Fysiologiske Recordings og RNA sekvensering av Gustatory vedheng av Yellow-feber Mosquito

Biology

Your institution must subscribe to JoVE's Biology section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Summary

Ved hjelp av to metoder for å anslå genuttrykk i de store smaks vedheng av Aedes aegypti, har vi identifisert et sett av gener putatively bak de nevrale responser til bitre og frastøtende forbindelser, som bestemmes av elektrofysiologisk undersøkelse.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Sparks, J. T., Dickens, J. C. Physiological Recordings and RNA Sequencing of the Gustatory Appendages of the Yellow-fever Mosquito Aedes aegypti. J. Vis. Exp. (94), e52088, doi:10.3791/52088 (2014).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Introduction

Forbindelser som DEET, Picaridin, citronellal og IR3535 har vist seg å effektivt frastøte mygg, inkludert viktig sykdom vektor Aedes aegypti 1,2. Vi registrerer aksjonspotensialer fra sensoriske nevroner forbundet med spesifikke gustatory sensilla å bestemme cellene som er involvert med myggavvisende. Sammen med nedstrøms sekvensering av uttrykte gener i disse vev, kan vi identifisere genene mest sannsynlig medier svarene av disse cellene for å screene nye forbindelser for forbedrede avvisende evner.

RNA-seq er et kraftig verktøy, raskt blitt standard for sporing tidsmessige og romlige endringer i genuttrykk. RNA-seq analyser av insekt chemosensory vedheng og organer har blitt brukt til å avdekke molekylære reseptorer i flere insektarter 3-5, mye bedre på konvensjonell PCR-basert søk genet ved genet 6. Insekter representerer den mest varierte dyre klasse, prerer mange muligheter til å studere sammenhengen mellom gener og unike fenotyper. RNA-seq teknologi kan brukes på en hvilken som helst levende insekt vev. På samme måte kan elektro opptak fra sensoriske celler i uniporous smaks- sensilla oppnås på mange forskjellige insektarter. Sammenkoblingen av disse to teknikkene tillater forskere å begrense de innstilte gener involvert i en observert chemosensory fenotype. Ulike arter vil presentere konkrete utfordringer, men kan informere sammenhengen mellom chemosensory reseptorgener og en chemosensory tilpasning. Størrelsen og morfologi chemosensory sensilla er variabel og kan kreve omfattende feilsøking ved opptak aksjonspotensialer for å redusere støy og identifisere repeterbare signaler. Dissections av chemosensory organer kan være ubetydelig eller delikat og tidkrevende, avhengig av morfologi og størrelse av insekt. Utvinning av høy kvalitet RNA kan kreve litt feilsøking også, slik som å unngå visse pigmenter undervev samling.

Mens demonstrere virkningene av fordrivende forbindelser gjennom adferdsforsøk er direkte og informativ, er denne tilnærmingen tidkrevende og bred med hensyn til virkningsmekanismen. Elektrofysiologi kombinert med RNA-seq åpner for mer spesifikke analyser av hva som driver unngåelsesatferd i insekter. Når "verktøykasse" kjemisk diskriminering er blitt identifisert i en insektarter, til mer spesifikke forsøk på å forbedre den kjente insektfordrivende midler er mulig. Reseptorer og tilhørende proteiner i sanseceller som er ansvarlige for disse atferd kan uttrykkes heterologt for direkte kjemisk screening. Videre kan molekylær modellering forutsi hvilke kjemikalier vil lokke fram sterke reaksjoner fra disse reseptorene 7.

Den øyeblikksbilde av alle aktive gener i et smalt sett av chemosensory vev kan også være nyttig for å identifisere tilsvarende gener i andre arter. Ved hjelp sekvenshomologi og uttrykk similarities, forskere kan danne sett av molekylære reseptorer mest sannsynlig medierende reaksjoner på insektmidler blir om lag effektive på insekter. Vi presenterer følgende protokoll for å hjelpe forskere i å dekonstruere insekt chemosensory stier og å overtale flere til å fordype deg i neuroethology av ikke-modellen og økonomisk viktige insekter.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. stell Ae. aegypti voksne

  1. Luke egg i ca ¾ tommers vann i grunne skuff. Overbefolkning vil redusere størrelsen på voksne.
  2. Bakre larver ved 25 ° C (12-HL: 12-HD) og mate med bakken fisk mat.
    MERK: fôring kan redusere overlevelse.
  3. Fjern puppe individuelt ved Pasteur pipette daglig og overføre til plast retter (9 cm x 5,5 cm) inne små containment bøtter med finmaskede lokk, og dermed etablere 24 timers aldersgrupperinger.
  4. Strøm voksne mygg 10% sukroseløsning med bomullsdott plassert på skjermen veggene i et bur huset myggen i et miljøkammer ved 27 ° C og 70% relativ fuktighet under samme fotoperiode som larver.
  5. For elektrofysiologi, bruker 5-10 dager gamle dyr. Generelt vil større dyr gi bedre resultater. For RNA isolering, bruke dyr som er innenfor en enkelt 24-timers alder gruppering i 5-10 dager gammel rekkevidde.

  1. Bestemme en egnet konsentrasjon av elektrolytt (for eksempel 1 til 10 mM) som utløser minimal aktivitet fra utvalgte sensoriske nevroner. 10 mM NaCl eller 1mM KCl er rimelige elektrolytter for å teste baseline aktivitet når du begynner et eksperiment.
  2. Oppløs hver forsøks kjemikalie i egnet oppløsningsmiddel (hvis ikke vann, bruker etanol eller DMSO) som har liten eller ingen effekt på pigg aktivitet sammenlignet med elektrolytt alene. Endelige konsentrasjoner av 10% etanol eller 1% DMSO er rimelige utgangskonsentrasjoner.
  3. Velg riktig (f.eks kinin for bitter eller sukrose for søt) kontroll kjemikalier som er godt beskrevet fôring avskrekking eller sentralstimulerende midler i insekter.

3. Elektro (tips opptak 8, figur 1)

  1. Form glasselektroder ved mekanisk trekke glasskapillærer. Optimalisere varme og trekke innstillinger for å trekke glass for å danne riktig formet recording elektroder. Nøye bryte av enden av glasselektrode ved hjelp av pinsett under et disseksjonsmikroskop å skape elektrodespissen åpning som er bred nok til å konvolutt mål sensillum, men liten nok til å unngå kontakt med nabostrukturer.
  2. Under et mikroskop, visuelt identifisere ved morfologi og posisjonere målet sensilla / sensillum å sikre repeterbarhet av tips opptak. Prep dyr å tillate fri tilgang til sensilla fra vinkelen på elektroden oppføring.
  3. Kalde Anesthetize voksne insekter i fryser ved -20 ° C. Unngå skader på perifere nerveceller ved overeksponering for kalde temperaturer. Skjær smale strimler av cellofan tape med barberblad på glass lysbilde. Immobilisere hele insekt på et glass lysbilde ved hjelp av smale strimler.
  4. Sett en kjemisk skjerpet wolfram ledning inn i rygg thorax eller øye å tjene som likegyldig (jord) elektrode.
  5. Fyll glasselektrode laget i trinn 3.1 med et stimulerende løsning av interesse. Ved hjelp av en innsatt sprøyte, fyll capIllary fra trakk slutt å butte enden. Flick ut alle luftbobler, holder trukket enden ned. Sett en sølvtråd (chloriding valgfritt) inn i glasselektrode laget i trinn 3.1 til å tjene som opptak og stimulerende elektrode.
  6. Koble elektrodene til en forforsterker som er designet for opptak fra kontakt chemoreceptive sensilla i insekter. Dette forforsterker (300 Hz-3 kHz båndpassfilter) vil redusere innsovningstid å fange neuronal aktivitet så nært på stimuli innføring som mulig. Samle inn, lagre og analysere elektriske signaler ved hjelp av en mikrodatamaskin utstyrt med pigg innspillingen programvare.
    MERK: Jording opptaket oppsettet riktig kan drastisk forbedre signal-til-støy-forhold.
  7. Stimulere sensilla med en kontrolløsning (elektrolytt) for å sikre funksjonalitet. Telle pigger start 200 msek følgende stimulans gjenstand for alle forberedelser.
  8. Random rekkefølgen av testkjemikalier for alle eksperimenter, med unntak av dose-responsundersøkelser,å eliminere bias. For dose-responsundersøkelser, eksponere sensilla til økende konsentrasjoner av forsøks kjemisk. Tillate minimum 3 min mellom stimulering for å sikre tilstrekkelig restitusjon.
    MERK: Dette kravet kan variere avhengig av insekt og sensilla. Terskelen er definert som den konsentrasjon som standard feil ikke overlapper med standardfeilen for den laveste konsentrasjonen testet.

4. RNA Isolation og Sekvensering (figur 2)

  1. Forberede de tettsittende RNase-fritt pestles ved å kjøle dem på tørris før vev disruption.Prepare medfølgende RNase-fritt pistiller som passer snap cap rør tett. Hold samling rør lukket med mindre aktivt dissekere å unngå for mye kondens.
  2. Ved hjelp av filtrert aspirator, plasserer 30 til 40 kald bedøvet mygg (15 sek i -20 ° C fryser) på kald scenen og sortere etter kjønn. Plasser dyr ryggsiden ned, fatte vinger for å ikke skade smaks vedheng.
  3. Ved hjelp av to par fine tang, dissekere parvise Labella eller tarsi fra menn eller kvinner under et disseksjonsmikroskop og begrense inkludering av tilstøtende vev.
    MERK: 500 paret Labella gir ca 800-1000 nanogram total mRNA. 400 individuelle tarsi (5 segmenter hver) vike 1,200-1,800 nanogram total mRNA.
  4. Med ett par gisper-tang, lett forstå mygg snabel bare proksimale til Labella utsette indre stylets. Bruke annen par innsamlings-tang, fjerne Labella og legge vev til side av kald samling rør.
  5. Med en pinsett, lett forstå mygg etappe ved krysset mellom tibia og først tarsal segment. Bruke annen pinsett, fjerner tarsi og legge vev til side av kald samling rør.
    MERK: Ta hensyn til de celletyper i grenselandet mellom ønsket og uønsket vev. Mens det er viktig å begrense inkludering av nabo vev, er det like viktig å ikke utelate deler av ønsket vev. Den final prøven må nøyaktig representere hele organet av interesse. Lag en presis grense med gripetang slik at innsamlings tang kan nettopp frigjøre ved skraping eller gripe bare ønsket vev.
  6. Med jevne mellomrom, spinne ned samling rør kort i 0 ° C sentrifuger ved 9000 xg å holde vev nederst på tube. Hvis fuktighet samler seg i innsamlings rør under disseksjon, legge 50uL av kald Trizol reagent å dekke innsamlet vev.
  7. Ved hjelp av anti-smudge lab markør, tydelig merke en RNase-free 1,5 ml snap cap tube for hver vevstype for samlingen. Ved hjelp av 1,5 ml tube rack og flytende nitrogen, fryse deretter slipe vev til fint pulver (fine stykker hvis i Trizol). Gjenta en gang. Bring totalt volum på Trizol til 1 ml og resuspender grunnvevet ved virvling.
  8. Tilsett 200 ul av kloroform og bland godt. Etter 5 minutter ved romtemperatur, spinne ned i sentrifuge ved 4 ° C og 11.000 x g i 15 min. Nøyelegge vandige laget direkte til et genomisk DNA filterkolonne. Spinne ned ved 11000 x g i 5 min. Legg likt volum av RNase-fri 70% etanol for å gjennomstrømning og bland ved pipette. Overfør væsken til en RNA samling kolonne og fortsette RNA ekstraksjon per instruksjonene.
  9. Kvantifisere og vurdere renhet av total RNA på en presisjon spektrofotometer og fortsetter med en standard RNA sekvenseringsmetode.

5. Kvantitativ RT-PCR Validering av RNA sekvensering (figur 3)

  1. Velg så mange gener som mulig å sammenligne relative genuttrykk nivåer over et dynamisk område, både i spådd sekvens overflod og antatt chemosensory gen-funksjon.
  2. Design primerpar for hver målgenet for å amplifisere en spesifikk 100-180 basepar PCR-produkt. Utelukke uspesifikk gDNA forsterkning ved å sikre minst en primer per sett spenner over et intron grense. Alternativt kan du bruke DNase behandling for å redusere genomisk forurensning.
  3. Samleinsekt vev som beskrevet i forrige avsnitt. Beregne hvor mye vev er nødvendig for å gi nok RNA å fullføre alle QRT-PCR reaksjoner.
    MERK: Biologisk tre eksemplarer og tekniske tredoble reaksjoner vil gi maksimal tillit til resultatene.
  4. Beregne relativ genet kvantifisering som X mål - (Ct [mål] -Ct [referanse]) for hvert mål gen og gjennomsnitt for hver replikere, både biologisk og teknisk. Bruke husholdningsgenet (e) å normal Ct verdier mellom biologiske replikater og å heie på Y-aksen skala i sammenligninger av relativ uttrykk.
  5. Vurdere likheten av RNA-seq og QRT-PCR datasett ved hjelp av regresjon-basert, bootstrap ekvivalens prosedyre 9, iterativt brukt, til dataene fra hver vev.
    MERK: Denne prosedyren identifiserer den minste "region av likhet" som kan bygges rundt den observerte RNA-seq og QRT-PCR data, og la den relative genuttrykk målt ved qRT-PCR for å bli betraktet som statistisk ekvivalent med måling av relativ genekspresjon av RNA-seq.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Spor opptak av aksjonspotensialer fra Ae. aegypti smaks- sensilla (figur 1) viser effektiviteten av direkte stimulering med en rekke kjemikalier. Denne teknikken kan brukes til å kvantifisere reaksjoner på en hvilken som helst kjemisk stimulering ved telling av toppene av en gitt amplitude og varighet i løpet av et rimelig tidsrom (vanligvis mindre enn 500 ms). Spor opptak må være lett reproduserbar under et gitt sett av eksperimentelle betingelser. Ellers kan de observerte fysiologiske responser representerer uvanlig fenotyper blant individer av forsøksarten.

Raw RNA-seq data krever filtrering og nøyaktig kartlegging før de blir presentert som avrundet RPKM (antall kartlagt leser per kilobase lengde på karakterutskriften per million leser kartlagt) eller FPKM (antall lese fragmenter per kilobase lengde på karakterutskrift per million leser kartlagt) numeriske verdier (figur 2). Skillet mellomdisse to RNA-seq normaliseringsfremgangsmåter er blitt beskrevet i to bryt verk 10,11. En fordel med total mRNA sekvensering er evnen til å påvise ekspresjon av store genfamilier samtidig. Den visuelle presentasjon av ekspresjonen av mange gener på en gang gir mulighet for en unik forståelse av den molekylære verktøysett for et gitt vev. Sammenligninger mellom kjønnene, utviklingsstadier eller vevstyper kan gjøres raskt.

Biologiske replikater for RNA-seq datasett kan være begrenset av kostnader eller vanskeligheter av vev samling. QRT-PCR gir mulighet til å validere små undergrupper av total genuttrykk med lavere kostnader og krever mindre kilde RNA. Side ved side data sammenligninger (figur 3A) åpner for større tillit til RNA-seq resultater, som de to metodene er avhengige av ulike kjemikalier for genet mengdemåling. Statistiske likeverdighet funksjoner (Figur 3B) viser grensene for sikkerhet i hvert enkelt tilfelle.

Figur 1
Figur 1: Elektro opptak fra en mellomstor sensillum på labellum av Ae. aegypti hunner, modifisert fra sitert arbeid 12. Spor viser svarene til 100 mM NaCl, 100 mM sukrose, 1 mM kinin, 0,8% DEET, 0,8% Picaridin, 0,8% citronellal og 0,8% IR3535. De tre toppene med ulike amplituder eller figurer er merket a, b eller c. Disse tre pigger korresponderer med tre sensorisk neuron undertyper med forskjellige følsomheter: salt, sukker og bitter, respektivt.

Figur 2
Figur 2:. Fortegn gustatory reseptor genuttrykk som bestemmes av RNA-seq for 8 vevsprøver, endret fra sitert arbeid 13 Individuelle celler rapportere RPKM verdier forhver gustatory genet merknader, mannlige vev (til venstre) og kvinnelige vev (til høyre). Numeriske verdier er avrundet til nærmeste tidel. Heat-kart fargeintensitet er avkortet til høyeste RPKM og midtpunktet er skalert for hvert gen familie individuelt. Det er bare én genfamilien vist i denne saken. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figur 3
Fig. 3: Sammenligning av QRT-PCR-data og RNA-seq data, modifisert fra nevnte arbeids 13 (A) Hver chemoreception gen for den horisontale akse er representert av to datakolonnene. Den venstre kolonne representerer relative uttrykk som bestemmes av RNA-seq; RPKM verdier av chemoreception genene ble delt ved at av husholdningsgenet Aaeg LAsP å generere numeriske proporsjoner i dette vevet. Rettenkolonne representerer relative uttrykk som bestemt ved QRT-PCR. Først ble biologisk replikere Ct verdier for Labella gener normalisert ved hjelp Aaeg LAsP som en standard. Sekund, replikere Ct-verdier for hvert gen ble brukt til å beregne relative uttrykk verdier (E target - (Ct [mål] -Ct [referanse])). Feil Linjene indikerer standardavvik på individuelt beregnede relative uttrykk verdier. (B) RNA-seq og QRT-PCR datasett ble sammenlignet i en egen analyse. De vertikale aksene representerer relativ genet overflod som demonstrert av RNA-seq data, med en verdi på 1 blir tilskrevet husholdningsgenet Aaeg LAsP og alle andre genuttrykk blir rapportert i forhold til denne verdien. De horisontale aksen representerer relative genet overflod som spådd av QRT-PCR, med en verdi på 1 blir tilskrevet husholdningsgenet Aaeg LAsP og alle andre genuttrykk blir rapportert i forhold til denne verdien. Røde linjer representerer eksakt ekvivalens. Stiplede linjer representerer grensene av 'regionen av likhet "for helling, beregnet av den statistiske ekvivalens algoritmen 9. Heltrukne sorte strekene representerer minste kvadraters regresjon av QRT-PCR likeverdighet til RNA-seq kvantifisering for de 12 mål gener og Aaeg LAsP husholdningsgenet, hver representert ved sirkel datapunkt. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Den mest utfordrende delen av opptaket aksjonspotensialer fra gustatory sensilla er å avgjøre hvilke reaksjoner er "normal". Når ansette enkelt gustatory sensillum tips opptak første gang for en gitt insektarter, totalt antall og sensitiviteter av smaks reseptor nevroner (GRNs) er sannsynlig ukjent. Mange foreløpige opptak blir først nødvendig for å bestemme omfanget og konsentrasjoner av kjemikalier for å teste. I dette tilfellet starter vi med den observasjon at en enkelt grn svarte til lave konsentrasjoner av DEET (figur 1). Deretter undersøkte vi responser i samme sensillum til et område av konsentrasjoner av kjemikalier som er kjent for å være bitter eller motvilje til andre insekter og observert en lignende spiss form og amplitude (figur 1). Disse observasjoner antydet at en enkelt grn subtype reagerer på disse aversjons forbindelser. Til sammenligning, vi testet sukkerholdige forbindelser kjent for å stimulere fôring i mosquitoes for å se om en tilsvarende pigg inntraff. Vi observerte en annen, større topp i dette tilfellet. Tilsvarende observerte vi en tredje, mellomstore pigg som svar på salt stimulering, og det totale GRN subtype teller til tre.

Elektrofysiologiske opptak preparater i insekter er iboende variabel. Target gustatory sensilla er vanligvis svært små og må plasseres på riktig vinkel for å få tilgang til opptaket elektrode uten å berøre glass til hårstråene. For å etablere en ledende bro til smaks neuroner, må panel pore av sensillum være åpen for det oppbevarte lymfe til å etablere direkte kontakt med opptakselektrodens elektrolytt. Vi har observert blokkering av sensilla åpninger enten ved utenlandske rusk eller utskilt og tørket materiale fra innenfor målet sensillum. For å unngå disse hindringer, må det utvises forsiktighet når stell og håndtering av insekter for å unngå kontakt med målet sensilla. I tillegg til Choosynge uskadde, sunne test insekter, biologiske faktorer som alder, fôring stat, parring stat og zeitgeber tid bør vurderes ved etablering av kontroller for å redusere variasjon i opptakene.

Det kan være vanskelig å oppnå et preparat som reagerer konsekvent. Mange forsøk kan være nødvendig for å forbedre signal-til-støy-forholdet nok til å løse de enkelte pigger. Eksperimentelle variasjoner av de ovennevnte preparater kan føre til bedre resultater. Det anbefales å etablere et robust svar på opptaket ditt apparat for testarter ved hjelp av et vanlig insekt pigg elicitor, som sukrose eller kinin. Når en gustatory sensillum svarer, bør disse svarene være reproduserbar. Den minste tiden mellom stimuleringer bør bestemmes eksperimentelt undersøke pigg dynamikk under forskjellige timelige begrensninger. Dreven stimulering bør unngås for å bevare grn helse, og for å hindre sensillum lymfe degradering. I tilfelle that respons følsomheten avtar raskt etter første stimulering, må skaffes et større antall preps for å gi visshet om at disse responsene er fysiologisk typisk for de gitte arter.

Løseligheten av noen testkjemikalier kan skape problemer med å gjøre stimulerende elektroder, som noen oppløsningsmidler kan påvirke grn aktivitet, selv ved lave sluttkonsentrasjoner. Disse hensynene kan ivaretas gjennom prøving og feiling og med hensiktsmessige kontroller. Alle anvendte løsningsmiddel skal tilsettes til styreelektrolytt og andre testløsninger for å sikre konsistens av svar. Immobiliserende små insekter, og dermed gi direkte tilgang til å målrette sensilla uten å skade skjøre vev, kan kreve prøving og feiling.

Den største begrensningen av elektrofysiologi er det uheldig separasjon av observerte nevrale responser og potensielle nedstrøms atferdsmessige reaksjoner. Derfor er det fordelaktig å teste responser til kjemikalier som har been vist seg å lokke fram konkrete atferdsmessige reaksjoner for å diskutere betydningen av resultatene i en økologisk sammenheng. Tips innspillinger tillate for svært nøyaktig deteksjon av cellulær aktivitet, noe som gjør denne teknikken ideell for å vurdere transgene dyr eller som har fenotypiske forskjeller i atferd. Disse opptakene har også mer informasjon om nevrale responser, som for eksempel timelige og amplitude dynamikk, enn systemer som baserer seg på visuelle journalister av neuronal aktivitet. I noen tilfeller kan nevrale responser kvantifiseres lettere enn atferdsdata 12.

Vev samling for RNA-seq og QRT-PCR er grei, men krever kontinuerlig konsentrasjon og oppmerksomhet til å bevare cellemateriale gjennom kjølelager og unngåelse av fuktighet. RNase aktivitet kan påvirke RNA kvalitet; derfor vev må bare ta kontakt med rene flater i hele samlingen og RNA ekstraksjon. Selv om feilsøking kreves for QRT-PCR is godt dokumentert, den mest sannsynlige fallgruver oppstå tidlig i prosessen når man utformer primere og velge målet og husholdningsgener. Gener som forutsigbart representerer jevnt adskilte punkter langs en ​​linje av relative ekspresjonsnivået er nyttig for å sammenligne RNA-seq og QRT-PCR-datasett (figur 3). For eksempel, ved å velge gener for qPCR som viser RPKM verdier av 0, 10, 20, 30, etc., respektivt, har en forutsigbar orden overflod som skal testes.

RNA-seq var vellykket på å fremheve ydmyk uttrykke gener i vår undersøkelse av smaks vev (figur 2). Den pålitelige genet bygge for Ae. aegypti (AaegL1.3, http://aaegypti.vectorbase.org/GetData/Downloads/) og før chemoreception genet identifikasjon 14 laget ledelsen genuttrykk relativt enkelt. For disse formålene, insekter med tilgjengelige genet merknader og identifiserte genfamilier av interesse er verdifulle modellsystemer. Bestemme en nøyaktig terskelfor genuttrykk vs. bakgrunnsstøy er spekulativt, men metoder for å bestemme rimelige tidsavgrensninger er tilgjengelig 15-17. Her har vi bestemt en RPKM nivå av tillit og et lavere RPKM nivå av redusert tillit basert på presedens 9 der vi innrammet vår diskusjon av resultater.

I fremtiden håper vi å dissekere andre chemosensory vev i både mygg og andre økonomisk viktige insekter for å utvide vår kunnskap om genene medierende insektavvisende. Vi har etablert flere kandidat smaks gener som er mest sannsynlig medierende svar på aversjons forbindelser ved å sammenligne gensekvenser til arter med tilgjengelige funksjonelle data 13. Vi genererer transgene linjer av mygg mangler disse individuelle chemosensory gener. Vi vil bruke tippe opptak for å vurdere hvilken rolle disse genene på dyrets evne til å oppdage kjente insektmidler og vurdere atferdsmessige reaksjoner på disse mutantene til Repellents. I det tilfellet at disse kandidatgener ikke i vesentlig grad påvirker fordrivende, kan mer oppløsning være nødvendig å mer nøyaktig bestemme genekspresjon eller protein til stede i en enkelt sensillum eller celle. Ydmyk uttrykt reseptorer kan være viktige mål for screening nye midler, sammen med overalt uttrykt co-reseptorer. Dessverre, in situ hybridisering og immunolocalization har vist seg utrolig vanskelig i insekt gustatory vev 18.

Når vi har etablert hvilke gener megle disse fysiologiske responser og atferd, kan vi uttrykke disse gener i cellesystemer som kan påvirkes med high-throughput screening av kandidat repellents. I silikofluorid tilnærminger som benytter strukturell modellering 7 kan også være nyttig for å forutsi hvilke typer forbindelser vil utløse sterke responser fra spesifikke reseptorer.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Glass capillary A-M Systems 628000 Standard, 1.5 mm X 0.86 mm, 4"
Silver wire A-M Systems 7875 .015" bare
Tungsten wire Alfa Products 369 0.127 mm diameter
Fine forceps Fine Science Tools 11252 #5SF Inox
Refridgerated stage BioQuip Products 1429 Chill Table
Preamplifier Syntech Taste Probe preamplifier
Software for electrophysiology Syntech Autospike software for electrophysiology
TetraMin fish food Tetra Tropical fish food granules fish food ground to fine powder
TRIzol Life Technologies 15596-026 RNA isolation reagent
RNeasy Plus Mini Kit Qiagen 74136 includes gDNA eliminator and RNeasy spin columns
Nanodrop spectrophotometer Nano Drop Products ND-1000 tabletop spectrometer
R statistics freeware (created by Robert Gentleman and Ross Ihaka) www.r-project.org Use the lm function of the stats package and the equiv.boot function of the equivalence package in the R computing environment.
1.5 ml tube rack Evergreen 240-6388-030 Pour liquid nitrogen into a few empty wells to freeze and grind tissue.
1.5 ml collection tubes with pestle Grainger 6HAX6 RNase free
Centrifuge Thermo Scientific 11178160 Spin down frozen tissue to keep at bottom of 1.5 ml tube.
Primer-BLAST Primer Designing tool NCBI n/a

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Klun, J. A., Khrimian, A., Debboun, M. Repellent and deterrent effects of SS220, picaridin, and DEET suppress human blood feeding by Aedes aegypti, Anopheles stephensi, and Phlebotomus papatasi. J. Med. Entomol. 43, (1), 34-39 (2006).
  2. Dickens, J. C., Bohbot, J. D. Mini review: Mode of action of mosquito repellents.Pestic. Biochem. Physiol. 106, (3), 149-155 (2013).
  3. Pitts, R. J., Rinker, D. C., Jones, P. L., Rokas, A., Zwiebel, L. J. Transcriptome profiling of chemosensory appendages in the malaria vector Anopheles gambiae reveals tissue- and sex-specific signatures of odor coding. BMC Genomics. 12, (271), (2011).
  4. Zhou, X., Slone, J. D., Rokas, A., Berger, S. L., Liebig,, et al. Phylogenetic and transcriptomic analysis of chemosensory receptors in a pair of divergent ant species reveals sex-specific signatures of odor coding. PLOS Genet. 8, (8), e1002930 (2012).
  5. Shiao, M., Fan, W., Fang, S., Lu, M. J., Kondo, R., Li, W. Transcriptional profiling of adult Drosophila antenna by high-throughput sequencing. Zoological Studies. 52, (42), (2013).
  6. Bohbot, J., Pitts, R. J., Kwon, H. W., Rützler, M., Robertson, H. M., Zwiebel, L. J. Molecular characterization of the Aedes aegypti odorant receptor gene family. Insect Mol. Biol. 16, (5), 525-537 (2007).
  7. Kain, P., Boyle, S. M., Tharadra, S. K., Guda, T., Pham, C., et al. Odour receptors and neurons for DEET and new insect repellents. Nature. 502, (7472), 507-512 (2013).
  8. Hodgson, E. S., Lettvin, J. Y., Roeder, K. D. The physiology of a primary chemoreceptor unit. Science. 122, (3166), 417-418 (1955).
  9. Robinson, A. P., Duursma, R. A., Marshall, J. D. A regression-based equivalence test for model validation: shifting the burden of proof. Tree Physiol. 25, (7), 903-913 (2005).
  10. Mortazavi, A., Williams, B. A., McCue, K., Schaeffer, L., Wold, B. Mapping and quantifying mammalian transcriptomes by RNA-seq. Nat. Methods. 5, (7), 621-628 (2008).
  11. Trapnell, C., Williams, B. A., Pertea, G., Mortazavi, A., Kwan, G., et al. Transcript assembly and quantification by RNA-seq reveals unannotated transcripts and isoform switching during cell differentiation. Nat. Biotechnol. 28, (5), 511-515 (2010).
  12. Sanford, J. L., Shields, V. D. C., Dickens, J. C. Gustatory receptor neuron responds to DEET and other insect repellents in the yellow-fever mosquito, Aedes aegypti. Naturwiss. 100, (3), 269-273 (2013).
  13. Sparks, J. T., Vinyard, B. T., Dickens, J. C. Gustatory receptor expression in the labella and tarsi of Aedes aegypti. Insect Biochem. Mol. Biol. 43, (12), 1161-1171 (2013).
  14. Kent, L. B., Walden, K. K. O., Robertson, H. M. The Gr family of candidate gustatory and olfactory receptors in the yellow-fever mosquito Aedes aegypti. Chem. Senses. 33, (1), 79-93 (2008).
  15. Ramsköld, D., Wang, E. T., Burge, C. B., Sandberg, R. An abundance of ubiquitously expressed genes revealed by tissue transcriptome sequence data. PLoS Comput. Biol. 5, (12), e1000598 (2009).
  16. Wagner, G. P., Kin, K., Lynch, V. J. A model based criterion for gene expression calls using RNA-seq data. Theory Biosci. 132, (3), 159-164 (2013).
  17. Hart, T., Komori, H. K., LaMere, S., Podshivalova, K., Salomon, D. D. Finding active genes in deep RNA-seq gene expression studies. BMC Genomics. 14, (778), (2013).
  18. Isono, K., Morita, H. Molecular and cellular designs of insect taste receptor system. Front. Cellu. Neurosci. 4, (20), 1-16 (2010).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics