애벌레 Zebrafish의 피부에 유도 GAL4 / UAS 식 시스템을 사용하여 선천성 면역과 종양 전 세포 상호 작용의 라이브 영상

Developmental Biology
 

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Ramezani, T., Laux, D. W., Bravo, I. R., Tada, M., Feng, Y. Live Imaging of Innate Immune and Preneoplastic Cell Interactions Using an Inducible Gal4/UAS Expression System in Larval Zebrafish Skin. J. Vis. Exp. (96), e52107, doi:10.3791/52107 (2015).

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Abstract

Introduction

그렇지 않으면 정상 상피 시트 내에서 발암 세포 자손의 전면에 자라 강하게의 미세 환경과의 상호 작용에 따라 달라집니다. 숙주 조직과의 상호 작용은 종양 전 셀이 상기 부푼 암으로 발전하는 클론 틈새를 확립 할 수 있는지의 주요 결정 요인이 될 가능성이 높다. 개발의 중요성에도 불구하고, 암의 진행이 초기 단계는 생체 내에서, 가장 일반적으로 사용되는 모델 시스템에 액세스 할 수 없습니다.

제브라 피쉬, 다니오 레 리오 (rerio)은, 때문에 개발 전반에 걸쳐 투명성, 수용성 약물의 유전자 조작에 대한 가능성과 접근성의 라이브 영상 검사에 대한 잘 확립 된 모델 생물이다. 상피 세포를 변환하는 과발현, 인간의 종양 유전자 HRAS G12V을 애벌레 제브라 피쉬 모델을 사용하여 최근의 연구는 숙주 세포가 특정 H 2 O 2 (으)로에서 신호를 유도 것을 보여 주었다선천성 면역 세포의 모집. 흥미롭게도, 모집 면역 세포, 호중구 및 대식 세포는 종양 전 세포 증식을 지원 2,3- 영양 역할을하는 것으로 하였다.

종양의 개시 및 진행의​​ 초기 사건뿐만 아니라 염증 반응의 기여를 이해하기 위하여, 하나는 이후 초기 시점에서 이러한 이벤트 이미지 할 수 있어야한다. 그러므로 시간적 및 조직 특이 적으로 세포 변환을 제어 할 필요가있다. 우리는 성공적으로 조건부 피부 특이 적 프로모터 각질 4 (krt4)의 제어하에 인간 종양 유전자 HRAS G12V을 표현하는 초파리 4에서 적응 된 GAL4 / UAS 시스템을 5 활용합니다. GAL4 전사 활성 즉, KalTA4 (6)의 수정 된 버전은, 상류 활성화 서열의 제어 (UAS하에 HRAS G12V의 발현을 가능하게). 조건부 전사 활성의 발현을 유도하기 위하여, 특별히 KalTA4 -4- Hydroxytamoxifen 결합 인간 에스트로겐 수용체 α의 돌연변이 리간드 결합 도메인 (ER의 T2) (7)에 융합 된 (4-OHT) 1. 4- OHT의 부재에서 ER-T2는 열 충격 단백질에 의해 세포질 바인딩된다. 4-OHT에 관심 8의 유전자를 제어 UAS의 KalTA4-ER T2의 핵 전위 이후 활성화 있도록, 단백질이 해리 열 충격 바인딩 (그림 1C을, B). 이러한 발현 시스템은 4 OHT의 존재에 의존 같이, 관심 유전자의 발현 조절 KalTA4 가역적이다. 비가역 재조합 이벤트 리드 치운다 ER의 T2 / 된 LOX 시스템과는 달리, KalTA4 ER-T2 의한 전사 활성화의 유도는 또한 4-OHT 제거함으로써 가역적이다.

다음 프로토콜여보세요 제브라 피쉬 애벌레 피부 세포의 조건 변화와 형광 단백질 발현에 의한 선천성 면역 세포와의 상호 작용의 후속 모니터링 WS. 13 -이 프로토콜에서 사용되는 기본적인 방법은 제브라 피쉬 커뮤니티 (9) 내에서 일반적으로 사용되는 기술과 유사하다.

세대와 함께 유전자 변형 구조의 미세 주입으로 유전자 변형 라인의 조합 적 사용은 모자이크 방식으로 단일 세포를 변환하는 일시적인 접근 할 수 있습니다. 배아와 유충 지브라 피쉬 피부의 산소 투과도는 일 시간이다 고해상도 현미경으로 시간 경과 라이브 영상 검사를위한 가능성을 제기한다. 또한, 수용성 약물 접근성 미래 기전 연구 및 암 발생의 초기 단계의 이해로 이어질 수 생체 내에서 세포의 생물학적 이벤트의 감시를 허용 할 것이다.

_content는 ">이 프로토콜은 모자이크 방식으로, 제브라 피쉬 유충에서 관심있는 조직 조건부 유전자 발현을 수행하도록 할 수있다. 하나는 또한 피부 이외의 화상 깊은 조직을 살 수 있도록 설정 현미경을 최적화 할 수있다.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
(Z)-4-Hydroxytamoxifen Sigma Aldrich H7904 dilute in ethanol and store in the dark at -20 °C
20X Objective Zeiss 20X/0.5 Ph2 ∞/0.17
40X Objective Zeiss 40X/1.2W Korr ∞/0.14-0.18
63X Objective Zeiss 63X/1.4 Oil Ph3 ∞/0.17
BamHI New England Biolabs R0136S
Confocal Microscope Zeiss LSM 510 META
Cover glass VWR 631-0171 Diameter 25 mm
Dimethylpolysiloxane Sigma Aldrich DMPSV
Dow Corning high-vacuum silicone grease  Sigma Aldrich MKBL4135V
Flaming/Brown P-97 Micropipette Puller Sutter Instruments Co. P-97 Program: heat 530, pull 200, velocity 80, and time 150
Fluorescent stereoscope  Leica M205 FA
Kwik-Fill Brosilicate Glass Capillaries World Precision Instruments 1B100F-4
Microinjection mold TU-1 Adaptive Science Tools TU-1
Microloader tip Eppendorf 930001007
Microscope Zeiss Axiovert 200
mMESSAGE mMACHINE Kit Ambion AM1348
Nuclease-free water Invitrogen AM9937
Pneumatic pico pump World Precision Instruments  PV820 
Pneumatic pico pump Warner Instruments PLI-90A
pTol2-krt4:KalTA4-ERT2;cmlc2:eGFP Dr. Thomas Ramezani/Yi Feng Lab/The University of Edinburgh
QIAprep Spin Miniprep Kit Quiagen 27106
Rhodamine B isothiocyanate-Dextran Sigma Aldrich R8881 10 mg/μl in water
Stereoscope Leica M80
Tg(lysC:dsRed2)nz50Tg BMC Developmental Biology 7, 42, doi:10.1186/1471-213X-7-42 (2007)
Tg(UAS:eGFP-HRASG12V)io006 PloS One 5 (12), e15170, doi:10.1371/journal.pone.0015170 (2010)
Tricaine/MS-222 Sigma Aldrich A5040
UltraPure Agarose Invitrogen 16500-100
UltraPure Low Melting Point Agarose  Invitrogen 16520-050
UltraPure Phenol : Chloroform : Isoamyl Alcohol Invitrogen 15593-031 25:24:1, v/v

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References

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