在实验颈脊髓损伤协同使用神经前体细胞,并自组装肽的

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Zweckberger, K., Liu, Y., Wang, J., Forgione, N., Fehlings, M. G. Synergetic Use of Neural Precursor Cells and Self-assembling Peptides in Experimental Cervical Spinal Cord Injury. J. Vis. Exp. (96), e52105, doi:10.3791/52105 (2015).

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Abstract

脊髓损伤(SCI)导致严重的神经功能障碍和心理,经济和社会后果的患者和他们的家庭。在临床上,脊髓损伤的50%以上的影响颈椎1。作为原发性损伤的结果,二次机制,包括炎症,细胞凋亡,和脱髓鞘级联发生最终导致组织结疤髓内腔2,3和发展。均代表物理和化学障碍细胞移植,集成和再生。因此,塑造抑制环境和桥接腔营造一个有利的环境对细胞移植和再生是一种很有前途的治疗目标4。这里,子宫颈癌的SCI的使用的动脉瘤夹挫伤/压缩​​模型进行说明。这种模式比其他实验模型更临床相关的,因为完全横断或电源线的破裂是罕见的。此外,在试比较n至重量下降模型,它特别损害鼻背列,则脊髓的圆周压缩出现有利的。夹子闭合力和持续时间可以调整,以达到不同的损伤程度。环形的弹簧有利于精确校准和夹子力恒定。在生理条件下,合成的自组装肽(SAP)的自组装成纳米纤维,因此,呼吁在SCI 5的应用程序。它们可以直接注射到病灶减少损坏的线。 SAP的具有生物相容性的结构支架架设桥梁髓内腔,因此,装备损坏的电源线用于再生治疗。 K2(QL)6K2(QL6)是由Dong 等一。6引入相对于其他的肽的新型的SAP,QL6自我组装成β片在中性pH SCI后60.14天,急性期,SAP的后被注入到病变和神经前体细胞(NPC)的中心是麟蹄反恐执行局到相邻背列。为了支持细胞存活,移植是结合的生长因子通过渗透微泵连续7天连续硬膜下施用。

Introduction

脊髓损伤的50%以上都与颈椎。在临床上设置两个主要病理生理学机制的描述:脊髓的初始挫伤,随后,引起骨骨折,出血或组织肿胀正在进行压缩。

动脉瘤夹挫伤/压缩​​模型模拟两者的病理生理机制:捕捉剪辑产生挫伤和削波的持续时间表示所述压缩元件,承认其在引起骨骨折,出血或组织临床设置中的压缩肿胀最后显著更长。所用动脉瘤夹由一环状弹簧保证精确和可重现的剪裁力修改。尤其是在比较半侧横断或挫伤模型,这种动脉瘤夹模型模拟最好的临床设置。虽然患者的胸部损伤截瘫,从大多数颈椎病患者注射吃亏uries是四肢瘫痪,完全依赖。颈髓的解剖结构,然而,示出相比于胸椎或腰椎显著的差异,并且因此,被寻址特别是在此协议。

髓内腔和疤痕组织的发展,是恢复和再生障碍。为了克服这些障碍,利用支架材料是一种很有前途的方法。自组装肽可直接注射到病灶的中心。在那里,他们组装成纳米纤维支架桥接腔,并通过减少炎症和组织瘢痕改善抑制环境。而刚性材料造成相当大的损害植入期间脊髓,流体肽可以安全且没有严重的额外伤害注入。

改善与自组装肽的抑制环境干细胞移植之前,因此,支持小区integration,分化最后,功能恢复,颈脊髓损伤后。

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Protocol

注:以下实验方案被批准为大学健康网络(多伦多,加拿大)的动物保护委员会,并按照既定的指导,关心和准备使用的动物保健加拿大议会实验动物的政策。

1.颈椎动脉瘤夹挫伤/压缩​​模式

  1. 术前高压灭菌仪器和通过将仪器在70%的酒精浴保持无菌条件下整个surgcial过程中。
  2. 麻醉Wistar大鼠(250-270克)与氧的结合(O 2),一氧化二氮(N 2 O)(1:1),和1.8-2.2%异氟醚,并且通过气体麻醉面罩支持自主呼吸。麻醉诱导开始用5%异氟醚1分钟,减少事后。前给予疼痛刺激( 在爪子)开始手术,麻醉的控制深度。适用于脂肪药膏在眼睛干涩避免和防止以后感染。
  3. 把老鼠到加热坐垫(37°C)和固定头部到立体定位框架。
  4. 剃手术区周围的颈椎和消毒用碘伏和70%的酒精。
  5. 使中线切口从颈椎(C2)延伸到胸椎椎体2(T2)的突出突脊的上方。
  6. 通过脊椎肌肉直接在中线外层切(避免出血)在头尾方向,并进一步剖析更深的肌肉层直言,直到你到达棘突和椎板。插入拉钩。
  7. 定向的椎体T2观察目标水平椎板切除的突出棘突。鉴定和显微外科制备选定薄片​​后,通过ligamenti flavae切割以松开薄层和棘突。最后,CUT斯达康通过与骨推子横向于脊髓的薄片和除去那些轻轻,避免了脊髓本身的任何压缩。
    注意:最常见的水平C5 / 6,C6 / 7或C7 / T1。围手术期死亡率增加了更多喙损伤水平。从椎旁静脉窦出血​​是常见的,并且可以通过用海绵小心压缩处理。
  8. 插入剪辑的精神创伤线前,确定新出现的神经根,从削波(特别是在一级C5 / 6),放过他们。
  9. 为了确保平稳剪辑感应,松开从椎体的背侧腹侧硬膜用钩,并准备一个走廊的剪辑。
  10. 最后,将打开夹子,让它捕捉关(快速闭合),实现了挫伤。夹子闭合力和夹闭合的持续时间决定了创伤的强度和压缩的程度。常用的有间15-35克和clippi夹力吴持续时间 1分钟。 ( 图1)。
  11. 除去夹子后,适应的肌肉在2层和闭合伤口。
  12. 停止麻醉并让动物唤醒在你连续观察,直到它重新获得足够的意识的胸骨斜卧。最后,把老鼠在一个笼子里,并按照手术后的治疗指南。
  13. 由于动物的这种类型的损伤的严重程度斗争,必须特别注意​​术后护理:
    1. 施用止痛药(丁丙诺啡和美洛昔康3天,5天,分别与根据临床症状)。
    2. 得到附加的盐水溶液皮下3天(每天2次,5-10毫升(ml))。
    3. 提前2天内提供在饮用水抗生素和直到后7天手术( 例如 Moxifloxacine)
    4. 挤压膀胱,每日2-3次,直到膀胱功能的恢复是不变LY明显。
    5. 每天观察神经功能缺损及手术动物的生理状态至少一次。

2.注射的SAP与NPC(伤后14天)

  1. 在1.1中描述诱导麻醉。到1.3,固定的大鼠的头在立体定位框架,取出线圈或卷绕片段和消毒伤口并用聚维酮碘和70%乙醇的手术区域。
  2. 小心解剖椎旁肌肉,插入拉钩,从硬脑膜显微镜除去疤痕组织,并重新露出病灶部位。
  3. 以1%的浓度制备的SAP(重量/体积),以执行一个细胞外基质的凝胶。 QL6的SAP具有生理上相容的pH值,并且不需要在注射前进行缓冲。在脊髓SAP的可视化,使用QL6(QL6-FITC)的荧光衍生物。
  4. 注入的SAP(5微升(μL)到中心的病变,分布在2份,每份中线2.5微升双边。用Hamilton注射器连接到立体定位框架用微玻璃毛细管(100微米(μm)的外径(OD))。用锋利的针尖小心打开硬脑膜,并插入玻璃毛细管立体定位2毫米(毫米)到创伤脊髓。
  5. 注射体积的1/3后,取出针至1.5mm的深度,并经过进一步的1/3至1毫米。注射的总体积的后,并除去注射器之前,等待5分钟,以稳定的凝胶形成。
  6. 要生成的NPC,用成年鼠红色荧光蛋白(或YFP阳性鼠,绿色)和隔离,并从paraventrical区4,18,21培养他们。
  7. 评估用台盼蓝染色的NPC指示90%的活细胞的〜在细胞悬浮液中存在的生存能力。稀释的细胞在生长培养基中(50×103活细胞/微升),然后将它们用于细胞移植。
  8. 提出四2微升(微升8总武lume明,含有4×10 5个的NPC)脊柱内注射双边为2mm喙和损伤部位的尾部。开口硬脑膜后,插入汉密尔顿微玻璃毛细管1.5毫米脊髓的背侧表面下方,并注入2微升的细胞悬浮液。选择喷射率在约0.5微升/分钟(分钟)。
  9. 在每次注射并除去毛细管出来的帘线之前结束时,等待至少1分钟,使组织伸展,以适应新的细胞体积。 ( 图2)

3.植入硬膜下的泵生长因子应用

  1. 为了丰富用生长因子的脑脊髓液(CSF),支持细胞存活,使用微渗透泵在整个7-14天子durally稀释的生长因子,以0.5微升/小时的稀释率,0.04的导管直径厘米外径,以及100微升的贮存体积。
  2. 选择首选生长因子(例如,脑源性生长因子(BDGF),表皮生长因子(EGF),成纤维细胞生长因子(FGF)),补油泵6-10小时之前注入,并平衡泵的水浴中在37℃。
  3. 立即NPC注射后,准备皮下凹陷放置泵。优选的位置是thoraco-腹部区域避免由于泵本身主要局部不适的横向侧面。
  4. 获得的生长因子的最高浓度,确保了导管的开口前端部附近的病变部位。因此,进行跳跃椎板切除相邻的上或下的水平。例如,如果在SCI是C7 / T1,执行小椎板C5的。
  5. 把泵入皮下凹槽,缩短导管必要的长度,并具有若干缝(6.0)上的椎旁肌避免任何运动相关脱位固定。
  6. 用锋利的尖端张开硬脑膜( 例如 ,在C5)后一针,引入导管进入硬膜下腔,并让它在没有任何抵抗,没有伤及脊髓骶管的方向滑行。 C6的跳过椎板提供固定导管和稳定的额外点。
  7. 确保导管运行平稳,不折。
  8. 关闭的肌肉层和皮肤,用缝线或夹子。 ( 图3)
  9. 停止麻醉并让动物唤醒在你连续观察,直到它重新获得足够的意识的胸骨斜卧。最后,把它们放回在一个笼子里,并按照手术后的治疗指南。
  10. 提供特殊的术后治疗,尽管,动物可能在这个时间点回收的部分:
    1. 施用止痛药(Buprenorthine和美洛昔康3天,5天,分别与根据临床症状)。
    2. 在水瓶提前2天,直到提供抗生素后7天的手术( 例如 Moxifloxacine)。
    3. 继续挤压膀胱,如果还是必要的。
    4. 给予额外皮下流体,如果大鼠出现脱水。
    5. 保持每天观察手术动物的神经功能和生理条件的至少一次。
    6. 辖免疫抑制治疗前2天NPC注射到晚上7天后transplanation(米诺环素),直到牺牲(SANDIMMUNE),分别为。

4.组织评估

  1. 牺牲动物在观察时间结束时( 例如 4周SCI后)在深度麻醉(5%异氟醚为2-3分钟),并用50ml冷的(4℃)的盐水,随后150毫升冷的4 transcardially灌注它们%多聚甲醛的0.1M磷酸盐缓冲盐水(PBS)。
  2. 取出脊髓,并把它在4%多聚甲醛的0.1M磷酸盐缓冲盐水(PBS)中24小时。
  3. 提供纵向冷冻切片的厚度为<30微米。
  4. 对于所有细胞的细胞核提供了一个背景使用的DAPI(1:1000)免疫组化染色。红色荧光蛋白阳性的NPC出现红色,QL-6 FITC显示为绿色,并且都因此不需要进行特殊染色。 ( 图4)。
  5. 为扫描电子显微镜(SEM)让样品浸泡在戊二醛在4℃下2小时,在10%的增量步骤的乙醇缓慢脱水它们为5分钟,并将其放置在一个加压的液体CO 2的虹吸1小时。用溅射镀膜机大衣支架黄金。采取与日立S-3400N扫描电子显微镜图像。 ( 图5)

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Representative Results

当执行上述的过程中,将得到一个SAP的支架桥接所述腔,并提供一种改进的抑制环境的,较少的组织瘢痕和增加鼻咽癌存活。 图4示出了在获得的大鼠脊髓的纵剖面损伤部位6周SCI后4周QL6 SAP注入和NPC移植后。 QL6肽成功注入脊髓,聚集在震中和半影扩散rostro-尾端。电子显微镜成像进一步示出,在图5中,1%的组件(重量/体积)QL6肽内2小时在PBS中稀释溶液的纳米纤维支架。

此矩阵提供了抑制环境有助于提高细胞存活和细胞分化,较少的组织疤痕的改善,最终导致了对功能恢复有更好的机会。

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图1:剪辑挫伤/压缩动脉瘤模型(A)至C7 / T1和剪辑挫伤/大鼠的脊髓压迫椎板切除后的手术显微镜的照片(B)中的图片的剪辑与环形弹簧保证精确关闭力。

图2
图2:注射点SAP的和干细胞注射点的图形说明:2进行立体定位注射的SAP在病变的中心,随后4次注射的NPC在相邻背侧列以2mm尾鳍和延髓的距离距离震中。

图3
:(A):硬膜导管生长因子给药通过手术显微镜照片。该导管被固定由几个6.0缝线在椎旁肌肉;小开硬脑膜在C5的;与开放导管端靠近病灶部位在C7 / T1导管的硬膜下的定位。(B)的导管连接到一个微泵放置在硬膜下凹槽上的横向侧面。

图4
图4:成功递送的SAP与NPC进入颈脊髓的荧光染色大鼠的创伤脊髓的纵截面的吲哚(DAPI背景,蓝色)。标记的SAP(QL6-FITC,绿色)都聚集在病灶的中心。注入的NPC(红色荧光蛋白阳性,红色)已扩散喙和尾方向。比例尺是指至5毫米。

图5
图5:纳米纤维支架形成的扫描电子显微镜(SEM)图像示出的纳米纤维支架形成组装SAP的。比例尺是指1微米)。

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Discussion

此协议已被开发,以使读者对大鼠进行颈椎损伤模型,并使用同的SAP与NPC促进子宫颈脊髓损伤后更好的恢复的组合的治疗方法。

特别是在相对于其他宫颈创伤模型,如在(半)-transection模型或重降和震荡模型,夹子挫伤/压缩​​模型代表两个主要病理生理机制创伤 - 挫伤和压缩在,因此,模拟最佳临床病症。虽然它是公认的用于在大鼠和小鼠胸椎7-11的用途,它最近已适于在颈椎使用。这是一个重要的步骤,因为颈脊髓损伤是最经常看到的,在诊所和宫颈解剖从胸椎显著而变化。此外,颈椎脊髓损伤患者患tetraparesis热衷于恢复至少部分电机˚F恩膏他们的上肢。

实验颈脊髓损伤的挑战性,然而,死亡率高,增加的喙方向从C7到C5和可以达到20-30%,在中部和上部颈椎。此外,新出现的神经根(尤其是在C 5/6)是操纵敏感,而在情况下,他们不会被保留,损害和刺激可能会导致产生动物的早期牺牲的必要性额叶爪子的咀嚼。在一般情况下,动物的颈脊髓损伤需要很多术后的重视和关怀,并出现复苏的病程较长。另一方面,除了仔细手术准备,这些问题可以部分地由通过选择适当的夹子闭合力( 例如,15至35克)和适当的限幅时间(例如1分钟)适配所述损伤的严重程度解决。修改这些参数会导致人身伤害的严重程度不同(轻度,modera德,或严重的SCI)。此外,有可能是医生的依赖的危险或损害的分配不均。为了解决这些问题,使用一种夹子施用器是其中总是夹子被释放,并且因此具有相同的速度,因而速度关闭一个选项。之前捕捉的剪辑它是强制性的,以确保夹子具有其正确的位置和同样包围整个脊髓。特殊的手术的挑战在于在重新曝光病灶部位去除硬脑膜的疤痕组织。建议在此过程中被执行的微外科手术,使用锋利的准备,并避免任何压力或拉力固定帘线。

自组装肽已被确定具有电位弥合空腔,此外,为了提高在病变部位最终甚至导致轴突再生和发芽5,12,13,14的抑制环境。 QL-6纳米纤维聚集到支架桥髓内腔,因此,可以提供一个矩阵轴突出芽和再生,提高细胞移植前的抑制环境。这些肽的优点在于它们的低粘度(流体)和中性pH。尤其是在比较高的粘性水凝胶或组织支架,SAP的可以很容易地注射到脊髓损伤和从注射本身是有限而产生的额外伤害。

虽然QL6纳米纤维本身可能会改善细胞存活4,15,然而,使用生长因子似乎是有利16,17,18,19,20,21。它们可以通过水凝胶的释放的生长施用因子22,或通过经由渗透泵应用(如上所述)。连接于硬膜导管渗透泵提供连续和受控释放的优点,因此,在颈部脊髓液(CSF)的富集。配售硬膜下导管,但是,是茶相对于可能发生的经过一些周后的伤害巨大的疤痕llenging更是如此。

为了提供良好的组织条件鼻咽癌存活和整合,一些研究已经在相邻的白质,2mm的病灶4,15,18的震中延髓或尾鳍到病变部位,而不是直接选择注入点。还有,NPC的有生存,集成和为星形胶质细胞,少突胶质细胞或神经细胞分化有更好的机会,并且可以朝向或进入导致轴突出芽和改进的轴突连通病灶迁移。

掌握这些技术此提出的协议威力之后由个人用户根据他们的需要和利益,围绕这些损伤的程度和严重性的修饰可​​以采用,使用不同类型的细胞或生长因子,或加入其它神经保护物质。

在综上所述,随着结构调整方案和筹备联合治疗可能提供一种新的和有前途的方法克服SCI的治疗中最具挑战性的障碍:腔和组织疤痕。

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Acknowledgments

我们要感谢为这项工作的健康研究(CIHR)加拿大研究所的资金支持,Krembil家庭基金会的主席亥尔波特在神经修复和再生,菲利普和佩吉DeZwirek,和戈登姚明的贡献,图2 。克劳斯Zweckberger资金由从“德意志Forschungsgesellschaft”(DFG)的资助。

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Aneurysmal clip SharpTech
Surgical microscope Leica
Micro injection system World Precision Instruments, Inc.
Small animal stereotaxic instrument David Kopf Instruments
Hamilton syringe Hamilton company
Subdural pumps Alzet osmotic micro pump 1007D
Surgical instrument Fine Science tools
Isoflurane USP Pharmaceutical Partners of Canada Inc.
0.9% Sodium Chloride injection USP Baxter
7.5% Povidone iodine Purdue Pharma
70% Isopropyl alcohol USP GreenField Ethanol Inc.
QL6 SAP Covidien
0.4% Trypan blue Gibco
Platelet-Derived Growth Factor (PDGF) Sigma
Epidermal Growth Factor (EGF) Sigma
Fibroblast Growth Factor (FGF) Sigma

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References

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