP myl7) के रूप में क्रॉस हृदय संवाददाता zebrafish।
  2. वांछित भ्रूण चरण 10,11 तक 28.5 डिग्री सेल्सियस पर अंडे पानी में भ्रूण बनाए रखें। एकत्र भ्रूण जनसंख्या जीन अभिव्यक्ति में बदलाव को सीमित करने के लिए दोनों आनुवंशिक रूप से और विकास मंच द्वारा सजातीय है कि सुनिश्चित करें।
  3. मैन्युअल रूप से भ्रूण dechorionate।

2. विदारक Zebrafish भ्रूण दिल

नोट: बर्फ पर सभी समाधान रखें। यदि संभव हो तो, एक साथ काम करते हैं: एक व्यक्ति EMB से दिलों dissectsryos किसी अन्य व्यक्ति प्रतिदीप्ति stereomicroscope के तहत दिलों लेगा। यह कुछ ही घंटों में भ्रूण के कई सैकड़ों के प्रसंस्करण की अनुमति देता है।

  1. एक 1.5 मिलीलीटर centrifugation के ट्यूब में 100 के बारे में भ्रूण स्थानांतरण। Tricaine के साथ भ्रूण (E3 के मध्यम में 0.16 मिलीग्राम / एमएल) anesthetize। भ्रूण स्पष्ट रूप से anesthetized हैं एक बार आगे बढ़ें (वे तैरने और ट्यूब के नीचे तलछट, लेकिन उनके दिल में अभी भी मार रहे हैं नहीं है)।
  2. Tricaine / E3 के समाधान निकालें और 1 मिलीलीटर एल-15/10% FBS के माध्यम से एक बार भ्रूण धोने और बर्फ पर बनाए रखें।
    नोट: एल-15/10% FBS के मध्यम दिलों RNAlater या Trizol में स्थानांतरित कर दिया गया है जब तक पूरे विच्छेदन प्रक्रिया के दौरान जिंदा अंगों और कोशिकाओं को रखने के लिए महत्वपूर्ण है।
  3. जर्दी पूरी तरह से बाधित है जब तक एक गोल जेल लोड हो रहा टिप के साथ ऊपर और नीचे भ्रूण और पिपेट को 5-8 गुना 1 मिलीलीटर एल-15/10% FBS के माध्यम जोड़ें। भ्रूण ड्रॉप-वार समाधान की सतह पर, बूंद फट जाएगा तो यह है कि पिपेट औरभ्रूण धीरे बाधित कर रहे हैं।
    नोट: ऊपर pipetted और नीचे यानी अधिक से pipetting देर चरणों (जैसे 56 HPF पर) में की जरूरत है, भ्रूण के विकास के चरण पर निर्भर होने के लिए सख्ती से और कितनी बार भ्रूण है।
  4. बहुत धीरे pipetted अगर कुछ दिल भ्रूण से जुड़ी रह सकती बाद से विच्छेदित भ्रूण के पहले बैच के लिए, भ्रूण की अखंडता और एक stereomicroscope के तहत विच्छेदित दिल के अनुपात का आकलन करें। तदनुसार विच्छेदन के अगले राउंड के लिए pipetting के तरीके से समायोजित करें।
    नोट: प्लास्टिक से चिपके हुए दिलों को कम करने के लिए कम प्रतिधारण पिपेट सुझाव और microcentrifuge ट्यूब का प्रयोग करें।
  5. एक 50 मिलीलीटर centrifugation ट्यूब पर रखा एक 100 माइक्रोन फिल्टर पर नमूना लागू करें; 1 मिलीलीटर एल-15/10% FBS के माध्यम के साथ 1.5 मिलीलीटर ट्यूब कुल्ला और फिर (कुछ दिलों ट्यूब की दीवारों से चिपके हुए किया जा सकता है) नमूना के नुकसान को कम करने के क्रम में फिल्टर करने के लिए इस पर लागू करें। 1 मिलीलीटर एल के साथ दो बार फिल्टर धो लें-15/10% FBS के। इस चरण में दिल फिल्टर के माध्यम से गुजरती हैं और 50 मिलीलीटर ट्यूब में एकत्र कर रहे हैं।
  6. एक 15 मिलीलीटर centrifugation ट्यूब पर रखा एक 30 माइक्रोन फिल्टर पर प्रवाह के माध्यम से लागू करें और 1 मिलीलीटर एल-15/10% FBS के माध्यम से एक बार फिल्टर कुल्ला। इस दूसरे निस्पंदन चरण में, दिल फिल्टर में रखा जाता है और छोटे मलबे से धोया जाता है।
  7. उल्टा फिल्टर मुड़ें और 1 मिलीलीटर एल-15/10% FBS के साथ लगातार तीन washes के लागू करने के द्वारा एक 1% agarose लेपित पेट्री डिश में फिल्टर से बाहर दिलों फ्लश।
  8. मैन्युअल एक प्रतिदीप्ति stereomicroscope के तहत संदंश की एक जोड़ी के साथ nonfluorescent भ्रूण मलबे (जैसे नेत्र लेंस) से GFP पॉजिटिव दिलों को अलग और पकवान के केंद्र में उन्हें ध्यान केंद्रित। चरण 3 के अनुसार उन्हें इकट्ठा।
    नोट: भ्रूण से अधिक उम्र के 24 HPF हैं, तो दिल की धड़कन ऊतकों अभी physiologically सामान्य हो रहे हैं यह दर्शाता है कि किया जाना चाहिए।

3. Dissec से mRNA के अलगटेड दिल

  1. (बर्फ पर) 0.75 मिलीग्राम RNAlater युक्त एक 1.5 मिलीलीटर ट्यूब में छोटी संभव मात्रा में दिल (जैसे 10 μl) और पिपेट ले लीजिए। कोई दिल एक प्रतिदीप्ति stereomicroscope के तहत यह देखने के द्वारा विंदुक टिप में बने रहने की जाँच करें।
  2. वैकल्पिक रूप से, एक रासायनिक हुड प्रतिदीप्ति सूक्ष्मदर्शी की तत्काल आसपास के क्षेत्र में उपलब्ध है, तो रासायनिक हुड के तहत Trizol (सतर्कता) में एकत्र दिलों हस्तांतरण। यह विंदुक टिप में और भी दिल की centrifugation के दौरान चिपके हुए दिलों के संभावित नुकसान में गतिरोध उत्पन्न (3.4, 3.5 और 3.7 कदम)। Trizol के साथ एक ही ट्यूब में अलगाव के कई दौर से दिलों पूल और 3.8 कदम को सीधे जाओ; अंतिम मात्रा मूल Trizol मात्रा का 10% से अधिक नहीं होना चाहिए।
    नोट: उपयोग करने से पहले Trizol सामग्री सुरक्षा डाटा शीट (MSDS) पढ़ें। एक डाकू के तहत Trizol अभिकर्मक संभाल और व्यक्तिगत सुरक्षा उपकरण की सिफारिश पहनने। त्वचा, आंखों और clothi के साथ संपर्क से बचेंएनजी। प्रज्वलन के सभी स्रोतों निकालें।
  3. शाही सेना के अलगाव की दक्षता में एकत्र ऊतक की राशि के साथ सुधार के रूप में, (बर्फ पर) RNAlater के साथ एक ही ट्यूब में अलगाव के कई दौर से दिलों पूल। कुल नमूना मात्रा मूल RNAlater मात्रा का 10% से अधिक है, (बर्फ पर) भंडारण के लिए 0.75 मिलीलीटर RNAlater के साथ एक अतिरिक्त ट्यूब का उपयोग करें।
  4. दिलों तलछट के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर 20 मिनट के लिए 15,700 XG पर नमूने अपकेंद्रित्र।
  5. एक प्रतिदीप्ति stereomicroscope के तहत, 3 मिलीग्राम एल-15/10% FBS के मध्यम युक्त एक 1% agarose लेपित पेट्री डिश में संभव के रूप में सावधानी के रूप में ज्यादा सतह पर तैरनेवाला जमा है, लेकिन centrifugation के ट्यूब के नीचे में sedimented दिलों को परेशान नहीं करते। दिलों की अप करने के लिए 15% की वजह से RNAlater के उच्च चिपचिपापन सतह पर तैरनेवाला में रह सकते हैं के बाद से कदम 3.7 में वर्णित के रूप में, उन्हें निकालते हैं।
  6. एक रासायनिक हुड के तहत, sedimented दिलों युक्त ट्यूब के लिए 0.5 मिलीलीटर Trizol जोड़ने और बर्फ पर रहते हैं।
  7. फ्लोरोसेंट microsco के तहतपीई, पतला करने के लिए 3 मिलीलीटर एल-15/10% FBS के साथ एक और 1% agarose लेपित डिश में RNAlater / एल-15/10% FBS के समाधान युक्त 1% agarose लेपित पकवान से (3.5 कदम से) दिल का स्थानांतरण RNAlater बाहर। पेट्री डिश के केंद्र में दिलों को इकट्ठा करने और एक रासायनिक हुड के तहत TRIzol में sedimented दिलों की ट्यूब में एक छोटी मात्रा में उन्हें स्थानांतरित।
  8. भंवर TRIzol में दिल युक्त 1.5 मिलीलीटर ट्यूब दिलों को बाधित और कमरे के तापमान पर 5 मिनट के लिए सेते हैं।
  9. एक रासायनिक हुड के तहत, 100 μl क्लोरोफॉर्म (सतर्कता) जोड़ने, मिश्रण अच्छी तरह से और (उपयोग करने से पहले अधिकतम गति से अपकेंद्रित्र 30 सेकंड) एक 1.5 मिलीलीटर में पूर्व काता PLG ट्यूब Trizol / क्लोरोफॉर्म समाधान स्थानांतरण। कमरे के तापमान पर 3 मिनट के लिए सेते हैं।
    नोट: उपयोग करने से पहले क्लोरोफॉर्म एमएसडीएस पढ़ें। एक डाकू के तहत क्लोरोफॉर्म अभिकर्मक संभाल और व्यक्तिगत सुरक्षा उपकरण की सिफारिश पहनने। त्वचा, आंखों और कपड़ों के साथ संपर्क से बचें। क्षार, ऐसी धातुओं के रूप में दूर incompatibles से रहते हैं।
  10. Centrifuजीई 4 डिग्री सेल्सियस पर 15 मिनट के लिए 15,700 XG पर नमूना और एक नया 1.5 मिलीलीटर ट्यूब में जलीय चरण हस्तांतरण।
  11. 5-10 माइक्रोग्राम प्रति ग्लाइकोजन और isopropanol (-20 डिग्री सेल्सियस) precooled 250 μl जोड़ें; मिश्रण अच्छी तरह से और -20 डिग्री सेल्सियस पर रात में सेते हैं।
  12. 4 डिग्री सेल्सियस पर 30 मिनट के लिए 15,700 XG पर नमूना अपकेंद्रित्र और सतह पर तैरनेवाला त्यागें।
  13. 4 डिग्री सेल्सियस पर 15 मिनट के लिए 15,700 XG पर 1 मिलीलीटर 75% इथेनॉल, सेंट्रीफ्यूज के साथ गोली धोने और सतह पर तैरनेवाला त्यागें।
  14. यह (10-15 मिनट के लिए उदाहरण के लिए) सफेद हो जाता है जब तक कमरे के तापमान पर गोली सूखने से इथेनॉल लुप्त हो जाना।
  15. गोली के लिए 20 μl RNase मुक्त DDH 2 हे जोड़ें और शाही सेना को भंग करने के लिए 55 डिग्री सेल्सियस पर 10-15 मिनट के लिए सेते; फिर बर्फ पर रहते हैं।
  16. Absorbance के माप से शाही सेना एकाग्रता और पवित्रता का आकलन करें। एक 1% agarose जेल पर नमूना चलाकर आरएनए अखंडता का आकलन करें।

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Representative Results

विशेष रूप से मायोकार्डियम (। अंजीर 1) के भीतर twu34 ट्रांसजेनिक लाइन 9, हरी फ्लोरोसेंट प्रोटीन (GFP) व्यक्त करता है जो: यहाँ, हम zebrafish टीजी (GFP myl7) का उपयोग कर एक प्रतिनिधि दिल विच्छेदन प्रयोग का वर्णन है। हम विच्छेदित दिल और वे दिल नमूना की शुद्धता का आकलन करने के लिए प्राप्त किए गए जिसमें से भ्रूण दोनों एकत्र की। संक्षेप में, समयुग्मक टीजी (myl7: GFP) के twu34 zebrafish 9 सभी भ्रूण दिल GFP के लेबल रहे थे तो यह है कि जंगली प्रकार के साथ outcrossed थे। कुछ 500 भ्रूण (56 HPF) 1.5 मिलीलीटर ट्यूबों में स्थानांतरित कर दिया गया (लगभग। 100 भ्रूण प्रत्येक में) (छवि। 1A1, 1 बी)। प्रोटोकॉल खंड (चरण 2) में और चित्रा 1 ए में वर्णित के रूप में प्रत्येक ट्यूब संसाधित किया गया था। दिल के नीचे कई बार (छवि। 1A2) ऊपर pipetting और द्वारा जारी की और फिर एक 100 माइक्रोन फिल्टर (छवि। 1A3) पर लागू किया गया। भ्रूण ऊतक के बड़े टुकड़े इस फिल्टर में बनाए रखा गया; इस अंश को पुनः प्राप्त और के लिए TRIzol में डाल दिया गया थाआर शाही सेना निकासी के लिए एक "भ्रूण दिल के बिना" शाही सेना के नमूने (छवि। 1A3) प्राप्त करने के लिए। दिल युक्त प्रवाह के माध्यम से तो समान आकार के दिलों और ऊतक मलबे को बरकरार रखा है, जो एक 30 माइक्रोन फिल्टर (छवि। 1A4), पर लागू किया गया था। GFP पॉजिटिव दिल एक agarose लेपित पेट्री डिश (छवि। 1A5, 1C), जल्दी से 0.75 मिलीलीटर RNAlater (छवि। 1A6) में एक फ्लोरोसेंट stereomicroscope के तहत पकवान के बीच में एकत्र हुए और हस्तांतरित में फिल्टर के बाहर प्लावित कर रहे थे। RNAlater के साथ इस ट्यूब के भीतर, हम 5 विच्छेदन दौर से व्युत्पन्न दिलों जमा (लगभग। 300 दिलों के बारे में 60% की निकासी दक्षता का प्रतिनिधित्व 500 भ्रूण से)। पूर्व 36 HPF बनाम 56 HPF में भ्रूण से मलबे से (छवि। 1C) छँटाई करने के लिए दिल के नमूनों की तुलना (छवि। 1C ') 56 HPF में चित्र 1 में दिखाया गया है, भ्रूण के विघटन (अधिक भ्रूण मलबे झुकेंगे इस तरह के 30 माइक्रोन निस्पंदन कदम (छवि निम्नलिखित 36 HPF में से लेंस, Arrowhead, अंजीर। -1 सी) के रूप में। -1 सी ')।

56 HPF 'दिल' नमूने की शुद्धता निर्धारित करने के लिए, हम आर टी-qPCR के द्वारा नमूने "दिल के बिना भ्रूण" "दिल" और में अतिरिक्त हृदय टेप बनाम हृदय की अभिव्यक्ति के स्तर की तुलना में। यह अंत करने के लिए, हम उन दो नमूनों से mRNA के निकाले और प्रोटोकॉल खंड (चरण 3) के रूप में वर्णित absorbance के माप (1 टेबल) द्वारा एक agarose जेल (2A चित्रा) और मात्रा पर शाही सेना गुणवत्ता का आकलन किया। लगभग। 300 दिलों 660 एनजी शाही सेना झुकेंगे। Manufacturer's निर्देशों के अनुसार और यादृच्छिक hexamers, और 12 में वर्णित के रूप में आर टी-qPCR के प्रयोगों प्रदर्शन किया गया (-) अगला, सीडीएनए एम MLV रिवर्स ट्रांसक्रिपटेस RNase एच का उपयोग कर संश्लेषित किया गया था। रिश्तेदार जीन अभिव्यक्ति के स्तर ऐसी मायोसिन प्रकाश पॉलीपेप्टाइड 7 [myl7, एक दौरे मार्कर 9], [kdrl, Endothelial / endocardial मार्कर] 13, हीमोग्लोबिन बीटा भ्रूण-एक तरह काइनेज डालने डोमेन रिसेप्टर के रूप में अलग ऊतक विशेष मार्कर के लिए गणना की गई।1 [hbbe1.1, एक एरिथ्रोसाइट मार्कर] 14, crystallin-अल्फा एक [cryaa, एक नेत्र लेंस मार्कर 15], और glial fibrillary अम्लीय प्रोटीन [GFAP, एक केंद्रीय तंत्रिका तंत्र मार्कर] 16 (चित्रा 2B)। 1 बी [eif1b] 12 एक आंतरिक संदर्भ जीन के रूप में इस्तेमाल किया गया था zebrafish यूकेरियोटिक अनुवाद दीक्षा कारक (GenBank आईडी नंबर, प्राइमर दृश्यों, पीसीआर उत्पाद आकार और प्रत्येक जीन के लिए ऊतक विशिष्टता के लिए 2 टेबल देखें)। जैसी कि उम्मीद थी नमूना (छवि। 2 बी) "दिल के बिना भ्रूण" की तुलना में, myl7 अत्यधिक 'दिल' नमूने में समृद्ध था। (छवि। 2 बी) (56 HPF पर हृदय कोशिकाओं के बारे में 40% kdrl endocardial कोशिकाओं -expressing कर रहे हैं) के रूप में उम्मीद endothelial सेल मार्कर kdrl, मामूली दिल नमूने में समृद्ध हो पाया था। एरिथ्रोसाइट मार्कर hbbe1.1 दिलों सेंट थे, भले ही 'दिल' नमूने में overrepresented किया गया थादिल (छवि। 2 बी) से लाल रक्त कोशिकाओं को निष्कासित करना चाहिए जो विच्छेदन के बाद बीमार पिटाई,। इसके विपरीत, सीएनएस और लेंस मार्कर (क्रमशः GFAP और cryaa,) की अभिव्यक्ति के स्तर 'दिल' नमूना (छवि। 2B) में बहुत कम थे। कुल मिलाकर, हम निष्कर्ष है कि पूरे zebrafish भ्रूण से दिल विच्छेदन प्रोटोकॉल पैदावार उच्च गुणवत्ता और हृदय-विशिष्ट आरएनए।

चित्रा 1
Zebrafish भ्रूण से चित्रा 1. हार्ट निष्कर्षण। दिल निष्कर्षण प्रक्रिया का चित्रण (ए) योजना। लगभग 100 लाइव भ्रूण, एक 1.5 मिलीलीटर ट्यूब (ए 1, बी, बी ') में एकत्र anesthetized और फिर दिल जारी करने के लिए एक संकीर्ण विंदुक टिप (ए 2) के माध्यम से कई बार pipetted और नीचे हैं। भ्रूण के ऊतकों (ए 2) युक्त जिसके परिणामस्वरूप समाधान तो एक 100 माइक्रोन फिल्टर (ए 3) पर लागू होता है। जर्दी और ज बिना भ्रूण के ऊतकोंearts, और बड़े भ्रूण मलबे फिल्टर (ए 3) में रहते हैं। प्रवाह के माध्यम से एक 50 मिलीलीटर ट्यूब (ए 3) में एकत्र की है और उसके बाद एक 30 माइक्रोन फिल्टर (ए 4) पर लागू होता है। दिल और छोटे मलबे से 30 माइक्रोन फिल्टर में बनाए रखा और एक छोटे से agarose लेपित पेट्री डिश (उ 5, सी, सी ') में स्थानांतरित कर रहे हैं। EGFP लेबल वाले दिल (सी, सी ', तीर) मैन्युअल ऐसे लेंस (सी, Arrowhead) के रूप में, शेष मलबे से हल कर रहे हैं, और RNAlater (ए 6) में एकत्र कर रहे हैं। इस प्रक्रिया में कम से कम 5 बार दोहराया जाता है और सब के दिल आगे की प्रक्रिया के लिए एक साथ जमा कर रहे हैं। (बीसी) प्रतिदीप्ति के ओवरले (हरे रंग में EGFP) और डीआईसी लाइव ट्रांसजेनिक टीजी (myl7: EGFP) की छवियों twu34 भ्रूण 56 HPF (बी, सी) और 36 HPF पर (बी ',' सी ') दिल के दो चरणों में विच्छेदन प्रक्रिया: भ्रूण विच्छेदन (बी, बी ') करने से पहले और सिर्फ पूर्व पेट्री डिश (सी, सी में मलबे से दिलों छँटाई करने के लिए, 30 माइक्रोन फिल्टर से निस्तब्धता के बाद')। स्केल बार: 500 माइक्रोन।

चित्रा 2
विश्लेषण क्रमशः वैद्युतकणसंचलन और आरटी-qPCR ने शाही सेना की गुणवत्ता और शुद्धता की चित्रा 2। (ए) कुल शाही सेना के 'दिल' नमूना (2 μl) और से नमूना (1 μl) "भ्रूण दिल के बिना," 56 से निकाली गई एक 1% agarose जेल पर हल HPF भ्रूण,। प्रमुख S18 और S28 rRNA बैंड RNAs अपमानित नहीं कर रहे हैं कि संकेत मिलता है। (बी) के ऊतक विशिष्ट मार्करों myl7 (मायोकार्डियम) 'दिल' नमूने के लिए आर टी-qPCR के द्वारा निर्धारित किया जाता है, के रूप kdrl (अन्तःचूचुक), hbbe1.1 (एरिथ्रोसाइट्स), cryaa (लेंस), और GFAP (सीएनएस) के रिश्तेदार अभिव्यक्ति के स्तर नमूना "दिल के बिना भ्रूण" के लिए सामान्यीकृत। आर टी-qPCR के प्रयोगों तकनीकी triplicates के रूप में प्रदर्शन किया गया और डेटा ± SEM के साधन के रूप में दिया जाता है। एक unpaired टी परीक्षण विश्लेषण किया गया था। **** पी <0,0001; ** पी <0005। बीपी, आधार जोड़ी।

नमूना आईडी एनजी / μl A260 A280 260/280 260/230 ABS कर्सर। 340 कच्चे
दिल 32.97 0.82 0.41 2.01 0.35 2.355 0.031
दिल के बिना भ्रूण 568.82 14.22 7.00 2.03 2.04 6.965 0.018

Spectrophotometric माप द्वारा तालिका 1. शाही सेना मात्रा और गुणवत्ता। 56 HPF भ्रूण से प्राप्त नमूनों "दिल के बिना भ्रूण" मात्रा और 'दिल' और की शाही सेना की गुणवत्ता स्पेक्ट्रोफोटोमेट्री द्वारा मापा।

जीईपूर्वोत्तर GenBank # प्राइमर अनुक्रम पीसीआर उत्पाद का आकार (बीपी) ऊतक विशेष मार्कर
myl7 BX248505 एफ: 5'-ACAGCAAAGCAGACAGTGAA-3 ' 163 मायोकार्डियम
आर: 5'-TAACTCCATCCCGGTTCTGA-3 '
kdrl CR759732 एफ: 5'-ACAACGACACTGGCATCTAC-3 ' 170 अन्तःचूचुक / endocardium
आर: 5'-TGTTCTACAGGGGACCACAA-3 '
GFAP BX324157 एफ: 5'-AGACAACTTGGCCTCAGAC-3 ' 247 केंद्रीय तंत्रिका तंत्र
आर: 5'-ATCCACATGAACCTGTTGGG-3 '
cryaa BX248514 190 नेत्र लेंस
आर: 5'-TCAGACCTCACCTCAGAGAC-3 '
hbbe1.1 BC095024 एफ: 5'-TGGTTGTGTGGACAGACTTCGA-3 '8 102 एरिथ्रोसाइट
आर: 5'-CGATAAGACACCTTGCCAGAGC-3 '8
eif1b BX323079 एफ: 5'-CAGAACCTCCAGTCCTTTGATC-3 '12 195 संदर्भ जीन
आर: 5'-GCAGGCAAATTTCTTTTTGAAGGC-3 '12

आर टी-qPCR के प्रयोगों के लिए इस्तेमाल तालिका 2 प्राइमरों। नाम, परिग्रहण संख्या, अनुक्रम, पीसीआर उत्पाद आकार और ऊतक विशिष्टता का विश्लेषण सभी जीनों के लिए दिखाए जाते हैं।

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Discussion

इस प्रोटोकॉल के जीन की अभिव्यक्ति के लिए zebrafish भ्रूण हृदय के ऊतकों का तेजी संवर्धन का विश्लेषण करती है की अनुमति देता है। आरएनए शुद्धि ही पर्याप्त के साथ काम करेंगे के बाद से, दिल की हानि प्रोटोकॉल के हर कदम पर रोका जाता है तो सबसे पहले, नमूना की मात्रा काफी सुधार हुआ है: हृदय-विशिष्ट शाही सेना के नमूने की मात्रा और गुणवत्ता में काफी कुछ महत्वपूर्ण कदमों पर निर्भर करता है सामग्री शुरू। दूसरा, प्रयोगकर्ता पर पूरी तरह से निर्भर नमूना है, जो की शुद्धता, छंटाई और सख्ती से अन्य ऊतकों को छोड़कर जबकि पेट्री डिश के भीतर दिलों इकट्ठा करके निर्धारित किया जाता है। तीसरा, नमूना गुणवत्ता गंभीर रूप से भ्रूण के विघटन पर हो सकता है जो आरएनए गिरावट सीमित पर निर्भर करता है; इस कोशिका मृत्यु से बचने के लिए सेल संस्कृति के माध्यम का उपयोग करके और बर्फ पर नमूने रखने के द्वारा हासिल की है। दिलों RNAlater या Trizol में स्थानांतरित किया गया है एक बार शाही सेना क्षरण बंद कर दिया है। दिल पेट्री डिश में पिटाई कर रहे हैं कि शक्तिशाली दर्शाता है कि हृदय टीइस मुद्दे को विच्छेदन के बाद physiologically सामान्य है।

हम पर्याप्त शाही सेना को सुरक्षित रूप से (एक साथ 5-10 माइक्रोग्राम प्रति ग्लाइकोजन के साथ) उपजी किया जा सकता है, जिसमें से कम से कम 300 दिलों (यानी लगभग 500 भ्रूण) के साथ शुरू करने की सिफारिश। कम दिलों छोटे पैमाने पर प्रयोगों के लिए पर्याप्त होगा की तुलना में हालांकि, हम बाहर नहीं कर सकते। यह नमूना की एकाग्रता, पवित्रता और अखंडता को निर्धारित करने के लिए पर्याप्त आरएनए है बस महत्वपूर्ण है। शाही सेना सामग्री विकास मंच पर और (असामान्य दिल के साथ म्यूटेंट के मामले में उदाहरण के लिए) भ्रूण के आनुवंशिक पृष्ठभूमि के आधार पर अलग-अलग हो सकता है कि कृपया ध्यान दें। इसलिए, एक प्रयोग के लिए आवश्यक भ्रूण की न्यूनतम राशि प्रत्येक व्यक्ति के मामले में निर्धारित करना होगा।

वहाँ इस प्रोटोकॉल और बर्न्स और मॅकरै से पहले के एक प्रोटोकॉल के बीच कुछ तकनीकी मतभेद रहे हैं, और हम दो प्रोटोकॉल के बीच दक्षता या गति में एक महत्वपूर्ण अंतर यह है कि वहाँ नहीं लगता है।हालांकि, हम सुधार पेश किया है: सबसे महत्वपूर्ण बात, हम RNAlater स्थिरीकरण समाधान का उपयोग करें। पहला, RNAlater तुरंत RNases inactivates और ऊतकों या कोशिकाओं के भीतर शाही सेना स्थिर के रूप में, एक न्यूनतम करने के लिए आरएनए गिरावट को कम करने से इस तरह के आर टी-qPCR के रूप में आगे के प्रयोगों के लिए उच्च गुणवत्ता शाही सेना को इकट्ठा करने के लिए: यह दो कारणों से महत्वपूर्ण है। दूसरा, RNAlater भ्रूण की संख्या एक सीमित कारक है जो महत्वपूर्ण है जब अलग अलग दिनों, पर दिल के संग्रह की अनुमति के लिए महत्वपूर्ण है। यह भी Trizol के साथ उच्च गुणवत्ता वाले शाही सेना के कुशल अलगाव के लिए सामग्री शुरू करने के लिए पर्याप्त मात्रा में प्राप्त करने के लिए आवश्यक हो सकता है जो दिल की पूलिंग की अनुमति देता है। Trizol में सीधे दिलों में परिवर्तित करने RNAlater के उपयोग बाईपास होगा, हालांकि, की वजह से स्वास्थ्य के खतरों के लिए, यह कदम सभी प्रयोगकर्ताओं के लिए प्रतिदीप्ति खुर्दबीन के प्रत्यक्ष आसपास के क्षेत्र में स्थित होना नहीं माना जा सकता है, जो एक रासायनिक डाकू, के तहत प्रदर्शन करना होगा ।

हम टी पायादिल विच्छेदन 12 20-72 HPF [के बीच भ्रूण के साथ अच्छी तरह से काम करता है टोपी; 72 HPF] के लिए अप्रकाशित डेटा। अतिरिक्त और अधिक सशक्त pipetting के सफलतापूर्वक लंबे टिप में भ्रूण को पेश करने के लिए और अन्य भ्रूण के ऊतकों से दिलों को अलग करने के लिए आवश्यक है: हालांकि, निष्कर्षण प्रक्रिया भ्रूण उम्र और लंबाई बढ़ाने के साथ और अधिक मुश्किल हो जाता है। नतीजतन, अधिक भ्रूण मलबे (चित्रा 1C, सी 'देखें) नमूना तैयार करने के भीतर मौजूद है और प्रयोगकर्ता पेट्री डिश में दिल छँटाई में अधिक सावधान हो गया है।

यहाँ प्रस्तुत दिल विच्छेदन प्रोटोकॉल मायोकार्डियम और endocardium सहित विभिन्न प्रकार की कोशिकाओं, के पूरे हृदय अभिव्यक्ति प्रोफाइल के एक विश्लेषण की अनुमति देता है। (: GFP के myl7) twu34 और टीजी (kdrl: कार्डियक प्रकार की कोशिकाओं के विभाजन endocardial- और मायोकार्डियल-विशेष संवाददाता लाइनों [जैसे टीजी का उपयोग करके प्राप्त किया जा सकता है mCherry is5] FACS छँटाई के साथ संयुक्त दिल निकासी के लिए 9, 17। ऊतक विच्छेदन के बिना ऊतक विशेष ट्रांसक्रिप्शनल विश्लेषण की अनुमति देता है, जो अनुवाद राइबोसोम आत्मीयता शुद्धि (ट्रैप) विधि 18,19, के विपरीत, हमारे दृष्टिकोण सक्रिय रूप-अनुवादित mRNAs तक ही सीमित है लेकिन यह भी नहीं सक्रिय-अनुवादित mRNAs या noncoding RNAs शामिल नहीं है। दिल विच्छेदन प्रोटोकॉल का एक वैकल्पिक आवेदन दिलों के भीतर प्रोटीन अभिव्यक्ति का विश्लेषण करने के लिए है: प्रोटीन का स्तर दिल की शारीरिक रचना विच्छेदन प्रक्रिया के दौरान संरक्षित है, के रूप में immunohistochemistry द्वारा विश्लेषण किया जा सकता पश्चिमी धब्बा और प्रोटीन स्थानीयकरण द्वारा मूल्यांकन किया जा सकता है।

सारांश में, हम यहाँ आगे के विश्लेषण के लिए उच्च शुद्धता के दिल-विशिष्ट आरएनए (या प्रोटीन) नमूने प्राप्त करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है, जो कम समय में भ्रूण के सैकड़ों से कार्यात्मक / पिटाई दिलों विदारक के लिए एक विस्तृत प्रोटोकॉल उपस्थित थे।

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Materials

Name Company Catalog Number Comments
Equipment for raising fish and collecting eggs  see the Zebrafish Book11 for details
Fluorescence stereomicroscope
Refrigerated Microcentrifuge
UV-Spectrophotometer e.g. Thermo Scientific Nanodrop 2000
Nucleic acid electrophoresis chamber
Petri dishes 4 cm Ø, coated with 1% agarose in E3 medium
Micropipettes and tips (P20, P100, P1000)
1.5 ml centrifugation tubes
15 ml and 50 ml centrifugation tubes
Pair of Dumont #5 forceps
ExactaCruz™ Round Gel Loading Tips in Sterile Rack, 1-200μl  Santa Cruz sc-201732
100 μm filter (BD Falcon 100 mm Cell Strainer) BD Biosciences 352360
30 μm filter (Pre-Separation Filters-30 µm) Miltenyi Biotec 130-041-407
Phase lock gel, heavy, 1.5 ml tubes  Prime 2302810
Egg water medium 60 μg/ml Instant Ocean Sea Salts in ddH2O, 0.00001% (w/v) Methylene Blue
E3 medium  5 mM NaCl, 0.17 mM KCl, 0.33 mM CaCl2, 0.33 mM MgSO4
Tricaine (3-amino benzoic acidethylester) Sigma-Aldrich A-5040 4 mg/ml Tricaine stock solution, pH 7
1% agarose (in E3 medium)
1% agarose gel (in TBE buffer)
Leibovitz´s L-15 medium  Gibco 21083-027
FBS (Fetal Bovine Serum) Sigma F4135
RNAlater Ambion AM7020
Trizol Ambion 1559606
Glycogen  Invitrogen 10814-010 20 µg/µl in RNase-free water
chloroform
isopropanol
75% ethanol (in DEPC-ddH2O)
Nuclease-free water or sterilized DEPC treated ddH2O
Nucleic acid loading buffer
TBE (Tris/Borate/EDTA) buffer for electrophoresis

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References

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