शारीरिक रिकॉर्डिंग और पीले बुखार मच्छर के स्वाद उपांग की शाही सेना अनुक्रमण

Biology

Your institution must subscribe to JoVE's Biology section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Summary

Electrophysiological परीक्षा द्वारा निर्धारित रूप में एडीज एजिप्टी के प्रमुख स्वाद उपांग में जीन की अभिव्यक्ति अनुमान लगाने के लिए दो विधियों का उपयोग, हम कथित कड़वा और प्रतिकारक यौगिकों को न्यूरोनल प्रतिक्रियाओं अंतर्निहित जीनों के सेट की पहचान की है।

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Sparks, J. T., Dickens, J. C. Physiological Recordings and RNA Sequencing of the Gustatory Appendages of the Yellow-fever Mosquito Aedes aegypti. J. Vis. Exp. (94), e52088, doi:10.3791/52088 (2014).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Introduction

DEET, Picaridin, Citronellal और IR3535 तरह यौगिकों को प्रभावी ढंग से 1,2 एजिप्टी महत्वपूर्ण रोग वेक्टर एडीज सहित मच्छरों, घृणा उत्पन्न करने के लिए दिखाया गया है। हम मच्छर repellency साथ शामिल कोशिकाओं का निर्धारण करने के लिए विशिष्ट स्वाद sensilla के साथ जुड़े संवेदी न्यूरॉन्स से कार्रवाई क्षमता रिकॉर्ड है। इन ऊतकों में व्यक्त जीनों के बहाव अनुक्रमण के साथ युग्मित, हम सुधार हुआ है repellency- क्षमताओं के लिए नए यौगिकों स्क्रीन करने के क्रम में सबसे अधिक संभावना है कि इन कोशिकाओं की प्रतिक्रियाओं मध्यस्थता जीन की पहचान कर सकते हैं।

आरएनए seq के जल्दी जीन अभिव्यक्ति में अस्थायी और स्थानिक परिवर्तन पर नज़र रखने के लिए मानक बनता जा रहा है, एक शक्तिशाली उपकरण है। आरएनए seq के कीट chemosensory उपांग का विश्लेषण करती है और अंगों को बहुत जीन 6 से पारंपरिक पीसीआर आधारित खोजों जीन पर सुधार, कई कीट प्रजातियों 3-5 में आणविक रिसेप्टर्स को उजागर करने के लिए इस्तेमाल किया गया है। कीड़े सबसे विविध पशु वर्ग का प्रतिनिधित्व करते हैं, पूर्वकई अवसरों senting जीन और अद्वितीय phenotypes के बीच संबंध का अध्ययन करने के लिए। आरएनए seq के प्रौद्योगिकी किसी भी रहने वाले कीट ऊतक पर नियोजित किया जा सकता है। इसी तरह, uniporous स्वाद sensilla भीतर संवेदी कोशिकाओं से electrophysiological रिकॉर्डिंग कई अलग अलग कीट प्रजातियों में प्राप्त किया जा सकता है। इन दो तकनीकों की जोड़ी शोधकर्ताओं ने एक मनाया chemosensory फेनोटाइप में शामिल सेट जीन संकीर्ण करने के लिए अनुमति देता है। विभिन्न प्रजातियों विशिष्ट चुनौतियों को पेश करेंगे, लेकिन chemosensory रिसेप्टर जीन और एक chemosensory अनुकूलन के बीच के संबंध में सूचित कर सकते हैं। आकार और chemosensory sensilla की आकृति विज्ञान चर रहा है और शोर को कम करने और repeatable संकेतों की पहचान करने के लिए कार्रवाई की क्षमता जब रिकॉर्डिंग व्यापक समस्या निवारण की आवश्यकता हो सकती है। Chemosensory अंगों के Dissections तुच्छ या नाजुक और समय कीट की आकृति विज्ञान और आकार पर निर्भर करता है, लगता हो सकता है। उच्च गुणवत्ता वाले शाही सेना की वसूली ऐसी दौरान कुछ पिगमेंट बचने के रूप में, साथ ही कुछ समस्या निवारण की आवश्यकता हो सकतीऊतक संग्रह।

व्यवहार परीक्षणों के माध्यम से बचाने वाली क्रीम यौगिकों के प्रभाव का प्रदर्शन प्रत्यक्ष और जानकारीपूर्ण है, वहीं इस दृष्टिकोण समय कार्रवाई की व्यवस्था के संबंध में गहन और व्यापक है। आरएनए seq के साथ युग्मित इलैक्ट्रोफिजियोलॉजी कीड़ों में परिहार व्यवहार क्या ड्राइव के अधिक विशिष्ट विश्लेषण के लिए अनुमति देता है। रासायनिक भेदभाव के "टूलकिट" एक कीट प्रजातियों में पहचान की गई है, एक बार और अधिक विशिष्ट प्रयासों के नाम से जाना जाता भगाने वाली संभव हो रहे हैं पर सुधार करने के लिए। इन कार्यों के लिए जिम्मेदार संवेदी कोशिकाओं में रिसेप्टर्स और जुड़े प्रोटीन प्रत्यक्ष रासायनिक जांच के लिए heterologously व्यक्त किया जा सकता है। इसके अलावा, आणविक मॉडलिंग रसायन इन रिसेप्टर्स 7 से मजबूत प्रतिक्रियाओं प्रकाश में लाना होगा जो भविष्यवाणी कर सकते हैं।

chemosensory ऊतकों की एक संकीर्ण सेट में सभी सक्रिय जीन का स्नैपशॉट भी अन्य प्रजातियों में इसी तरह के जीन की पहचान करने में उपयोगी हो सकता है। अनुक्रम समरूपता और अभिव्यक्ति एसआई का प्रयोगmilarities, शोधकर्ताओं ने सबसे अधिक संभावना कीड़ों पर मोटे तौर पर प्रभावी रहे हैं कि भगाने के लिए प्रतिक्रियाओं mediating आणविक रिसेप्टर्स के सेट फार्म कर सकते हैं। हम कीट chemosensory रास्ते deconstructing में शोधकर्ताओं सहायता करने के लिए और गैर-मॉडल और आर्थिक रूप से महत्वपूर्ण कीड़ों की neuroethology में तल्लीन अधिक राजी करने के लिए निम्नलिखित प्रोटोकॉल उपस्थित थे।

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. पालन ऐ। एजिप्टी वयस्कों

  1. उथले ट्रे में लगभग ¾ इंच पानी में हैच अंडे। भीड़भाड़ वयस्कों के आकार कम हो जाएगा।
  2. रियर लार्वा 25 डिग्री सेल्सियस (12-एच एल: 12-HD) में और जमीन मछली खाने के साथ खाते हैं।
    नोट: overfeeding जीवित रहने की दरों को कम कर सकते हैं।
  3. दैनिक पाश्चर विंदुक द्वारा व्यक्तिगत रूप से pupae निकालें और इस प्रकार 24 घंटा आयु समूहों की स्थापना, ठीक मेष lids के साथ प्लास्टिक के बर्तन के लिए छोटे रोकथाम बाल्टी के अंदर (5.5 सेमी × 9 सेमी) हस्तांतरण।
  4. एक पिंजरे आवास की स्क्रीन दीवारों पर रखा कपास की गेंद द्वारा फ़ीड वयस्क मच्छरों 10% sucrose के समाधान लार्वा के रूप में ही photoperiod के तहत 27 डिग्री सेल्सियस और 70% सापेक्ष आर्द्रता में एक पर्यावरण कक्ष में मच्छरों।
  5. इलेक्ट्रोफिजियोलॉजी के लिए, 5-10 दिन पुराने जानवरों का उपयोग करें। सामान्य में, बड़े जानवरों बेहतर परिणाम देगा। शाही सेना के अलगाव के लिए, 5-10 दिन पुरानी श्रृंखला में एक भी 24 घंटा आयु समूह के भीतर कर रहे हैं कि जानवरों का उपयोग करें।

  1. चयनित संवेदी न्यूरॉन्स से कम से कम गतिविधि elicits कि इलेक्ट्रोलाइट (जैसे 1-10 मिमी) का एक उपयुक्त एकाग्रता का निर्धारण। 10 मिमी NaCl या 1mm KCl एक प्रयोग शुरुआत जब आधारभूत गतिविधि का परीक्षण करने के लिए उचित इलेक्ट्रोलाइट्स हैं।
  2. अकेले इलेक्ट्रोलाइट की तुलना में जब कील गतिविधि पर बहुत कम या कोई प्रभाव नहीं है कि प्रत्येक प्रयोगात्मक उपयुक्त विलायक में रासायनिक (नहीं तो पानी का उपयोग करें, इथेनॉल या DMSO के) भंग। 10% इथेनॉल या 1% DMSO के अंतिम सांद्रता उचित प्रारंभिक सांद्रता हैं।
  3. कीड़ों में खिला बाधा या उत्तेजक अच्छी तरह से वर्णित हैं कि नियंत्रण रसायन (मिठाई के लिए कड़वी या सूक्रोज के लिए जैसे कुनैन) उपयुक्त का चयन करें।

3. इलैक्ट्रोफिजियोलॉजी (8 टिप रिकॉर्डिंग, 1 चित्रा)

  1. यंत्रवत् कांच केशिकाओं खींच कर फार्म कांच इलेक्ट्रोड। गर्मी का अनुकूलन और उचित आकार recordi के लिए फार्म का गिलास खींचने के लिए सेटिंग्स खींचएनजी इलेक्ट्रोड। ध्यान से लक्ष्य है कि Sensillum लिफाफा काफी व्यापक है, लेकिन पड़ोसी संरचनाओं के साथ संपर्क से बचने के लिए काफी छोटा है खोलने इलेक्ट्रोड टिप बनाने के लिए एक विदारक माइक्रोस्कोप के तहत संदंश का उपयोग कांच इलेक्ट्रोड के अंत से दूर तोड़ने।
  2. एक खुर्दबीन के नीचे, नेत्रहीन आकृति विज्ञान द्वारा की पहचान करने और टिप रिकॉर्डिंग के repeatability सुनिश्चित करने के लिए लक्ष्य sensilla / Sensillum स्थिति। प्रेप जानवरों इलेक्ट्रोड प्रविष्टि के कोण से sensilla को मुफ्त का उपयोग की अनुमति है।
  3. -20 डिग्री सेल्सियस पर फ्रीजर में शीत चतनाशून्य वयस्क कीड़े। ठंडे तापमान को overexposure द्वारा परिधीय न्यूरॉन्स को नुकसान से बचने। कांच की स्लाइड पर धार के साथ सिलोफ़न टेप की संकीर्ण स्ट्रिप्स काटें। संकीर्ण स्ट्रिप्स का उपयोग कर एक गिलास स्लाइड पर पूरे कीट स्थिर।
  4. उदासीन (भूमि) इलेक्ट्रोड के रूप में सेवा करने के लिए पृष्ठीय छाती या आंख में एक रासायनिक बढ़ाई टंगस्टन तार डालें।
  5. ब्याज की एक उत्तेजक समाधान के साथ कदम 3.1 में किए गए कांच इलेक्ट्रोड भरें। एक सम्मिलित सिरिंज का प्रयोग, टोपी भरनेखींचा अंत से illary अंत कुंद करने के लिए। नीचे खींच लिया छोर पकड़े, सभी हवाई बुलबुले बाहर झटका। रिकॉर्डिंग और उत्तेजक इलेक्ट्रोड के रूप में सेवा करने के लिए कदम 3.1 में किए गए कांच इलेक्ट्रोड में एक चांदी के तार (chloriding वैकल्पिक) डालें।
  6. कीड़ों में संपर्क chemoreceptive sensilla से रिकॉर्डिंग के लिए डिज़ाइन किया गया है कि एक preamplifier के लिए इलेक्ट्रोड कनेक्ट करें। इस preamplifier (300 हर्ट्ज -3 किलोहर्ट्ज़ bandpass फिल्टर) संभव के रूप में परिचय उत्तेजना के करीब के रूप neuronal गतिविधि कब्जा करने के लिए व्यवस्थित समय कम हो जाएगा। लीजिए, दुकान और कील रिकॉर्डिंग सॉफ्टवेयर से लैस एक माइक्रो कंप्यूटर का उपयोग कर विद्युत संकेतों का विश्लेषण।
    नोट: तेजी से संकेत करने वाली शोर अनुपात में सुधार हो सकता है ठीक से रिकॉर्डिंग सेटअप ग्राउंडिंग।
  7. कार्यक्षमता सुनिश्चित करने के लिए एक नियंत्रण समाधान (इलेक्ट्रोलाइट केवल) के साथ sensilla उत्तेजित। सभी तैयारी के लिए प्रोत्साहन विरूपण साक्ष्य निम्नलिखित 200 मिसे शुरू करने के spikes गणना।
  8. खुराक-प्रतिक्रिया पढ़ाई छोड़कर सभी प्रयोगों के लिए परीक्षण रसायनों के आदेश अनियमित करें,पूर्वाग्रह खत्म करने के लिए। खुराक-प्रतिक्रिया के अध्ययन के लिए, प्रायोगिक रसायन की सांद्रता में वृद्धि करने के लिए sensilla बेनकाब। पर्याप्त वसूली सुनिश्चित करने के लिए stimulations के बीच तीन मिनट की एक न्यूनतम की अनुमति दें।
    नोट: इस आवश्यकता को कीट और sensilla के आधार पर भिन्न हो सकते हैं। थ्रेसहोल्ड मानक त्रुटि का परीक्षण सबसे कम एकाग्रता के लिए मानक त्रुटि के साथ ओवरलैप नहीं करता है जिसके लिए कि एकाग्रता के रूप में परिभाषित किया गया है।

4. शाही सेना अलगाव और अनुक्रमण (चित्रा 2)

  1. कसकर तस्वीर टोपी ट्यूबों कि फिट ऊतक disruption.Prepare साथ RNase मुक्त pestles से पहले सूखी बर्फ पर उन्हें ठंडा करके कसकर फिटिंग RNase मुक्त pestles तैयार करें। सक्रिय रूप से अतिरिक्त संक्षेपण से बचने के लिए विदारक जब तक बंद कर संग्रह ट्यूबों रखें।
  2. फ़िल्टर्ड चूषित्र का प्रयोग, 30 से 40 ठंड anesthetized मच्छरों (डिग्री सेल्सियस फ्रीजर -20 में 15 सेकंड) ठंड के मंच पर और तरह सेक्स से जगह है। जगह जानवरों स्वाद उपांग नुकसान नहीं करने के लिए पंखों लोभी, नीचे की ओर पृष्ठीय।
  3. ठीक संदंश के दो जोड़े का प्रयोग, एक विदारक माइक्रोस्कोप के तहत पुरुषों या महिलाओं से बनती labella या tarsi काटना और आसन्न ऊतकों के शामिल किए जाने की सीमा।
    नोट: 500 बनती labella कुल mRNA की लगभग 800-1000 nanograms पैदावार। 400 व्यक्ति tarsi (5 खंडों प्रत्येक) कुल mRNA की 1,200-1,800 nanograms निकलेगा।
  4. हांफते-संदंश की एक जोड़ी के साथ, हल्के से भीतरी stylets उजागर labella करने के लिए सिर्फ समीपस्थ मच्छर सूंड समझ। संग्रह-संदंश के अन्य जोड़ी का उपयोग, labella को हटाने और ठंड संग्रह ट्यूब की ओर करने के लिए ऊतक जोड़ें।
  5. संदंश की एक जोड़ी के साथ, हल्के से टिबिया और पहले टखने की हड्डियों खंड के जंक्शन पर मच्छर पैर समझ। संदंश के अन्य जोड़ी का उपयोग, tarsi को हटाने और ठंड संग्रह ट्यूब की ओर करने के लिए ऊतक जोड़ें।
    नोट: चाहता था और अवांछित ऊतक के इंटरफेस में खाते में सेल प्रकार ले लो। यह ऊतक पड़ोसी के शामिल किए जाने को सीमित करने के लिए महत्वपूर्ण है, यह वांछित ऊतक के कुछ भागों चूकना नहीं करने के लिए भी उतना ही महत्वपूर्ण है। फाईएनएएल नमूना सही रूप में ब्याज की पूरी अंग का प्रतिनिधित्व करना चाहिए। संग्रह संदंश ठीक स्क्रैप या केवल वांछित ऊतक हथियाने से आजाद कराने सकते हैं कि इस तरह के लोभी संदंश के साथ एक सटीक सीमा बनाएँ।
  6. समय समय पर, ट्यूब के नीचे ऊतक रखने के लिए 9000 XG पर संक्षेप में शून्य डिग्री सेल्सियस अपकेंद्रित्र में संग्रह ट्यूब नीचे स्पिन। नमी विच्छेदन के दौरान संग्रह ट्यूबों में जम जाता है, तो एकत्र ऊतक कवर करने के लिए ठंड Trizol अभिकर्मक की 50ul जोड़ें।
  7. विरोधी धब्बा प्रयोगशाला मार्कर का उपयोग करना, स्पष्ट रूप से एक RNase मुक्त 1.5 एमएल संग्रह के लिए प्रत्येक ऊतक प्रकार के लिए टोपी ट्यूब तस्वीर लेबल। (TRIzol में अगर ठीक टुकड़े) 1.5 मिलीलीटर ट्यूब रैक और तरल नाइट्रोजन का उपयोग करें, फिर ठीक पाउडर में ऊतक पीस फ्रीज। एक बार दोहराएँ। 1 मिलीलीटर Trizol की कुल मात्रा लाने और vortexing द्वारा जमीन ऊतक resuspend।
  8. क्लोरोफॉर्म के 200 उल जोड़ें और मिश्रण अच्छी तरह से। कमरे के तापमान पर 5 मिनट के बाद, 4 डिग्री सेल्सियस और 15 मिनट के लिए 11,000 XG पर अपकेंद्रित्र में नीचे स्पिन। ध्यान सेएक जीनोमिक डीएनए फिल्टर स्तंभ के लिए सीधे जलीय परत जोड़ें। 5 मिनट के लिए 11,000 x जी पर स्पिन। -प्रवाह के माध्यम से और pipet द्वारा मिश्रण करने के लिए RNase मुक्त 70% इथेनॉल के बराबर मात्रा में जोड़ें। एक शाही सेना संग्रह स्तंभ के लिए तरल स्थानांतरण और दिए गए निर्देशों के अनुसार शाही सेना निकासी जारी है।
  9. यों और एक सटीक स्पेक्ट्रोफोटोमीटर पर कुल शाही सेना की शुद्धता का आकलन करने और किसी भी मानक शाही सेना अनुक्रमण विधि के साथ आगे बढ़ें।

5. मात्रात्मक आरटी पीसीआर शाही सेना अनुक्रमण के मान्यकरण (चित्रा 3)

  1. भविष्यवाणी अनुक्रम बहुतायत और प्रकल्पित chemosensory जीन समारोह में दोनों एक गतिशील रेंज पर रिश्तेदार जीन अभिव्यक्ति के स्तर की तुलना करने के लिए संभव के रूप में कई जीनों का चयन करें।
  2. प्रत्येक लक्ष्य जीन के लिए डिजाइन प्राइमर जोड़े एक विशिष्ट 100-180 basepair पीसीआर उत्पाद बढ़ाना। सेट के अनुसार कम से कम एक प्राइमर सुनिश्चित करने के द्वारा गैर विशिष्ट gDNA प्रवर्धन बाहर निकालें एक Intron सीमा तक फैला है। वैकल्पिक रूप से, जीनोमिक प्रदूषण को कम करने के लिए DNase उपचार का उपयोग करें।
  3. लीजिएपिछले अनुभाग में वर्णित के रूप में कीट ऊतक। सभी QRT- पीसीआर प्रतिक्रियाओं को पूरा करने के लिए पर्याप्त शाही सेना को उपलब्ध कराने के लिए आवश्यक है कि कितना ऊतक की गणना।
    नोट: जैविक तीन प्रतियों और तकनीकी तीन प्रतियों प्रतिक्रियाओं परिणामों में अधिकतम आत्मविश्वास प्रदान करेगा।
  4. , जैविक और तकनीकी दोनों प्रत्येक के लिए प्रत्येक लक्ष्य जीन और औसत के लिए (सीटी [लक्ष्य] -Ct [संदर्भ]) को दोहराने - एक्स लक्ष्य के रूप में रिश्तेदार जीन मात्रा का ठहराव की गणना। जैविक प्रतिकृति के बीच सीटी मूल्यों को सामान्य करने के लिए गृह व्यवस्था जीन (एस) का उपयोग करें और रिश्तेदार अभिव्यक्ति की तुलना में वाई अक्ष पैमाने जड़।
  5. आरएनए-सेक और प्रतिगमन आधारित, बूटस्ट्रैप तुल्यता प्रक्रिया 9, iteratively प्रत्येक ऊतक से डेटा को लागू का उपयोग कर QRT- पीसीआर डेटासेट की समानता का आकलन करें।
    नोट: यह प्रक्रिया मनाया आरएनए-सेक और QRT- पीसीआर डेटा के आसपास का निर्माण किया जा सकता है कि छोटी से छोटी "समानता के क्षेत्र 'को दिखाता है, और qRT- द्वारा मापा रिश्तेदार जीन अभिव्यक्ति की अनुमतिपीसीआर आरएनए seq के द्वारा रिश्तेदार जीन अभिव्यक्ति की माप के लिए सांख्यिकीय समकक्ष माना जाता है।

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

से कार्रवाई की क्षमता का पता लगाने के रिकॉर्डिंग। एजिप्टी स्वाद sensilla (चित्रा 1) रसायन की एक सीमा के साथ प्रत्यक्ष उत्तेजना की प्रभावशीलता को प्रदर्शित करता है। इस तकनीक को एक उचित समय सीमा (आम तौर पर कम 500 से एमएस) पर एक दिया आयाम और अवधि के spikes की गणना के द्वारा किसी भी उत्तेजक रासायनिक प्रतिक्रियाओं का यों के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है। ट्रेस रिकॉर्डिंग प्रयोगात्मक शर्तों का सेट दिया तहत आसानी से प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य होना चाहिए। अन्यथा, मनाया शारीरिक प्रतिक्रियाओं परीक्षण प्रजाति के व्यक्तियों के बीच असामान्य phenotypes के प्रतिनिधित्व कर सकते हैं।

कच्चे आरएनए seq के डेटा गोल RPKM के रूप में प्रस्तुत किया जा रहा से पहले निस्पंदन और सटीक मानचित्रण की आवश्यकता है (मैप किया की संख्या प्रति दस लाख प्रतिलेख के kilobase लंबाई प्रति पढ़ता मैप किया पढ़ता है) या FPKM (मिलियन प्रति प्रतिलेख के kilobase लंबाई प्रति पढ़ें टुकड़े की संख्या मैप किया पढ़ता है) संख्यात्मक मूल्यों (चित्रा 2)। के बीच अंतरइन दो आरएनए seq के सामान्य बनाने के तरीकों के दो मौलिक काम करता 10,11 में वर्णित किया गया है। कुल mRNA के अनुक्रमण का एक फायदा एक साथ बड़े जीन परिवारों की अभिव्यक्ति का पता लगाने की क्षमता है। कई जीनों की अभिव्यक्ति का दृश्य प्रस्तुति में एक बार एक दिया ऊतक के लिए आणविक toolset के एक अद्वितीय समझने के लिए अनुमति देता है। लिंगों, विकास के चरणों या प्रकार के ऊतकों के बीच तुलना में तेजी से बनाया जा सकता है।

आरएनए seq के डेटासेट के लिए जैविक प्रतिकृति लागत या ऊतक संग्रह की कठिनाई द्वारा सीमित किया जा सकता है। QRT- पीसीआर कम कीमत पर कुल जीन अभिव्यक्ति के छोटे सबसेट को मान्य करने की क्षमता प्रदान करता है और कम स्रोत शाही सेना की आवश्यकता है। (चित्रा 3 ए) दो तरीकों जीन बहुतायत आकलन के लिए अलग chemistries पर भरोसा करते हैं, के रूप में शाही सेना seq के परिणामों में अधिक से अधिक आत्मविश्वास के लिए अनुमति देने के पक्ष डेटा की तुलना से कंधा मिलाकर। सांख्यिकीय तुल्यता कार्य (3B चित्रा) प्रत्येक मामले में निश्चितता की सीमा प्रदर्शित करता है।

चित्रा 1
चित्रा 1: की labellum पर एक मध्यम आकार के Sensillum से electrophysiological रिकॉर्डिंग। उद्धृत काम 12 से संशोधित एजिप्टी महिलाओं,। निशान 100 मिमी NaCl, 100 मिमी सुक्रोज, 1 मिमी कुनैन, 0.8% DEET, 0.8% Picaridin, 0.8% Citronellal और 0.8% IR3535 के लिए प्रतिक्रियाओं दिखा। भिन्न आयाम या आकार के साथ तीन spikes के ए, बी या सी लेबल रहे हैं। क्रमशः, नमक, चीनी और कड़वी: इन तीन spikes के भिन्न संवेदनशीलता के साथ तीन संवेदी न्यूरॉन उपप्रकार के साथ अनुरूप हैं।

चित्रा 2
चित्रा 2:।, 8 ऊतकों के नमूनों के लिए आरएनए seq के द्वारा निर्धारित उद्धृत काम 13 से संशोधित रूप में स्वाद रिसेप्टर जीन अभिव्यक्ति की तालिका व्यक्ति की कोशिकाओं के लिए RPKM मूल्यों की रिपोर्टप्रत्येक स्वाद जीन एनोटेशन, पुरुष ऊतकों (बाएं) और महिला के ऊतकों (दाएं)। संख्यात्मक मान निकटतम दसवें करने के लिए गोल कर रहे हैं। हीट नक्शा रंग तीव्रता उच्चतम RPKM पर छाया हुआ है और मध्य व्यक्तिगत रूप से प्रत्येक जीन परिवार के लिए बढ़ाया है। इस मामले में दिखाया गया है कि केवल एक जीन परिवार नहीं है। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्रा 3
चित्रा 3:। उद्धृत काम 13 से संशोधित QRT- पीसीआर डेटा और आरएनए seq के डेटा की तुलना (ए) क्षैतिज अक्ष में से प्रत्येक chemoreception जीन दो डेटा स्तंभों का प्रतिनिधित्व करती है। बाएँ स्तंभ आरएनए seq के द्वारा निर्धारित रूप में रिश्तेदार अभिव्यक्ति का प्रतिनिधित्व करता है; Chemoreception जीन की RPKM मूल्यों इस ऊतक में संख्यात्मक अनुपात उत्पन्न करने के लिए गृह व्यवस्था जीन Aaeg की कोई जरूरत नहीं है कि द्वारा विभाजित किया गया। सहीस्तंभ QRT- पीसीआर द्वारा निर्धारित रूप में रिश्तेदार अभिव्यक्ति का प्रतिनिधित्व करता है। सबसे पहले, labella जीनों के लिए जैविक दोहराने सीटी मूल्यों एक मानक के रूप में Aaeg सभी देता का उपयोग कर सामान्यीकृत थे। प्रत्येक जीन रिश्तेदार अभिव्यक्ति मूल्यों की गणना करने के लिए इस्तेमाल किया गया के लिए दूसरा, सीटी मूल्यों को दोहराने (ई लक्ष्य - (सीटी [लक्ष्य] -Ct [संदर्भ]))। त्रुटि सलाखों के अलग-अलग गणना की रिश्तेदार अभिव्यक्ति मूल्यों का मानक विचलन का संकेत मिलता है। (बी) आरएनए-सेक और QRT- पीसीआर डेटासेट एक अलग विश्लेषण में तुलना की गई। 1 के एक मूल्य के गृह व्यवस्था जीन Aaeg की कोई जरूरत नहीं करने के लिए जिम्मेदार ठहराया जा रहा है और सभी अन्य जीन की अभिव्यक्ति इस मूल्य के सापेक्ष सूचित किया जा रहा से, आरएनए seq के डेटा के द्वारा प्रदर्शन के रूप में खड़ी कुल्हाड़ियों रिश्तेदार जीन बहुतायत प्रतिनिधित्व करते हैं। 1 के एक मूल्य के गृह व्यवस्था जीन Aaeg की कोई जरूरत नहीं करने के लिए जिम्मेदार ठहराया जा रहा है और सभी अन्य जीन की अभिव्यक्ति इस मूल्य के सापेक्ष सूचित किया जा रहा से, QRT- पीसीआर ने भविष्यवाणी के रूप में क्षैतिज कुल्हाड़ियों रिश्तेदार जीन बहुतायत प्रतिनिधित्व करते हैं। लाल लाइनों सटीक तुल्यता का प्रतिनिधित्व। धराशायी लाइनों सांख्यिकीय तुल्यता एल्गोरिथ्म 9 द्वारा गणना की ढलान के लिए 'समानता के क्षेत्र' की सीमाओं का प्रतिनिधित्व करते हैं। ठोस काली लाइनें 12 लक्ष्य जीन और Aaeg प्रदान नहीं करता हाउसकीपिंग जीन के लिए आरएनए seq के मात्रा का ठहराव के लिए QRT- पीसीआर तुल्यता की कम से कम वर्गों प्रतिगमन, वृत्त डेटा बिंदु के प्रतिनिधित्व वाले प्रत्येक प्रतिनिधित्व करते हैं। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

स्वाद sensilla से रिकॉर्डिंग कार्रवाई क्षमता का सबसे चुनौतीपूर्ण पहलू हैं जो प्रतिक्रियाएं तय है "सामान्य।" एक दिया कीट प्रजातियों, कुल संख्या और स्वाद रिसेप्टर न्यूरॉन्स की संवेदनशीलता (GRNs) के लिए पहली बार रिकॉर्डिंग एकल स्वाद Sensillum टिप रोजगार कब कर रहे हैं संभावना अज्ञात। कई प्रारंभिक रिकॉर्डिंग पहली रेंज और परीक्षण करने के लिए रसायनों की सांद्रता तय करने के लिए आवश्यक हैं। इस उदाहरण में, हम एक एकल में GRN DEET (चित्रा 1) की कम सांद्रता को जवाब दिया कि अवलोकन के साथ शुरू हुआ। बाद में, हम कड़वा या अन्य कीड़ों के लिए प्रतिकूल होने के लिए जाना जाता रसायनों की सांद्रता की एक श्रृंखला के लिए एक ही Sensillum भीतर प्रतिक्रियाओं की जांच की और इसी तरह की एक कील आकार और आयाम (चित्रा 1) मनाया। इन टिप्पणियों के लिए एक एकल में GRN उप प्रकार इन प्रतिकूल यौगिकों का जवाब है कि सुझाव दिया। तुलना के लिए, हम mosqu में खिला प्रोत्साहित करने के लिए जाना जाता है मीठा यौगिकों का परीक्षण कियाइसी तरह की एक कील हुआ अगर itoes देखने के लिए। हम इस मामले में एक अलग, बड़ा कील मनाया। इसी तरह, हम तीन के लिए कुल में GRN उप गिनती लाने, नमक उत्तेजना के जवाब में एक तिहाई, मध्यवर्ती आकार कील मनाया।

कीड़ों में electrophysiological रिकॉर्डिंग की तैयारी स्वाभाविक चर रहे हैं। लक्ष्य स्वाद sensilla आम तौर पर बहुत छोटे हैं और छल्ली के लिए गिलास को छूने के बिना रिकॉर्डिंग इलेक्ट्रोड के साथ उपयोग करने के लिए उपयुक्त कोण पर तैनात किया जाना चाहिए। स्वाद न्यूरॉन्स के लिए एक प्रवाहकीय पुल की स्थापना करने के लिए, Sensillum के टर्मिनल ताकना रिकॉर्डिंग इलेक्ट्रोड के इलेक्ट्रोलाइट के साथ सीधा संपर्क स्थापित करने के लिए निहित लसीका के लिए खुला होना चाहिए। हम विदेशी मलबे sensilla खुलने से किसी ने रुकावट मनाया या उत्सर्जित और लक्ष्य Sensillum भीतर से सामग्री सूख गए हैं। इन बाधाओं से बचने के लिए, देखभाल के पालन और लक्ष्य sensilla के साथ संपर्क से बचने के लिए कीड़ों से निपटने जब लिया जाना चाहिए। इसके अलावा चू के लिएundamaged, स्वस्थ परीक्षण कीड़े, जैविक जैसे उम्र जैसे कारकों, रिकॉर्डिंग में परिवर्तनशीलता को कम करने के लिए नियंत्रण स्थापित करने के लिए जब विचार किया जाना चाहिए राज्य और zeitgeber समय संभोग, राज्य खिला गाते हैं।

यह लगातार एक उत्तरदायी तैयारी प्राप्त करने के लिए मुश्किल हो सकता है। कई परीक्षणों व्यक्ति के spikes को हल करने के लिए संकेत करने वाली शोर अनुपात काफी सुधार करने के लिए आवश्यक हो सकता है। इस aforementioned तैयारियों पर प्रायोगिक विविधताओं बेहतर परिणाम के लिए नेतृत्व कर सकते हैं। यह सूक्रोज या कुनैन की तरह एक आम कीट कील elicitor का उपयोग करके अपने परीक्षण प्रजातियों के लिए अपने रिकॉर्डिंग उपकरण पर एक मजबूत प्रतिक्रिया, स्थापित करने की सलाह दी जाती है। एक स्वाद Sensillum जवाब है एक बार, इन प्रतिक्रियाओं प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य होना चाहिए। stimulations के बीच समय का न्यूनतम लंबाई प्रयोगात्मक अलग अस्थायी बाधाओं के तहत कील गतिशीलता की जांच निर्धारित किया जाना चाहिए। अत्यधिक उत्तेजना में GRN स्वास्थ्य की रक्षा करने के लिए और Sensillum लिम्फ गिरावट को रोकने के लिए बचा जाना चाहिए। मामले में थाटी प्रतिक्रिया संवेदनशीलता preps की एक बड़ी संख्या में इन प्रतिक्रियाओं को देखते हुए प्रजातियों के लिए physiologically विशिष्ट हैं कि आत्मविश्वास प्रदान करने के लिए प्राप्त किया जाना चाहिए, पहले उत्तेजना के बाद तेजी से घट जाती है।

कुछ सॉल्वैंट्स भी कम अंतिम सांद्रता में, कि GRN गतिविधि को प्रभावित कर सकते हैं के रूप में कुछ परीक्षण रसायन की विलेयता, उत्तेजक इलेक्ट्रोड बनाने में कठिनाई पैदा कर सकते हैं। इन कारणों से परीक्षण और त्रुटि के माध्यम से और उचित नियंत्रण के साथ संबोधित किया जा सकता है। प्रयुक्त कोई विलायक प्रतिक्रियाओं की स्थिरता सुनिश्चित करने के लिए नियंत्रण इलेक्ट्रोलाइट और अन्य परीक्षण के समाधान के लिए जोड़ा जाना चाहिए। इस प्रकार सीधी पहुँच प्रदान immobilizing छोटे कीड़े, नाजुक ऊतकों को नुकसान पहुँचाए बिना sensilla लक्षित करने के लिए परीक्षण और त्रुटि की आवश्यकता हो सकती है।

इलेक्ट्रोफिजियोलॉजी की मुख्य सीमा मनाया न्यूरोनल प्रतिक्रियाएं और संभावित बहाव के व्यवहार प्रतिक्रियाओं की दुर्भाग्यपूर्ण जुदाई है। इसलिए, यह ख है कि रसायनों के लिए प्रतिक्रियाओं का परीक्षण के लिए फायदेमंद हैeen एक पारिस्थितिकी के संदर्भ में परिणाम के महत्व पर चर्चा करने के क्रम में विशिष्ट व्यवहार प्रतिक्रियाओं प्रकाश में लाना करने के लिए दिखाया गया है। टिप रिकॉर्डिंग ट्रांसजेनिक जानवरों का आकलन करने या व्यवहार में प्ररूपी मतभेद का प्रदर्शन उन लोगों के लिए इस तकनीक का आदर्श बना रही है, सेलुलर गतिविधि का बहुत ही सटीक पता लगाने के लिए अनुमति देते हैं। ये रिकॉर्डिंग भी neuronal गतिविधि के दृश्य संवाददाताओं पर भरोसा प्रणालियों की तुलना में, इस तरह के अस्थायी और आयाम गतिशीलता के रूप में न्यूरोनल प्रतिक्रियाओं के बारे में अधिक जानकारी प्रदान करते हैं। कुछ उदाहरणों में, तंत्रिका प्रतिक्रियाओं व्यवहार डेटा 12 से अधिक आसानी मात्रा निर्धारित किया जा सकता है।

आरएनए-सेक और QRT- पीसीआर के लिए ऊतक संग्रह सीधा है, लेकिन कोल्ड स्टोरेज और अधिक नमी के परिहार के माध्यम से सेलुलर सामग्री के संरक्षण के लिए निरंतर एकाग्रता और ध्यान देने की आवश्यकता है। RNase गतिविधि शाही सेना की गुणवत्ता को प्रभावित कर सकते हैं; इसलिए ऊतक केवल संग्रह और शाही सेना निकासी के दौरान साफ ​​सतहों से संपर्क करना चाहिए। समस्या निवारण QRT- पीसीआर मैं के लिए आवश्यक हालांकिप्राइमरों डिजाइन और लक्ष्य और गृह व्यवस्था जीन का चयन करते समय अच्छी तरह से प्रलेखित है, सबसे अधिक संभावना नुकसान प्रारंभिक प्रक्रिया में होते हैं। जाहिर रिश्तेदार अभिव्यक्ति के स्तर की एक रेखा के साथ समान रूप से स्थान अंक का प्रतिनिधित्व करते हैं जीन है कि शाही सेना-सेक और QRT- पीसीआर डेटासेट (चित्रा 3) की तुलना के लिए उपयोगी होते हैं। उदाहरण के लिए, परीक्षण किया जा 0, 10, 20, 30, आदि, क्रमशः, बहुतायत के एक पूर्वानुमान के आदेश की पेशकश की RPKM मूल्यों को दिखाने कि qPCR के लिए जीन का चयन।

आरएनए-सेक (चित्रा 2) नीच प्रकाश डाला स्वाद के ऊतकों के हमारे सर्वेक्षण में जीन व्यक्त करने में सफल रहा था। के लिए विश्वसनीय जीन का निर्माण। एजिप्टी (AaegL1.3, http://aaegypti.vectorbase.org/GetData/Downloads/) और पूर्व chemoreception जीन की पहचान 14 रन बनाकर जीन अभिव्यक्ति अपेक्षाकृत आसान बना दिया। इन उद्देश्यों के लिए, उपलब्ध जीन एनोटेशन और ब्याज की पहचान जीन परिवारों के साथ कीड़े मूल्यवान मॉडल प्रणालियों रहे हैं। एक सटीक दहलीज निर्धारणपृष्ठभूमि शोर बनाम जीन की अभिव्यक्ति के लिए सट्टा है, लेकिन उचित कटऑफ़ का निर्धारण करने के तरीकों 15-17 उपलब्ध हैं। यहाँ हम पूरा विश्वास की एक RPKM स्तर और हम परिणाम के बारे में हमारी चर्चा फंसाया है जिसके द्वारा मिसाल 9 के आधार पर कमी आई विश्वास की एक निचली RPKM स्तर निर्धारित की।

भविष्य में हम कीट repellency मध्यस्थता जीन की हमारे ज्ञान का विस्तार करने के लिए मच्छर और अन्य आर्थिक रूप से महत्वपूर्ण कीड़े दोनों में अन्य chemosensory ऊतकों काटना की उम्मीद है। हम सबसे अधिक संभावना उपलब्ध कार्यात्मक डेटा 13 प्रजातियों के लिए जीन दृश्यों की तुलना द्वारा प्रतिकूल यौगिकों के लिए प्रतिक्रियाओं मध्यस्थता कर रहे हैं कि कई उम्मीदवार स्वाद जीन की स्थापना की है। हम इन व्यक्तिगत chemosensory जीन लापता मच्छरों की ट्रांसजेनिक लाइनों पैदा कर रहे हैं। हम repe करने के लिए इन म्यूटेंट के व्यवहार प्रतिक्रियाओं में जाना जाता भगाने का पता लगाने और आकलन करने के लिए पशु की क्षमता पर इन जीनों की भूमिका का आकलन करने के लिए टिप रिकॉर्डिंग का उपयोग करेगाllents। इन उम्मीदवार जीन काफी repellency प्रभावित नहीं करते कि उदाहरण में, अधिक संकल्प और अधिक ठीक एक एकल Sensillum या सेल में जीन की अभिव्यक्ति या प्रोटीन उपस्थिति निर्धारित करने के लिए आवश्यक हो सकता है। नीच व्यक्त रिसेप्टर्स सर्वत्र व्यक्त सह रिसेप्टर्स के साथ साथ, उपन्यास भगाने वाली स्क्रीनिंग के लिए महत्वपूर्ण लक्ष्य हो सकता है। दुर्भाग्य से, सीटू संकरण और immunolocalization में कीट स्वाद ऊतक 18 में अविश्वसनीय रूप से मुश्किल साबित हो गया है।

हम जीन इन शारीरिक प्रतिक्रियाओं और व्यवहार मध्यस्थता जो स्थापित करने के बाद, हम उम्मीदवार repellents के उच्च throughput स्क्रीनिंग के लिए उत्तरदायी हैं कि सेल प्रणाली में इन जीनों व्यक्त कर सकते हैं। यह भी यौगिकों के प्रकार के विशिष्ट रिसेप्टर्स से मजबूत प्रतिक्रियाओं प्रकाश में लाना होगा जो भविष्यवाणी करने में उपयोगी हो सकता है संरचनात्मक मॉडलिंग 7 उपयोग कि सिलिको दृष्टिकोण में।

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Glass capillary A-M Systems 628000 Standard, 1.5 mm X 0.86 mm, 4"
Silver wire A-M Systems 7875 .015" bare
Tungsten wire Alfa Products 369 0.127 mm diameter
Fine forceps Fine Science Tools 11252 #5SF Inox
Refridgerated stage BioQuip Products 1429 Chill Table
Preamplifier Syntech Taste Probe preamplifier
Software for electrophysiology Syntech Autospike software for electrophysiology
TetraMin fish food Tetra Tropical fish food granules fish food ground to fine powder
TRIzol Life Technologies 15596-026 RNA isolation reagent
RNeasy Plus Mini Kit Qiagen 74136 includes gDNA eliminator and RNeasy spin columns
Nanodrop spectrophotometer Nano Drop Products ND-1000 tabletop spectrometer
R statistics freeware (created by Robert Gentleman and Ross Ihaka) www.r-project.org Use the lm function of the stats package and the equiv.boot function of the equivalence package in the R computing environment.
1.5 ml tube rack Evergreen 240-6388-030 Pour liquid nitrogen into a few empty wells to freeze and grind tissue.
1.5 ml collection tubes with pestle Grainger 6HAX6 RNase free
Centrifuge Thermo Scientific 11178160 Spin down frozen tissue to keep at bottom of 1.5 ml tube.
Primer-BLAST Primer Designing tool NCBI n/a

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Klun, J. A., Khrimian, A., Debboun, M. Repellent and deterrent effects of SS220, picaridin, and DEET suppress human blood feeding by Aedes aegypti, Anopheles stephensi, and Phlebotomus papatasi. J. Med. Entomol. 43, (1), 34-39 (2006).
  2. Dickens, J. C., Bohbot, J. D. Mini review: Mode of action of mosquito repellents.Pestic. Biochem. Physiol. 106, (3), 149-155 (2013).
  3. Pitts, R. J., Rinker, D. C., Jones, P. L., Rokas, A., Zwiebel, L. J. Transcriptome profiling of chemosensory appendages in the malaria vector Anopheles gambiae reveals tissue- and sex-specific signatures of odor coding. BMC Genomics. 12, (271), (2011).
  4. Zhou, X., Slone, J. D., Rokas, A., Berger, S. L., Liebig,, et al. Phylogenetic and transcriptomic analysis of chemosensory receptors in a pair of divergent ant species reveals sex-specific signatures of odor coding. PLOS Genet. 8, (8), e1002930 (2012).
  5. Shiao, M., Fan, W., Fang, S., Lu, M. J., Kondo, R., Li, W. Transcriptional profiling of adult Drosophila antenna by high-throughput sequencing. Zoological Studies. 52, (42), (2013).
  6. Bohbot, J., Pitts, R. J., Kwon, H. W., Rützler, M., Robertson, H. M., Zwiebel, L. J. Molecular characterization of the Aedes aegypti odorant receptor gene family. Insect Mol. Biol. 16, (5), 525-537 (2007).
  7. Kain, P., Boyle, S. M., Tharadra, S. K., Guda, T., Pham, C., et al. Odour receptors and neurons for DEET and new insect repellents. Nature. 502, (7472), 507-512 (2013).
  8. Hodgson, E. S., Lettvin, J. Y., Roeder, K. D. The physiology of a primary chemoreceptor unit. Science. 122, (3166), 417-418 (1955).
  9. Robinson, A. P., Duursma, R. A., Marshall, J. D. A regression-based equivalence test for model validation: shifting the burden of proof. Tree Physiol. 25, (7), 903-913 (2005).
  10. Mortazavi, A., Williams, B. A., McCue, K., Schaeffer, L., Wold, B. Mapping and quantifying mammalian transcriptomes by RNA-seq. Nat. Methods. 5, (7), 621-628 (2008).
  11. Trapnell, C., Williams, B. A., Pertea, G., Mortazavi, A., Kwan, G., et al. Transcript assembly and quantification by RNA-seq reveals unannotated transcripts and isoform switching during cell differentiation. Nat. Biotechnol. 28, (5), 511-515 (2010).
  12. Sanford, J. L., Shields, V. D. C., Dickens, J. C. Gustatory receptor neuron responds to DEET and other insect repellents in the yellow-fever mosquito, Aedes aegypti. Naturwiss. 100, (3), 269-273 (2013).
  13. Sparks, J. T., Vinyard, B. T., Dickens, J. C. Gustatory receptor expression in the labella and tarsi of Aedes aegypti. Insect Biochem. Mol. Biol. 43, (12), 1161-1171 (2013).
  14. Kent, L. B., Walden, K. K. O., Robertson, H. M. The Gr family of candidate gustatory and olfactory receptors in the yellow-fever mosquito Aedes aegypti. Chem. Senses. 33, (1), 79-93 (2008).
  15. Ramsköld, D., Wang, E. T., Burge, C. B., Sandberg, R. An abundance of ubiquitously expressed genes revealed by tissue transcriptome sequence data. PLoS Comput. Biol. 5, (12), e1000598 (2009).
  16. Wagner, G. P., Kin, K., Lynch, V. J. A model based criterion for gene expression calls using RNA-seq data. Theory Biosci. 132, (3), 159-164 (2013).
  17. Hart, T., Komori, H. K., LaMere, S., Podshivalova, K., Salomon, D. D. Finding active genes in deep RNA-seq gene expression studies. BMC Genomics. 14, (778), (2013).
  18. Isono, K., Morita, H. Molecular and cellular designs of insect taste receptor system. Front. Cellu. Neurosci. 4, (20), 1-16 (2010).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics