להתיר את השחקנים הנעלמת באוקיינוס ​​- מדריך שדה לכימיה מים והימי מיקרוביולוגיה

1Department of Biology, San Diego State University, 2Scripps Institution of Oceanography, University of California San Diego
Environment
 

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Haas, A. F., Knowles, B., Lim, Y. W., McDole Somera, T., Kelly, L. W., Hatay, M., Rohwer, F. Unraveling the Unseen Players in the Ocean - A Field Guide to Water Chemistry and Marine Microbiology. J. Vis. Exp. (93), e52131, doi:10.3791/52131 (2014).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

כאן אנו מציגים סדרה של פרוטוקולי מחקר נבדקו ביסודיות וגם תקניים המותאמים לשימוש בסביבות ימיות מרוחקות. פרוטוקולי הדגימה כוללים הערכה של משאבים העומדים לרשות קהילת החיידקים (פחמן מומס אורגני, חומר אורגני חלקיקים, חומרים מזינים אורגניים), ותיאור מקיף של הקהילות נגיפיות וחיידקיים (באמצעות ספירה נגיפית וחיידקים ישירים, ספירה של חיידקים autofluorescent, ו בניית metagenomes הנגיפי וחיידקים). אנו משתמשים בשילוב של שיטות, המייצגות את השדה מפוזר של דיסציפלינות מדעיות הכוללות פרוטוקולים כבר הוקמו וכמה מן הטכניקות האחרונות פיתחו. טכניקות רצף במיוחד metagenomic המשמשות לאפיון קהילה נגיפי וחיידקיים, הוקמו רק בשנים האחרונות, ולכן עדיין נתון לשיפור מתמיד. זה הוביל למגוון רחב של curren נהלי דגימה ועיבוד מדגםtly בשימוש. הקבוצה של שיטות שהוצגה כאן מספקת את גישת מועד לאיסוף ועיבוד דגימות סביבתיות. פרמטרים התייחסו לפרוטוקולים אלה יניבו מינימום על מידע החיוני לאפיין ולהבין את המנגנון הבסיסי של דינמיקת קהילה נגיפית וחיידקים. זה נותן קל לעקוב אחרי הנחיות לביצוע סקרים מקיפים ודן שלבים קריטיים ואזהרות פוטנציאליות רלוונטיים לכל טכניקה.

Introduction

מערכות אקולוגיות ימיות חשופים למגוון רחב של הפרעות שגורמות לשינויים מזמינות חומרי מזון לביומסה של טורפי שיא. בעשור האחרון, מחקרים רבים הוכיחו את החשיבות של קהילות חיידקים במערכות אקולוגיות ימיות 1-4. ניכר כי שינויים בקהילת חיידקי וירוסים קשורים באופן הדוק עם השפלה הכוללת של סביבות ימיות 5. שינויים אלה עשויים להיות בהנחייתם של גיאוכימיה שינו בעמודת המים כגון זמינות חמצן או 6,7 remineralization פחמן. כתוצאה מהתלות ההדדית בין macroorganisms, הכימיה מים ולולאות משוב פעילות המיקרוביאלית עשויים להאיץ את קצב פירוק המערכת האקולוגית 8.

ב -1970 ו -80 ניסיונות מרובים שנעשו כדי לפתור מחזורי biogeochemical במערכות אקולוגיות ימיות 9-11. אחד האתגרים העיקריים למחקרים המוקדמים אלה היה החוסרגישות סטנדרטיות למדידת הפרמטרים biogeochemical העריכו. אמנם היו פרוטוקולים זמינים, בעיקר בחומרים מזינים מי ים 12,13, ההערכה של דינמיקת פחמן ומבנה קהילת החיידקים היו מוגבלים על ידי הכלים והשיטות זמינים. עם השוואת שיטות JGOFS EqPac, שארפ ואח '. 14 הציע בפעם הראשונה פרוטוקול אמין וסטנדרטי להערכת פחמן אורגני מומס ריכוז (DOC). על ידי 2000s מוקדם האתגרים אנליטיים כדי לקבוע משאבים העומדים לרשות קהילת החיידקים שכך רובן נפתרו וגישות לאפיין קהילות חיידקים בסביבות תרבות מבוקרות שהוקמו (ראה 15 DeLong). השיטות לקביעת רצף המסורתיות באותה העת הסתמכו במידה רבה על תרבויות משובטים טיפחו. רצף של גנים סביבתיים מוקדם של דגימות טבעיות מתגלה, עם זאת, כי הרוב המכריע של מגוון ביולוגי של חיידקים שהוחמץ על ידי cultivשיטות המבוסס על ation 16. בשנת 2002, ברייטברט et al. 17 משמשים רצף רובה בפעם הראשונה שתארה את קהילת ויראלי בדגימות מי ים סביבתיים הקמת שיטה לקביעת רצף הגנום כולו של קהילות נגיפיות ימיות חסרות תרבות.

בתוך הערכות חיידקים הקיימות, וירוסים עדיין להישאר במיוחד תחת נלמד, כמו רוב קשים לתרבות ואין להם סמן אוניברסלי שמורה כגון RNA ריבוזומלי 16S (rRNA) גנים משמשים בדרך כלל להערכת גיוון ואפיון קהילה. גישת רצף metagenomic מספקת אלטרנטיבה לשיטות תלוית תרבות וממוקדת גן לניתוח קהילות נגיפיות מורכבות. בעוד metagenomes הנגיפי הראשון שנוצר ממי הים היה רצף באמצעות סנגר רצף 17, פיתוח טכנולוגיות רצף של הדור הבא וטכניקות מולקולריות משופרות הוביל לגידול מהיר במחקרי metagenomic 18 19-21.

כדי לקדם את הידע הקיים על נגיפיים, חיידקים ותפקוד ביוכימי במערכות אקולוגיות ימיות, השוואת ערכות נתונים במערכות שונות ברחבי העולם הוא חיוני. עם זאת, הפרוטוקולים הוקמו במידה רבה פותחו עבור סביבות near-shore עם מתקני מעבדה נגישים בקלות. כך, חוסר שיטות שדה סטנדרטיים מעכב השוואות המערכת האקולוגית צולבת אלה. כאן אנחנו מציגים נבדקו ביסודיות וטופלנו גם עיבודים ממצב של פרוטוקולי מחקר אמנות לשימוש במקומות בשדה מרוחקים. שיטות אלו הוכחו מוצלחות במחקרים רבים פורש העשור האחרון 5,22 ומשמשות כיום על ידי מעבדות ימיות שונות, כמו גם על NOAAשונית הערכה ותכנית ניטור (רמפה) בכל האוקיינוס ​​השקט 4 האוקיינוס. פרוטוקולי הדגימה כוללים פרמטרים של מים כימיה (ריכוזי פחמן אי-אורגניים ואורגניים, ריכוז חומרי תזונה אורגני), שפע ויראליים וחיידקים (ספירת חיידקים ישירה, ספירה נגיפית ישירה, וcytometry זרימה להעריך אוטוטרוף לעומת יחסי הטרוטרוף), ומבנה קהילה ויראליים וחיידקים ו פוטנציאל מטבולים באמצעות ניתוח metagenomic (לסקירה ראה איור 1). התוצאות שהתקבלו מהשיטות שתוארו כאן נדרשות על מנת להבהיר פרמטרים רקע biogeochemical מפתח הדרושים כדי לאפיין באופן מקיף על מערכות אקולוגיות ימיות.

Protocol

1. הכנה של מכשירים

  1. הכנה של תוכנית ההתקנה סינון
    1. הכן פתרון 5% חומצה הידרוכלורית (HCl) (0.5-0.6 מ '; להוסיף 250 מיליליטר 32-36% HCl לרמה של 4.75 מים L מזוקק כדי לעשות 5 ליטר של פתרון סופי). אחסן את הפתרון הזה בצפיפות גבוהה פוליאתילן מיכל (HDPE) לתקופה של עד 2 שבועות.
    2. השאר את כל החלקים שבאים במגע עם המדגם (למעט המסננים) למשך 24 שעות בפתרון 5% HCl עלוקה מתוך פחמן אורגני מומס מזהמים פוטנציאליים (DOC). לאחר כל אירוע דגימה לשטוף את כל החלקים וקווים מיושרים עם כ -30 מיליליטר פתרון 5% HCl על מנת למנוע זיהום פחמן (למשל, מאדי דלק, שמן, סירות, תרסיס נגד יתושים).
    3. שמור את כל פריטי הדגימה עטופים בנייר אלומיניום-שריפה מראש או כתרים עד למייד לפני השימוש.
    4. GF 25 מ"מ Precombust / מסנני F עטופים בנייר אלומיניום בתנורי מופל ב 550 מעלות צלזיוס במשך שעה 12 עד לנדוף מכל פחמן ולאחסן אותם בנקי, יבשמקום עד לשימוש. שימוש במלקחי חומצה שטפה וכפפות סטריליות, שאינה אבקה לטיפול במסנני precombusted בכל העת.
  2. הכנת ויראלי חומרי דגימת Metagenome
    1. ביסודיות לשטוף ארבע carboys 20 L מתקפל בצפיפות נמוכה פוליאתילן וארבעה דליים פוליאתילן בצפיפות גבוהה 20 L ומכסים עם אקונומיקה 10%.
    2. בהמשך לכך לשטוף את כל פריטי 3x עם מים מדגם מזוקקים ולאחר מכן ולחתום מחדש carboys עם הברז.
    3. מסננים לשטוף משיקי זרימה (TFF) לאחר כל שימוש על פי הפרוטוקול הבא, ונקי מנע אם המסנן לא היה בשימוש ב 5 הימים האחרונים.
    4. לפזר 50 גרם של כדורי NaOH ב 5 ליטר של מים בדלי שטיפה.
    5. צרף TFF רטוב לצינורות ולהרכיב לפי איור 3.
    6. הפעל משאבת peristaltic ב ~ 30 סל"ד בלי backpressure להעביר חלק מהפתרון לשטוף NaOH באמצעות המערכת. ברגע שטיפה זורמת מקו התמורה, העברה להעביר לשטוף דליכדי להשלים את המחזור של פתרון.
    7. החל backpressure למערכת על ידי הצבת מהדק על קו ההחזרה במורד הזרם של TFF. זה יאלץ את הפתרון לשטוף את קו התסנין. זמן מוגזם (5 דק ') להציף מחוץ לTFF ולייצר תסנין מעיד על TFF מושפל.
    8. להפעיל את המערכת עד שכל פתרון NaOH הוא בקווים. ואז להסיר backpressure פתרון לרוץ, מחוץ למערכת וזורקים.
    9. יש לשטוף את TFF על ידי מים זורמים תחת backpressure עד pH של המים זורמים מקווי השיבה ותסנין הוא pH 7-8.
    10. הסר צינורות ממשאבת peristaltic וTFF. יש לחתום מחדש TFF לאחסון. ודא שTFF נשאר רטוב עד לשימוש הבא.

אוסף 2. דוגמא

הערה: במהלך הובלה צריכה להיות מאוחסנים בכל הדגימות שנאספו מגניבים (אם אפשר 4 ° C) ואינן חשופות לאור שמש ישיר עד עיבוד נוסף.

  1. דגימהלפחמן, חומרים מזינים, מיקרוסקופית, cytometry הזרימה, וmetagenomics מיקרוביאלית
    1. קח שתי יחידות Hatay Niskin לאירוע דגימה (וכתוצאה מכך מים מדגם 4 L). פתח את כלי הדגימה רק לפני הצללה (אוויר שנלכד אחרת ימנע יורד).
    2. באתר המתאים, לשטוף את החלק הפנימי של כלי דגימה עם המים מדגם על ידי פתיחת שני הקצוות ומרגשים הגליל לאורך ציר הקוטב במים.
    3. קח לדוגמא ולסגור את מיכל הדגימה בזהירות. ודא כי אתר הדגימה הוא במעלה הזרם מהסירה וצוללנים, כדי למנוע זיהום.
  2. דגימה לmetagenomics ויראלי
    1. באתר יעד הר משאבה-מים ביום 20 בַּקבּוּק L.
    2. מלא את כניסת משאבה-מים בַּקבּוּק מכוונת לכל בַּקבּוּק אזור והחותם ממוקד עם הברז המקביל.
    3. לאסוף 4 carboys של מי ים מסונן (כולם ביחד 80 ליטר) מכל אתר דגימה.

3. SAMPהכנת le

הערה: תהליך הדגימות לפי הסדר ההופעה כאן, מתחילה עם DOC כדי למזער את הסיכוי לזיהום. השתמש בכפפות ללא אבקה לנוהל כולו.

  1. פחמן אורגני מומס (DOC)
    1. הר אחד משתי יחידות Hatay Niskin aliquot בחריץ המתאים של קבוצת הסינון. חבר את צינורות השקע שמוביל לבעל המסנן המתאים. חבר את צינורות אוויר בלחץ (0.2 בר) ליחידת Hatay Niskin (ראה איור 2).
    2. ריקון כל הקווים עם מים מדגם 100 מיליליטר לפני הכנסת מסננים בבעלי המסנן. הנח GF / מסנן F מראש שריפה-25 מ"מ בבעל מסנן באמצעות החומצה שטפה מלקחיים. לשטוף כל בקבוק DOC וכובע 3 פעמים עם כ -20 מיליליטר מים המסוננים דגימה.
    3. מלא את בקבוק עם כ -40 מיליליטר (~ 2/3 מלאים) של מים דגימה. אסוף בכפילויות לפחות של דגימות DOC יש גיבוי במקרה של זיהום או אובדן פוטנציאלי במהלך הובלה.
    4. Fבקבוקי דגימת reeze עומדים זקוף ב -20 מעלות צלזיוס עד לניתוח.
  2. חומר חלקיקים אורגניים (POM)
    1. לאחר דגימות DOC נאספו להמשיך סינון עד סך של 500 מיליליטר עבר את סינון GF / F, כולל מה שעבר בעת איסוף דגימות DOC.
    2. בעל מסנן מוטבע הבריג החוצה.
    3. הסר את המסנן לניתוח POM באמצעות מלקחיים ולסנן מקום בתוך ריבוע של נייר אלומיניום-שריפה מראש, לקפל עליון בצד המכונס בתוך עצמה, ולעטוף.
    4. להקפיא מסננים ב -20 ° C לאחסון עד נתון לניתוח יסודות ואיזוטופים.
  3. חומרים מזינים אורגניים
    1. הנח 0.2 מיקרומטר מסנן חרוט מסלול לכל בעל מסנן. לצרף מחדש קלטות המסנן.
    2. לשטוף כל בקבוק נצנץ פלסטיק 20 מיליליטר שלוש פעמים במי דגימה. ממלא כל בקבוק לכתף (~ 18 מיליליטר).
    3. להקפיא ב -20 ° C עד לניתוח מאוחר יותר.
  4. Microscopy (SYBR זהב וDAPI)
    1. קח את בעל מסנן.
    2. לאסוף 1 מיליליטר של מים בכל אחד משני צינורות microcentrifuge.
    3. להוסיף paraformaldehyde 66 μl 32% לאחד מaliquots (מכתים זהב SYBR מאוחר יותר). להוסיף glutaraldehyde 12 μl 25% למקבילים אחרים (לשימוש מאוחר יותר מכתים DAPI).
    4. לערבב בעדינות, ולאפשר דגימות כדי "לתקן" לפחות 15 דקות ב RT בחושך.
  5. Cytometry הזרימה
    1. מניחים מסנן פוליקרבונט 8.0 מיקרומטר באחד מבעלי המסנן להוציא פסולת ותאים אוקריוטים גדולים.
    2. עובר מים דרך דגימה כדי למלא 2 cryovials מכל אתר דגימה עם מדגם 1 מיליליטר.
    3. הוסף 5 μl של glutaraldehyde 25% לכל אחד (ריכוז סופי = 0.125%) cryovial.
    4. הפוך בקבוקונים לערבב.
    5. לאפשר את המדגם כדי לתקן עבור 15-30 דקות ב RT. לא יעלה על 30 דקות.
    6. דגימות פלאש להקפיא בחנקן נוזלי.
    7. דגימות חנות ב -80 ° C או בLIQUIשולח ד חנקן יבש עד לניתוח על cytometer זרימה.
  6. לדוגמא metagenomic חיידקים
    1. הסר בבעלי מסנן קו.
    2. ישירות הר מסנן גלילי 0.22 מיקרומטר על קו בהתאמה.
    3. מסנן מים שנותר מדגם של שתי יחידות Hatay Niskin מכל אתר (בהיקף של 3-4 ליטר למסנן) דרך מסנן אחד.
    4. לאחר הסינון לדחוף את המים שנותרו מכל מסנן באמצעות מזרק 10 מיליליטר נקי מלא באוויר.
    5. מניחים מסנן חזרה לאריזה מקורית ולאטום את החבילה עם מעבדה קלטת.
    6. אחסן מסננים ארוזים בנפרד ב -20 מעלות צלזיוס.
  7. לדוגמא metagenomic ויראלי
    1. העבר את דגימות metagenome נגיפיות מייד לדליי שטף כדי להבטיח שאין מדגם אבד או מזוהם בסביבה.
    2. טרום לסנן באמצעות רשת גדולה נקבובית ניילון גודל (25-100 מיקרומטר) כדי להסיר שאריות וחומר תאי לפני הריכוז 19.
    3. הגדרת TFF כפי שמוצג באיור 3, הצבת קו הסניקה בדלי מדגם, ומשאיר את קווי שיבה ותסנין לרוץ לתוך כיור.
    4. הפעל משאבת peristaltic וקווים מיושרים עם 1-2 ליטר של מים מדגם.
    5. הנח קו החזרה בדלי המדגם כדי להשלים את המעגל, להוסיף 0.7 בר של backpressure.
    6. תוך התרכזות מי הים, מאגר מדגם עליון כרמה יורד. כאשר מפלס מים יורד מתחת לקו הצריכה בדלי, להתרכז העברה ל, כוס tripour-שטף אקונומיקה לשטוף משולשת ולהמשיך להתרכז.
    7. אם כוס מאגר ריקה, להסיר backpressure, להגביר את קצב המשאבה ולדחוף את המדגם כולו מבעד לקווים, מתאושש זה בtripour.
    8. לעבור את התרכיז באמצעות 0.45 מיקרומטר מסננים גליליים להסיר את רוב החיידקים ואילו לא להפלות נגד כל שושלות ויראלי.
    9. לשנות 0.45 מיקרומטר מסננים גליליים לאחר כל 150 מיליליטר. לאסוף 0.45 מיקרומטר-filתרכיז נגיפי tered בצינורות 50 מיליליטר.
    10. הוסף 250 μl של כלורופורם לכל aliquot 50 מיליליטר של תרכיז נגיפי מסונן לחסל חיידקים שיורית. היפוך לערבב, וחנות, זקוף על 4 מעלות צלזיוס עד העיבוד הבא.
    11. ייבש את 0.45 מיקרומטר המסננים ושומרים אותם כמתואר בשלבי 3.6.5 ו3.6.6.

4. עיבוד של דוגמאות מיקרוסקופית

הערה: יש לשטוף את מגדלי מסנן עם אקונומיקה 10% ואחריו 95% אתנול למנוע כתם פוטנציאלי או שאריות ביולוגיות בין ריצות. דגימות מיקרוסקופ התהליך בתוך שעה 1 ולהימנע מכתמי חשיפה ומסננים מוכתמים להדליק אם אפשר.

  1. הר
    1. הוספה של 10% חומצה אסקורבית 100 μl 4.9 מיליליטר של 1X PBS, ומערבבים היטב.
    2. הוסף 5 מיליליטר של גליצרול 100%, ומערבבים היטב.
    3. מסנן הר באמצעות 0.02 מסנן מזרק חד פעמי מיקרומטר מטריצת אלומינה, aliquot ולאחסן ב -20 ° C.
  2. SYBRזהב מכתים
    1. פיפטה aliquot 500 μl של כל דגימה קבועה עם 2% paraformaldehyde ריכוז סופי בצינור microcentrifuge.
    2. הוסף 0.5 μl של 1,000x פתרון SYBR זהב לכל אחד מaliquots.
    3. מערבבים בעדינות מדגם ולשים אותו בחושך במשך 10 דקות.
    4. מקום מסנן מטריצת אלומינה 0.02 מיקרומטר עם טבעת תמיכת פוליפרופילן טבעתית בכל עמדת מסנן של מערכת משאבת הוואקום ולצרף את מגדלי המסנן (איור 4). ודא המסנן 0.02 מיקרומטר ממוקם על דוכן מסנן הפלסטיק בצד למעלה, כמו שיש לי מסננים אלה נקבוביות כפולים.
    5. עם משאבת הוואקום כבויה, להוסיף 500 μl של מדגם SYBR מוכתם, יחד עם 2 מיליליטר של 0.02 מים חופשיים מיקרומטר וירוס מסונן כדי להבטיח המדגם להתפשט באופן שווה על פני המסנן.
    6. הפעל את משאבת הוואקום כדי ליצור לחץ שלילי של לא יותר ממטיל 1 להימנע מוירוסים וחיידקים לפגוע מסוננים.
    7. לאפשר המדגם כולו ללכתדרך.
    8. בעזרת מלקחיים (לא אותו הזוג שבו משתמש DOC), להסיר בזהירות כל מסנן ממגדל סינון, ולעבור על משימה עדינה לנגב על מנת להבטיח את המסנן הוא יבש.
    9. פיפטה 10 μl של הר בשקופית מיקרוסקופ ולמקם את המסנן היבש המכיל את המדגם המוכתם בירידה של הר.
    10. הוסף 10 μl הר לחלק העליון של כל מסנן לפני הוספת coverslip.
    11. לחץ בעדינות על coverslip למטה. נסה לחסל את בועות אוויר אם אפשר ולהימנע הצידה תנועה של coverslip.
    12. שקופיות מקום בslidebox ולאחסן ב -20 ° C.
  3. DAPI מכתים
    1. מקום מסנן מטריצת אלומינה 0.2 מיקרומטר עם טבעת תמיכת פוליפרופילן טבעתית בכל עמדת מסנן ולצרף את מגדלי המסנן.
    2. עם משאבת הוואקום כבויה, להוסיף 2 מיליליטר של 0.02 מיקרומטר מים וירוס בחינם מסוננים לכל מגדל בשימוש.
    3. מיליליטר פיפטה 1 של המדגם קבוע glutaraldehyde לכל מגדל, כך שסכה o נפחו 3 מיליליטר בכל מגדל מסנן.
    4. הפעל משאבת ואקום כדי ליצור לחץ שלילי של לא יותר ממטיל 1.
    5. סנן מדגם כולו על מסנן מטריצת אלומינה 0.2 מיקרומטר.
    6. מוציא בזהירות את המסנן ממגדל סינון באמצעות מלקחיים (לא אותו הזוג שבו משתמש DOC).
    7. הנח את המסנן על פתרון 100 ירידת μl DAPI [25 מיקרוגרם / מיליליטר] בצלחת פטרי שמירת המסנן בצד ימין למעלה ולתת את כתם המדגם במשך 15 דקות. הימנע מהאור במהלך תהליך הצביעה.
    8. לאחר 15 דקות, להסיר את המסנן מהכתם, מעביר אותה על משימה עדינה לנגב לייבש ולהעביר לירידה של 100 μl של מים חופשיים 0.02 מיקרומטר וירוס מסונן, שוב שמירה על המסנן בצד ימין למעלה, כדי לשטוף את הכתם שנותר DAPI 1 דקות. חזור על לשטוף פעם אחת.
    9. מסנן ההר במיקרוסקופ להחליק את הדרך הזהה כמתואר עבור דגימות SYBR הזהב.

5. הפקת DNA

  1. חיידקי metagenomic DNA
    1. להפשיר את המסננים גליליים לפחות 20 דקות ב RT.
    2. הסר את כל מי ים שנותר במסנן באמצעות מזרק 10 מיליליטר. מכסה את הקצה התחתון של המסנן הגלילי באמצעות כובע לבן וautoclaved.
    3. לכל מסנן, לערבב T1 "טרום תמוגה" 360 μl חיץ ו-50 μl proteinase K, ולאחר מכן טפטף את התערובת לתוך המסנן. מכסה את הקצה הפתוח.
    4. דגירה תגובת תמוגה בO התנור / N (או לפחות 2 שעות) מסתובבות ב 55 מעלות צלזיוס.
    5. הסר אחד מהכובע ולהוסיף "תמוגה" 200 μl B3 חיץ לתוך מסנן המדגם מראש lyse. מסנן מחדש כובע דגירה את התערובת בתנור מסתובב במשך 10-20 דקות ב 70 מעלות צלזיוס.
    6. חלץ את כל הנפח מהמסנן הגלילי באמצעות מזרק 3 מיליליטר על ידי מוצץ את הנוזל עם המסנן הפוך.
    7. לגרש את מדגם lysed לתוך צינור microfuge חדש, ולהוסיף 200 μl של 100% אתנול.
    8. מערבבים היטב, לטעון את המדגם כולו על גבי הספיןטור, והמשך כפי שהורה הפרוטוקול של היצרן.
    9. לכמת DNA באמצעות assay המבוסס על ניאון.
  2. הימי ויראלי metagenomics
    1. טיהור וריכוז הפאג חלקיקים (שונה מThurber et al. 19)
      1. לפזר CsCl במי ים כדי להכין פתרונות של 1.7 גר '/ מיליליטר, 1.5 גר' / מיליליטר, 1.35 גר '/ מיליליטר, 1.2 גרם / מיליליטר (מכויל על ידי שקילה מתוך 1 מיליליטר של תמיסה). סנן כל חלק עם 0.02 מיקרומטר לסנן לפני השימוש.
        הערה: ודא כי הצפיפות של כל חלק מדויקת לשלוש דמויות משמעותיות לפני השימוש בפתרונים ולסנן את כל הפתרונות עם מסנן 0.02 מיקרומטר לפני השימוש. מי ים או מי ים לשימוש רווי CsCl להנמיך או להגביר את הצפיפות, בהתאמה.
      2. הפוך שקופית מיקרוסקופ מיום 1 מיליליטר של חומרים כימיים בשילוב כאמור בסעיף 4.2 כדי להבטיח שכל החומרים הכימיים נטולי וירוסים לפני שתמשיך.
      3. להוסיף 9 גר 'CsCl 45 מיליליטר של תרכיז TFF הנגיפי לצפיפות סופית של 1.12 גר '/ מיליליטר. מכניס למקרר תוך הגדרת שיפוע צעד CsCl.
      4. החל מגרם / מיליליטר הפתרון 1.7 ברציפות להוסיף 1 מיליליטר של כל אחד ברצף חלק פחות צפוף לאט לתוך צינור אחד באמצעות טפטפות סרולוגיות. סמן את הרמה של כל המניסקוס פרט ולהבטיח שpycnoclines בין שברים לא מופרע. לפירוט נוסף ראה נייר הלוויה (Lim et al. 2014).
      5. עם סרולוגיות עומס פיפטה 7.5 מיליליטר של מדגם לכל אחד מצינורות 6 ו צנטריפוגות ב ~ 83,000 XG, 4 מעלות צלזיוס למשך 2 שעות.
      6. מבלי לשבש את מפלי הצפיפות לפרוק את הרוטור ולנקב את הצינור מתחת לg / ml השכבה מסומנת בעבר 1.5 צפיפות (איור 5) עם 18 מחט G במזרק 3 מיליליטר. לצייר את 1.5 מיליליטר של VLPs המטוהר ומעביר לצינור microcentrifuge חדש. חזור על פעולה עבור כל הדגימות.
      7. להוסיף 0.2 נפח של כלורופורם לVLPs המטוהר, לערבב במרץ, לדגור על RT במשך 10 דקות.
      8. הוסף 150 ו# 181; l של 10x חיץ DNAse על צינור אחד microcentrifuge.
      9. ספין ב16,000 XG למשך 5 דקות, ולאסוף את השלב המימי. אם כלורופורם לא מצטבר בחלק התחתון של צינור microcentrifuge, להוסיף עוד חיץ DNAse, לערבב וחזור.
      10. להוסיף DNase אני (ריכוז סופי = 2.5 יחידה / μl) ולדגור על 37 מעלות צלזיוס למשך 2 שעות, ולאחר מכן להשבית פעילות DNase ידי דוגרים על 65 מעלות צלזיוס למשך 15 דקות.
    2. הפקת DNA מחלקיקים נגיפיים דמוי (VLPs)
      1. באופן שווה בריכת VLPs המטוהר מכל מדגם לשני צינורות באוק רידג 'ניקו וautoclaved.
      2. להוסיף 0.1 (pH 8.5) בנפח 2 M טריס-HCl עם 0.2 M EDTA, 0.01 נפח 0.5 M EDTA, נפח של 1 פוראמיד, 10 גליקוגן μl (10 מ"ג / מיליליטר). מערבבים היטב דגירה ב RT למשך 30 דקות.
      3. בהתייחסו לכרך חדש, להוסיף 2 כרכים RT אתנול 100%. מערבבים דגירה על 4 מעלות צלזיוס במשך יותר מ -30 דקות.
      4. DNA גלולה על ידי ספינינג צינורות Oak Ridge ב17,200 XG במשך 60 דקות, בשעה 4 & #176; C.
      5. הסר את supernatant. שטוף את כדור DNA פעמיים עם אתנול 70% קרים כקרח באמצעות טפטפות סרולוגיות.
      6. הסר את כל אתנול (מחדש ספינינג בקצרה במידת צורך), הכיסוי, ותאפשר גלולה לאוויר יבש ב RT ל> 15 דקות.
      7. Resuspend גלולה DNA ל> 15 דקות ב567 μl של חיץ 1X TE (pH 8.0). העבר את 567 μl של ה- DNA המושעה זה לתוך צינור 1.5 מיליליטר microcentrifuge חדש.
      8. הוסף 30 μl של 10% SDS (טרום חם על 65 מעלות צלזיוס לפני שימוש) μl ו -3 של proteinase K (20 מיקרוגרם / מיליליטר), ומערבב היטב דגירה במשך השעה 1 ב 56 מעלות צלזיוס.
      9. הוספה של 5 M NaCl 100 μl ומערבבים היטב. הוסף 80 μl של פתרון CTAB NaCl מראש חימם, מערבולת, ודגירה של 10 דקות על 65 מעלות צלזיוס.
      10. להוסיף 0.2 חלקים של נפח של כלורופורם, מערבולת, וספין ב16,000 XG במשך 2 דקות. העברת supernatant לצינור 1.5 מיליליטר microcentrifuge חדש.
      11. הוספת נפח שווה של כלורופורם isoamyl פנול 25: 24: 1 פתרון, מערבולת לערבב,ולהסתובב ב16,000 XG במשך 2 דקות. מעביר את supernatant לצינור microcentrifuge 1.5 מיליליטר חדש.
      12. הוספת נפח שווה של כלורופורם, מערבולת, וספין ב16,000 XG במשך 2 דקות. מעביר את supernatant לצינור microcentrifuge 1.5 מיליליטר חדש.
      13. להוסיף 0.7 נפח של isopropanol לשבריר supernatant ו דגירה ב -20 מעלות צלזיוס במשך לפחות 30 דקות כדי לזרז DNA.
      14. גלולה DNA על ידי ספינינג ב16,000 XG במשך 20 דקות ב 4 ° C. פיפטה את supernatant לשטוף את הכדור פעמיים עם 500 μl של אתנול 70% קרים כקרח.
      15. ספין ב16,000 XG ולהסיר את אתנול נותר מהצינור. אוויר יבש גלולה במשך 15 דקות.
      16. גלולה הגלולה DNA עם 50 μl של חיץ elution (5 מ"מ טריס, pH 7.5) או טריס-EDTA pH 8.0 לפחות 5 דקות ב RT.
      17. לכמת את ה- DNA באמצעות assay הקרינה מבוסס רגישות גבוהה.

Representative Results

מיקרוסקופית

אפשר וצריכים ניתחו דגימות מיקרוסקופית באופן מיידי כדי לוודא שהם באיכות הרצויה. כדי למדוד תפוצה ושפע גודלה של קהילת החיידקים, מגלשות DAPI תיבחנה על ידי מיקרוסקופ epifluorescence (עירור / פליטה: 358/461 ננומטר, לראות McDole et al 2012.) (איור 6 א). ספירת תאים וממדים ניתן לאסוף באמצעות תוכנת הדמיה (למשל, ImagePro או ImageJ). מכרכי תא אורך ומדידות רוחב (V) נגזרים על ידי ביצוע ההנחה שלכל התאים צורת גלילים עם כובעים חצי כדור באמצעות המשוואה הבאה:

V = π / 4 × w 2 (L - w / 3)

כאשר L הוא אורך וw הוא רוחב של כל 23,4 תא. ביומסה מיקרוביאלית אז ניתן להעריך באמצעות יחסי גודל תלוי שהוקמו בעבר FOקהילות r ימיות מיקרוביאלי 24. בדרך כלל חיידקים ימיים נעים באורך 0.1-4 מיקרומטר, אבל ללכת עד ~ מיקרומטר 8 במקומות מסוימים.

בעוד המסננים (0.2 מיקרומטר) מגואלות DAPI יוצג רק חיידקים, המופעל על כתם SYBR הזהב (0.02 מיקרומטר) להכיל חיידקים ווירוסים. מדידת השפע של וירוסים עוקבת אחר אותו הפרוטוקול כמו לחיידקים, לעומת זאת עירור של 325-375 ננומטר ישמש ומקסימום הפליטה הוא ב537 ננומטר (איור 6).

על מנת להפיק נתונים כמותיים דגימת הנפח ייתכן שיצטרך להיות מותאם בהתאם לשפע של הנגיף בדגימה המקורית. הנפח הנכון כדי לסנן נקבע הטוב ביותר באופן אמפירי לגוף מים מסוים. דוגמאות לmicrographs המכילה דגימות עם ריכוזים שונים נגיפיים הן באיור 7.

תוצאות ממחקרים קודמים מצביעות על כך שוירוס לMicrobeיחסים (VMR) בדרך כלל נעים 1-50 במערכות מים 25-29, ובין 3 ו -20, עם ממוצע של כ 6 במערכות שונית אלמוגים (נתונים שלא פורסמו נואלס).

Cytometry הזרימה

בנוסף לספירה הישירה והערכת גודלה של קהילת החיידקים, הערכות של היחס אוטוטרופי לחיידקים heterotrophic באמצעות הזרימה cytometry יכולות עוד לחלץ מן הדגימות שנאספו (זרימת מופת cytometry התפוקה ניתנת באיור 8). כדי לקבוע את מספר התאים בקטריה הכולל, דגימות מגואלות SYBR הירוק אני וצינור מכפיל עם מסנן bandpass 530/30 משמש לזיהוי. ערוץ לכלורופיל (חזרה למראות LP גב וכתוצאה מכך מגוון של 675-735 ננומטר) ו- (מסנן 585/42 bandpass) phycoerytherin משמש כדי לספור את השפע של autotrophs בדגימות ללא רבב. כדי לקבוע את השפע של חיידקים heterotrophic, ספירת אוטוטרופי מאיחלק מוכתם חסר מהספירה מוכתמת SYBR הכולל (McDole et al. הוגשה).

Metagenomics ויראלי

metagenomics ויראלי משתמש בגישה מולקולרית תרבות העצמאית לאקולוגיה ויראלי, באמצעות כולל מידע רצף הגנומי כדי לקבוע מבנה קהילה ותפקוד. במטגנומיקה קידום הבנת המורכבות והגיוון של קהילות נגיפיות בגיל 17 המקומיים שלנו לקני מידה העולמיים 30. הפיתוח האחרון של מגוון רחב של כלים bioinformatic לניתוח של נתונים metagenomic נגיפיים ירד צווארי בקבוק חישובית, המאפשר מבט מקיף יותר של virosphere דרך העדשה של metagenomics.

השיטות שהוצגו כאן להדגיש את הבידוד והעשרה של חלקיקים נגיפיים ממי הים באמצעות שילוב של קדם-סינון עם ניילון גודל נקבובית גדול רשת כדי להסיר שאריות וחומר תאי, ריכוזדגימות עם TFF (איור 3) וסינון 0.45 מיקרומטר לאחר הסרת תאים גדולים יותר. שיטה זו מייצרת כ 100x מדגם מרוכז (איורים 5 ב-5E) שמאפשר לנו לבצע תהליכים במורד הזרם בכמויות קטנות יותר. על מנת למנוע צמיחה של כל תאי חיידקים שנותרו בlysate הנגיפי ועל כן שינויים בשפע הנגיפי של המדגם בזמן מעבר הארוך בין תחנת שדה ומעבדה, כלורופורם מתווסף לעתים קרובות לריכוז סופי של 2% לאחסון. לאחר בידוד וטיהור של VLPs, מיקרוסקופיה epifluorescence עם צבעי חומצות גרעין כמו SYBR זהב משמשות לאימות הנוכחות וטוהר של החלקיקים הנגיפיים (איורים 5 ב-5E).

כאן, אנו מציגים שתי metagenomes נגיפי משונית אלמוגי האי הדרומי קו, במיוחד, סטארבק (Star7) ומילניום (CAR9; נקרא בעבר קרוליין) איים. נפח כולל של 120 ליטר סםמים מממש נאספו מכל אתר בעומק של 10 מטרים ומעובד כמתואר בסעיף 3.7 ו -5.2. VLPs מטוהר מצנטריפוגה שיפוע צזיום כלוריד היו 3.3 x 10 8 חלקיקים / מיליליטר לCAR9 (איור 5D) ו -2.9 x 10 9 חלקיקים למ"ל לStar7 כפי שאומת על פי השיטה שתוארה בסעיף 4 (איור 5). הסכום הכולל של ה- DNA מבודד מדגימות אלה היו סביב 400 NG מבוסס על מדידת Nanodrop. ה- DNA היה מוגבר באמצעות פולימראז Phi29 ורצף של המתקן הסביבתי Genomics Core בשנת 2011. המאפיינים של נתוני הרצף מוצג בלוח 1. בהתבסס על חיפושי דמיון משתמשים במסדי נתונים קיימים, הרוב (> 70%) של הרצפים לעתים קרובות בסופו של , כלומר, מקורות uncharacterized ידועים ופונקציות. באופן דומה, שני viromes מוצג כאן מוצג יותר מ -97% מרצפים ידועים. כתוצאה מכך, אינו בסיס הנתוניםניתוח תלוי שימש לניתוח ופתח את הזרוע חדשה של הזדמנויות מחקר על "החומר אפל" בmetagenomics הנגיפי (Seguritan et al. בעיתונות).

החיידקים metagenomics

ניתוח metagenomes חיידקים מאפשר האפיון של הווה קהילת החיידקים והתיאור הפונקציונלי של קהילות אלה. דוגמאות לכך כוללות הערכות של נוכחותם של פתוגנים וארסיים 5,22 או השוואות בין שינויים במבנה קהילת macrobial או חומרים מזינים זמינים ושפע של מינים ומסלולי מטבוליים העיקריים שלהם (איור 9; אל קלי et 2014.).

כימיה מים

פרמטרים כימיה מים בדרך כלל לוקחים עיבוד אנליטי נרחב כדי ליצור את הנתונים הרצויים; דגימות לבדיקת DOC תימדדנה באמצעות 31,3 חמצון קטליטי טמפרטורה גבוהה2, חומר חלקיקים אורגני (POM) באמצעות ספקטרומטר מסת יחס איזוטופ מצמידים את מנתח יסודות 33-35, וחומרים מזינים אורגניים על ידי הזרקת ניתוח תזרים 36,12,37. לאחר סיום מוצלח של כל הניתוחים, מידע, כפי שמוצג בטבלה 1 יהיה זמין כדי להשלים את האפיון של החיידקים וקהילות ויראלי. מידע זה יכול להיות החמיא עם יחס איזוטופ יציב של דגימות פחמן וחנקן אורגניות (ראה האס et al. 35) ויחסים בין autotrophs וheterotrophs (McDole et al. הוגשו).

איור 1
סקירת איור 1. שיטות מתוארות בסעיף בפרוטוקול. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של figu זהמחדש.

איור 2
התקנת איור 2. דוגמא אסדת עיבוד. התקנת הסינון הציגה כאן (ציור סכמטי עזב, פנל ימני תמונה בפועל) אינה נדרשת בהכרח ליצירת דגימות אבל תזרז את התהליך באופן משמעותי. ההתקנה מורכבת של backplate, שבו היחידות (1) Hatay Niskin הם רכובים. על השקע פונה כלפי מטה, יחידות Hatay Niskin מחוברות עם צינורות סיליקון לבעלי המסנן בקו (2). אלה הגיבו על נדגמו המים דרך המסנן המתאים למבחנות דגימת HDPE (3) רכוב ממש מתחת. תהליך הסינון הוא מואץ באמצעות אוויר דחוס (4), שמוסדר על ידי שעון לחץ (5). אגן הצפה מונע שפיכת מים במהלך חילופי בקבוקוני HDPE או סינון POM. אנאלחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

איור 3
מים מדגם 3. הרכב איור משיקי זרימת מסנן (שונה מThurber et al. 19). רשת ניילון מסונן נשאבים מהמאגר (1) באמצעות משאבת peristaltic (2) לזרימת מסנן משיק (3). חוזר המים מדגם למאגר (1) לאורך קו התמורה (4) בהעדר backpressure. כאשר backpressure מיושם באמצעות מהדק צינור (5) על קו ההחזרה, מים עוברים דרך המסנן ויימחקו או יועברו למאגר התסנין (6). מים מדגם מוחלפים כפי שהוא מרוכז את קו התסנין עד שכל המים המדגם מרוכזים בקווי צינורות.

איור 4
התקנת סינון שקופיות איור 4. מיקרוסקופ.לפזר באופן אחיד דגימות מוכתמות DAPI וSYBR זהב במסנן מטריקס אלומינה המתאים (1), מסננים צריכים להיות ממוקמים בין מגדל המסנן (2) והגזע של סעפת הסינון וקבועה עם מהדק (4). ואקום וסת לחץ (5) יהיה לזרז את תהליך הסינון (למעלה סכמטי ציור, פנל תחתון תמונה בפועל). אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

איור 5
איור 5. טיהור וריכוז של חלקיקי הפאג. סך של 1 מיליליטר של כל שיפוע צפיפות צזיום כלוריד הוא שכבות על גבי כל אחד אחר לפני מוביל המדגם שטופל מראש (א). כל שכבה צריכה להיות מסומנת מחוץ לצינור כדי להקל על החילוץ לאחר ultracentrifugation. סימני חץ אדומים שבו הצינור יהיה פירסינג לשעברמערכת שבריר VLP. (BE) micrographs של תרכיזי ויראלי: micrographs epifluorescence של 0.45 תרכיזים נגיפיים נציג מיקרומטר מסונן של Star7 (B) וCAR9 (ד '). חלקיקים גדולים כוללים תאי חיידקים נראו מ0.45 מיקרומטר-filtrates משתי דגימות Star7 (B) וCAR9 (ד '), ואילו VLPs בלבד (חיצים לבנים) יישאר אחרי ultracentrifugation שיפוע צזיום כלוריד; כוכבים 7 (ג) וCAR9 (E). אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

איור 6
איור 6. דוגמא של DAPI וניתוח מיקרוסקופ SYBR זהב. צילום מסך מניתוח DAPI () ודוגמא שקופיות זהב מוכתמת SYBR (B). אורך () ורוחב (מיקרומטר) מכל הדגישו חלקיקים(= חיידקים) ניתן להעריך בעזרת תוכנת הדמיה. שים לב לקיבוץ במרכז התמונה. אשכולות אלה יהיו צורך נכללו ניתוח שלאחר מכן. (ב) במהלך וירוסי ניתוח וחיידקים צריכים להיות זרקו לפח על ידי ספי גודל לVLP וטווחי גודל סלולריים (VLP אדום, ירוקה סלולארי). שים לב שיש בדרך כלל כמה VLPs קלוש Uncategorized על ידי תכנית ההדמיה המתאימה. VLPs אלה המופיעים נקודות לבנות קלושות חייב ייספר באופן ידני ולהוסיף לספירה הנגיפית האוטומטית. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

איור 7
דגימות איור 7. ריכוזים של SYBR זהב מוכתם. micrographs של מסנן 0.02 מטריצת אלומינה המכיל מספרים שונים של דגימות וירוס SYBR מוכתמות. לוח מראה afilter המכיל כמות מתאימה של מי ים המסוננת, ואילו הריכוזים על המסנן מוצגים B הם גבוהים מדי ובC נמוכים מדי לספירה אמינה. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

איור 8
איור 8. תוצאות של cytometry זרימת פלט ניתוח של מדגם שונית-מים. לוח (א) מראה מים כיתה מולקולריים רק עם microspheres צהוב-ירוק ניאון (0.75 מיקרומטר), משמש לאימות רקע מינימאלי עם הגדרות המכשיר. לוח (B) מתאר את הפלט של ריצת דגימת מים שונית עם הגדרות זהות ופריסה בביאור א שעדיין ניתן לראות את החרוזים באותו המקום, יחד עם כמה אוכלוסיות של autotrophs. (C) ב( ב '), המשמש לגיבוי שער cytometer הזרימה, מיקוד אירועים חיוביים SYBR (אוטוטרופי + ספירת heterotrophic) ורקע צמצום. (ד) מדגם שונית-המים הנציג מוכתם בSYBR הירוק I. שימוש gating הוקם ב( C), הכוללת ספירת חיידק נוצרה, וחיידקי heterotrophic ואוטוטרופי למחיצות על ידי autofluorescence כלורופיל (ראו McDole et al. 4). אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

איור 9
איור 9. דוגמא לנתוני metagenome חיידקים. דפוסים בין נתוני חיידקי metagenomic רצף ומשתנים תלויים אתר. הנה, את השפע היחסי של Synechococcus Pelagibacter. לא (משמאל לוחות). המסלול מטבולים להעברת conjugative היה בקורולציה חיובית עם ריכוזי החנקות, ואילו המסלול מטבולים לתיקון ה- DNA היה עקבי בין כל metagenomes (לוחות מימין). אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

כוכבים 7 CAR9
מספר הכולל של קורא 939,311 591,600
מספר העיבוד המקדים קורא 579,664 360,246
אומר אורך רצף (נ"ב) 395 ± 131 451 ± 159
רצפים מבואר (%) 42,218 (7.3%) 9117 (2.5%)
לא ידוע (%) 537,446 (92.7%) 351,129 (97.5%)

טבלת 1. מאפייני נתונים של שתי viromes שנוצר מאיי הקו הדרומיים, סטארבק ומילניום. מידת הביאור מבוססת על בלאט באמצעות שרת MG-RAST.

טבלה 2
2. תוצאות נציג טבלה המציגות את הנתונים מאתרים שונים במהלך מסע אחד. הפרמטרים שנבדקו כאן מדידות כימיה מים יחד עם חיידקים ושכיחותם נגיפיות. הטבלה מכילה יותר שמות קבצים המתייחסים לנתונים metagenomic המתאימים עבור כל מיקום דגימה. מקבלים ריכוזי פחמן וחומרים מזינים אורגניים בμmol / L. אנאלחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של השולחן הזה.

Discussion

השיטות שהוצגו כאן תספק כלי ליצירת הערכה מקיפה של דינמיקה נגיפית וחיידקים במערכות אקולוגיות ימיות. הם ממוקדים לכמת את המניה עומדת משאבים אורגניים ואי-אורגניים זמינים לקהילות חיידקים ולאפיין את האיפור של הווה הקהילה הנגיפי וחיידקים. בסמוך לכימות שפע נגיפי ושפע וביומסה חיידקים, מידע רצף הגנומי מגלה מבנה הקהילה ותפקודם. כל השיטות פותחו או שונה כדי לאפשר ליישום במקומות בשדה מרוחק. עם זאת חוסר הגדרות מעבדה מבוקרת מטבע יוצר כמה פוטנציאל לטעויות. כאן אנו דנים כמה אזהרות הקשורים לכל אחד מהפרמטרים שהוערכו. ליד פוטנציאל לזיהום במהלך מדגם טיפול חלק מהפרמטרים גם להניב פוטנציאל לטעויות בתהליך אנליטי.

פחמן אורגני מומס

זיהום פחמן יכול להתרחש במהלך הליכי הדגימה (דגימה במורד הזרם, או בקרבת סירה או צוללן), במהלך הכנת המדגם (זיהום של ציוד או טיפול שלא במתכוון), וגם בזמן האחסנה של מדגם (דוגמאות אחרות במקפיא המכיל אורגני ממסים / נדיפים). כדי להימנע מהמקורות השונים של התנהגות זיהום ככמה צעדי טיפול ככל האפשר, כמו כל מעבר מדגם מהווה מקור נוסף לזיהום. המדגם לא צריך לקבל במגע עם כל פריט שלא חומצה שטפה או שריפה. לבסוף, מייעד מקפיא אחסון באופן בלעדי עבור דגימות לא מכילות חומרים אורגניים נדיפים יבטיח את השלמות של הדגימות במהלך תקופות אחסון ארוכות יותר. אם לא יכולים להיות כל הזמן דגימות קפואות במהלך החמצת תקופת נסיעות מורחבת של דגימות DOC עם HCl המרוכז (כמתואר 38-41) עשוי להיות חלופה מתאימה. כדי לוודא יש להשתמש בחומרי ייחוס קונסנסוס DOC דיוק המדידה regularly במהלך מדידת DOC פועל. במיוחד מי ים עמוק (2,000> מ ') אזכור הוא בעלי ערך בהערכת הביצועים של המכונה האנליטית כפי שהוא מאוד יציב בתוכן DOC שלה 42.

חומר אורגני חלקיקים

בנוסף להימנעות זיהום פחמן אורגני, דגימת POM דורשת תשומת לב מיוחדת כדי להבטיח את הדיוק של הנפח המסונן. אם הנפח הממוקד של 500 מיליליטר צריך לסטות מכל סיבה שפוטנציאל הזה צריך לציין להתייחס הסכום של POM שנתפס על המסנן לתסנין שהוא נוצר.

חומרים מזינים אורגניים

כמו בדגימת פחמן אורגנית, יש לשים לב לזיהום מדגם מזין אפשרי שנוצר על ידי מקורות שונים כמו סירות או פריקות שפכים 12. מסננים המשמשים לדגימת פחמן אורגנית עם גודל נקבובית נומינלי של 0.8 מיקרומטר, ייתכן שלא לכלול את כל יומסה וציוד ה החיידקיםולד ולכן להיות שונה כדי 0.2 מיקרומטר מסננים לסינון צעד זה. יתר על כן, מגבלות זיהוי להוות בעיה עם דגימות מזינים; במיוחד במים העיליים oligotrophic סביב מקומות שונית אלמוגים רבים (למשל, Cotner et al. 43). גבולות איתור הם בערך סביב 0.1, 0.2, ו -0.1 μmol / L לאמוניום, ניטראט וניטריט, ואורתו-פוספט בהתאמה (ראה 36,12,37)

מיקרוסקופית

לצד הבדלים בריכוז של ניתוח תמונת דגימות משקופיות מיקרוסקופ מניב נוסף פוטנציאל לטעויות. לדוגמא, תמונות עשויות להיות מחוץ לפוקוס באזורים מסוימים של שדה הראייה, ונמצאים בפוקוס באחרים. כמסנן מטריצת אלומינה טוהר גבוה הוא סוג מסנן נוקשה מאוד, כל פסולת מתחת למסנן עלולה לגרום לכל המסנן לשבת על זווית לשקופית. כתוצאה מכך, תמונות יכולות להיות באופן עקבי מחוץ לפוקוס בחלקים שונים של שדה הראייה למסנן נתון, מחדשgardless של יישור מיקרוסקופ. לתלות שוב מסננים, להבטיח את החלק התחתון של המסנן נקי, יכול לשפר את זה אם הוא ציין. כמו כן, במקרים מסוימים ייתכן שיש שני מוקדי מטוסים שבו ניתן למצוא וירוסים וחיידקים. זוהי התוצאה של אובייקטים מוכתמים הופכים מנותק מהמסנן על הרכבה, ומרחפים לי לחלק התחתון של להחליק את המכסה מה שעלול להפוך ספירה לא אמינה. לכן מומלץ תמיד לבדוק את האיכות של הדגימות במהלך התהליך.

Cytometry הזרימה

כמו במקרה של הדגימות מיקרוסקופית, יכול להיות שיש באופן טבעי הבדלים בין זרימת cytometry דגימות אשר דורשות התאמות של התהליך אנליטי. לדוגמא, תלוי ברגישות של המכשיר, תאי פרוכלורוקוקוס עמום fluorescing עשויים להיות נמוכים מרמת הרעש ולא ניתן לכמת. חרוזים לשמש שליטת מדגם פנימי (למשל, כדי לוודא שהשו"ת של המכשירonse לאותות ניאון עולה בקנה אחד מהיום ליום (ונשאר יציב בזמן הריצה עצמה). אם נוסף למדגם בריכוזים ידועים, הם יכולים לשמש גם כבקרה פנימית כדי לוודא את ריצת נפח דגימה. עם זאת, מומלץ תמיד לרוץ aliquot של מדגם קפוא בעבר "סטנדרטי" של מי ים שמופשר ומוכתם יחד עם הדגימות של עניין לספק הדברה ביולוגית נוספת למדגם טיפול בין ריצות צלחת 96-היטב. בהתאם למיקום, דגימות מי ים עשויות להיראות שונות מאוד אחד מהשני. מיון אוכלוסיות "נציג" ולאחר מכן הצגה תחת מיקרוסקופ epifluorescent (EM) יכול להיות דרך טובה כדי לוודא במהירות אוכלוסיות הפיטופלנקטון כמו גם Synechococcus sp. או אאוקריוטים פוטוסינתזה. תאי פרוכלורוקוקוס הם בדרך כלל לא נראים לעין תחת EM כי הם נעלמים מהר מדי. בנוסף לכלורופיל, sp Synechococcus. מכיל גם phphycoeurythrin otopigment (PE), אשר פולט אור באורכי גל קצר יותר (540-630 ננומטר) מאשר כלורופיל (660-700 ננומטר). כאשר תאי Synechococcus נרגשים עם אור כחול / ירוק (470-490 ננומטר), הם יופיעו זהב נצפו אם תחת מסנן פליטה שמסיר את כל אורכי הגל של אור מתחת 510 ננומטר. לשם השוואה, החלק האווקריוטי ייראה אדום, כאשר ירגשו עם אותו אורך הגל של אור.

Metagenomics ויראלי

חשוב לציין כי התהליך של ריכוז ואחסון VLP משפיע על הקהילה התאוששה. אובדן חלקיקים נגיפי יכול להתרחש בכל שלב בתהליך, ובכך, הבחירה של פרוטוקולים לטיהור והעשרה נגיפיים יכולה הסוף של דבר משפיעה על הרכב שנצפה הטקסונומית וגיוון של metagenomes הנגיפי כתוצאה 44,45,18. ריכוז של דגימות ניתן לעשות זאת באמצעות TFF 19 או כימי מבוסס הַפתָתָה 20. בבסיס כימי הגישה, לְהַנִיחַively טעון יוני ברזל מחייבים את חלקיקי נגיף באופן טבעי הטעונים שלילי ויוצרים מתחמי ברזל-ויראלי (> 8 מיקרומטר) גדולים שflocculate מתוך פתרון וניתן לשחזר באמצעות 8 מיקרומטר מסננים. בהמשך הברזל chelated את חלקיקי נגיף ומחדש מומס באמצעות מגנזיום, חומצה אסקורבית, וEDTA, עוזב חלקיקים נגיפיים מרוכזים להפקת חומצות גרעין 20. לאחר ההשוואה בין שתי שיטות קיימים אלה, הגענו למסקנה כי שיטת כלוריד הברזל הוא פחות זמן רב יותר מאשר ריכוז נגיפי TFF, אך עשוי להניב כמה אזהרות. מצאנו כי ניתוק ופירוק של הברזל ויראלית דורש פי שניים פתרון מגנזיום חומצה אסקורבית-EDTA מרוכז יותר מ -20 דיווחו על מנת שפירוק להמשיך לפני מדרדרת החומצה אסקורבית. מלבד בעיה זו, הפרוטוקול מטהר חלקיקים נגיפיים על ידי גודל-חלוקה לבד, הסרת מזהמי חיידקים באמצעות 0.2 מיקרומטר סינון. וירוסים גדולים אינם עוברים דרך filtאה (לדוגמא, יאנג et al. 46) ובכך לא להיות מזוהה בmetagenome, בעוד כמה חיידקים לעשות (McDole, נתונים שלא פורסמו). התוצאה היא זיהום חיידקים תוך אפליה נגד וירוסים גדולים.

שהבעיה ספציפית אך רלוונטית גם להסרת של חיידקים בחיבור עם ריכוז TFF. כטיפול כלורופורם הוכח להסיר וירוסי כלורופורם רגיש עם ממברנות שומנים בדם חיצוניות 47 מחקרים מראים כי 0.22 מיקרומטר סינון ניתן להשתמש כדי להסיר את רוב החיידקים. ראוי גם לציין, כי השיטה שהציגה בעיקר למטרה bacteriophage, הספק הנפוץ ביותר של חומר גנטי בסביבות ימיות. מכיוון שהפאג נחשב בדרך כלל לא מכילים בדרך כלל שומנים 48 הם עמידים יותר לטיפול כלורופורם. למיטב ידיעתנו שיטת "לתפוס את כל" אינה קיימת עד כה. השיטה המוצגת כאן היא עיבוד ouניסיון בתחום R במהלך 10 השנים האחרונות בסביבות ימיות המיועדות למערכות טרופיות הארקטי.

החיידקים metagenomics

הבנייה של ספריות metagenomic לחיידקים (כלומר, חיידקים וחיידקים קדומים) היא יותר פשוטה מאשר metagenomes הנגיפי כפי שהוא קל יותר ליצור ריכוזי DNA מינימאליים הנדרשים להכנת ספרייה. ספריות לינקר הגברה רובה (LASLs) הגברה 17,49,50 וכל הגנום המבוססים על ההגברה עקירה מרובה (מד"א) הן שני השיטות הנפוצות ביותר ליצירת DNA מספיק לקביעת רצף. השימוש במד"א להשיג ריכוזי DNA גבוהים יותר בmetagenomes חיידקים לפעמים יש צורך. אולם זה יכול לגרום להפרעות בנתונים ברצף, כגון overamplification של minicircles dinoflagellate. שיטות מד"א ידועות כדי להגביר דנ"א חד-גדילים ומעגליים מועדף, וכתוצאה מכך התוצאות לא-כמותי 51,52. LASLs מותאם להתקרב 50 ניתן אפוא משמש כחלופה טובה יותר בהגברת שני חיידקים וDNA הנגיפי metagenomic עבור סידור. חשוב לציין כי יש לו את גישת LASLs שלבים מרובים, דורשת ציוד מתוחכם, ומוגבלת לתבניות dsDNA. יתר על כן, ערכת חילוץ DNA הרקמה הוכח לחלץ DNA משני טווח מערכת שלילית גרם חיובי וגרם, אבל זה לא אומת למיני חיידקים ביעילות lyse סוררים או מבנים הקשורים בם (למשל, חיידקים קדומים מסוימים, endospores, או נבגי פטריות) . לכן צעד מכות חרוז עשוי להיות נחוץ כדי להשיג DNA מחיידקים מסוימים.

הערכות מקיפות אלה יגרמו להבנה טובה יותר של תפקוד מערכת אקולוגית ויראליים וחיידקים. למרות שמספר מחקרים שנערכו הניסיון להעריך את כל הפרמטרים שהוצעו, רב כבר חוקר אלה שנבחרו. נלסון ואח '. 53 הציע חיבור betwבתי גידול een שונית ספציפית וdepletions בשני ריכוזי DOC וbacterioplankton יחסית למים מהחוף. שינויי ריכוז אלו לוו בבידול מובחן של קהילות bacterioplankton. Dinsdale et al. 5 הראה כי השפעת פעילות אנושית מוגברת הייתה מלווה ב10x שכיחות גבוהה יותר של תאי חיידקים וחלקיקים כמו וירוס. קהילות חיידקים במי אוקיינוס ​​המקיפים את האיים מיושבים היו גם שברים גדולים יותר של heterotrophs ופתוגנים פוטנציאליים 5. לבסוף McDole et al. 4 הראו, על ידי הצגת ציון microbialization, שפעילות אנושית הסטת אנרגיה לחיידקים, על חשבון macrobes. מחקרים אלה, המתמקדים בפרמטרים של חיידקים וכימיה מים ספציפיים, לספק תובנות חדשות למבנה הביוכימי של מערכות אקולוגיות ימיות. שילוב הנתונים מסורתיים של מאמצי ניטור מערכת אקולוגית - כמו ערכי טמפרטורה ו- pH, ביומסה הדגים וdiversity, כיסוי של קרקעית ים, או חשיפה להשפעה אנושית - עם כימיה מים והערכות חיידקים, צפוי לגרום למאמצי ניטור סביבתי רגישים יותר, שעלולה להוביל למאמצי שימור ממוקדים יותר.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Niskin collection and processing units (Hatay Niskins) Figure 1
Filtration setup Figure 1
32-36% Hydrochloric acid (HCl) Fisher Sci A508-212
High-density polyethylene (HDPE) container e.g., 5 Gallon HDPE UN Certified Pail with Snap-On Lid
Combustion oven (550 °C)
60 ml HDPE vials  Fisher Sci 02-896-2B
25 mm GF/F filter Fisher Sci 09-874-64
Forceps  Fisher Sci XX62-000-06
Sterile, non-powdered gloves Fisher Sci 19-170-010B
Bilge pump  e.g., Thirsty Mate 124PF
20 L collapsible low-density polyethylene carboy e.g., Reliance Fold A Carrier II
Tangential flow filter (TFF) ultrafiltration hollow fiber cartridges Amersham CFP-2-E-9A
Platinum-cured silicon tubing for TFF Cole Parmer 96440-82
Hose clamps Cole Parmer P-68007-23
Peristaltic pump Cole Parmer EW-77410-10
Sodium hydroxide (NaOH) solution Electron Microscopy Sciences 21162
0.2 µm Polycarbonate track-etched membrane filter Fisher Sci 09-300-61
8.0 µm Polycarbonate track-etched membrane filter Fisher Sci 09-300-57
0.22 µm Polyvinylidene difluoride cylindrical filter Fisher Sci SVGP01050
0.45 µm Polyvinylidene difluoride cylindrical filter Fisher Sci SVHV010RS
Synthetic nylon mesh Sefar 03-125-37
20 ml Plastic scintillation bottle Fisher Sci 03-341-72C
Clean bucket (10-20 L)
32% Paraformaldehyde Electron Microscopy Science 15714
25% Glutaraldehyde Electron Microscopy Science 16220
Liquid nitrogen
0.02 µm High-purity alumina matrix filter with annular polypropylene support ring  Fisher Sci 6809-6002
0.2 µm High-purity alumina matrix filter with annular polypropylene support ring Fisher Sci 6809-6022
10,000x SYBR Gold nucleic acid stain Invitrogen S11494
DAPI solution 25 µg/ml Invitrogen D1306
Molecular grade water sigma aldrich W-4502
Ascorbic acid Fisher Sci BP351-500
Phosphate Buffered Saline (PBS) Fisher Sci BP399-500
Glycerol Fisher Sci G31-500
Microscope slide Fisher Sci 12-550-123
Coverslip Fisher Sci 12-548-5M
Delicate task wipe  Fisher Sci 06-666A
Slide station with vacuum pump Figure 3
DNA extraction kit Macherey-Nagel 740952.1 Nucleospin tissue kit
Proteinase K (20 mg/ml) Lifetechnologies AM2546
200-proof Ethanol Electron Microscopy Sciences 15058
Red cap: Male Luer with Lock Ring x Female Luer Coupler  Cole Parmer EW-45503-88
Cesium chloride (CsCl) Fisher Sci bp1595-500
60 ml Syringe Fisher Sci 13-6898
0.02 µm Alumina matrix disposable syringe filter Fisher Sci O992613
Ultra-clear centrifuge tubes Beckman Coulter 344059
Ultra-swinging bucket rotor Beckman Coulter 333790 SW41 Ti Rotor 
DNase I (100 units/µl) Calbiochem 260913
0.5 M EDTA Fisher Sci BP2482-500
Formamide Fisher Sci BP228-100
Glycogen sigma aldrich G-1767
1x Tris-EDTA (TE) pH 8.0 Fisher Sci BP2473-500
Sodium Dodecyl Sulfate (SDS) Fisher Sci 02674-25
20 μg/ml Proteinase K Fisher Sci BP1700-500
Chloroform Fisher Sci BP1145-1
Phenol:Chloroform:Isoamyl alcohol 25:24:1 sigma aldrich p3803
Isopropanol Fisher Sci BP2618-500
50 ml Oak Ridge tube Fisher Sci 05-562-16B

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Fuhrman, J. A. Marine viruses and their biogeochemical and ecological effects. Nature. 399, (6736), 541-548 (1999).
  2. Azam, F., Malfatti, F. Microbial structuring of marine ecosystems. Nature Reviews Microbiology. 5, (10), 782-791 (2007).
  3. Huber, J. A., et al. Microbial population structures in the deep marine biosphere. Science. 318, (5847), 97-100 (2007).
  4. McDole, T., et al. Assessing coral reefs on a Pacific-wide scale using the microbialization score. PloS ONE. 7, (9), (2012).
  5. Dinsdale, E. A., et al. Microbial ecology of four coral atolls in the Northern Line Islands. PloS ONE. 3, (2), (2008).
  6. Nelson, C. E., et al. Coral and macroalgal exudates vary in neutral sugar composition and differentially enrich reef bacterioplankton lineages. The ISME Journal. 7, (5), 962-979 (2013).
  7. Haas, A. F., et al. Influence of coral and algal exudates on microbially mediated reef metabolism. PeerJ. 1, (2013).
  8. Smith, J. E., et al. Indirect effects of algae on coral: algae‐mediated, microbe‐induced coral mortality. Ecology Letters. 9, (7), 835-845 (2006).
  9. Burdige, D. J., Martens, C. S. Biogeochemical cycling in an organic-rich coastal marine basin: 10. The role of amino acids in sedimentary carbon and nitrogen cycling. Geochimica et Cosmochimica Acta. 52, (6), 1571-1584 (1988).
  10. Capone, D. G., Kiene, R. P. Comparison of microbial dynamics in marine and freshwater sediments: Contrasts in anaerobic carbon catabolism. Limnology and Oceanography. 33, (4), 725-749 (1988).
  11. Krom, M. D., Sholkovitz, E. R. Nature and reactions of dissolved organic matter in the interstitial waters of marine sediments. Geochimica et Cosmochimica Acta. 41, (11), 1565-1574 (1977).
  12. Grasshoff, K. Methods of sea-water analysis. Verlag Chemie. Weinheim and New York. (1976).
  13. Strickland, J. D. Practical handbook of seawater analysis. Bulletin Fisheries Research Board of Canada. 167, (1968).
  14. Sharp, J. H., et al. Analyses of dissolved organic carbon in seawater: the JGOFS EqPac methods comparison. Marine Chemistry. 48, (2), 91-108 (1995).
  15. DeLong, E. F. Microbial population genomics and ecology. Current Opinion in Microbiology. 5, (5), 520-524 (2002).
  16. Hugenholz, P., Goebel, B. M., Pace, N. R. Impact of Culture-Independent Studies on the Emerging Phylogenetic View of Bacterial Diversity. Journal of Bacteriology. 180, (18), 4765-4774 (1998).
  17. Breitbart, M., et al. Genomic analysis of uncultured marine viral communities. Proceedings of the National Academy of Sciences. 99, (22), 14250-14255 (2002).
  18. Willner, D., Hugenholtz, P. From deep sequencing to viral tagging: Recent advances in viral metagenomics. BioEssays. 35, 436-442 (2013).
  19. Thurber, R. V., Haynes, M., Breitbart, M., Wegley, L., Rohwer, F. Laboratory procedures to generate viral metagenomes. Nature Protocols. 4, 470-483 (2009).
  20. John, S. G., et al. A simple and efficient method for concentration of ocean viruses by chemical flocculation. Environmental Microbiology Reports. 3, 195-202 (2011).
  21. Lim, Y. W., et al. The Microbiome and Virome of CF. Pediatric Pulmonology. 47, 321-322 (2012).
  22. Kelly, L. W., et al. Black reefs: iron-induced phase shifts on coral reefs. The ISME Journal. 6, (3), 638-649 (2012).
  23. Bjornsen, P. K. Automatic determination of bacterioplankton biomass by image analysis. Applied Environmental Microbiology. 51, 1199 (1986).
  24. Simon, M., Azam, F. Protein content and protein synthesis rates of planktonic marine bacteria. Marine Ecology Progress Series. 51, (3), 201-213 (1989).
  25. Hara, S., Koike, I., Terauchi, K., Kamiya, H., Tanoue, E. Abundance of viruses in deep oceanic waters. Marine Ecology Progress Series. 145, (1), 269-277 (1996).
  26. Wommack, K. E., Colwell, R. R. Virioplankton: viruses in aquatic ecosystems. Microbiology and Molecular Biology Reviews. 64, (1), 69-114 (2000).
  27. Weinbauer, M. G., Brettar, I., Hofle, M. G. Lysogeny and virus-induced mortality of bacterioplankton in surface, deep, and anoxic marine waters. Limnology and Oceanography. 48, (4), 1457-1465 (2003).
  28. Clasen, J. L., Brigden, S. M., Payet, J. P., Suttle, C. A. Evidence that viral abundance across oceans and lakes is driven by different biological factors. Freshwater Biology. 53, (6), 1090-1100 (2008).
  29. Parada, V., Baudoux, A. C., Sintes, E., Weinbauer, M. G., Herndl, G. J. Dynamics and diversity of newly produced virioplankton in the North Sea. The ISME Journal. 2, (9), 924-936 (2008).
  30. Angly, F. E., et al. The marine viromes of four oceanic regions. PLoS Biology. 4, (11), (2006).
  31. Hansell, D. A., Carlson, C. A. Deep ocean gradients in dissolved organic carbon concentrations. Nature. 263, (266), (1998).
  32. Carlson, C. A., et al. Dissolved organic carbon export and subsequent remineralization in the mesopelagic and bathypelagic realms of the North Atlantic basin. Deep Sea Research Part II: Topical Studies in Oceanography. 57, (16), 1433-1445 (2010).
  33. Sharp, J. H. Improved analysis for particulate organic carbon and nitrogen from seawater. Limnology and Oceanography. 19, (6), 984-989 (1974).
  34. Ehrhardt, M., Koeve, W. Determination of particulate organic carbon and nitrogen. Methods of Seawater Analysis. Third Edition, 437-444 (2007).
  35. Haas, A. F., et al. Organic matter release by coral reef associated benthic algae in the Northern Red Sea. Journal of Experimental Marine Biology and Ecology. 389, (1), 53-60 (2010).
  36. Guildford, S. J., Hecky, R. E. Total nitrogen, total phosphorus, and nutrient limitation in lakes and oceans: Is there a common relationship. Limnology and Oceanography. 45, (6), 1213-1223 (2000).
  37. Allison, S. D., Chao, Y., Farrara, J. D., Hatosy, S., Martiny, A. C. Fine-scale temporal variation in marine extracellular enzymes of coastal southern California. Frontiers in Microbiology. 3, (2012).
  38. Van Duyl, F. C., Gast, G. J. Linkage of small-scale spatial variations in DOC, inorganic nutrients and bacterioplankton growth with different coral reef water types. Aquatic Microbial Ecology. 24, (1), 17-26 (2001).
  39. De Goeij, J. M., Van Duyl, F. C. Coral cavities are sinks of dissolved organic carbon (DOC). Limnology and Oceanography. 52, (6), 2608-2617 (2007).
  40. De Goeij, J. M., et al. Major bulk dissolved organic carbon (DOC) removal by encrusting coral reef cavity sponges. Marine Ecology Progress Series. 357, 139-151 (2008).
  41. Mueller, B., et al. Natural diet of coral-excavating sponges consists mainly of dissolved organic carbon (DOC). PLoS ONE. 9, (2), (2014).
  42. Carlson, C. A., Ducklow, H. W., Hansel, D. A. Organic carbon partitioning during spring phytoplankton blooms in the Ross Sea polynya and the Sargasso Sea. Oceanography. 43, (3), 375-386 (1998).
  43. Cotner, J. B., et al. Nutrient limitation of heterotrophic bacteria in Florida Bay. Estuaries. 23, (5), 611-620 (2000).
  44. Willner, D., et al. Metagenomic detection of phage-encoded platelet-binding factors in the human oral cavity. Proceedings of the National Academy of Science USA. 108, (1), 4547-4553 (2011).
  45. Hall, R. J., et al. Evaluation of rapid and simple techniques for the enrichment of viruses prior to metagenomic virus discovery. Journal of Virological Methods. 195, 194-204 (2013).
  46. Yang, S. Y., et al. Nanoporous membranes with ultrahigh selectivity and flux for the filtration of viruses. Advanced Materials. 18, (6), 709-712 (2006).
  47. Feldman, H. A., Wang, S. S. Sensitivity of various viruses to chloroform. Proceedings of the Society for Experimental Biology and Medicine. 106, (4), 736-738 (1961).
  48. Ackermann, H. W. The Bacteriophages., Second Edition. Calendar, R. Oxford University Press. New York. 8-16 (2006).
  49. Henn, M. R., et al. Analysis of High-Throughput Sequencing and Annotation Strategies for Phage Genomes. PLoS ONE. 5, (2), (2010).
  50. Duhaime, M. B., Deng, L., Poulos, B. T., Sullivan, M. B. Towards quantitative metagenomics of wild viruses and other ultra-low concentration DNA samples: a rigorous assessment and optimization of the linker amplification method. Environmental Microbiology. 14, (9), 2526-2537 (2012).
  51. Yilmaz, S., Allgaier, M., Hugenholtz, P. Multiple displacement amplification compromises quantitative analysis of metagenomes. Nature Methods. 7, (12), 943-944 (2010).
  52. Kim, K. H., Bae, J. W. Amplification Methods Bias Metagenomic Libraries of Uncultured Single-Stranded and Double-Stranded DNA Viruses. Applied Environmental Microbiology. 77, (21), 7663-7668 (2011).
  53. Nelson, C. E., Alldredge, A. L., McCliment, E. A., Amaral-Zettler, L. A., Carlson, C. A. Depleted dissolved organic carbon and distinct bacterial communities in the water column of a rapid-flushing coral reef ecosystem. The ISME Journal. 5, (8), 1374-1387 (2011).
  54. Kelly, L. W., et al. Local genomic adaptation of coral reef-associated microbiomes to gradients of natural variability and anthropogenic stressors. Proceedings of the National Academy of Sciences. 111, (28), 10227-10232 (2014).
  55. Lim, Y. W., Haynes, M., Furlan, M., Robertson, C. E., Harris, J. K., Rohwer, F. Purifying the Impure: Sequencing Metagenomes and Metatranscriptomes from Complex Animal-associated Samples. J. Vis. Exp. (2014).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics