प्रायोगिक ग्रीवा रीढ़ की हड्डी की चोट में तंत्रिका अग्रदूत साबित कोशिकाओं और स्वयं कोडांतरण पेप्टाइड्स के synergetic का प्रयोग करें

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Zweckberger, K., Liu, Y., Wang, J., Forgione, N., Fehlings, M. G. Synergetic Use of Neural Precursor Cells and Self-assembling Peptides in Experimental Cervical Spinal Cord Injury. J. Vis. Exp. (96), e52105, doi:10.3791/52105 (2015).

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Abstract

रीढ़ की हड्डी की चोट (एससीआई) के रोगियों और उनके परिवारों के लिए गंभीर स्नायविक हानि और, मनोवैज्ञानिक, आर्थिक और सामाजिक परिणामों का कारण। चिकित्सकीय, एससीआई के 50% से अधिक सर्वाइकल स्पाइन एक प्रभावित करते हैं। प्राथमिक चोट का एक परिणाम के रूप में, सूजन, apoptosis, और demyelination सहित माध्यमिक तंत्र की एक झरना अंत में intramedullary cavities के 2,3 के ऊतक scarring और विकास के लिए अग्रणी होते हैं। दोनों सेल प्रत्यारोपण, एकीकरण, और उत्थान के लिए भौतिक और रासायनिक बाधाओं का प्रतिनिधित्व करते हैं। इसलिए, निरोधात्मक वातावरण को आकार देने और कोशिका प्रत्यारोपण और उत्थान के लिए एक सहायक वातावरण बनाने के लिए cavities को पाटने एक होनहार चिकित्सकीय लक्ष्य 4 है। इधर, एक धमनीविस्फार क्लिप का उपयोग कर ग्रीवा एससीआई के एक contusion / संपीड़न मॉडल में वर्णित है। पूरा transection या हड्डी के ruptures दुर्लभ हैं के बाद से इस मॉडल, अधिक नैदानिक ​​प्रासंगिक अन्य प्रयोगात्मक मॉडल की तुलना में है। इसके अलावा compariso मेंविशेष रूप से नुकसान में पीठ कॉलम, रीढ़ की हड्डी के परिधीय संपीड़न लाभप्रद दिखाई देता है, जो वजन छोड़ मॉडल, n करने के लिए। क्लिप समापन बल और अवधि विभिन्न चोट की गंभीरता को प्राप्त करने के लिए समायोजित किया जा सकता है। एक अंगूठी वसंत सटीक अंशांकन और क्लिप बल की भक्ति की सुविधा। शारीरिक शर्तों के तहत, सिंथेटिक स्वयं कोडांतरण पेप्टाइड (एसएपी) nanofibers में स्वयं को इकट्ठा और इस प्रकार, एससीआई 5 में आवेदन के लिए अपील कर रहे हैं। वे कॉर्ड को होने वाले नुकसान को कम करने के घाव में सीधे इंजेक्ट किया जा सकता है। SAPS intramedullary cavities को पाटने और इस प्रकार, पुनर्योजी उपचार के लिए क्षतिग्रस्त कॉर्ड लैस करने के लिए scaffolds के खड़ी होने biocompatible संरचनाओं हैं। K2 (QL) (QL6) अन्य पेप्टाइड्स की तुलना में दांग एट एक एल। 6 द्वारा शुरू की गई एक उपन्यास एसएपी है, QL6, 6 .14 दिनों एससीआई के बाद तटस्थ पीएच पर β-शीट में 6K2 स्वयं assembles तीव्र चरण, SAPS के बाद घाव और तंत्रिका अग्रदूत कोशिकाओं (एनपीसी) के केंद्र में इंजेक्ट कर रहे हैं inje हैंआसन्न पृष्ठीय स्तंभों में cted। सेल अस्तित्व का समर्थन करने के लिए, प्रत्यारोपण के 7 दिनों के लिए आसमाटिक सूक्ष्म पंपों से वृद्धि कारकों के निरंतर अवदृढ़तानिकी प्रशासन के साथ संयुक्त है।

Introduction

रीढ़ की हड्डी की चोट के 50% से अधिक ग्रीवा रीढ़ से संबंधित हैं। नैदानिक ​​में दो प्रमुख pathophysiological तंत्र में वर्णित हैं की स्थापना: बाद में प्रारंभिक रीढ़ की हड्डी के कुचलन और, अस्थि भंग, हेमोरेज या ऊतक सूजन की वजह से चल रही संपीड़न।

धमनीविस्फार क्लिप कुचलन / संपीड़न मॉडल mimics दोनों pathophysiological तंत्र: क्लिप तड़क एक contusion पैदा करता है और कतरन की अवधि के अस्थि भंग, हेमोरेज या ऊतक की वजह से नैदानिक ​​सेटिंग में संपीड़न पिछले महत्वपूर्ण लंबे समय तक सूजन है कि मानने, संपीड़न घटक का प्रतिनिधित्व करता है। इस्तेमाल किया धमनीविस्फार क्लिप सटीक और प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य कतरन बल गारंटी एक अंगूठी वसंत द्वारा संशोधित किया गया है। खासकर हेमी-transection या कुचलन मॉडल, इस धमनीविस्फार क्लिप मॉडल mimics सबसे अच्छा नैदानिक ​​सेटिंग की तुलना में। वक्ष चोटों के साथ रोगियों ग्रीवा inj के साथ अंगों का पक्षाघात, अधिकांश रोगियों से पीड़ित हैं जबकिuries tetraplegic और पूरी तरह से निर्भर हैं। ग्रीवा की हड्डी की शारीरिक संरचना, हालांकि, वक्ष या काठ का रीढ़ की तुलना में काफी अंतर पता चलता है, और इस प्रकार, इस प्रोटोकॉल में विशेष रूप से संबोधित किया है।

intramedullary cavities और ऊतक scarring के विकास वसूली और उत्थान के लिए बाधाएं हैं। इन बाधाओं पाड़ सामग्री के उपयोग पर काबू पाने के लिए एक आशाजनक दृष्टिकोण है। स्वयं कोडांतरण पेप्टाइड्स घाव के उपरिकेंद्र में सीधे इंजेक्ट किया जा सकता है। वहाँ वे गुहा ब्रिजिंग नैनो फाइबर scaffolds के रूप में इकट्ठा करने और सूजन और ऊतकों को डरा कम करने से निरोधात्मक वातावरण में सुधार होगा। कठोर सामग्री आरोपण के दौरान रीढ़ की हड्डी का काफी नुकसान का कारण है, जबकि तरल पदार्थ पेप्टाइड्स सुरक्षित और गंभीर अतिरिक्त क्षति के बिना इंजेक्शन जा सकता है।

स्टेम कोशिका प्रत्यारोपण से पहले स्वयं कोडांतरण पेप्टाइड्स के साथ निरोधात्मक पर्यावरण में सुधार लाने, इसलिए, सेल समर्थन मैंntegration, गर्भाशय ग्रीवा रीढ़ की हड्डी में चोट के बाद भेदभाव और अंत में, कार्यात्मक वसूली,।

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Protocol

नोट: निम्न प्रयोगात्मक प्रोटोकॉल विश्वविद्यालय स्वास्थ्य नेटवर्क (टोरंटो, कनाडा) के जानवरों की देखभाल समिति ने मंजूरी दे दी और देखभाल और जानवरों की देखभाल की कनाडा परिषद द्वारा तैयार की प्रायोगिक पशुओं के उपयोग के लिए गाइड में स्थापित नीतियों के अनुसार किया गया है ।

1. सरवाइकल एन्यूरिज्म क्लिप contusion / संपीड़न मॉडल

  1. सर्जरी आटोक्लेव यंत्र और एक 70% शराब स्नान में यंत्र लगाने के द्वारा पूरे surgcial प्रक्रिया के दौरान बाँझ शर्तों रखने से पहले।
  2. (1: 1) ऑक्सीजन का एक संयोजन (ओ 2), नाइट्रस ऑक्साइड (एन ओ 2) के साथ Wistar चूहों (250-270 ग्राम) चतनाशून्य, और 1.8-2.2% isoflurane और एक गैस संज्ञाहरण मुखौटा के माध्यम से सहज साँस लेने समर्थन करते हैं। संज्ञाहरण के शामिल करने के लिए एक मिनट के लिए 5% isoflurane के साथ शुरू करते हैं और बाद में कम। एक दर्दनाक प्रोत्साहन (जैसे। पंजे पर) देकर सर्जरी, संज्ञाहरण के नियंत्रण गहराई शुरू करने से पहले। फैटी मलहम लागू करेंआंखों में सूखापन से बचने के लिए और बाद में संक्रमण को रोकने के लिए।
  3. एक हीटिंग तकिया (37 डिग्री सेल्सियस) पर चूहों रखो और एक stereotactic फ्रेम में सिर तय कर लो।
  4. ग्रीवा रीढ़ के आसपास शल्य चिकित्सा क्षेत्र दाढ़ी और povidone आयोडीन और 70% शराब के साथ कीटाणुरहित।
  5. वक्ष कशेरुका शरीर 2 (टी 2) के प्रमुख processus तक पहुँचने की ग्रीवा बांस (सी 2) से रीढ़ की हड्डी के ऊपर एक midline चीरा बनाओ।
  6. सीधे midline पर वर्टिब्रल मांसपेशियों की बाहरी परत के माध्यम से कट एक cranio-दुम दिशा में (खून बह रहा से बचने के लिए) और आगे आप processus spinosus और laminae तक दो टूक गहरी मांसपेशी परतों काटना। Retractors डालें।
  7. Laminectomy के लिए लक्षित स्तर को निरीक्षण करने के लिए बांस शरीर टी 2 के प्रमुख processus spinosus मालूम। पहचान और चयनित laminae के सूक्ष्म शल्य चिकित्सा की तैयारी के बाद, laminae और processus spinosus ढीला करने के लिए ligamenti flavae माध्यम से काटा। अंत में, गरीढ़ की हड्डी के लिए एक हड्डी क्लिपर पार्श्व साथ laminae के माध्यम से केन्द्र शासित प्रदेशों और रीढ़ की हड्डी के ही किसी भी संपीड़न से परहेज है, धीरे उन को हटा दें।
    नोट: अधिकांश आम स्तरों सी 5/6, सी 6/7, या सी 7 / T1 के हैं। PeriOperative मृत्यु दर में चोट के स्तर पर व्याख्यान चबूतरे वाला और अधिक बढ़ जाती है। Paravertebral शिरापरक साइनस से रक्त स्राव सामान्य है और स्पंज के साथ सावधान संपीड़न ने संबोधित किया जा सकता है।
  8. कॉर्ड घाव क्लिप डालने से पहले, (विशेष रूप से स्तर सी 5/6 पर) कतरन से उन्हें क्षमा करने के लिए तंत्रिका जड़ों उभरते की पहचान।
  9. चिकनी क्लिप प्रेरण सुनिश्चित करने के लिए, एक हुक के साथ कशेरुका निकायों के पृष्ठीय पक्ष से उदर ड्यूरा ढीला और क्लिप के लिए एक गलियारा तैयार करते हैं।
  10. अंत में, खुले क्लिप डालने और यह एक contusion चोट प्राप्त करने के लिए बंद (रैपिड बंद करने) स्नैप करते हैं। क्लिप समापन बल और क्लिप बंद करने की अवधि को आघात की तीव्रता और संपीड़न की सीमा निर्धारित। आमतौर पर इस्तेमाल 15-35 ग्राम और एक clippi के बीच की क्लिप बलों रहे हैंउदाहरण के लिए एक मिनट का एनजी अवधि। (चित्र 1)।
  11. क्लिप को हटाने के बाद, दो परतों में मांसपेशियों अनुकूल है और घाव बंद कर दें।
  12. संज्ञाहरण बंद करो और यह sternal अवलंबन के लिए पर्याप्त होश आएगा जब तक अपने सतत निगरानी के तहत पशु जगा देना। अंत में, एक ही पिंजरे में चूहे डाला और पोस्ट ऑपरेटिव उपचार के दिशा निर्देशों का पालन करें।
  13. जानवरों चोट के इस प्रकार की गंभीरता के साथ संघर्ष के बाद से, आप पोस्ट ऑपरेटिव उपचार करने के लिए विशेष ध्यान देना चाहिए:
    1. (3 दिन और 5 दिन, क्रमशः और नैदानिक ​​लक्षण के अनुसार के लिए Buprenorphine और Meloxicam) दर्द निवारक प्रशासन।
    2. 3 दिनों के लिए अतिरिक्त खारा समाधान subcutaneously दे दो (2 बार एक दिन, 5-10 मिली लीटर (माले))।
    3. दो दिन पहले पीने के पानी में एंटीबायोटिक दवाओं को उपलब्ध कराने और 7 दिनों के बाद सर्जरी तक (जैसे Moxifloxacine)
    4. मूत्राशय समारोह की वसूली स्थिर है जब तक मूत्राशय 2-3 बार एक दिन निचोड़ly के स्पष्ट।
    5. एक दिन में कम से कम एक बार न्यूरोलॉजिकल घाटा और ऑपरेशन जानवरों की शारीरिक हालत को ध्यान से देखें।

2. (14 दिन चोट के बाद) SAPS और NPCs इंजेक्शन

  1. 1.1 में वर्णित के रूप में संज्ञाहरण प्रेरित। 1.3 करने के लिए, एक stereotactic फ्रेम में चूहे के सिर को ठीक टांके या घाव क्लिप हटाने, और घाव और povidone आयोडीन और 70% शराब के साथ शल्य चिकित्सा के क्षेत्र कीटाणुरहित।
  2. ध्यान से, retractors डालें, paravertebral मांसपेशियों काटना ड्यूरा से microscopically निशान ऊतक निकालने के लिए, और घाव साइट फिर से बेनकाब।
  3. 1% की एकाग्रता में SAPS तैयार करें (w / v) एक बाह्य मैट्रिक्स जेल प्रदर्शन करने के लिए। QL6 SAPS एक physiologically संगत पीएच है और इंजेक्शन के लिए पहले बफर होने की जरूरत नहीं है। रीढ़ की हड्डी में SAPS के दृश्य के लिए, QL6 (QL6-FITC) के एक फ्लोरोसेंट के derivate का उपयोग करें।
  4. दो भागों में, प्रत्येक में वितरित घाव के केंद्र में SAPS (5 माइक्रोलीटर (μl) इंजेक्षनMidline की 2.5 μl द्विपक्षीय। एक माइक्रो गिलास केशिका (100 माइक्रोमीटर (माइक्रोन) बाहरी व्यास (ओवर ड्राफ्ट)) के साथ स्टीरियोटैक्टिक फ्रेम से जुड़ा एक हैमिल्टन सिरिंज का प्रयोग करें। एक तेज सुई की नोक के साथ सावधानी से ड्यूरा खोलें, और आघात रीढ़ की हड्डी में कांच केशिका stereotactically 2 मिलीमीटर (मिमी) डालें।
  5. मात्रा का 1/3 इंजेक्शन लगाने के बाद, 1.5 मिमी गहराई तक सुई निकालने के लिए, और बाद में एक और 03/01 के लिए 1 मिमी। पूरी मात्रा के इंजेक्शन के बाद, और सिरिंज के हटाने से पहले, जेल के गठन को स्थिर करने के लिए 5 मिनट तक प्रतीक्षा करें।
  6. NPCs उत्पन्न करने के लिए, वयस्क DsRed चूहों (या, हरी YFP सकारात्मक चूहों) का उपयोग करें और अलग और paraventrical क्षेत्र 4,18,21 से उन्हें खेती।
  7. सेल निलंबन में 90% जीवित कोशिकाओं ~ की उपस्थिति का संकेत Trypan ब्लू धुंधला द्वारा NPCs की व्यवहार्यता का आकलन करें। मध्यम विकास (50 एक्स 103 जीवित कोशिकाओं / μl) में कोशिकाओं पतला और फिर सेल प्रत्यारोपण के लिए उन्हें इस्तेमाल करते हैं।
  8. चार 2 μl बनाओ (8 μl कुल VOlume, 2 मिमी व्याख्यान चबूतरे वाला और चोट साइट की दुम पर द्विपक्षीय 4 एक्स 10 5 NPCs) intraspinal इंजेक्शन युक्त। ड्यूरा के उद्घाटन के बाद, हैमिल्टन सूक्ष्म गिलास केशिका रीढ़ की हड्डी के पृष्ठीय सतह के नीचे 1.5 मिमी डालने और सेल निलंबन के 2 μl इंजेक्षन। के बारे में 0.5 μl / मिनट (न्यूनतम) पर एक इंजेक्शन दर चुनें।
  9. प्रत्येक इंजेक्शन की और रस्सी से बाहर केशिका के हटाने से पहले अंत में, नए सेल मात्रा समायोजित करने के लिए खींच कम से कम 1 मिनट की अनुमति के ऊतक के लिए प्रतीक्षा करें। (चित्र 2)

Subdural 3. आरोपण ग्रोथ फैक्टर अनुप्रयोग के लिए पंप

  1. सेल अस्तित्व का समर्थन वृद्धि कारकों के साथ मस्तिष्क रीढ़ की हड्डी द्रव (सीएसएफ) को समृद्ध करने के लिए, 0.5 μl / घंटा की एक कमजोर पड़ने की दर, 0.04 की एक कैथेटर व्यास के साथ, 7-14 दिनों के दौरान उप-durally वृद्धि कारकों गिराए सूक्ष्म आसमाटिक पंप का उपयोग सेमी आयुध डिपो, और 100 μl के एक जलाशय मात्रा।
  2. वरीय वृद्धि कारकों चुनें(जैसे, मस्तिष्क व्युत्पन्न वृद्धि कारक (BDGF), epidermal वृद्धि कारक (EGF), fibroblast वृद्धि कारक (FGF)), पंप 6-10 घंटा पूर्व आरोपण भरने, और 37 डिग्री सेल्सियस पर एक पानी के स्नान में पंप संतुलित करना।
  3. इसके तत्काल बाद एनपीसी इंजेक्शन के बाद, पंप स्थान के लिए एक चमड़े के नीचे अवकाश तैयार करते हैं। पसंदीदा स्थानों ही पंप की वजह से प्रमुख स्थानीय असुविधा से बचने thoraco- पेट क्षेत्र के पार्श्व flanks हैं।
  4. वृद्धि कारकों के सर्वोच्च एकाग्रता हासिल करने के लिए, कैथेटर के खुले टिप घाव साइट के करीब समाप्त हो जाती है कि सुनिश्चित करते हैं। इसलिए, आसन्न ऊपरी या निचले स्तर के एक छोड़ें-laminectomy प्रदर्शन करते हैं। एससीआई सी 7 / T1 है पर अगर उदाहरण के लिए, सी 5 के एक छोटे से laminectomy प्रदर्शन करते हैं।
  5. चमड़े के नीचे अवकाश में पंप रखो आवश्यक लंबाई को कैथेटर को छोटा, और किसी भी आंदोलन से जुड़े अव्यवस्था से बचने paravertebral मांसपेशियों पर कई टांके (6.0) के साथ सुरक्षित।
  6. तेज टिप के साथ (सी 5 में, उदाहरण के लिए) ड्यूरा खोलने के बादएक सुई का, अवदृढ़तानिकी अंतरिक्ष में कैथेटर शुरू करने और इसे किसी भी प्रतिरोध के बिना और रस्सी घायल हुए बिना एक दुम दिशा में सरकना करते हैं। उदाहरण के लिए सी 6 के छोड़ दिया लामिना कैथेटर के निर्धारण और स्थिरीकरण के रूप में अतिरिक्त बिंदु में कार्य करता है।
  7. कैथेटर को सुचारू रूप से चलता है और गुना नहीं करता है कि सुनिश्चित करें।
  8. टांके या क्लिप के साथ बंद परत से मांसपेशियों, और त्वचा। (चित्र तीन)
  9. संज्ञाहरण बंद करो और यह sternal अवलंबन के लिए पर्याप्त होश आएगा जब तक अपने सतत निगरानी के तहत पशु जगा देना। अंत में, एक ही पिंजरे में उन्हें वापस रख दिया और पोस्ट ऑपरेटिव उपचार के दिशा निर्देशों का पालन करें।
  10. भले ही जानवरों इस समय बिंदु पर आंशिक रूप से बरामद हो सकता है विशेष पश्चात उपचार, प्रदान करते हैं:
    1. (3 दिन और 5 दिन, क्रमशः और नैदानिक ​​लक्षण के अनुसार के लिए Buprenorthine और Meloxicam) दर्द निवारक प्रशासन।
    2. दो दिन पहले तक पानी की बोतलों में एंटीबायोटिक दवाओं प्रदान करें7 दिनों के बाद सर्जरी (जैसे Moxifloxacine)।
    3. आवश्यक अब भी अगर, मूत्राशय फैलाएंगे जारी रखें।
    4. चूहों निर्जलित दिखाई देते हैं, तो अतिरिक्त चमड़े के नीचे तरल पदार्थ दे।
    5. एक दिन में कम से कम एक बार संचालित पशुओं के मस्तिष्क संबंधी समारोह और शारीरिक हालत को देख रखें।
    6. दो दिन पहले एनपीसी इंजेक्शन प्रतिरक्षादमन उपचार प्रशासन और 7 दिनों के बाद transplanation (माइनोसाइक्लिन) और बलिदान तक (sandimmune), जब तक क्रमशः।

4. ऊतक आकलन

  1. अवलोकन के समय के अंत (उदाहरण के लिए। एससीआई के बाद चार सप्ताह) गहरी संज्ञाहरण (5% Isoflurane 2-3 मिनट के लिए) में कम से जानवरों के बलिदान और चार ठंड 150 मिलीलीटर द्वारा पीछा 50 मिलीलीटर ठंड (4 डिग्री सेल्सियस) खारा साथ transcardially उन्हें छिड़कना 0.1 एम फॉस्फेट बफर खारा (पीबीएस) में% paraformaldehyde के।
  2. रीढ़ की हड्डी निकालें और 24 घंटे के लिए 0.1 एम फॉस्फेट बफर खारा (पीबीएस) में 4% paraformaldehyde में डाल दिया।
  3. <30 माइक्रोन की मोटाई के साथ अनुदैर्ध्य cryosections प्रदान करें।
  4. एक पृष्ठभूमि का उपयोग DAPI (: 1,000 1) उपलब्ध कराने के सभी सेल नाभिक के immunohistochemical धुंधला के लिए। DsRed सकारात्मक NPCs के लाल दिखाई देते हैं, QL-6 FITC हरी दिखाई देता है, और दोनों इस प्रकार विशेष रूप से सना हुआ किए जाने की जरूरत नहीं है। (चित्रा 4)।
  5. स्कैनिंग इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी (SEM) के लिए नमूने, 2 घंटे के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर glutaraldehyde में सोख 5 मिनट के लिए इथेनॉल का 10% वेतन वृद्धि चरणों में धीरे-धीरे उन्हें निर्जलीकरण और 1 घंटे के लिए एक दबाव तरल सीओ 2 अपनाना में उन्हें जगह देते हैं। एक धूम coater का उपयोग कर सोने के साथ कोट scaffolds के। एक Hitachi एस 3400N स्कैनिंग इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोप के साथ छवियों को ले लो। (चित्रा 5)

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Representative Results

ऊपर वर्णित प्रक्रिया का प्रदर्शन करते हैं, तो आप। एक एसएपी पाड़ गुहा को पूरा करने और एक निरोधात्मक पर्यावरण के सुधार, कम ऊतक डरा और एनपीसी अस्तित्व में वृद्धि की पेशकश मिल 4 आंकड़ा होगा पर प्राप्त एक चूहे की रीढ़ की हड्डी के एक अनुदैर्ध्य खंड से पता चलता है चोट साइट एससीआई के बाद 6 सप्ताह और QL6 एसएपी इंजेक्शन और एनपीसी प्रत्यारोपण के बाद 4 सप्ताह। QL6 पेप्टाइड्स सफलतापूर्वक उपरिकेंद्र में एकत्रित, हड्डी में इंजेक्शन और Penumbra में समास में प्रयुक्त रूप-दुमदारी दूर तक फैला रहे थे। इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोप चित्रा 5 में, आगे पता चलता है इमेजिंग, 1% की सभा (w / v) पीबीएस समाधान में पतला 2 घंटे के भीतर एक nanofiber पाड़ को QL6 पेप्टाइड्स।

इस मैट्रिक्स में वृद्धि हुई सेल अस्तित्व और सेल भेदभाव, कम ऊतक scarring के लिए योगदान दे निरोधात्मक वातावरण के एक सुधार प्रदान करता है और अंत में कार्यात्मक वसूली के लिए एक बेहतर मौका होता है।

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चित्रा 1: क्लिप कुचलन / संपीड़न धमनीविस्फार मॉडल सी 7 / T1 और क्लिप कुचलन / एक चूहे की रीढ़ की हड्डी के संपीड़न की laminectomy के बाद सर्जिकल माइक्रोस्कोप के माध्यम से (ए) तस्वीर अंगूठी वसंत सटीक गारंटी के साथ क्लिप (बी) चित्र।। बल बंद।

चित्र 2
चित्रा 2: SAPS इंजेक्शन अंक और स्टेम कोशिकाओं को इंजेक्शन अंक की चित्रमय चित्रण:। घाव के उपरिकेंद्र में दो stereotactically प्रदर्शन किया एसएपी इंजेक्शन, 2 मिमी दुम और व्याख्यान चबूतरे की दूरी के साथ सटे पृष्ठीय कॉलम में NPCs के चार इंजेक्शन द्वारा पीछा उपरिकेंद्र से।

चित्र तीन
(ए) वृद्धि कारकों की व्यवस्था करने के क्रम में अवदृढ़तानिकी कैथेटर प्रत्यारोपित:। कैथेटर paraspinal मांसपेशियों में कई 6.0 टांके द्वारा तय हो गई है; सी 5 में ड्यूरा के छोटे से खोलने; सी 7 / T1 पर घाव साइट के करीब खुला कैथेटर अंत के साथ कैथेटर की अवदृढ़तानिकी पोजीशनिंग। पार्श्व दिशा में एक अवदृढ़तानिकी अवकाश में रखा एक माइक्रो पंप से जुड़ा (बी) कैथेटर।

चित्रा 4
चित्रा 4: गर्भाशय ग्रीवा रीढ़ की हड्डी में SAPS और NPCs के सफल प्रसव फ्लोरोसेंट धुंधला एक चूहे के एक आघात रीढ़ की हड्डी के एक अनुदैर्ध्य धारा (DAPI पृष्ठभूमि, नीला)।। लेबल वाले SAPS (हरी QL6-FITC,) घाव के उपरिकेंद्र में एकत्रित किया है। इंजेक्ट NPCs (DsRed सकारात्मक, लाल) में दूर तक फैला हुआ हैव्याख्यान चबूतरे वाला और दुम दिशाओं। स्केल बार 5 मिमी को दर्शाता है।

चित्रा 5
चित्रा 5:। Nanofiber पाड़ गठन स्कैनिंग इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोप (SEM) इकट्ठे SAPS के nanofiber पाड़ गठन दिखा छवि। स्केल बार) 1 माइक्रोन को दर्शाता है।

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Discussion

इस प्रोटोकॉल चूहों में एक गर्भाशय ग्रीवा चोट मॉडल प्रदर्शन करने के लिए पाठक को सक्षम करने के लिए और गर्भाशय ग्रीवा एससीआई के बाद बेहतर वसूली को बढ़ावा देने SAPS और NPCs के साथ एक संयुक्त उपचार दृष्टिकोण का उपयोग करने के लिए विकसित किया गया है।

विशेष रूप से इस तरह के (हेमी) -transection मॉडल या वजन ड्रॉप और हिलाना मॉडल, क्लिप कुचलन / संपीड़न मॉडल प्रमुख pathophysiological आघात तंत्र दोनों का प्रतिनिधित्व के रूप में अन्य ग्रीवा आघात मॉडल, की तुलना में - कुचलन और compression- और इसलिए mimics सबसे अच्छा नैदानिक ​​स्थितियों। यह अच्छी तरह से चूहा और माउस वक्ष रीढ़ 7-11 में उपयोग के लिए स्थापित किया गया है, यह हाल ही में सर्वाइकल स्पाइन में उपयोग के लिए अनुकूलित किया गया है। ग्रीवा रीढ़ की हड्डी की चोट सबसे अक्सर क्लिनिक में देखा जाता है और गर्भाशय ग्रीवा शरीर रचना वक्ष रीढ़ की हड्डी से काफी भिन्न होता है के बाद से यह एक महत्वपूर्ण कदम था। इसके अलावा, tetraparesis से पीड़ित ग्रीवा एससीआई रोगियों में कम से कम आंशिक मोटर च हासिल करने के लिए उत्सुक हैंउनके ऊपरी extremities के गर्मजोशी।

एक प्रयोगात्मक ग्रीवा एससीआई का चुनौतीपूर्ण पहलुओं, हालांकि, सी 5 के लिए सी 7 से एक व्याख्यान चबूतरे वाला दिशा में बढ़ जाती है और मध्यम और ऊपरी ग्रीवा रीढ़ की हड्डी में 20-30% तक पहुँच सकते हैं कि एक उच्च मृत्यु दर रहे हैं। इसके अलावा, (विशेष रूप से सी 5/6 पर) उभरते तंत्रिका जड़ों में गड़बड़ी के प्रति संवेदनशील हैं, और इस मामले में वे जानवरों का एक प्रारंभिक बलिदान की आवश्यकता में जिसके परिणामस्वरूप ललाट पंजे की चबाने के कारण हो सकता है, नुकसान और जलन संरक्षित नहीं हैं। सामान्य में, ग्रीवा रीढ़ की हड्डी की चोट के साथ जानवरों के पोस्ट ऑपरेटिव ध्यान और देखभाल की बहुत जरूरत है और वसूली की एक लंबी पाठ्यक्रम दिखा। दूसरी ओर, सावधान शल्य चिकित्सा की तैयारी के अलावा, इन मुद्दों को आंशिक रूप से एक उचित क्लिप समापन बल (जैसे 15 से 35 ग्राम) और एक पर्याप्त कतरन समय (उदाहरण के लिए एक मिनट) का चयन करके चोट की गंभीरता को आदत डाल द्वारा संबोधित किया जा सकता है। इन मानकों चोट के विभिन्न कठोर अनुशासन के लिए नेतृत्व को संशोधित (हल्के, moderaते, या गंभीर एससीआई)। इसके अलावा, सर्जन निर्भरता के जोखिम या नुकसान का असमान वितरण हो सकता है। एक क्लिप applicator के के उपयोग से इन मुद्दों का समाधान करने के लिए हमेशा क्लिप जारी की है और इसलिए एक ही गति और इसलिए वेग के साथ बंद कर दिया है, जहां एक विकल्प है। क्लिप तड़क इससे पहले कि यह क्लिप अपनी सही स्थिति है और समान रूप से पूरे रीढ़ की हड्डी encloses है कि यह सुनिश्चित करने के लिए अनिवार्य है। विशेष शल्य चुनौती ड्यूरा से निशान ऊतक को हटाने के घाव साइट की फिर से जोखिम में निहित है। यह इस प्रक्रिया तेज तैयारी का उपयोग कर, और किसी भी दबाव से बचने या तय की हड्डी की खींच, सूक्ष्म शल्य चिकित्सा द्वारा मार डाला है कि सिफारिश की है।

स्वयं कोडांतरण पेप्टाइड्स क्षमता अंत में भी axonal उत्थान के लिए अग्रणी और, 5 12,13,14 अंकुरण घाव स्थल पर निरोधात्मक पर्यावरण को बेहतर बनाने के लिए, इसके अलावा, गुहा को पाटने और करने के लिए होने की पहचान की गई है। QL-6 nanofibers scaffolds के पूरा करने के लिए इकट्ठाintramedullary गुहा और, इस प्रकार, axonal अंकुरण और उत्थान के लिए एक मैट्रिक्स प्रदान करते हैं और कोशिका प्रत्यारोपण से पहले निरोधात्मक वातावरण में सुधार कर सकते हैं। इन पेप्टाइड्स के फायदे उनके कम चिपचिपापन (द्रव) और तटस्थ पीएच में निहित है। खासकर हाइड्रोजेल या ऊतक scaffolds के उच्च चिपचिपा की तुलना में, SAPS आसानी से घायल रीढ़ की हड्डी और खुद को सीमित कर रहे हैं इंजेक्शन से ली गई अतिरिक्त चोटों में इंजेक्ट किया जा सकता है।

QL6 खुद को सेल अस्तित्व 4,15 सुधार कर सकते हैं Nanofibers हालांकि, फिर भी, वृद्धि कारकों का उपयोग फायदेमंद 16,17,18,19,20,21 हो रहा है। (जैसा कि ऊपर वर्णित के रूप में) वे विकास को रिहा हाइड्रोजेल द्वारा या तो प्रशासित किया जा सकता है, 22 या आसमाटिक पंप के माध्यम से आवेदन द्वारा कारकों। अवदृढ़तानिकी कैथेटर से जुड़ा आसमाटिक पंप, इस प्रकार एक सतत और नियंत्रित रिलीज का लाभ और, गर्भाशय ग्रीवा रीढ़ की हड्डी में तरल पदार्थ (सीएसएफ) के संवर्धन की पेशकश करते हैं। अवदृढ़तानिकी कैथेटर रखकर, तथापि, चा हैकुछ हफ्तों चोट पोस्ट करने के बाद हुआ हो सकता है कि विशाल scarring के लिए सम्मान के साथ विशेष रूप से llenging।

एनपीसी अस्तित्व और एकीकरण के लिए अच्छा ऊतक स्थिति प्रदान करने के लिए, कई अध्ययनों घाव 4,15,18 के उपरिकेंद्र में नहीं सीधे 2 मिमी व्याख्यान चबूतरे वाला या घाव साइट के लिए दुम और आसन्न सफेद पदार्थ, में इंजेक्शन अंक चुना है। वहाँ, NPCs के astrocytes, oligodendrocytes या न्यूरॉन्स में अस्तित्व, एकीकरण, और भेदभाव के लिए एक बेहतर मौका है, और दिशा या axonal अंकुरण और बेहतर axonal कनेक्टिविटी में जिसके परिणामस्वरूप घाव में विस्थापित कर सकते हैं।

इस प्रस्तावित प्रोटोकॉल हो सकता है इन तकनीकों mastering के बाद व्यक्तिगत उपयोगकर्ताओं को उनकी आवश्यकताओं और चोट के स्तर पर और गंभीरता के संशोधनों को शामिल हितों अनुसार द्वारा अपनाया जाना, विभिन्न प्रकार की कोशिकाओं या वृद्धि कारकों, या अन्य न्यूरो सुरक्षात्मक पदार्थों के अलावा के उपयोग ।

मेंcavities और ऊतक scarring: सारांश, SAPS और NPCs के साथ संयुक्त उपचार सबसे चुनौतीपूर्ण एससीआई के उपचार में बाधाओं पर काबू पाने के लिए एक उपन्यास और आशाजनक दृष्टिकोण पेश कर सकती है।

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Acknowledgments

हम स्वास्थ्य अनुसंधान (CIHR) की कनाडा के संस्थानों से इस काम के लिए धन का समर्थन स्वीकार करना चाहते हैं, योगदान के लिए Krembil परिवार फाउंडेशन, तंत्रिका मरम्मत में Halbert चेयर और पुनर्जनन, फिलिप और पैगी DeZwirek, और गॉर्डन याओ दो चित्र । क्लाउस Zweckberger "ड्यूश Forschungsgesellschaft" (DFG) से अनुदान द्वारा वित्त पोषित किया गया।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Aneurysmal clip SharpTech
Surgical microscope Leica
Micro injection system World Precision Instruments, Inc.
Small animal stereotaxic instrument David Kopf Instruments
Hamilton syringe Hamilton company
Subdural pumps Alzet osmotic micro pump 1007D
Surgical instrument Fine Science tools
Isoflurane USP Pharmaceutical Partners of Canada Inc.
0.9% Sodium Chloride injection USP Baxter
7.5% Povidone iodine Purdue Pharma
70% Isopropyl alcohol USP GreenField Ethanol Inc.
QL6 SAP Covidien
0.4% Trypan blue Gibco
Platelet-Derived Growth Factor (PDGF) Sigma
Epidermal Growth Factor (EGF) Sigma
Fibroblast Growth Factor (FGF) Sigma

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