Zuiveren van de Onzuivere: Sequencing metagenomes en Metatranscriptomes van Complex-Animal geassocieerd Samples

Biology
 

Summary

De cystic fibrosis luchtwegen als voorbeeld, het manuscript presenteert een uitgebreide workflow omvattende een combinatie van metagenomic en metatranscriptomic benaderingen van de microbiële en virale gemeenschappen in dieren door monsters te karakteriseren.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Lim, Y. W., Haynes, M., Furlan, M., Robertson, C. E., Harris, J. K., Rohwer, F. Purifying the Impure: Sequencing Metagenomes and Metatranscriptomes from Complex Animal-associated Samples. J. Vis. Exp. (94), e52117, doi:10.3791/52117 (2014).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

De toegankelijkheid van high-throughput sequencing heeft een revolutie teweeggebracht vele gebieden van de biologie. Om beter te begrijpen-gastheer-geassocieerde virale en microbiële gemeenschappen, een uitgebreide workflow voor DNA en RNA extractie werd ontwikkeld. De workflow gelijktijdig genereert virale en bacteriële metagenomes, evenals metatranscriptomes, uit één monster voor next-generation sequencing. De koppeling van deze benaderingen geeft een overzicht van zowel de taxonomische kenmerken en de gemeenschap gecodeerde functies. De gepresenteerde methoden Cystic Fibrosis (CF) sputum, een problematische soort monster, omdat het buitengewoon viskeus en bevat hoge hoeveelheid mucinen, vrij neutrofielen DNA, en andere onbekende verontreinigingen. De hier beschreven protocollen richten deze problemen en met succes te herstellen virale en bacteriële DNA met minimale menselijke DNA besmetting. Om de metagenomica studies aan te vullen, werd een transcriptoomstudie protocol geoptimaliseerd voor zowel microbiële herstellenen gastheer mRNA dat relatief weinig ribosomaal RNA (rRNA) sequenties bevat. Een overzicht van de gegevens karakteristieken gepresenteerd dienen als referentie voor de beoordeling van het succes van de methoden. Extra CF sputum monsters werden verzameld (i) de mate waarin de microbiome profielen in zeven opeenvolgende dagen evalueren binnen een enkele patiënt, en (ii) vergelijkt de samenhang van metagenomic benadering van een 16S ribosomale RNA-genen gebaseerde sequencing. De resultaten toonden aan dat dagelijkse fluctuatie van microbiële profielen zonder antibioticum verstoring was minimaal en de taxonomie profielen van de gemeenschappelijke CF-geassocieerde bacteriën waren zeer vergelijkbaar tussen de 16S rDNA bibliotheken en metagenomes gegenereerd uit de hypotone lysis (HL) -afgeleide DNA. De verschillen tussen 16S rDNA taxonomische profielen gegenereerd uit totaal DNA en HL-afgeleide DNA suggereren dat hypotone lysis en wasstappen profiteren niet alleen het verwijderen van de mens afgeleide DNA, maar ook microbieel afgeleide extracellular DNA dat de werkelijke microbiële profielen kan verkeerd.

Introduction

Virale en microbiële gemeenschappen geassocieerd met het menselijk lichaam zijn uitgebreid onderzocht in het afgelopen decennium door toepassing van sequencing technologie 1,2. De resultaten hebben geleid tot de erkenning van het belang microben in de menselijke gezondheid en ziekte. De belangrijkste initiatief kwam van het menselijk microbioom project dat de bacterie beschrijft (en enkele archaea) die zich op de menselijke huid, en binnen de mondholte, de luchtwegen, urinewegen, en het maagdarmkanaal 3. Verdere microbiome onderzoek van gezonde luchtwegen door bronchoalveolaire lavage (BAL) 4,5 en nasofaryngeale uitstrijkjes 4 blijkt dat de longen kan dienen als een milieubemonstering inrichting resultaten voorbijgaande microbiële kolonisatie van de luchtwegen. Echter, de effecten van microbiële kolonisatie verminderde luchtwegen oppervlakken leiden tot ernstige en chronische longinfectie, zoals waargenomen in Cystic Fibrosis (CF) patiënten.

t "> CF is een dodelijke erfelijke ziekte veroorzaakt door de mutatie in Cystic Fibrosis Transmembrane Regulator (CFTR) gen 6. Deze mutaties leiden tot defecte CFTR eiwitten die beïnvloeden ook transepitheliaal ionentransport over het apicale oppervlak van het epitheel. De ziekte treft meerdere orgaansystemen, maar de meerderheid van mortaliteit en morbiditeit wordt toegeschreven aan CF longziekte 7. De CF long een unieke ecosysteem microbiële kolonisatie. Het defect in ionentransport veroorzaakt slijm op te bouwen in de CF luchtwegen, waardoor micro-omgevingen bestaan ​​uit aërobe , microaerophilic en anaerobe compartimenten verankerd door een statische voedselrijke slijmvliesoppervlak. Deze omgeving vergemakkelijkt de kolonisatie en proliferatie van microben, waaronder virale, bacteriën en schimmels. Acute en chronische pulmonaire microbiële infecties leiden tot constant maar ineffectieve immuunrespons, waardoor uitgebreide luchtwegremodelling, verlies van pulmonale capaciteit, en uiteindelijk pulmonaire mislukking.

Bacteriële gemeenschappen in verband met de CF longen zijn goed beschreven met behulp van zowel cultuur-afhankelijke en cultuur-onafhankelijke aanpak, die onder meer met behulp van 16S ribosomaal RNA (rRNA) gensequentiebepaling 8 en shotgun metagenomica 9,10. De 16S rRNA-benadering kan een groot aantal microbiële soort karakteriseren en vangen grote verschuivingen in verscheidenheid gemeenschap. Is echter beperkt zijn resolutie definiëren gemeenschappen (samengevat in Claesson et al. 2010 11) en de voorspellingen van metabole potentieel beperkt tot die algemene functies bekend om de taxa geïdentificeerd. Daarom 16S rRNA gen sequencing methoden onvoldoende zijn voor de noodzakelijke taxonomische en functionele analytische nauwkeurigheid van de diverse microbiële gemeenschappen aanwezig in CF longen. De metagenomic aanpak hier beschreven aanvulling op het 16S rRNA-gebaseerde benadering, overwint zijn beperkingen, en maakt een relatief effectieve manierzowel de microbiële gemeenschap taxonomie en genetische inhoud CF longen geanalyseerd.

Microbiële DNA geïsoleerd uit dieren geassocieerde samples bevat vaak een grote hoeveelheid gastheer-DNA. CF sputum of longweefsel monsters bevatten gewoonlijk een grote hoeveelheid humaan DNA vrijgemaakt door neutrofielen in de immuunrespons, vaak meer dan 99% van het totale DNA 12 - 14. Hoewel sommige intacte humane cellen aanwezig zijn, de meeste van deze DNA vrij in oplossing of geadsorbeerd aan het oppervlak van microben. Bovendien is de aanwezigheid van uitzonderlijk viskeuze slijm stekkers, celafval en andere onbekende verontreinigingen nog moeilijker isolatie van microbiële cellen. Verschillende methoden werden getest afbrekende deze monsters van menselijk DNA, zoals Percoll gradiënten afzonderlijke menselijke microbiële cellen 15, behandeling met DNase I, ethidiumbromide monoazide menselijk DNA 16 en het MolYsis kit, allemaal met beperkt succes selectief afbreken. De meest effectieve microbiële DNA zuiveringsprocedure CF sputum heden is een modificatie van de door Breitenstein et al proces geweest. (1995) 17. Deze benadering, hierin bekend als hypotone lysis werkwijze (HL), een combinatie van β-mercaptoethanol aan mucine disulfidebindingen, hypotone lysis van eukaryote cellen en DNase I behandeling van oplosbare DNA 9 verminderen. Ondanks het gebrek aan alternatieven verhoogde de HL werkwijze aantal problemen wegens (i) mogelijke vertekeningen als gevolg van ongewenste lysis van microben en (ii) of de waargenomen fluctuaties in gemeenschapssamenstelling 9,10 zijn de invloed van variaties geassocieerd met het monster verwerking. Naast het genereren van shotgun metagenomes, pakken we deze problemen door het vergelijken van het 16S rRNA gen profielen van de totaal DNA en microbiële DNA geëxtraheerd uit de HL gebruik van dezelfde set van sputum monsters van een patiënt in zeven opeenvolgende dagen.

ent "> Ten opzichte van microbiële gemeenschappen, de karakterisering van virale gemeenschappen in verband met dieren is beperkt 18,19 De virale gemeenschappen in CF luchtwegen zijn slechts minimaal gekarakteriseerd 20 -.. 22 De eerste metagenomic studie karakteriseren van het DNA van virale gemeenschappen in CF luchtwegen bleek dat de meeste virussen geassocieerd met CF longen fagen 20. De metabole potentieel van faag CF en niet-CF individuen significant verschillend. Specifiek de faag gemeenschappen CF individuen gedragen genen weerspiegelen bacteriële gastheer aanpassingen van de fysiologie van CF luchtwegen, en bacteriële virulentie 20. Daaropvolgende metagenomic studies van virussen in CF longweefsel aangetoond uitgesproken ruimtelijke heterogeniteit van virale gemeenschappen tussen anatomische gebieden 22. Bovendien CF longweefsel geherbergd de laagste virale diversiteit waargenomen date in een ecosysteem. 22 meeste virussen geïdentificeerd waren fagenmet mogelijk CF pathogenen infecteren. Echter, werden eukaryotische virussen zoals herpesvirussen, adenovirussen, en menselijke papillomavirussen (HPV) ook gedetecteerd. In een geval waar cysten in het longweefsel tijdens dissectie waargenomen, werd meer dan 99% van een humaan papillomavirus genoom teruggewonnen, hoewel de patiënt nooit werd gediagnosticeerd met een pulmonaire papilloma of carcinoom. Dit geeft aan dat de virale diversiteit onderhavige weerspiegelt niet alleen de ernst van weefselbeschadiging, maar ook bloot leggen en een onderliggende ongekarakteriseerde aandoening. De hier beschreven protocollen bieden een eenvoudige maar krachtige manier om virusachtige deeltjes (VLP's) uit monsters die bestaan ​​uit grote hoeveelheden dik slijm, gastheer en microbiële cellen, vrij DNA, evenals celafval isoleren.

Aanvulling metagenomica, wordt transcriptoomstudie gebruikt om de dynamiek in genexpressie bewaken over de microbiële gemeenschappen en de gastheer 9,23. In dit geval, zowel microbiële en host mRNA moeten bij voorkeur worden geselecteerd. Aangezien bacteriële mRNA's niet worden gepolyadenyleerd, kan een oligo-dT-gebaseerde mRNA pull-down methode niet worden benut. Polyadenylatie-afhankelijke RNA amplificatie kan niet worden gebruikt gastheer geassocieerde monsters indien de monsters zijn bekend grote hoeveelheden eukaryote mRNA. Veel dieren door monsters, zoals CF sputum, bevatten een hoge dichtheid van cellen naast grote hoeveelheden cellulair puin en nucleasen die RNases omvatten. Derhalve andere uitdaging is uitgebreide RNA afbraak tijdens metatranscriptome verwerking. Meestal totaal RNA geëxtraheerd uit CF sputum gedeeltelijk afgebroken, beperken de verdere toepassingen en nut van de afgeleide RNA. De laatste jaren hebben verschillende benaderingen voor het rRNA uitputting ontwikkeld en aangepast commercieel verkrijgbare kits. De effectiviteit van deze aanpak is echter beperkt, vooral bij het ​​werken met gedeeltelijk afgebroken rRNA 9,24. De methoden die hier werkzaam toestaaned voor het ophalen van gedeeltelijk afgebroken totaal RNA geschikt voor efficiënte downstream totale rRNA verwijderen. Directe vergelijking van de efficiëntie rRNA verwijdering uit gedeeltelijk aangetaste totaal RNA vergelijken van twee verschillende sets geïllustreerd door Lim et al. (2012) 9.

Over het algemeen is het doel van dit manuscript is om een complete set van protocollen (figuur 1) om virale en bacteriële shotgun metagenomes genereren, en een metatranscriptome bieden, van een enkel-dier geassocieerd, met gebruik van geïnduceerde sputummonster als voorbeeld. Moleculaire laboratorium workflow moet onder andere een afzonderlijk pre- en post-versterking gebieden om kruisbesmetting te minimaliseren. De methoden zijn eenvoudig aan te passen aan andere typen monster zoals weefsel 22, nasofaryngeale en orofarynxswabs 25, bronchoalveolaire lavage (BAL) en koraal (ongepubliceerde gegevens). Elk monster moet onmiddellijk worden verwerkt na inzameling vooral wanneer microbiële metagenomica en ontmoetteatranscriptomics studies gewenst. Indien de monsters werden ingevroren, het beperkt de isolatie van intacte microbiële cellen voor microbiële metagenomes het bevriezen mogelijk de cel integriteit verstoren. Echter, bevriezing niet tegen transcriptoomstudie en virale isolatie, maar de kwaliteit van het RNA en de hoeveelheid virale partikels teruggewonnen kan worden beïnvloed door de vries-dooi proces. Het is belangrijk op te merken dat sputum heeft gediend als de primaire bron van monsters in veel studies geassocieerd met volwassen patiënten met CF en andere chronische longziekten 26,27 als BAL te invasief zijn. In onze studies, werden sputum monsters verzameld met een zorgvuldige en consistente sampling methode, dat wil zeggen, na mondspoeling en spoelen van de mondholte met steriele zoutoplossing om orale microben verontreiniging binnen het sputum monsters tot een minimum te houden.

Protocol

OPMERKING: Induced sputum monsters werden verzameld in overeenstemming met de Universiteit van Californië Institutional Review Board (HRPP 081.500) en San Diego State University Institutional Review Board (IRB SDSU # 2121), door de coördinator onderzoek van de University of California, San Diego (UCSD ) volwassen CF-kliniek.

1. Monsterneming en voorbehandeling (Pre-treat Monsters binnen 30 minuten na Collection)

  1. Voorafgaand aan de monstername, label vier 15 ml buisjes als: (i) virale metagenoom, (ii) microbiële metagenoom, (iii) metatranscriptome, en (iv) extra sputum. Herhaal dit voor elk monster. Voeg 2 ml van 0,1 mm silica korrels in de buis label "Metatranscriptome", gevolgd door 6 ml van guanidine isothiocyanaat-gebaseerde RNA lysisbuffer (GITC-lysis buffer).
  2. Tijdens monstername, steriel zoutoplossing (60 ml) als een mondspoeling om besmetting te minimaliseren door orale bacteriën. Verzamel sputum monsters over een 30 min periode na deinademing van 4 ml 7% hypertone zoutoplossing via een verstuiver. Process monsters direct, zoals hieronder beschreven.
  3. Verdun het monster op een totaal volume van 8 ml.
    1. Schatten monstervolume door weging lege sputum kop voor en na de monsterneming.
    2. Indien het volume van het monster minder dan 8 ml, voeg juiste hoeveelheid van 0,02 urn gefiltreerd 1x PBS tot een totaal monstervolume van ten minste 8 ml genereren.
    3. Onmiddellijk homogeniseren van het monster met een spuit 3 ml tot geen zichtbare klonten in het sputum blijven
    4. Met behulp van dezelfde spuit, het opstellen van 2 ml van het sputum en meteen doorgaan naar stap 1.4.
  4. Behoud van totaal RNA van sputummonster
    1. Injecteren 2 ml sputummonster uit stap 1.3.4 in de "metatranscriptome" buis met silica kralen en GITC-lysis buffer.
    2. Sluit het deksel en sluit de buis stevig vast met Parafilm om lekkage te voorkomen.
    3. Homogeniseren het sputum onmiddellijk bij gemiddelde snelheid 10 kmn. Afhankelijk van de vortexer beschikbaar, plaats de buis horizontaal en zet vast met tape indien nodig.
    4. Houd de buis bij 4 ° C of in een koelbox en transport naar het laboratorium indien nodig.
  5. Met dezelfde injectiespuit aliquot 2 ml van sputum elk in de buizen label "virale metagenoom" en "microbiële metagenoom" en draagt ​​de resterende sputum van het sputum beker in de buis label "extra sputum".
  6. Bewaar alle buizen bij 4 ° C of koelbox en transport naar het laboratorium indien nodig.

2. Het genereren van Viral metagenoom

  1. Voorbereiding van Buffers en oplossingen
    1. Bereid 50 mM dithiothreitol (DTT) vooraf en bewaar bij 4 ° C. Dit is stabiel gedurende 2 weken.
    2. Bereid Saline Magnesium (SM) buffer (250 ml): 1 M NaCl, 10 mM MgSO4, 50 mM Tris-HCl; pH op 7,4. Filter steriliseren (0,02 micrometer poriegrootte) en bij kamertemperatuur bewaren. Bereid DNase I enzym tot 100 U / ul (moleculaire waterbehandeling) vanaf gevriesdroogd runder pancreas DNase I volgens de activiteit die door Dornase eenheid / mg drooggewicht.
    3. Bereid 10x DNase I buffer (50 ml): 100 mM MgCl2, 20 mM CaCl2; pH op 6,5. Filter steriliseren (0,02 micrometer poriegrootte) en bij kamertemperatuur bewaren.
    4. Bereid 4% paraformaldehyde.
    5. Bereid 200x TE-buffer: 2 M Tris-HCl (pH 8,5), 0,2 M EDTA. Filter steriliseren (0,02 micrometer poriegrootte) en bij kamertemperatuur bewaren.
    6. Bereid 10 ml 10% natriumdodecylsulfaat (SDS) via moleculaire kwaliteit water.
    7. Bereid 50 ml CTAB / NaCl (10% CTAB. 700 mM NaCl) met behulp van moleculair-biologische kwaliteit water. Ontbinden CTAB nachts. Als precipitaten aanhouden Verwarm de oplossing bij 65 ° C. Oplossing is zeer viskeuze in kamertemperatuur.
      OPMERKING: De filtratie van buffers met 0,02 urn filter kan de verwijdering van virusachtige deeltjes in de oplossing, maar nietgratis nucleïnezuur besmetting.
  2. Monstervoorbehandeling
    1. Bereid juiste hoeveelheid verse 6,5 mM dithiothreitol (DTT).
    2. Verdun het homogenaat door toevoeging van 0,02 urn gefiltreerd SM buffer tot een totaal volume van 6 ml genereren.
    3. Om te helpen bij slijm oplossen, voeg gelijk volume (6 ml) van 6,5 mM dithiothreitol (DTT) verdund, vortex krachtig mengen en incuberen gedurende 1 uur bij 37 ° C.
    4. Vortex het behandelde monster krachtig en centrifugeren bij 10 ° C, 3056 g gedurende 15-20 minuten.
    5. Verzamel de bovenstaande vloeistof in een nieuwe buis van 15 ml.
    6. Herhaal stap 2.2.3 en 2.2.5 voor het volgende monster.
    7. Overdracht en filteren supernatant met een 0,45 urn filter gemonteerd op een spuit in een nieuwe buis van 15 ml.
      OPMERKING: Als het filter verstopt, halen de monsters uit de spuit en laat de filtratie stap.
    8. Neem een ​​100 ul submonster van de 0,45 pm-gefilterd monster, chloroform en DNase I behandeling uit te voeren (zie sectie 2.3.12-2.3.15) en voeg gelijk volume van 4% paraformaldehyde om het monster voor epifluorescentiemicroscopie (Figuur 2A te repareren).
    9. Voor een "catch-all" virusdeeltjes verrijking benadering (zie bespreking), ga dan naar stap 2.3.12 tot virusdeeltjes selectie weglaten gebaseerd op cesiumchloridegradiënt ultracentrifuge. Dit kan echter resulteren in chloroform-resistente bacteriële contaminatie en grotere hoeveelheid gastheer-DNA in het virale lysaat.
  3. Virusachtige deeltjes (VLP's) Verrijking en Zuivering
    1. Bereid afzonderlijke cesiumchloride (CsCl) oplossing door oplossen van de geschikte hoeveelheid van CsCl met ongefilterde SM buffer om de gewenste dichtheid (1,7 g / ml, 1,5 g / ml, 1,35 g / ml en 1,2 g / ml). Filtreer elke oplossing door een 0,02 urn filter vóór gebruik.
    2. Stel CsCl gradiënt zoals in figuur 2B.
    3. Load 1 ml van 1,7 g / ml in elke buis, load 1 ml van 1,5 g / ml in elke buis, load 1 ml van 1,35 g/ Ml in elke buis, lading 1,2 g / ml in elke buis (optioneel), en tenslotte 6-8 ml monster geladen in de betreffende buis. Markeer afzonderlijke lagen om de locatie van elke fractie duiden.
    4. Evenwicht elk tegengestelde paar buizen tot op 1 mg.
    5. Laadt elke buis voorzichtig in de spin emmer. Spin alle emmers, zelfs als ze leeg zijn. Laad de spin emmer op de rotor.
    6. Centrifugeer bij 82.844 xg bij 4 ° C gedurende 2 uur.
    7. Na centrifugatie, zorgvuldig de buizen uit de houder te verwijderen zonder verstoring van de dichtheid hellingen.
    8. Met een 3 ml spuit met een 18 G naald, prik de buis net onder de 1,5 g / ml dichtheid laag (Figuur 2, rode pijl) en trek ~ 1,5 ml in de spuit.
    9. Verzamel de bovenste fractie door langzaam de naald en waardoor de resterende fractie in de buis te druppelen in een nieuwe 15 ml buis door de punctie. Bestempelen dit als "bovenfractie afval".
    10. Verzamel de 1,5 g / ml fractioneringn (met VLP's) van de spuit door het uitwerpen van de inhoud in twee nieuwe microfugebuizen.
    11. Herhaal stap 2.3.8-2.3.10 voor alle monsters.
    12. Voeg 0,2 volume chloroform in het virale concentraat, schud krachtig, incubeer bij kamertemperatuur gedurende 10 min centrifugeren bij maximale snelheid gedurende 5 min, en het verzamelen van de waterige fase.
    13. Voeg 10x DNase buffer en DNase I (eindconcentratie = 2,5 U / ul) in de met chloroform behandelde virale concentraat en incubeer bij 37 ° C gedurende 1,5-2 uur.
    14. Inactivatie van het DNase activiteit bij 65 ° C gedurende 15 min.
    15. Verwijder 15 ul van de chloroform en DNase I-behandelde virale fractie in een nieuwe buis en voeg 15 ul 4% paraformaldehyde om het monster voor epifluorescentiemicroscopie lossen.
  4. DNA Extraction
    1. Pool virale concentraten van elk monster in een gereinigd en geautoclaveerd 50 ml Oak Ridge hoge snelheid centrifuge buis.
    2. Voeg de volgende: 0,1 volume 200x TE-buffer, 10 pi 0,5 M EDTA per ml sruim, 1 volume formamide en 10 pl glycogeen. Goed mengen en incuberen bij kamertemperatuur gedurende 30 min.
    3. Met de nieuwe volumes, voeg 2 volumina kamertemperatuur 100% ethanol. Goed mengen en incuberen bij 4 ° C gedurende ten minste 30 min.
    4. Pellet DNA door het draaien van de buis bij 17.226 xg gedurende 20 min bij 4 ° C met een SS-34 rotor.
    5. Verwijder het supernatant voorzichtig met een serologische pipet. Was de pellet twee keer met ijskoude 70% ethanol.
    6. Verwijder zoveel mogelijk vloeistof en de pellet aan de lucht drogen bij kamertemperatuur gedurende 15 minuten.
    7. Resuspendeer de DNA pellet in 567 ul van 1 x TE buffer (pH 8,0).
      OPMERKING: Laat minstens 15 min voor volledige resuspensie bij kamertemperatuur. Bewaar de geresuspendeerde DNA overnacht bij 4 ° C tot verdere verwerking.
    8. Breng de volledige 567 ul geresuspendeerde DNA oplossing in een nieuwe 1,5 ml microfugebuis. Voeg 30 ul van voorverwarmde 10% SDS en 3 ui van proteïnase K (20 _6; g / ml), meng zorgvuldig en incubeer gedurende 1 uur bij 56 ° C. Voorverwarmen CTAB / NaCl bij 65 ° C.
    9. Voeg 100 ul van 5 M NaCl en meng goed. Voeg 80 ul van voorverwarmde CTAB / NaCl-oplossing, vortex en incubeer gedurende 10 minuten bij 65 ° C.
    10. Voeg gelijk volume chloroform, vortex mengen en centrifugeren bij 16.100 xg gedurende 5 minuten.
    11. Breng het supernatant naar een nieuwe 1,5 ml microfugebuis. Voeg een gelijk volume fenol / chloroform, vortex mengen en centrifugeren bij 16.100 xg gedurende 5 minuten.
    12. Breng het supernatant naar een nieuwe 1,5 ml microfugebuis. Voeg een gelijk volume chloroform, vortex mengen en centrifugeren bij 16.100 xg gedurende 5 minuten.
    13. Breng het supernatant naar een nieuwe 1,5 ml microfugebuis. Voeg gelijk volume isopropanol aan het supernatant fractie, mengen en incuberen bij -20 ° C gedurende ten minste 30 min.
    14. Pellet de DNA rotatie bij 16.100 xg gedurende 15 min bij 4 ° C. Pipetteer het supernatant voorzichtig en was het pellet tweemaal met ijskoude 70% ethanol. Voer een korte draai en verwijder de resterende ethanol uit de buis. Lucht droog de pellet gedurende 15 min.
    15. Resuspendeer de DNA pellet met 50 ui elutiebuffer (5 mM Tris, pH 8,5). De pellet te rehydrateren tenminste 5 min bij kamertemperatuur geroerd.
    16. Kwantificeren van het DNA met een hooggevoelige fluorescentie gebaseerde bepaling.
  5. Amplificatie met behulp Phi29 Polymerase (optioneel)
    1. Bereid 2x hybridisatie buffer: 80 mM Tris-HCl (pH 8,0), 20 mM MgCl2.
    2. Verdun Phi29 DNA-polymerase tot 5 U / pl.
    3. Voormengsel sample buffer, bestaande uit 50 pl willekeurige hexameer primer (100 uM), 125 ul 2x hybridisatie buffer en 25 pl water. Aliquot en bewaar bij -20 ° C.
    4. Voormengsel reactiebuffer, bestaande uit 100 pl Phi29 10x buffer, 40 ui 10 mM dNTP en 560 pl water. Aliquot en bewaar bij -20 ° C.
    5. Voeg 1 ul mal DNA in 4 pl monsterbuffer.
    6. Incubeer the mengsel bij 95 ° C gedurende 3 minuten en afkoelen op ijs.
    7. Voeg 14 pl reactiebuffer in het mengsel van 2.4.4, meng door en neer te pipetteren.
    8. Voeg 1 pl Phi29 DNA-polymerase, meng door en neer te pipetteren, en geïncubeerd bij 30 ° C gedurende 18 uur gevolgd door 65 ° C gedurende 10 min.
    9. Het schoonmaken van de reacties met behulp van genomische DNA kolommen of fenol / chloroform en ethanol neerslag.
  6. Epifluorescentiemicroscopie (Zie Haas et al. 2014 28 voor filtratie systeem setup)
    OPMERKING: Na isolatie en zuivering epifluorescentie microscopie met nucleïnezuur kleurstoffen kunnen worden gebruikt om de aanwezigheid en de zuiverheid van virale deeltjes in monsters (figuren 2A en 2C) controleren. Vrije DNA in het monster kan leiden tot hoge achtergrond fluorescentie geven. Daarom moet het monster DNase I behandeld vóór fixatie en kleuring voor microfoto.
    1. Bereid mount oplossing (0,1% ascorbinezuur, 50% glycerol). Voeg 100 ui 10% ascorbinezuur 4,9 ml 1x fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS), meng grondig. Voeg 5 ml 100% glycerol aan het mengsel, meng zorgvuldig en label de buis als "mount".
    2. Filterhouder met een 0,02 urn alumina matrix wegwerpspuit filter, aliquot in microfuge buizen en bewaar bij -20 ° C.
    3. Aliquot 100 pl monster in een nieuwe microfugebuis en voeg gelijk volume van 4% paraformaldehyde aan de VLP lossen. Incubeer het mengsel bij kamertemperatuur gedurende ten minste 10 minuten.
    4. Vul met water aan tot 1 ml door het toevoegen van 800 pi van 0,02 micrometer-gefilterd water. Voeg 1 ui SYBR Gold vlek in de buis en incubeer bij kamertemperatuur gedurende 10 minuten.
    5. Het opzetten van het filtersysteem door te draaien aan de vacuümpomp tussen -9 en -10 psi (-62,1 en -68,9 kPa).
    6. Was de sokkel met water en plaats een 0,02 micrometer aluminamatrix filter met ringvormige polypropyleen ondersteuning ring in het filter voetstuk.
    7. Plaats een filter toren bovenop het filter voetstuk met het filter en veilig met een klem.
    8. Pipetteer de inhoud van de 1,5 ml microfugebuis in het filter toren, en laat een paar minuten voor het monster te filteren door.
    9. Label en pipet 10 ul van mount reagens in een microscopisch preparaat.
    10. Laat het vacuüm op tijdens het verwijderen van het filter toren en klem.
    11. Haal de filter uit de filter voetstuk en dep de onderkant van het filter met een Kimwipe, plaats dan het filter direct op de top van de berg in het microscopisch preparaat.
    12. Pipet nog eens 10 ul van mount reagens op het filter en plaats een dekglaasje over het filter.

3. Het genereren Microbiële metagenoom

  1. Bereiding van buffers en oplossingen
    1. Bereid 50 ml 1x DNase buffer: 50 mM NaAc, 10 mM MgCl2, 2 mM CaCl2; pH op 6,5. Filter steriliseren (0,22 pm) en op te slaanbij kamertemperatuur.
    2. Bereid DNase I enzym tot 1000 U / pl (moleculaire waterbehandeling) vanaf gevriesdroogd runder pancreas DNase I volgens de activiteit die door Dornase eenheid / mg drooggewicht.
    3. Bereiding van 100 ml SE buffer: 75 mM NaCl, 25 mM EDTA; pH op 7,5. Filter steriliseren (0,22 pm) en bij kamertemperatuur bewaren.
  2. Monstervoorbehandeling Voorafgaand aan DNA Extraction
    1. Verdun het homogenaat met 5 volumes van 0,22 pm gefiltreerd 1x PBS voegen. Bijvoorbeeld, voeg 10 ml 1x PBS in 2 ml van het monster.
    2. Voeg β-mercaptoethanol tot 2% (v / v) eindconcentratie. Rock het mengsel (chemische afzuigkap) bij kamertemperatuur gedurende 2 uur.
    3. Spin het monster bij 10 ° C en 3056 g gedurende 15 min en gooi supernatans.
    4. Resuspendeer de pellet in 10 ml moleculaire kwaliteit water (of 0,22 pm gefilterd water), en incuberen bij kamertemperatuur gedurende 15 minuten.
    5. Herhaal de stappen 3.2.3 en 3.2.4 een keer.
    6. Spin bij 10 ° C en 3056 g gedurende 15 min en gooi supernatans.
    7. Resuspendeer de pellet in 5 ml 1x DNase buffer en voeg 15 ul DNase I (1000 U / ul) per ml van het monster.
    8. Incubeer bij 37 ° C met herhaalde mengen gedurende 2 uur.
    9. Inactivatie van het DNase activiteit bij 65 ° C gedurende 15 min.
    10. Spin bij 10 ° C en 3056 g gedurende 15 min en gooi supernatans. Resuspendeer de pellet in 10 ml SE buffer.
    11. Herhaal stap 3.2.10.
    12. Spin bij 10 ° C en 3056 g gedurende 15 min en gooi supernatans.
    13. Resuspendeer de pellet in 2 ml SE buffer en over naar twee microfugebuizen.
    14. Pellet de cellen in de microfuge buizen. Spin de buizen bij 16.100 xg bij kamertemperatuur gedurende 15 minuten.
    15. Verwijder het supernatant en extraheren van DNA uit de gepelleteerde cellen met een genomisch DNA extractie kit, Gram-positieve variatie protocol.

4. Het genereren Metatranscriptome

  1. Monster Pre-behandeling
    1. Voeren mechanische lysis van cellen door kraal afstraffing in GITC-lysebuffer onmiddellijk na monstername en homogenisering. Zie stap 1.4.
    2. Spin het mengsel bij 4 ° C en 600 g gedurende 5 min naar de siliciumoxideparels pellet.
    3. Breng de bovenstaande in een nieuwe buis.
    4. Voeg 200 ul chloroform elk 750 pl GITC-lysis buffer gebruikt, schud krachtig met de hand gedurende 15 seconden incuberen bij kamertemperatuur gedurende 10 minuten en centrifugeren bij 4 ° C en 3056 g gedurende 15 min. Tijdens deze 15 minuten draaien, voor te bereiden op stap 4.2.
    5. Na de 15 minuten draaien (een duidelijke scheiding van de waterfase vormen fase-interfase-organisch), verwijder de waterige fase (zonder verstoring van de interfase) in nieuwe RNase gratis tube (s).
      OPMERKING: De waterige fase bevat het RNA. Houd de buizen op ijs tot de volgende stap.
  2. Voeren totale RNA-extractie en zuivering met behulp van in de handel verkrijgbare RNA zuivering-column gebaseerd kits of conveNtional-isopropanol gebaseerde RNA neerslag.
    1. Silica Column-gebaseerde RNA Purification
      1. Meet het totale volume van de waterige fractie verkregen.
      2. Voeg het juiste volume van de RNA-bindende buffer om te proeven en meng goed.
      3. Pas mengsel tot bindende voorwaarde eigenen volgens het protocol van de fabrikant. Meng goed en doe een korte centrifuge.
      4. Plaats het mengsel in de RNA-kolom. Voor een groot volume monster, gebruik van meerdere laden en laden elke kolom tot 4x. Anders overwegen gebruik te maken van meerdere kolommen voor elk monster.
      5. Was de kolom behoren volgens het protocol van de fabrikant.
      6. Elueer het RNA met ten minste 30 gl RNase-vrij water. Double-elutie zal licht stijgen de opbrengst van RNA. Dit zal echter de RNA-concentratie te verdunnen.
      7. Meet de RNA-concentratie en gaat direct naar DNase I behandeling. Gebruik de Bioanalyzer de kwaliteit van het RNA controleren (aanbevolen).
      8. RNA Neerslag
        1. Voeg een gelijk volume isopropanol (bijvoorbeeld 500 pl isopropanol in 500 pl waterige fractie) en 2 ui 10 pg / ul RNase-free glycogeen het monster.
        2. Incubeer het mengsel bij kamertemperatuur gedurende 10 minuten.
        3. Spin bij 12.000 xg en 4 ° C gedurende 15 min.
        4. Verwijder voorzichtig het supernatant, voeg 1 ml van RNase-vrij 75% ethanol. Draai het mengsel bij 7500 xg en 4 ° C gedurende 5 minuten om ervoor te zorgen dat de pellet intact is.
        5. Verwijder de ethanol voorzichtig.
        6. Herhaal de stappen 4.2.2.4 en 4.2.2.5 keer.
        7. Lucht droog de pellet gedurende 10 min.
        8. Hydrateren de pellet in 50 gl RNase-vrij water, incubeer bij 55 ° C gedurende 5 minuten en gaat rechtstreeks naar DNase behandeling. Gebruik de Bioanalyzer om de kwaliteit van het RNA te controleren (aanbevolen).
        9. WINKEL RNA in hoeveelheden bij -20 ° C of -80 ° C voor langdurige opslag.

Representative Results

Virale metagenomes

CF sputum is buitengewoon viskeus en bevat een grote hoeveelheid mucine en vrij DNA (Figuur 2A); de dichtheidsgradiënt ultracentrifugatie vergemakkelijkt de verwijdering van gastheer afkomstig DNA (Figuur 2B). De resultaten van een eerdere studie 9 toont acht viromes gegenereerd uit de gepresenteerde workflow worden hier samengevat (tabel 1). Zeven monsters (CF1-D, CF1-E, CF1-F, CF4-B, CF4-C, CF5-A en CF5-B; Tabel 1) werd verwerkt zoals beschreven in hoofdstuk 2. De gegenereerde viromes kleine bevatte (0,02 % -3.7%) van mensen afkomstige sequenties met slechts één uitzondering (70%). CF4-A werd weggelaten uit de dichtheidsgradiënt ultracentrifugatie stap (CF4-A) en de virome gegenereerd uit dit specifieke monster bevatte> 97% van mensen afkomstige sequenties (tabel 1). Figuur 2 toont een voorbeeld van epifluorescentie microscopie afbeelding van een typische CF sputum monster voor (figuur 2A) en na (figuur 2C) dichtheidsgradiënt ultracentrifugatie. Clear virusachtige deeltjes (VLP's) werden in de microfoto gezien zonder grote deeltjes na de dichtheidsgradiënt scheiding. Na VLP DNA extractie wordt bacteriële besmetting vaak getest met 16S rDNA amplificatie vóór het sequencen van VLP DNA.

Microbiële metagenomes

Zeven sputum monsters hier gepresenteerd werden verzameld uit een enkele CF-patiënt in zeven opeenvolgende dagen. De patiënt begon op orale antibiotica (ciprofloxacine en doxycycline) op dag 3 na het sputum werd verzameld. Het volume van elk sputum monster vanuit deze patiënt was 15 ml gedurende 7 dagen; Daarom werd PBS niet toegevoegd aan het monster. Het doel van deze bemonstering evenement was om de protocollen in deze workflow door (i) de evaluatie van de dagelijkse schommelingen van de microbiële gemeenschap structuur te evalueren, en (ii) te vergelijkende microbiële gemeenschap structuur en de resolutie tussen metagenomica en 16S rDNA sequencing. Daarom totaal DNA en HL-DNA werd geëxtraheerd uit elk monster.

De HL-DNA concentratie van elk sputummonster volgende DNA extractie wordt weergegeven in Tabel 2. De totale opbrengst van HL-DNA varieerde van 210 ng tot> 5 ug. Illumina sequencing bibliotheken werden gemaakt met een totaal uitgangsmateriaal van 1 ng per monster (figuur 3). De kenmerken van de metagenomica gegevens worden in tabel 2. Op één bibliotheek leverde meer dan 1.000.000 sequenties en meer dan 85% hoge kwaliteit sequenties werden behouden aan data preprocessing met de PRINSEQ 29 software. Alle datasets werden voor het eerst voorbewerkt om duplicaten en sequenties van lage kwaliteit (minimum kwaliteit score van 25), gevolgd door verdere screening en verwijdering van mensen afgeleide sequenties met behulp DeconSeq 30 verwijderen. De hoeveelheid humaan-derived sequentie vervuiling sterk afhankelijk van het monster eigenschappen. Hier, de totale hoeveelheid humaan-afgeleide sequenties varieerde 14-46% (tabel 2). De voorbewerkte sequenties werden vervolgens geannoteerd met behulp van de Metaphlan 31 pijplijn evenals MG-RAST 32 server.

Naast metagenomes werden 16S rDNA amplicon bibliotheken gegenereerd uit zowel het totaal DNA en HL-DNA via primers gericht op ongeveer 300 bp van het V1-V2 variabele gebied in het 16S rRNA gen 33,34. PCR producten van individuele monsters werden genormaliseerd en samengevoegd voor sequencing met de Illumina 500 cycle gepaarde-end sequencing uitgevoerd op de MiSeq platform. Gepaarde-end 16S rDNA amplicon sequenties zijn gesorteerd op monster via barcodes met behulp van een python script en de gepaarde leest werden geassembleerd met behulp van phrap 35,36. Geassembleerde opeenvolging uiteinden werden afgezet totdat de gemiddelde kwaliteit score werd ≥20 met behulp van een 5 nt venster. Potentiële hersenschimmen waren den verwijderd met behulp van Uchime 37 tegen een hersenschim gratis subset van de SILVA 38 referentie-sequenties. Taxanomy werd toegewezen aan de hoge kwaliteit leest met SINA 39 (versie 1.2.11) met behulp van de 418.497 bacteriële sequenties uit de SILVA 38 database. Sequenties met identieke taxonomische opdrachten werden geclusterd tot Operational Taxonomische Units (OTU's) te produceren. Dit proces gegenereerd 1.655.278 sequenties voor 16 monsters (gemiddelde grootte: 103.455 sequenties / monster; min: 72.603; max: 127.113). De mediane Goederen dekking score, een maat voor de volledigheid van sequencing, was ≥ 99,9%. Het softwarepakket Explicet 40 (v2.9.4, www.explicet.org) werd gebruikt voor analyse en figuur generatie. Alpha-diversiteit (intra-monster) en beta-diversiteit (inter-monster) werden berekend Explicet op de verdunning punt van 72.603 sequenties met 100 bootstrap re-proeverijen.

De eerste vraag die bij dit onderzoek was of hypotone lysis preferentibondgenoot kiest voor (dat wil zeggen, bij voorkeur behoudt of lyses) bepaalde groepen van microben. Na de eerste hypotonische lysis werden geresuspendeerd celpellets subsampled van de eerste twee monsters (CF1-1A * en CF1-2A *) te vergelijken met dezelfde monsters na de tweede hypotonische lysis (CF1-1and CF1-2). Alle monsters werden behandeld gelijk, dat wil zeggen behandeld met DNase I voor DNA extractie, gevolgd door DNA-extractie en de sequencing pijpleiding. Zoals getoond in figuur 4, het microbiële profiel van de deelmonsters zeer vergelijkbaar met de monsters na twee hypotone lysis behandelingen. Bovendien, de tweede hypotonische lysis verhoogt de fractie van niet-humane sequenties met 6-17% binnen metagenomes (tabel 2).

Om te testen voor verschillen in microbiële samenstelling tussen metagenomic- en 16S rDNA-gebaseerde profilering, en voor veranderingen voor en na hypotone lysis dat de verschillen kunnen verklaren eerder te zien tussen onze studs en anderen, werden bacteriële 16S rDNA sequentie bibliotheken gegenereerd uit zowel het totaal DNA en HL-afgeleide DNA (Figuur 4B). Op genus niveau, de taxonomie profielen van de common-CF-geassocieerde bacteriën zoals Pseudomonas, Stenotrophomonas, Prevotella, Veillonella, en Streptococcus waren zeer vergelijkbaar tussen de 16S rDNA bibliotheken en metagenomes gegenereerd op basis van de HL-afgeleide DNA. Echter, Rothia detectie in het 16S rDNA bibliotheken niet zo overvloedig als de metagenomic bibliotheken. Bij vergelijking van de 16S rDNA taxonomische profielen gegenereerd uit totaal DNA en HL-afgeleide DNA werd Pseudomonas differentieel vertegenwoordigd in het totaal DNA vergeleken met de HL afgeleide DNA startpunt van dag 3.

Metatranscriptomes

Kenmerkend is dat de totale RNA geëxtraheerd uit CF sputum is gedeeltelijk afgebroken en de grootte varieert van 25-4,000 bps (figuren 5A en et al. 2012 9. De fractie van rRNA in de niet verarmde metatranscriptomes varieert 27-83% en de relatieve hoeveelheid van rRNA varieerden monsters (Tabel 3; gegevens uit Lim et al. 9). Echter, depletie met Ribo-Zero kit verminderde de rRNA relatieve abundantie van rRNA tot 1-5% met uitzondering van monster CF1-F. De variatie in de effectiviteit van rRNA verwijdering kunnen de kwaliteit van geëxtraheerde RNA, of verschillen in de microbiële gemeenschap aanwezig en dus de toegankelijkheid van rRNA hybridisatie probes 9 weerspiegelen. De elektroferogrammen van een succesvolle (figuur 5B) en mislukte (figuur 5D) rRNA verwijderingsprocedure met de Ribo-Zero rRNA demontageset verschillen, waarbij rRNA pieken zichtbaar zijn in de mislukte verwijderen.

De orde van grootte van cDNA bibliotheken gevergoede vaak een afspiegeling van de orde van grootte van het starten van RNA-monster. De cDNA-bibliotheken die hier gepresenteerd werden gegenereerd met een hele transcriptoom amplificatie kit (WTA2) bij rRNA uitputting gevolgd door Roche-454 sequencing bibliotheek bereiding 9. De cDNA-gegenereerde fragmenten bevatten variërend van 50-4,000 bps (figuren 5E en 5F) en zeer consistent monsters (Lim et al. 2012) 9. De beschikbaarheid van andere platform-specifieke RNA-Seq preparaat bibliotheek kits nog meer bieden andere mogelijkheden voor een cDNA-synthese en bereiding sequencing bibliotheek combineren optimale omstandigheden. Een aanbevolen optie tot op heden is de ScriptSeq Compleet Gold Kit combineren rRNA verwijderen reagentia hierboven aanbevolen en RNA-Seq voorbereiding bibliotheek kit.

Figuur 1
Figuur 1: Workflow voor de prepreiding van de host geassocieerd monsters, zoals sputum monster, voor virome, microbioom en metatranscriptome sequencing.

Figuur 2
Figuur 2: Cesiumchloride dichtheidsgradiënten ultracentrifugatie vergemakkelijkt de verwijdering van extracellulair DNA en grote deeltjes (A), en zorgen voor optimale isolatie van virusachtige deeltjes van CF sputum. Eén milliliter van elk gradiënt gelaagd bovenop elkaar vóór het laden van het voorbehandelde monster (B). Na deeltjes isoleren en zuiveren, epifluorescentie microscopie met nucleïnezuur kleurstoffen zoals SYBR Gold worden gebruikt om de aanwezigheid en de zuiverheid van virale deeltjes in monsters controleren. Duidelijke virale-achtige deeltjes (C; witte pijl) werden waargenomen na de dichtheid gradiënt scheiding van CF sputummonster.


Figuur 3:. Voorbeeld van de grootteverdeling van Nextera XT bibliotheken gegenereerd uit 1 ng HL-DNA die resulteerde in CF sputum microbiomes Library normalisatie, poolen en lading hoeveelheid werd uitgevoerd zoals beschreven in de fabrikant protocol zonder enige afwijking.

Figuur 4
Figuur 4: Taxonomische analyse van microbiële populaties in negen monsters lengterichting vanuit een CF patiënt (A) Microbiële profielen gebaseerd op de metagenomic bibliotheken gegenereerd uit hypotone lysis-methode gebaseerde DNA.. De soort opdracht is gebaseerd op het Metaphlan pijpleiding volgende data preprocessing dat duplicaten en sequenties met lage kwaliteit en humane sequentie homologie verwijderen. Om deze twee-st toneneps hypotone lysis niet preferentieel geselecteerd voor bepaalde groepen microben, submonsters (*) na de eerste hypotonische lysis opgenomen. (B) Microbiële profielen gebaseerd op de V1V2 regio van 16S rRNA gensequentie uit totaal DNA (T) en hypotone lysis werkwijze gebaseerde DNA (HL). Deze gegevens zijn niet eerder gepubliceerd.

Figuur 5
Figuur 5: Voorbeelden van Agilent 2100 Bioanalyzer elektroferogrammen RNA (AD) en cDNA (EF) gegenereerd voor de metatranscriptomic bibliotheken, gebruikmakend van RNA pico en hoge gevoeligheid dsDNA chips respectievelijk. (A) en (C) tonen de voorbeelden van elektroferogrammen voor rRNA verwijderingsprocedures. De elektroferogrammen van een succesvolle (B) en mislukte (D) rRNA verwijderingsprocedure middels totale rRNA demontageset verschillen enigszins, eent die pieken rRNA zichtbaar in de mislukte verwijderen. Het groottebereik van cDNA (EF) gegenereerd met het hele transcriptoom amplificatie kit (Sigma-Aldrich) is vergelijkbaar met het groottebereik van het uitgangs-rRNA verarmd RNA en uiterst consistent in de twee verschillende monsters. Klik hier om te bekijken grotere versie van deze figuur.

CF1-D CF1-E CF1-F CF4-A CF4-B CF4-C CF5-A CF5-B
Totaal aantal leest 224.859 87.891 106.189 93.301 140.020 1.558 272.552 217.438
Voorbewerkt leest een 109.389 73.624 67.070 82.011 68.617 1.137 215.808 158.432
49% 84% 63% 88% 49% 73% 79% 73%
Aantal bases 47.239.573 33.351.525 28.922.479 27.667.695 29.386.841 243.986 95.205.805 69.581.811
Bedoel gelezen lengte 432 453 431 337 428 215 441 439
Host sequenties b 240 526 28 79.774 13 797 585 5859
0,21% 0,71% 0,04% 97,27% 0.02% 70.10% 0,27% 3.70%
Virale treffers c 7214 23.550 4.070 737 4642 22 6466 5981
6,59% 31.99% 6.07% 0,90% 6,77% 1,93% 3.00% 3,78%
Niet toegewezen Leest d 103.888 60.490 32.780 1935 68.440 311 105.612 119.551
94,97% 82.16% 48,87% 2,36% 99.74% 27.35% 48,94% 75,46%
een Leest na data pre-processing door PRINSEQ 29.
b Human leest geïdentificeerd door DeconSeq 30 plus leest met een beste BLASTN hit (NCBI nucleotide database) tot phylum Chordata.
c TBLASTX raakt tegen de in-house virale genoom database. Het percentage werd berekend op basis van het totaal aantal voorbewerkte leest.
d Leest zonder BLASTN sloeg tegen de NCBI nucleotide database. Het percentage werd berekend op basis van het totaal aantal voorbewerkte leest. Sommige leest zonder BLASTN sloeg tegen de NCBI nucleotide-database werden geïdentificeerd als virale op eiwit niveau in de TBLASTX analyse.

Tabel 1:. Bibliotheek kenmerken van acht viromes gegenereerd uit sputum monsters met behulp gepresenteerd workflow wordt deze tabel gewonnen uit Lim <em> et al. (2012) 9. Zeven monsters (CF1-D, CF1-E, CF1-F, CF4-B, CF4-C, CF5-A, en CF5-B) werd verwerkt zoals beschreven in hoofdstuk 2 en gegenereerd viromes dat kleine (0,02% bevatte - 3.7 %) humaan-afgeleide sequenties met één uitzondering (70%). CF4-A werd weggelaten uit de dichtheidsgradiënt ultracentrifugatie stap (CF4-A) en gegenereerde virome dat> 97% van mensen afkomstige sequenties bevatte.

Monster Concentratie Totale opbrengst Totaal Aantal Leest Totaal Aantal Leest (Verwerkte b) Niet-menselijke sequenties
(Ng / ul) (Ng) (Raw a) (%)
CF1-1A * 2.3 1.098.454 937.688 691.541
74%
CF1-1 13 1300 2.212.756 1.958.910 1.574.520
80%
CF1-2A * 2.1 210 672.878 588.106 407.530
69%
CF1-2 5.2 520 1.944.012 1.697.010 1.455.174
86%
CF1-3 28.8 2880 1.048.304 896.756 560.852
63%
CF1-4 24.1 2.410 1.154.922 984.702 621.098
63%
CF1-5 33.6 3360 1.029.622 888.630 481.548
54%
CF1-6 43.2 4320 1.434.016 1.256.504 725.858
58%
CF1-7 57.8 5780 1.000.174 872.036 565.376
65%
* 1 ml monster werd subsampled van CF1 -1 En CF1-2 na de eerste hypotone lysis stap (stap 3.1.5) voor de tweede hypotone lysis procedure. De cellen werden gecentrifugeerd zoals beschreven in 3.1.7 en verder door de resterende protocol zonder enige wijziging.
een Onverwerkte Illumina leest van een 2 x 300 bp MiSeq sequencing run.
b Leest werden beoordeeld, getrimd, en verwijderd worden op basis van kwaliteit en lengte als omschreven in de discussie.

Tabel 2:. Kenmerken van microbiomes gegenereerd uit sputum monsters met behulp gepresenteerd workflow De DNA-concentratie van elk monster in 100 ui elutiebuffer (5 mM Tris / HCl, pH 8,5) en de kenmerken van sequentiegegevens worden gepresenteerd. Een totaal van 1 ng werd gebruikt om individuele bibliotheek genereren met de Nextera XT bibliotheek bereiding kit.

0 "fo: keep-together.within-page =" always "> Monster CF1-D CF1-F CF4-B CF4-C Behandeling Geen Ribo-Zero Geen Ribo-Zero Geen Ribo-Zero Geen Ribo-Zero Voorbewerkte leest 2.088 1991 40.876 25.238 19.728 32.737 31.791 36.172 Bedoel gelezen lengte 275 245 262 270 233 259 240 267 Totaal rRNA leest 1737 91 29.499 17.267 5285 291 16.371 1.761 83,20% 4.60% 72.20% 68.40% 26.80% 0,90% 51.50% 4.90% Microbiële rRNA 1.414 32 19.978 12.035 23 227 6916 1076 67,70% 1,60% 48.90% 47.70% 0,10% 0,70% 21.80% 3.00% Eukaryota rRNA 323 59 9520 5232 5262 64 9455 683 15.50% 3.00% 23.30% 20.70% 26.70% 0,20% 29.70% 1.90% % RRNA verwijderd * 0% 95% 0% 5% 0% 97% 0% 91% Niet-rRNA leest 351 (16,8%) 1900 (95.4%) 11.377 (27,8%) 7971 (31,6%) 14.443 (73,2%) 32446 (99.1%) 15.420 (48,5%) 34411 (95.1%) Totaal NR treffers 102 (4,9%) 691 (34,7%) 3327 (8,1%) 2.857 (11,3%) 4938 (25,0%) 10.751 (32,8%) 5905 (18,6%) 15.766 (43,6%) Eukaryotic 74 407 2790 2.524 4614 10.227 4553 8274 Bacterie- 26 283 520 312 287 471 1.326 7442 Niet toegewezen leest 249 (11,9%) 1.209 (60,7%) 8.050 (19,7%) 5114 (20.3%) 9505 (48,2%) 21695 (66.3%) 9515 (29,9%) 18.645 (51,5%) * De hoeveelheid rRNA verwijderd uitgedrukt als percentage van de in het niet verarmde aliquot bedrag.

Tabel 3:. Library kenmerken van de metatranscriptomes met en zonder rRNA uitputting De gegevens worden geëxtraheerd uit Lim et al (2012) 9, die aanvullende vergelijking van andere rRNA verwijdering kits en het effect van cDNA verneveling vóór bereiding sequencing bibliotheek..

Discussion

Virale Metagenomics

Virale deeltjes worden geconcentreerd met polyethyleenglycol (PEG) precipitatie of klein volume concentrators. In sommige gevallen kan de concentratie niet nodig, maar voorfiltratie of lage snelheid centrifugatie stappen worden gebruikt om eukaryotische en microbiële cellen te verwijderen. Virale lysaten zal verder worden verrijkt en gezuiverd met dichtheidsgradiënt ultracentrifugatie 9,41 of filters klein formaat (bijvoorbeeld 0.45 pm) waardoor eukaryotische en grote microbiële cellen 25 verwijderen. Dichtheidsgradiënt ultracentrifugatie wordt typisch uitgevoerd met dichte maar inert oplossingen zoals sucrose of cesiumchloride isoleren en concentreren virusdeeltjes 41. Fysieke scheiding is gebaseerd op de grootte en de drijvende dichtheid van virale deeltjes. Derhalve juiste keuze van filter poriegrootte en de zorgvuldige voorbereiding van gradiënten zijn essentieel voor specifieke virale gemeenschappen isoleren, het succes van de fysieke herstel vanVLP bepaalt de gemeenschap geïsoleerd 41 (dwz virale deeltjes die niet door het filter of vallen binnen de extractie dichtheid niet wordt gedetecteerd in het metagenoom). Na virale isolatie en concentratie, kunnen er contaminerende niet-viraal genomisch materiaal in het monster, zowel in de vorm van vrije nucleïnezuren en microbiële en eukaryotische cellen. Daarom is het essentieel om de zuiverheid van virale deeltjes in monsters (Figuren 1A en 1B) controleren. Een chloroform behandeling wordt vaak gebruikt om overblijvende cellen, gevolgd door nuclease behandeling om vrije nucleïnezuren vóór nucleïnezuurextractie afbreken lyseren.

Een nadeel met de bij workflow was het gebruik van dichtheid gradiënt scheiding virale deeltjes te isoleren als het omhulde virale deeltjes die te drijfvermogen om het CsCl gradiënt voeren kan uitsluiten. Een alternatief "catch-all" methode is om de dichtheidgradiënt SEPAR weglatenatie en isoleren van de gemeenschap DNA van de 0,45 pm - filtraat behandeld met chloroform en DNase I. Deze benadering is ook zinvol om kleine steekproef volumes zoals die van wattenstaafjes of bloedplasma tegemoet te komen. Dit kan echter resulteren in chloroform-resistente bacteriële contaminatie en grotere hoeveelheid DNase I-resistente extracellulaire DNA.

Voor sequencing protocollen vereisen 1 ng tot 1 ug nucleïnezuren voor bereiding sequencing bibliotheek waarbij hogere DNA opbrengst bieden een ruimere keuze aan sequentiebepaling opties. De DNA concentratie gegenereerde viromes vaak varieert de detectielimiet meer dan 200 ng / ul. De hoeveelheid virale nucleïnezuren hersteld kan onvoldoende voor directe voorbereiding sequencing bibliotheek. In dergelijke gevallen nucleïnezuur amplificatie noodzakelijk. Linker amplificatie shotgun bibliotheken (LASLs) 2,42,43 en gehele genoom amplificatie op basis van meerdere verdringing amplificatie (MDA) zijn de tweemethoden het meest gebruikt om voldoende DNA voor sequencing genereren. MDA methoden zoals die gebaseerd op Phi29 DNA-polymerase bekend te lijden aan amplificatie vooroordelen, en kunnen bij voorkeur versterken ssDNA en circulair DNA, resulterend in niet-kwantitatieve taxonomische en functionele karakterisatie 44,45. Een geoptimaliseerde versie van de LASLs benadering is aangetoond dat slechts minimale biases voeren, bevordert een hogere gevoeligheid (voor kleine hoeveelheden uitgangsmateriaal) en wordt gemakkelijk aangepast voor verschillende sequencing platforms 43. Echter, de benadering vele stappen vereist speciale apparatuur om DNA te minimaliseren, en is beperkt tot dsDNA templates. In ons laboratorium, heeft deze aanpak met succes aangepast aan detecteerbare en niet-detecteerbare hoeveelheid DNA geëxtraheerd uit bronchoalveolar lavage-, koraal- en zeewater afkomstig VLP (ongepubliceerd en Hurwitz et al. 46) te versterken.

Het ontwikkelen van data-analyse pijpleidingen heeft classically is een van de meest uitdagende aspecten van virale metagenomica analyse te wijten aan de zeer diverse en grotendeels onbekende aard van de virale gemeenschappen. Hoewel er naar schatting 10 8 virale genotypen in de biosfeer, tot dusver bestaande virale databases bevatten ~ 4000 virale genomen, dat is ongeveer 1/100000 ontvangt deze totale virale diversiteit. Daarom similarity-gebaseerde zoekopdrachten (zoals BLAST 47) voor taxonomische en functionele opdracht virale metagenomes bezitten inherente uitdagingen. Veel sequenties niet significante overeenkomsten met genomen in de database, en daarom geclassificeerd als onbekend. Ook al-homologie gebaseerde zoekopdrachten zijn de belangrijkste toepassingen voor het toewijzen van taxonomie en functie om gegevens te sequencen, hebben alternatieve benaderingen op basis van de database-onafhankelijke analyse ontwikkeld 48- 50. Fancello et al. 51 zorgen voor een volledige herziening van computationele gereedschappen en algoritmen gebruikt in Viral metagenomica.

Microbiële Metagenomics

Gewoonlijk is de totale hoeveelheid DNA geëxtraheerd uit hypotone lysis behandelde microbiële gemeenschappen (HL-DNA) variëren van 20 ng tot 5 pg. De opbrengst is sterk afhankelijk van de gezondheidstoestand van de patiënt en de hoeveelheid sputum monster verzameld, waarin de variaties waargenomen in de totale opbrengst van HL-DNA in deze studie (Tabel 2) geëxtraheerd uit. De kritische stappen genereren goede kwaliteit sequentiegegevens vertrouwen op de kwaliteit van sequencing bibliotheken gegenereerd. Figuur 2 toont een typische bereik van de sequencing bibliotheken gegenereerd uit CF sputum afgeleide microbieel DNA met behulp van een enzymatische gebaseerde DNA fragmentatie procedure. De optimale bankgrootte is afhankelijk van de keuze van sequencing platform en applicatie, en derhalve kunnen de fragmentatie procedure geoptimaliseerd indien nodig via alternatieve methoden zoals sonicatie en verneveling. Bovendiende gepresenteerde representatieve resultaten, is het succes van de gepresenteerde methode op CF sputum verzameld van meerdere patiënten over meerdere tijdstippen ook geïllustreerd in Lim et al. (2012) 9 en Lim et al. (2014) 10.

Eerdere studies 9,10 suggereren dat elke patiënt herbergt een unieke set van microbiële gemeenschap dat verschuivingen in de tijd, en weerspiegelt aldus het voortbestaan ​​van de grote spelers binnen de gemeenschap, terwijl schommelingen zijn waarschijnlijk het gevolg van verstoringen zoals behandelingen met antibiotica. Of deze fluctuaties dagelijkse optreden, zelfs zonder externe verstoringen of als gevolg van sampling procedure en monster verwerking, is nog steeds in kwestie. Op basis van de HL-DNA metagenomic en 16S rDNA amplicon analyse, de 7-daagse longitudinale monsterneming blijkt dat de dagelijkse fluctuatie van microbiële profielen zonder antibioticum perturbatie (Dag 1, 2, en 3) was minimaal (Figuren 3A en 3B). Bij het introproductie van orale antibiotica onmiddellijk na de Dag 3 bemonstering, veranderingen in de gemeenschap profiel bleek op dag 4. Terwijl het antibioticum ciprofloxacine richt zich op een breed spectrum van bekende bacteriële pathogenen zoals P. aeruginosa, Staphylococcus aureus en Streptococcus pneumonia, de behandeling verhoogde de relatieve abundantie van P. aeruginosa bij een lagere Streptococcus spp. en P. melaninogenica. Op dag 6, de gemeenschap langzaam hersteld naar de oorspronkelijke uitgangspunt gemeenschap structuur. De resultaten suggereren dat schommelingen van microbiële profielen binnen een patiënt vaker gevolg door verstoringen in de luchtwegen.

Gezien de samenhang tussen het microbiële profiel van 16S rDNA bibliotheken en metagenomes van HL-afgeleide DNA, we uitgesloten de vooroordelen afkomstig van het 16S rRNA primers die in deze studie. Een mogelijke verklaring voor de verschillen gezien over 16S rDNA taxonomischeal profielen gegenereerd uit totaal DNA en HL-afgeleide DNA (figuur 3B) kan de aanwezigheid van grote hoeveelheden Pseudomonas spp. extracellulair DNA na behandeling met antibiotica. Dit wordt ondersteund door de bevindingen dat deze verschillen blijken duidelijk op dag 7, drie dagen na de behandeling met antibiotica, die Pseudomonas spp gericht. naast andere. Ciprofloxacine wordt vaak gebruikt als de eerste-lijns behandeling bij patiënten met CF en chronische P. aeruginosa infectie, ook al zijn werkingsspectrum omvat de meeste CF-gerelateerde pathogenen. Onze hypothese was dat de behandeling met antibiotica uitroeit gevoelig gemeenschappen, waaronder Streptococcus spp. en dus het creëren van een niche gevuld door resistente P. aeruginosa. Pseudomonas aeruginosa kan resistentie verwerven door verhoging van de biofilmgemeenschappen en extracellulair DNA is aangetoond dat de voornaamste structurele steun van de biofilm 52 zijn. Zelfs als tHij gemeenschap structuur hersteld, extracellulair DNA kan in het CF sputum zijn gebleven. Derhalve suggereren deze gegevens dat hypotone lysis en wasstappen in deze werkstroom potentieel voordelig in niet alleen het verwijderen van de mens afgeleide DNA, maar ook microbieel afgeleide extracellulaire DNA kan de werkelijke microbiële profielen verkeerd.

Transcriptoomstudie

Een hoge kwaliteit metatranscriptome moet relatief weinig ribosomaal RNA (rRNA) sequenties bevatten en vormen een onpartijdige bemonstering van de gemeenschap transcripten (mRNA). Vanwege de korte halfwaardetijd en beperkte hoeveelheid mRNA, is het essentieel dat het protocol, zoals hier voorgesteld, minimaliseert monsterbehandeling het aantal transcripten teruggewonnen te maximaliseren.

De laatste jaren hebben verschillende benaderingen voor het rRNA uitputting ontwikkeld en aangepast commercieel verkrijgbare kits. Deze omvatten Microb Enrich, Ribo-Zero, en sample-specifieke subtractieve hybridizations 53 die zijn gebaseerd op oligonucleotide hybridisatie, en de mRNA-ONLY kit die is gebaseerd op exonuclease enzymactiviteit gericht RNA dat een 5'-monofosfaat. Bovendien hebben verschillende benaderingen voor mRNA verrijkingen zoals MessageAmp II-bacteriën Kit voorkeur polyadenylates en versterkt lineaire RNA zijn ook beschikbaar. Sommige van deze methoden (bijvoorbeeld mRNA-ONLY, Microb E xpress en de MessageAmp) gelijktijdig worden gebruikt voor een optimale efficiëntie. Echter, de effectiviteit van al deze benaderingen zijn beperkt, vooral bij het werken met gedeeltelijk gedegradeerd rRNA, zoals vaak waargenomen in totaal RNA geëxtraheerd uit CF monsters. Polyadenylatie-afhankelijke RNA amplificatie kan niet worden gebruikt om metatranscriptomes bestaande uit zowel eukaryote en prokaryote mRNA genereren. Bovendien, het poly (A) staart toegevoegd aan de sequenties kan de hoeveelheid nuttige sequentiegegevens vermindert. Regio's met homopolymeer stukken zal de neiging om een ​​lagere kwaliteit scores hebben, causing een groot aantal leest door sequentiebepaling en post-sequencing software, en de gemiddelde nuttig gelezen lengte te filtreren na knippen uit poly (A) staarten aanzienlijk 54 verminderd.

Behandeling van complexe CF microbiële gemeenschappen en gedeeltelijk afgebroken RNA (Figuren 4A en 4C), onze eerdere studie toonde aan dat de hybridisatie-capture methode de Ribo-Zero Gold kit was effectiever menselijke en microbiële rRNA verwijderen tegenover de maaidorser behandelingen met andere kits 9 (Tabel 3). De resulterende gegevens maakt gelijktijdige analyse van zowel menselijke gastheer en microbiële transcripties. Afhankelijk van de opbrengst en kwaliteit van RNA, alsmede uiteindelijke keuze van sequencing platform, veel van deze processen met inbegrip van de cDNA-synthese stap kan worden gestroomlijnd sequencing bibliotheek generatie. Bijvoorbeeld kan Ribo-Zero behandelde RNA worden gebruikt metatranscriptome sequencing Libra makenries behulp ScriptSeq RNA-Seq Bibliotheek Voorbereiding kit.

Metagenomic analyse van dieren betrokken gemeenschappen biedt een uitgebreide weergave van het totale functionele entiteit die de gastheer en zijn betrokken gemeenschappen omvat. De hier gepresenteerde werkstroom is aangepast om een ​​verscheidenheid aan complexe dieren door monsters, met name die dik slijm, grote hoeveelheden celafval extracellulair DNA, eiwit en glycoproteïne complexen, alsmede gastheercellen bevatten naast de gewenste virale en microbiële deeltjes. Hoewel virale en microbiële deeltjes verloren bij elke stap, deeltjes isolatie en zuivering essentieel om de hoeveelheid gastheer DNA minimaliseren. Terwijl de metagenomica data geeft metabole potenties van de onderzochte gemeenschappen, transcriptoomstudie dit aanvullen door de onthulling van de differentiële expressie van gecodeerde functies 9. Een uitgebreide evaluatie van de genomica en transcripties gegevens heeft nieuwe ins opgeleverdECHTEN om de dynamiek van de gemeenschap interacties en faciliteert de ontwikkeling van het verbeteren van therapieën 9,10,55.

Acknowledgments

Dit werk werd ondersteund door het National Institute of Health (1 R01 GM095384-01) toegekend aan Forest Rohwer. Wij danken Epicentrum, een Illumina bedrijf voor het verstrekken van vroegtijdige toegang tot Ribo-Zero Epidemiologie kits. Wij bedanken Mark Hatay voor het ontwerp en de productie van de ultracentrifuge buishouder. Wij danken Andreas Haas en Benjamin Knowles voor kritische lezingen en discussies van het manuscript, en Lauren Paul voor het bijstaan ​​van het filmen proces.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Guanidine isothiocyanate-based RNA lysis buffer Life Technologies 10296-028 TRIzol LS Reagent was used in this study
Silica beads; 0.1 to 0.15 mm Cole-Parmer YO-36270-62 Zirconia-silicate beads were used in this study
Dithiothreitol, molecular grade (dry powder) Promega V3155 Can be purchased from any other company
Sterile syringe filter; 0.45 µm pore size hydrophilic PVDF membrane Millipore SLHV033RS
DNase I enzyme  Calbiochem 260913
Sterile syringe filter; 0.02 µm pore size FisherScientific 09-926-13 Diameter: 25 mm
Ultra-clear centrifuge tubes Beckman 344059 9/16 x 3 ½ in. (14 x 90 mm), suitable for SW41 Ti Rotor and VLPs density gradient ultracentrifugation
SW41 Ti Rotor Beckman 333790
SS-34 fixed angle rotor Thermo Scientific 28020
Phi29 DNA polymerase Monserate Biotech 4001 10 U/µl
Phi29 Random Hexamer Thermo Scientific S0181 Previously bought from Fidelity Systems
Alumina matrix filter with annular polypropylene support ring; 0.02 µm pore size FisherScientific 09-926-34 Whatman Anodisc filter membranes were used in this study; diameter 25 mm
SYBR Gold nucleic acid gel stain Life Technologies S-11494
2-Mercaptoethanol Sigma-Aldrich M6250-100ML
RNase-free DNase I  NEB M0303S Can be purchased from any other company
Glycogen, RNA grade FisherScientific FERR0551 Can be purchased from any other company
Oak Ridge high-speed centrifuge tubes FisherScientific 05-562-16B For large volume DNA extraction procedure, suitable for SS-34 fixed-angle rotor
Total rRNA removal kit Epicentre MRZE724 ScriptSeq Complete Gold Kit (Epidemiology) can be used to couple rRNA removal with sequencing library preparation
Cesium chloride  FisherScientific BP1595-500
Hexadecytrimethyl-ammonium bromide (CTAB) Sigma-Aldrich H5882-100G

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Suau, A., et al. Direct analysis of genes encoding 16S rRNA from complex communities reveals many novel molecular species within the human gut. Applied and Environmental Microbiology. 65, (11), 4799-4807 (1999).
  2. Breitbart, M., et al. Genomic analysis of uncultured marine viral communities. Proceedings of the National Academy of Sciences. 99, (22), 14250-14255 (2002).
  3. Proctor, L. M. The human microbiome project in 2011 and beyond. Cell Hos., & Microbe. 10, (4), 287-291 (2011).
  4. Charlson, E. S., et al. Topographical continuity of bacterial populations in the healthy human respiratory tract. American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 184, (8), 957-963 (2011).
  5. Pragman, A. A., Kim, H. B., Reilly, C. S., Wendt, C., Isaacson, R. E. The lung microbiome in moderate and severe chronic obstructive pulmonary disease. PLoS ONE. 7, (10), e47305 (2012).
  6. Kerem, B., et al. Identification of the Cystic Fibrosis gene: Genetic analysis. Science. 245, (4922), 1073-1080 (1989).
  7. Kleven, D., McCudden, C., Willis, M. Cystic Fibrosis: Newborn screening in America. Medical Laboratory Observer. 40, (7), 16-27 (2008).
  8. Fodor, A. A., et al. The adult cystic fibrosis airway microbiota is stable over time and infection type, and highly resilient to antibiotic treatment of exacerbations. PLoS ONE. 7, (9), e45001 (2012).
  9. Lim, Y. W., et al. Metagenomics and metatranscriptomics: Windows on CF-associated viral and microbial communities. Journal of Cystic Fibrosis: Official Journal of the European Cystic Fibrosis Society. 12, (2), 154-164 (2012).
  10. Lim, Y. W., et al. Clinical insights from metagenomic analysis of sputum samples from patients with cystic fibrosis. Journal of Clinical Microbiology. 52, (2), 425-437 (2014).
  11. Claesson, M. J., et al. Comparison of two next-generation sequencing technologies for resolving highly complex microbiota composition using tandem variable 16S rRNA gene regions. Nucleic Acids Research. 38, (22), e200 (2010).
  12. Breitenstein, S., Tümmler, B., Römling, U. Pulsed field gel electrophoresis of bacterial DNA isolated directly from patients’ sputa. Nucleic Acids Research. 23, (4), 722-723 (1995).
  13. Shak, S., Capon, D. J., Hellmiss, R., Marsters, S. A., Baker, C. L. Recombinant human DNase I reduces the viscosity of Cystic Fibrosis sputum. Proceedings of the National Academy of Sciences. 87, (23), 9188-9192 (1990).
  14. Lethem, M., James, S., Marriott, C., Burke, J. The origin of DNA associated with mucus glycoproteins in Cystic Fibrosis sputum. European Respiratory Journal. 3, (1), 19-23 (1990).
  15. Childs, W. C., Gibbons, R. J. Use of percoll density gradients for studying the attachment of bacteria to oral epithelial cells. Journal of Dental Research. 67, (5), 826-830 (1988).
  16. Lee, J. -L., Levin, R. E. Use of ethidium bromide monoazide for quantification of viable and dead mixed bacterial flora from fish fillets by polymerase chain reaction. Journal of Microbiological Methods. 67, (3), 456-462 (2006).
  17. Breitenstein, S., Tümmler, B., Römling, U. Pulsed field gel electrophoresis of bacterial DNA isolated directly from patients’ sputa. Nucleic Acids Research. 23, (4), 722-723 (1995).
  18. Mokili, J. L., Rohwer, F., Dutilh, B. E. Metagenomics and future perspectives in virus discovery. Current Opinion in Virology. 2, (1), 63-77 (2012).
  19. Bibby, K. Improved bacteriophage genome data is necessary for integrating viral and bacterial ecology. Microbial Ecology. 67, (2), 242-244 (2014).
  20. Willner, D., et al. Metagenomic analysis of respiratory tract DNA viral communities in Cystic Fibrosis and non-Cystic Fibrosis individuals. PloS One. 4, (10), e7370 (2009).
  21. Willner, D., Furlan, M. Deciphering the role of phage in the cystic fibrosis airway. Virulence. 1, (4), 309-313 (2010).
  22. Willner, D., et al. Case studies of the spatial heterogeneity of DNA viruses in the cystic fibrosis lung. American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 46, (2), 127-131 (2012).
  23. Bomar, L., Maltz, M., Colston, S., Graf, J. Directed culturing of microorganisms using metatranscriptomics. mBio. 2, (2), e00012-e00011 (2011).
  24. He, S., et al. Metatranscriptomic array analysis of “Candidatus Accumulibacter phosphatis”-enriched enhanced biological phosphorus removal sludge. Environmental Microbiology. 12, (5), 1205-1217 (2010).
  25. Mokili, J. L., et al. Identification of a novel Human Papillomavirus by metagenomic analysis of samples from patients with febrile respiratory illness. PLOS ONE. 8, (3), e58404 (2013).
  26. Henig, N. R., Tonelli, M. R., Pier, M. V., Burns, J. L., Aitken, M. L. Sputum induction as a research tool for sampling the airways of subjects with Cystic Fibrosis. Thorax. 56, (4), 306-311 (2001).
  27. Rogers, G. B., et al. Use of 16S rRNA gene profiling by terminal restriction fragment length polymorphism analysis to compare bacterial communities in sputum and mouthwash samples from patients with Cystic Fibrosis. J. Clin. Microbiol. 44, (7), 2601-2604 (2006).
  28. Haas, A., et al. Unraveling the unseen players in the ocean - a field guide to water chemistry and marine microbiology. Journal of Visualized Experiments. In press, Forthcoming.
  29. Schmieder, R., Edwards, R. Quality control and preprocessing of metagenomic datasets. Bioinformatics. 27, (6), 863-864 (2011).
  30. Schmieder, R., Edwards, R. Fast identification and removal of sequence contamination from genomic and metagenomic datasets. PLOS ONE. 6, (3), e17288 (2011).
  31. Segata, N., et al. Metagenomic microbial community profiling using unique clade-specific marker genes. Nature Methods. 9, (8), 811-814 (2012).
  32. Meyer, F., et al. The metagenomics RAST server - a public resource for the automatic phylogenetic and functional analysis of metagenomes. BMC Bioinformatics. 9, (1), 386 (2008).
  33. Hara, N., et al. Prevention of virus-induced type 1 diabetes with antibiotic therapy. Journal of Immunology (Baltimore, Md.: 1950). 189, (8), 3805-3814 (2012).
  34. Markle, J. G. M., et al. Sex differences in the gut microbiome drive hormone-dependent regulation of autoimmunity. Science (New York, N.Y.). 339, (6123), 1084-1088 (2013).
  35. Ewing, B., Green, P. Base-calling of automated sequencer traces using phred. II. Error probabilities. Genome Research. 8, (3), 186-194 (1998).
  36. Ewing, B., Hillier, L., Wendl, M. C., Green, P. Base-calling of automated sequencer traces using phred. I. Accuracy assessment. Genome Research. 8, (3), 175-185 (1998).
  37. Edgar, R. C., Haas, B. J., Clemente, J. C., Quince, C., Knight, R. UCHIME improves sensitivity and speed of chimera detection. Bioinformatics (Oxford, England). 27, (16), 2194-2200 (2011).
  38. Quast, C., et al. The SILVA ribosomal RNA gene database project: improved data processing and web-based tools. Nucleic Acids Research. 41, (Database issue), D590-D596 (2013).
  39. Pruesse, E., Peplies, J., Glöckner, F. O. SINA: accurate high-throughput multiple sequence alignment of ribosomal RNA genes. Bioinformatics (Oxford, England). 28, (14), 1823-1829 (2012).
  40. Robertson, C. E., et al. Explicet: graphical user interface software for metadata-driven management, analysis and visualization of microbiome data. Bioinformatics (Oxford, England). 29, (23), 3100-3101 (2013).
  41. Thurber, R. V., Haynes, M., Breitbart, M., Wegley, L., Rohwer, F. Laboratory procedures to generate viral metagenomes. Nat. Protocols. 4, (4), 470-483 (2009).
  42. Henn, M. R., et al. Analysis of high-throughput sequencing and annotation strategies for phage genomes. PLoS ONE. 5, (2), e9083 (2010).
  43. Duhaime, M. B., Deng, L., Poulos, B. T., Sullivan, M. B. Towards quantitative metagenomics of wild viruses and other ultra-low concentration DNA samples: a rigorous assessment and optimization of the linker amplification method. Environmental Microbiology. 14, (9), 2526-2537 (2012).
  44. Yilmaz, S., Allgaier, M., Hugenholtz, P. Multiple displacement amplification compromises quantitative analysis of metagenomes. Nat Meth. 7, (12), 943-944 (2010).
  45. Kim, K. -H., Bae, J. -W. Amplification methods bias metagenomic libraries of uncultured single-stranded and double-stranded DNA viruses. Applied and Environmental Microbiology. 77, (21), 7663-7668 (2011).
  46. Hurwitz, B. L., Deng, L., Poulos, B. T., Sullivan, M. B. Evaluation of methods to concentrate and purify ocean virus communities through comparative, replicated metagenomics. Environmental Microbiology. 15, (5), 1428-1440 (2013).
  47. Altschul, S. F., Gish, W., Miller, W., Myers, E. W., Lipman, D. J. Basic local alignment search tool. Journal of Molecular Biology. 215, 403-410 (1990).
  48. Angly, F., et al. PHACCS, an online tool for estimating the structure and diversity of uncultured viral communities using metagenomic information. BMC Bioinformatics. 6, (1), 41 (2005).
  49. Angly, F. E., et al. The GAAS Metagenomic Tool and Its Estimations of Viral and Microbial Average Genome Size in Four Major Biomes. PLoS Comput Biol. 5, (12), (2009).
  50. Dutilh, B. E., et al. Reference-independent comparative metagenomics using cross-assembly: crAss. Bioinformatics (Oxford, England). 28, (24), 3225-3231 (2012).
  51. Fancello, L., Raoult, D., Desnues, C. Computational tools for viral metagenomics and their application in clinical research. Virology. 434, (2), 162-174 (2012).
  52. Allesen-Holm, M., et al. A characterization of DNA release in Pseudomonas aeruginosa cultures and biofilms. Molecular Microbiology. 59, (4), 1114-1128 (2006).
  53. Stewart, F. J., Ottesen, E. A., DeLong, E. F. Development and quantitative analyses of a universal rRNA-subtraction protocol for microbial metatranscriptomics. ISME J. 4, (7), 896-907 (2010).
  54. Frias-Lopez, J., et al. Microbial community gene expression in ocean surface waters. Proceedings of the National Academy of Sciences. 105, (10), 3805-3810 (2008).
  55. Lim, Y. W., et al. Mechanistic model of Rothia mucilaginosa adaptation toward persistence in the CF lung, based on a genome reconstructed from metagenomic data. PLOS ONE. 8, (5), e64285 (2013).

Comments

5 Comments

  1. Hi, when generating the microbial metagenome: are you sure you are using DNase I at 1,000 U/µl concentration?

    I think it must be 1,000 U/ml instead of 1,000 U/µl

    Thanks in advance,
    Galo

    Reply
    Posted by: Galo G.
    September 16, 2015 - 6:42 AM
  2. Hi Galo,

    Yes to your question. We are using extremely high concentration of the DNase I (1000U/µl) to ensure all extracellular DNA are digested while not adding too much volume to the sample. The amount of extracellular DNA in CF sputum is high. If you were to use this protocol for other samples that do not have that much extracellular DNA, you can definitely adjust the amount of DNase I. The high concentration of DNase I can be prepared from the lyophilized DNase I. The catalogue number is in the materials table.

    Please let me know if you have any other questions.

    Yan Wei

    Reply
    Posted by: Yan Wei L.
    September 16, 2015 - 12:53 PM
  3. In that case I think I had to use that high concentrations of DNase since, although I don't work with CF, my samples are sputum too.

    Thank you very much!

    Galo

    Reply
    Posted by: Galo G.
    September 17, 2015 - 4:15 AM
  4. Actually I have another question I cannot answer from internet.

    Normally I use DTT in order to liquefy sputum samples. In your paper you use DTT for the viral extraction, but B-mercaptoethanol for the microbial one instead.

    I don't know if it really makes any difference or there is any reason to use one or another in microbial extracion.

    Thanks again,

    Galo

    Reply
    Posted by: Galo G.
    September 17, 2015 - 5:47 AM
  5. Hi Galo,

    Many has tried and used DTT. Our group didn't see any differences. However, since we are modifying the protocol described by Breitenstein et al. (1995) and they used B-mercap, we decided to stick to B-mercap.

    Yan Wei

    Reply
    Posted by: Yan Wei L.
    September 17, 2015 - 12:46 PM

Post a Question / Comment / Request

You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

Usage Statistics