Физиологические Записи и РНК Секвенирование Вкусовые придатков Желто-лихорадки комаров

Biology

Your institution must subscribe to JoVE's Biology section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Summary

Использование двух методов оценки экспрессии генов в крупных вкусовых придатков Комар желтолихорадочный, мы определили набор генов, предположительно, лежащих в основе нейронных ответов на горьких и отталкивания соединений, а определяется электрофизиологического исследования.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Sparks, J. T., Dickens, J. C. Physiological Recordings and RNA Sequencing of the Gustatory Appendages of the Yellow-fever Mosquito Aedes aegypti. J. Vis. Exp. (94), e52088, doi:10.3791/52088 (2014).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Introduction

Соединения, как DEET, Picaridin, цитронеллаль и IR3535 было показано, что эффективно отпугивания комаров, в том числе важных переносчиков болезней Комар желтолихорадочный 1,2. Мы записываем потенциалы действия от сенсорных нейронов, связанных с конкретной вкусовой сенсилл для определения клеток, участвующих с москитной отталкивающей. В сочетании с выходным последовательности экспрессируются гены в этих тканях, мы можем выявить гены, скорее всего, посреднические ответов этих клеток, направленных на выявление новых соединений для улучшения возможностей для отпугивания.

Секвенирование РНК является мощным инструментом, быстро становится стандартом для отслеживания временных и пространственных изменений экспрессии генов. Секвенирование РНК анализы насекомых хемосенсорных придатков и органов были использованы для выявления молекулярные рецепторы в нескольких видов насекомых 3-5, значительно улучшая на обычной ПЦР на основе поисков гена геном 6. Насекомые представляют собой наиболее разнообразную класс животных, предварительноляющих много возможностей изучать связь между генами и уникальных фенотипов. Секвенирование РНК технология может быть использована на любой живой насекомых ткани. Кроме того, электрофизиологические записи от сенсорных клеток в вкусовой uniporous сенсилл может быть достигнуто во многих различных видов насекомых. Спаривание этих двух методов позволяет исследователям сузить набор генов, участвующих в наблюдаемой хемосенсорной фенотипа. Различные виды представит конкретные проблемы, но может сообщить связь между хемосенсорных рецепторных генов и адаптации хемосенсорной. Размер и морфология хемосенсорной сенсилл является переменной и может потребовать ремонта ошибок при записи потенциалов действия, чтобы снизить уровень шума и определить повторяющиеся сигналы. Вскрытия хемосенсорного органов может быть тривиальным или деликатный и требует много времени, в зависимости от морфологии и размера насекомого. Восстановление из высококачественной РНК может потребовать их устранению, а также, например, избегая определенных пигментов воКоллекция тканей.

В то время как демонстрации влияния отталкивающих соединений через поведенческих испытаний является прямым и информативным, этот подход затрат времени и широкое по отношению к механизму действия. Электрофизиологии в сочетании с Секвенирование РНК позволяет более конкретных анализов, что движет уклонения от поведения насекомых. После того, как "инструментарий" химической дискриминации были выявлены в видов насекомых, более конкретные попытки улучшить известные репелленты возможно. Рецепторы и связанные с ними белков в чувствительных клетках, ответственных за эти поведения могут быть выражены гетерологично для непосредственного химического скрининга. Кроме того, молекулярное моделирование может предсказать, какие химические вещества будут вызывать сильные реакции от этих рецепторов 7.

Снимок всех активных генов в узком наборе хемосенсорных тканей также могут быть полезны в идентификации подобных генов у других видов. Использование гомологию последовательности и выражения сиmilarities, исследователи могут сформировать наборы молекулярных рецепторов, скорее всего, посреднических ответов на репеллентов, которые в целом эффективным против насекомых. Мы приведем следующий протокол, чтобы помочь исследователям в деконструкции насекомых хемосенсорных пути и убедить более углубиться в Нейроэтология не-модели и экономически важных насекомых.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Разведение Ae. Aegypti взрослых

  1. Высиживают яйца в приблизительно ¾ дюйма воды в мелководных лоток. Перенаселение приведет к сокращению размера взрослых.
  2. Задняя личинки при 25 ° C (12-HL: 12-HD), а накормить землю корма для рыб.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Перекармливание может снизить уровень выживаемости.
  3. Удалить куколки индивидуально пипетки Пастера в день и передать пластиковой посуды (9 см х 5,5 см) внутри небольших ведрах по сдерживанию с мелкими крышками сетки, создав таким образом 24 ч возрастным группам.
  4. Кормовые взрослых комаров 10% раствор сахарозы с ватным тампоном размещенных как на экране стенах корпуса сепаратора комары в климатическую камеру при 27 ° С и 70% относительной влажности, при одной и той же фотопериода как личинок.
  5. Для электрофизиологии, используйте 5-10 день старых животных. В общем, крупные животные будут лучшие результаты. Для выделения РНК, используют животных, которые находятся в одном 24 ч возрастной группировки в 5-10-дневного возраста диапазона.

  1. Определить подходящую концентрацию электролита (например, 1-10 мм), которое вызывает минимальную активность в отдельных сенсорных нейронов. 10 мМ NaCl или 1mm KCl разумные электролиты контрольного испытания активности, когда начинают эксперимент.
  2. Растворите каждой экспериментальной химического вещества в подходящем растворителе (если не вода, употреблять этанол или ДМСО), который имеет мало или вообще не влияет на импульсной активности по сравнению с электролит в одиночку. Конечные концентрации 10% этанола или 1% ДМСО разумные исходные концентрации.
  3. Выберите соответствующий (например, хинин горьким или сахарозы в течение Sweet) химических средств, которые хорошо описанных кормления сдерживающие факторы или стимуляторы насекомых.

3. электрофизиологии (совет записи 8, рисунок 1)

  1. Форма стеклянные электроды механически вытягивать стеклянные капилляры. Оптимизация тепло и тянуть настройки, чтобы вытащить стекло, чтобы сформировать соответствующую форму recordiнг электроды. Осторожно разорвать конец стеклянного электрода с помощью щипцов при вскрытии микроскопом, чтобы создать кончик электрода отверстие, которое является достаточно широким, чтобы конверт целевой сенсиллу, но достаточно малы, чтобы избежать контакта с соседними структурами.
  2. Под микроскопом, визуально определить по морфологии и положение цели сенсилл / сенсиллу, чтобы обеспечить повторяемость записи наконечника. Подготовительные животные для обеспечения свободного доступа к сенсилл от угла влета электрода.
  3. Холодные анестезии взрослых насекомых в морозильной камере при -20 ° С. Избегайте повреждения периферических нейронах Нахождение в холодных температурах. Вырезать узкие полоски скотча с лезвием бритвы на стекле. Остановите все насекомое на стекле с использованием узких полос.
  4. Вставка химически заостренный вольфрамовой проволоки в спинной грудной клетки или глаза в качестве индифферентного (земля) электрода.
  5. Заполните стеклянный электрод, выполненный в шаге 3,1 с стимулирующие решения интересов. Использование вставлен шприц, крышку заливной горловиныIllary от вытащил конца, чтобы тупой конец. Флик все пузырьки воздуха, держа вытащил конец вниз. Вставьте серебряную проволоку (хлорирующим дополнительный) в стеклянный электрод сделали в шаге 3.1 в качестве записи и стимулирующего электрода.
  6. Подключите электроды к предусилителя, который предназначен для записи от контакта chemoreceptive сенсилл в насекомых. Это предусилитель (300 Гц-3 кГц полосовой фильтр) позволит сократить время установления для захвата активность нейронов как можно ближе к стимул введение насколько это возможно. Сбор, хранение и анализ электрических сигналов с использованием микрокомпьютера, оснащенный программным обеспечением для записи шип.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Заземление установки записи должным образом, может существенно улучшить отношение сигнал-шум.
  7. Стимулировать сенсиллы с контрольным раствором (только электролита), чтобы обеспечить функциональность. Граф шипы, начиная 200 мс следующие стимула артефакт для всех препаратов.
  8. Случайный порядок испытаний химических веществ для всех экспериментов, за исключением исследований доза-реакция,устранить перекос. Для исследований доза-ответ, чтобы подвергнуть сенсиллы возрастающих концентраций химических экспериментальной. Разрешить минимум 3 минуты между раздражениями, чтобы обеспечить адекватное восстановление.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Это требование может варьироваться в зависимости от насекомых и сенсилл. Порог определяется как концентрации, для которых стандартная ошибка не перекрывается с стандартной ошибки для самой низкой испытанной концентрации.

4. Выделение РНК и секвенирование (рис 2)

  1. Подготовьте подогнанных РНКазы пестики охлаждением их на сухом льду до ткани disruption.Prepare сопровождающих РНКазы пестики, которые соответствуют оснастки крышки пробирки плотно. Держите сбора трубки закрыт, если активно рассечения, чтобы избежать образования конденсата.
  2. Использование отфильтрованного аспиратор, место 30 до 40 холодного наркозом комаров (15 сек в -20 ° C морозильнике) на холодной сцене и сортировать по полу. Место животные спинной стороной вниз, захватывая крылья, чтобы не повредить вкусовые придатки.
  3. Использование двух пар тонких щипцов, анализировать парных Labella или лапки из мужчин и женщин при вскрытии микроскопом и ограничить включение соседних тканей.
    ПРИМЕЧАНИЕ: 500 в паре Labella дает примерно 800-1000 нг тотальной мРНК. 400 индивидуальных лапки (5 сегментов, каждый) дают 1,200-1,800 нг тотальной мРНК.
  4. С одной паре задыхаясь-щипцы, слегка понять комаров хоботок просто проксимальнее LaBella подвергая внутренние стилеты. Использование другую пару коллекторно-щипцы, удалить Labella и добавить ткань в сторону холодной пробирку.
  5. С одной парой щипцов, слегка понять комаров ногу на стыке большой берцовой кости и первого членика лапки. Использование другую пару щипцов, удалить лапки и добавить ткань в сторону холодной пробирку.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Примите во внимание типы клеток на границе желательные и нежелательные ткани. Хотя важно, чтобы ограничить включение соседних тканей, в равной степени важно, чтобы не пропустить части требуемой ткани. Фантастическиенал образец должен точно представлять всю орган интересов. Создать точную границу с щипцы, так что коллекция щипцы могут точно освобождению соскоблить или захват только нужную ткань.
  6. Периодически, спин вниз коллекцию пробирки на 0 ° C центрифуге при 9000 мкг в держать ткань в нижней части трубы. Если влага накапливается в коллекции трубок во время вскрытия, добавить 50 мкл холодного Trizol реагента, чтобы покрыть накопившийся ткани.
  7. Использование анти-смазыванию лаборатории маркера, четко обозначить один РНКазы 1,5 мл оснастки колпачок трубки для каждого типа ткани для коллекции. Использование 1,5 мл стойку трубки и жидкий азот, замораживание затем измельчить ткань в мелкий порошок (мелкие куски, если в TRIZOL). Повторить один раз. Довести общий объем триазол до 1 мл и ресуспендируют в грунтовые ткани на вортексе.
  8. Добавить 200 мкл хлороформа и тщательно перемешать. После 5 мин при комнатной температуре, спин вниз в центрифуге при 4 ° С и 11000 мкг в течение 15 мин. Внимательнодобавить водный слой непосредственно к геномной ДНК колонке фильтра. Спин вниз на 11000 х г в течение 5 мин. Добавить равный объем РНКазы 70% этанола, проточные и перемешать с помощью пипетки. Трансфер жидкости в колонну сбора РНК и продолжают экстракции РНК согласно инструкциям.
  9. Количественная и оценки чистоты общей РНК на точность спектрофотометра и заполните любым стандартным способом РНК последовательности.

5. Количественный RT-PCR Проверка РНК Секвенирование (Рисунок 3)

  1. Выбор, как много генов, как можно сравнивать относительные уровни экспрессии генов в динамическом диапазоне, как в предсказанной последовательности и обилие предполагаемой функции хемосенсорных гена.
  2. Дизайн пары праймеров для каждого гена-мишени для амплификации конкретной 100-180 пар оснований ПЦР-продукта. Исключить неспецифической амплификации GDNA путем обеспечения, по меньшей мере один праймер за множества охватывает интрона границу. Кроме того, использование лечение ДНКазы, чтобы уменьшить геномной загрязнения.
  3. Собиратьткани насекомых, как описано в предыдущем разделе. Посчитайте, сколько ткани необходимо для обеспечения достаточного РНК завершить все реакции Qrt-ПЦР.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Биологическая трех экземплярах и реакции технические тройные обеспечит максимальную уверенность в результатах.
  4. Рассчитать относительную гена количественное определение X цели - (Ct [цель] -ct [ссылка]) для каждого гена-мишени и в среднем для каждого повторить, как биологических, так и технических. Используйте ген (ы) Уборка нормализовать значения Ct между биологических повторяет и укоренить масштаб Y-ось в сравнении относительном выражении.
  5. Оценка сходство Секвенирование РНК и Qrt-ПЦР наборов данных с использованием регрессии, на основе начальной загрузки процедуру эквивалентности 9, итерационно применяться, чтобы данные из каждой ткани.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Эта процедура определяет наименьший «Регион сходства", которые могут быть построены вокруг наблюдаемого Секвенирование РНК и Qrt-PCR данных и позволяют выражение относительной гена, измеряется qRT-ПЦР следует рассматривать статистически эквивалентно измерению экспрессии гена относительной РНК-SEQ.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

В след записи потенциалов действия из Ae. Aegypti вкусовые сенсиллы (Рисунок 1) продемонстрировать эффективность прямой стимуляции с диапазоном химических веществ. Этот метод может быть использован для количественной оценки ответов на любой стимулирующий химических путем подсчета шипы заданной амплитуде и длительности в течение разумного интервала времени (как правило, менее 500 мс). Трассировка записи должны быть легко воспроизводимы при данном наборе условий эксперимента. В противном случае, наблюдаемые физиологические реакции могут представлять необычные фенотипы среди особей испытуемых видов.

Сырье РНК-след данных требует фильтрации и точным отображением прежде, чем быть представлены в виде округлой RPKM (число отображается читает на единицу длины килобаз стенограммы на миллион чтениями) или FPKM (количество фрагментов для чтения на единицу длины килобаз стенограммы на миллион чтениями) Численные значения (рисунок 2). Различие междуЭти два РНК-SEQ способы нормализации была описана в двух основополагающих работ 10,11. Одним из преимуществ общего мРНК последовательности является способность детектировать экспрессию больших семейств генов одновременно. Визуальное представление экспрессии многих генов одновременно обеспечивает уникальное понимание молекулярной набор инструментов для данной ткани. Сравнение между полами, этапы развития и типы тканей могут быть быстро сделано.

Биологических повторяет для РНК-след наборов данных может быть ограничена стоимости или сложности сбора ткани. Qrt-PCR предлагает возможность проверки малых подгрупп полной экспрессии генов при меньших затратах и ​​требует меньше исходного РНК. Бок о сопоставлении данных побочных (рис 3а) обеспечения большей уверенности в Секвенирование РНК результатов, так как две методы основаны на различных химических для оценки ген изобилие. Статистические функции эквивалентности (рис 3b) показывают пределы уверенностью в каждом конкретном случае.

Рисунок 1
Рисунок 1: Электрофизиологические записи из среднего сенсиллы на Губа Ае. Aegypti женщины, модифицированные с цитируемой работе 12. Следы показать ответов до 100 мм NaCl, 100 мМ сахарозы, 1 мМ хинин, 0,8% ДЭТА, 0,8% Picaridin, 0,8% цитронеллаль и 0,8% IR3535. Три пики с различными амплитудами или формы помечены А, В или С. Эти три пики соотносятся с тремя сенсорными нейронами подтипов с различными чувствительности: соль, сахар, и горький, соответственно.

Фиг.2
Рисунок 2:. Таблица вкусовой экспрессии генов рецептора, как определено Секвенирование РНК для 8 образцов ткани, модифицированной с цитируемой работе 13 Отдельные клетки сообщить значений RPKM длякаждый вкусовой ген аннотации, мужские ткани (слева) и женские ткани (справа). Численные значения округлены до ближайшей десятой. Тепло-карту интенсивность цвета суммой в высоком RPKM и середина масштабируется для каждого семейства генов в отдельности. Существует только один ген семья показано в этом случае. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этой цифры.

Рисунок 3
Рисунок 3:. Сравнение данных Qrt-ПЦР и РНК-SEQ данных, модифицированных с цитированной работе 13 (А) Каждый ген хеморецепция горизонтальной оси представлена ​​двумя колоннами данных. Левая колонка представляет относительный выражение, как определяется РНК-след; RPKM значения генов Хеморецепция были разделены, что гена уборка Aaeg LAsP для создания цифровых пропорции в этой ткани. Правоколонка представляет относительную экспрессию как определено QRT-PCR. Во-первых, биологическая повторных значения Ct для генов Labella были нормализованы с помощью Aaeg LAsP в качестве стандарта. Во-вторых, повторить значения Ct для каждого гена были использованы для расчета относительных значений экспрессии (E цель - (Ct [цель] -ct [ссылка])). Столбики ошибок указывают стандартное отклонение индивидуально вычисленных значений относительной экспрессии. (В) Секвенирование РНК и Qrt-ПЦР наборов данных были сравнены в отдельном анализе. Вертикальные оси представляют относительную гена изобилие, как показано на РНК-SEQ данных, со значением 1 приписывается гена домашнего хозяйства Aaeg LAsP и все другие экспрессии генов сообщается по отношению к этой величине. Горизонтальные оси представляют относительную гена изобилие как предсказано Qrt-ПЦР, со значением 1 приписывается гена домашнего хозяйства Aaeg LAsP и все другие экспрессии генов сообщается по отношению к этой величине. Красные линии представляют точную эквивалентность, Пунктирные линии представляют границы "области подобия» для наклона, рассчитываемый статистического алгоритма эквивалентности 9. Твердые черные линии представляют собой регрессию наименьших квадратов Qrt-PCR эквивалентности РНК-след количественного для генов-мишеней 12 и гена домашнего хозяйства Aaeg LAsP, каждый из которых представлен точки данных круг. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этой цифры.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Наиболее сложным аспектом потенциалов действия записи из вкусовой сенсилл решает, какие ответы "нормально". При использовании одного наконечника вкусовые сенсиллу записи в первый раз для данного вида насекомых, общее количество и чувствительности вкусовых нейронов рецепторов (GRNs) являются вероятно, неизвестно. Многие предварительные записи необходимо сначала решить ряд и концентраций химических веществ, чтобы проверить. В этом случае, мы начали с наблюдения, что единственный GRN ответил на низких концентраций DEET (рис 1). Впоследствии, мы рассмотрели ответы в течение того же сенсиллы в диапазоне концентраций химических веществ, известных быть горьким или отвращение к другим насекомых и наблюдал подобную форму шип и амплитуду (рисунок 1). Эти наблюдения предположил, что один ГИН подтипа реагирует на эти отвращение соединений. Для сравнения, мы проверили сладких соединений, известных, чтобы стимулировать подачу в mosquitoes, чтобы увидеть, если произошла похожи шип. Мы наблюдали иную, большую иглу в этом случае. Кроме того, мы наблюдали третий, промежуточный размера всплеск в ответ на солевой стимуляции, в результате чего общее количество GRN подтипа до трех.

Электрофизиологические препараты записи в насекомых по сути своей переменной. Целевая вкусовые сенсиллы, как правило, очень малы и должны быть расположены под соответствующим углом, чтобы получить доступ с записью электродом, не касаясь стекла, чтобы кутикулы. Чтобы установить проводящий мост вкусовых нейронов, терминал пор сенсиллы должны быть открыты для содержащегося лимфы установить прямой контакт с электролитом записывающего электрода. Мы наблюдали блокировку сенсилл отверстия как иностранным мусора или выводится и сушат материал изнутри целевой сенсиллы. Чтобы избежать этих препятствий, следует соблюдать осторожность при выращивании и обработке насекомых, чтобы избежать контакта с целевой сенсилл. В дополнение к Chooпеть неповрежденные, здоровые испытаний насекомых, биологические факторы, такие как возраст, кормление состояние, половое состояние и zeitgeber время следует учитывать при установлении контроля в целях снижения изменчивости в записи.

Это может быть трудно получить ответное препарат последовательно. Многие испытания могут быть необходимы для повышения отношение достаточно сигнал-шум для решения отдельных пиков. Экспериментальные вариации на вышеуказанных препаратов может привести к лучшим результатам. Желательно, чтобы создать надежную ответ на ваш записывающего устройства для тестирования видов, используя общий насекомых шип активатор, как сахароза или хинина. После того, как вкусовая сенсиллы отвечает, эти меры должны быть воспроизводимыми. Минимальный интервал времени между раздражениями должны быть определены экспериментально изучения динамики шипованные под различными временными ограничениями. Избыточная стимуляция следует избегать, чтобы сохранить GRN здоровья и предупреждения сенсиллу деградации лимфы. В случае ThaЧувствительность т ответ быстро уменьшается после первой стимуляции, большее количество Preps должны быть получены для обеспечения уверенности, что эти ответы являются физиологически характерно для данного вида.

Растворимость некоторых испытаний химических веществ может создать проблемы при создании стимулирующих электродов, так как некоторые растворители могут повлиять GRN активности, даже при низких конечных концентраций. Эти соображения могут быть решены путем проб и ошибок и с соответствующим контролем. Любой растворитель, используемый должны быть добавлены к контрольной электролита и других испытуемых растворов, чтобы обеспечить согласованность ответов. Иммобилизирующие мелкие насекомые, таким образом обеспечивая прямой доступ к целевой сенсиллы, не повреждая хрупкие ткани, может потребоваться метод проб и ошибок.

Основным ограничением электрофизиологии является неудачным разделение наблюдаемых нейронов ответов и потенциальных последующих поведенческих реакций. Таким образом, целесообразно, чтобы проверить ответы на химических веществ, которые бееп показано, вызывают определенные поведенческие реакции для того, чтобы обсудить значение результатов в экологическом контексте. Совет записи позволяют очень точное обнаружение клеточной активности, что делает этот технику идеально подходит для оценки трансгенных животных или тех, выставляется фенотипические различия в поведении. Эти записи также предлагаем более подробную информацию о нейронных реакций, таких как временные и амплитудные динамики, чем системы, использующие визуальные журналистами нейронной активности. В некоторых случаях, нейронные реакции может быть определена количественно легче, чем поведенческими данными 12.

Коллекция тканей для Секвенирование РНК и Qrt-ПЦР проста, но требует постоянного концентрацию и внимание к сохранению клеточный материал через холодного хранения и предотвращения избыточной влаги. РНКазы деятельность может повлиять на РНК качество; поэтому ткань должна только связаться чистые поверхности всей коллекции и экстракции РНК. Хотя поиск и устранение неисправностей, необходимые для Qrt-PCR яы хорошо документированы, наиболее вероятные подводные камни встречаются в начале процесса при проектировании праймеров и выбора целевых и служебные гены. Гены, которые предсказуемо представляют равномерно расположенных точек вдоль линии уровня относительной экспрессии полезны для сравнения Секвенирование РНК и Qrt-ПЦР наборов данных (рисунок 3). Например, при выборе гены, которые показывают кПЦР RPKM значения 0, 10, 20, 30 и т.д., соответственно, предлагают предсказуемую порядок избытке, чтобы быть проверены.

Секвенирование РНК была успешной на выявление смирен экспрессии генов в нашем опросе вкусовых тканях (рис 2). Надежный ген построить для Ae. Aegypti (AaegL1.3, http://aaegypti.vectorbase.org/GetData/Downloads/) и ген до хеморецепция идентификации 14, выполненная выражение забил ген относительно легко. Для этих целей, насекомые с доступный ген аннотации и выявленных семейств генов, представляющих интерес, ценные модельных системах. Определение точного порогдля экспрессии генов против фонового шума является спекулятивным, но методы определения разумных отключений доступны 15-17. Здесь мы определил уровень RPKM полного доверия и более низкий уровень RPKM сниженной доверия на основе прецедента 9, с помощью которого мы обрамлении обсуждение результатов.

В будущем мы надеемся анализировать другие хемосенсорных тканей в обоих комаров и других экономически важных насекомых расширить наши знания о генах, опосредующих отпугивать насекомых. Мы создали несколько генов-кандидатов вкусовые что, скорее всего, посреднические ответов на отвращение соединений путем сравнения последовательностей генов видам с имеющимися функциональных данных 13. Мы трансгенных линий комаров, пропавших без вести эти отдельные хемосенсорных гены. Мы будем использовать наконечник записи, чтобы оценить роль этих генов на способность животного, чтобы обнаружить известные репелленты и оценки поведенческих реакций этих мутантов REPEllents. В случае, что эти гены-кандидаты не оказывают существенного влияния отталкивание, может быть необходимо более разрешение, чтобы более точно определить генную экспрессию белка или наличие в одном сенсиллы или клетки. Кроткий, выраженные рецепторы могут быть критические цели для скрининга новых репеллентов, наряду с повсеместно выраженных корецепторов. К сожалению, в гибридизация и иммунолокализации оказалось невероятно трудно в насекомых вкусовой ткани 18.

После того, как мы установили, какие гены посредником эти физиологические реакции и поведение, мы можем выразить эти гены в клеточных системах, которые поддаются высокопроизводительного скрининга кандидатов репеллентов. В силиконового подходов, которые используют структурного моделирования 7 также могут быть полезны при прогнозировании, какие типы соединений будут вызывать сильные реакции от специфических рецепторов.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Glass capillary A-M Systems 628000 Standard, 1.5 mm X 0.86 mm, 4"
Silver wire A-M Systems 7875 .015" bare
Tungsten wire Alfa Products 369 0.127 mm diameter
Fine forceps Fine Science Tools 11252 #5SF Inox
Refridgerated stage BioQuip Products 1429 Chill Table
Preamplifier Syntech Taste Probe preamplifier
Software for electrophysiology Syntech Autospike software for electrophysiology
TetraMin fish food Tetra Tropical fish food granules fish food ground to fine powder
TRIzol Life Technologies 15596-026 RNA isolation reagent
RNeasy Plus Mini Kit Qiagen 74136 includes gDNA eliminator and RNeasy spin columns
Nanodrop spectrophotometer Nano Drop Products ND-1000 tabletop spectrometer
R statistics freeware (created by Robert Gentleman and Ross Ihaka) www.r-project.org Use the lm function of the stats package and the equiv.boot function of the equivalence package in the R computing environment.
1.5 ml tube rack Evergreen 240-6388-030 Pour liquid nitrogen into a few empty wells to freeze and grind tissue.
1.5 ml collection tubes with pestle Grainger 6HAX6 RNase free
Centrifuge Thermo Scientific 11178160 Spin down frozen tissue to keep at bottom of 1.5 ml tube.
Primer-BLAST Primer Designing tool NCBI n/a

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Klun, J. A., Khrimian, A., Debboun, M. Repellent and deterrent effects of SS220, picaridin, and DEET suppress human blood feeding by Aedes aegypti, Anopheles stephensi, and Phlebotomus papatasi. J. Med. Entomol. 43, (1), 34-39 (2006).
  2. Dickens, J. C., Bohbot, J. D. Mini review: Mode of action of mosquito repellents.Pestic. Biochem. Physiol. 106, (3), 149-155 (2013).
  3. Pitts, R. J., Rinker, D. C., Jones, P. L., Rokas, A., Zwiebel, L. J. Transcriptome profiling of chemosensory appendages in the malaria vector Anopheles gambiae reveals tissue- and sex-specific signatures of odor coding. BMC Genomics. 12, (271), (2011).
  4. Zhou, X., Slone, J. D., Rokas, A., Berger, S. L., Liebig,, et al. Phylogenetic and transcriptomic analysis of chemosensory receptors in a pair of divergent ant species reveals sex-specific signatures of odor coding. PLOS Genet. 8, (8), e1002930 (2012).
  5. Shiao, M., Fan, W., Fang, S., Lu, M. J., Kondo, R., Li, W. Transcriptional profiling of adult Drosophila antenna by high-throughput sequencing. Zoological Studies. 52, (42), (2013).
  6. Bohbot, J., Pitts, R. J., Kwon, H. W., Rützler, M., Robertson, H. M., Zwiebel, L. J. Molecular characterization of the Aedes aegypti odorant receptor gene family. Insect Mol. Biol. 16, (5), 525-537 (2007).
  7. Kain, P., Boyle, S. M., Tharadra, S. K., Guda, T., Pham, C., et al. Odour receptors and neurons for DEET and new insect repellents. Nature. 502, (7472), 507-512 (2013).
  8. Hodgson, E. S., Lettvin, J. Y., Roeder, K. D. The physiology of a primary chemoreceptor unit. Science. 122, (3166), 417-418 (1955).
  9. Robinson, A. P., Duursma, R. A., Marshall, J. D. A regression-based equivalence test for model validation: shifting the burden of proof. Tree Physiol. 25, (7), 903-913 (2005).
  10. Mortazavi, A., Williams, B. A., McCue, K., Schaeffer, L., Wold, B. Mapping and quantifying mammalian transcriptomes by RNA-seq. Nat. Methods. 5, (7), 621-628 (2008).
  11. Trapnell, C., Williams, B. A., Pertea, G., Mortazavi, A., Kwan, G., et al. Transcript assembly and quantification by RNA-seq reveals unannotated transcripts and isoform switching during cell differentiation. Nat. Biotechnol. 28, (5), 511-515 (2010).
  12. Sanford, J. L., Shields, V. D. C., Dickens, J. C. Gustatory receptor neuron responds to DEET and other insect repellents in the yellow-fever mosquito, Aedes aegypti. Naturwiss. 100, (3), 269-273 (2013).
  13. Sparks, J. T., Vinyard, B. T., Dickens, J. C. Gustatory receptor expression in the labella and tarsi of Aedes aegypti. Insect Biochem. Mol. Biol. 43, (12), 1161-1171 (2013).
  14. Kent, L. B., Walden, K. K. O., Robertson, H. M. The Gr family of candidate gustatory and olfactory receptors in the yellow-fever mosquito Aedes aegypti. Chem. Senses. 33, (1), 79-93 (2008).
  15. Ramsköld, D., Wang, E. T., Burge, C. B., Sandberg, R. An abundance of ubiquitously expressed genes revealed by tissue transcriptome sequence data. PLoS Comput. Biol. 5, (12), e1000598 (2009).
  16. Wagner, G. P., Kin, K., Lynch, V. J. A model based criterion for gene expression calls using RNA-seq data. Theory Biosci. 132, (3), 159-164 (2013).
  17. Hart, T., Komori, H. K., LaMere, S., Podshivalova, K., Salomon, D. D. Finding active genes in deep RNA-seq gene expression studies. BMC Genomics. 14, (778), (2013).
  18. Isono, K., Morita, H. Molecular and cellular designs of insect taste receptor system. Front. Cellu. Neurosci. 4, (20), 1-16 (2010).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics