Svelare i giocatori invisibili del Mare - Una guida del campo di Acqua Chimica e microbiologia marina

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Haas, A. F., Knowles, B., Lim, Y. W., McDole Somera, T., Kelly, L. W., Hatay, M., Rohwer, F. Unraveling the Unseen Players in the Ocean - A Field Guide to Water Chemistry and Marine Microbiology. J. Vis. Exp. (93), e52131, doi:10.3791/52131 (2014).

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Abstract

Qui vi presentiamo una serie di protocolli di ricerca accuratamente testati e ben standardizzati adattati per l'uso in ambienti marini remoti. I protocolli di campionamento comprendono la valutazione delle risorse a disposizione della comunità microbica (carbonio organico disciolto, particelle di materia organica, nutrienti inorganici), e una descrizione esauriente delle comunità batteriche e virali (via conte virali e microbiche diretti, enumerazione dei microbi autofluorescenti, e costruzione di metagenomi virali e microbiche). Noi usiamo una combinazione di metodi, che rappresentano un campo disperso di discipline scientifiche che comprendono i protocolli già esistenti e alcune delle più recenti tecniche sviluppate. Tecniche di sequenziamento Soprattutto metagenomiche utilizzati per la caratterizzazione della comunità virali e batteriche, sono stati stabiliti solo negli ultimi anni, e sono quindi ancora sottoposto a un costante miglioramento. Ciò ha portato a una serie di procedure di campionamento e di elaborazione del campione Currentemente in uso. L'insieme dei metodi qui presentata fornisce un approccio fino a data da raccogliere e trattare campioni ambientali. I parametri affrontati con questi protocolli producono il minimo di informazioni essenziale per caratterizzare e comprendere i meccanismi alla base della dinamica comunità virali e microbiche. Dà facile da seguire le linee guida per condurre indagini complete e discute passaggi critici e potenziali avvertenze pertinenti per ogni tecnica.

Introduction

Ecosistemi marini sono sottoposti ad una vasta gamma di perturbazioni che provocano cambia da disponibilità di nutrienti alla biomassa dei predatori. Negli ultimi dieci anni, diversi studi hanno dimostrato l'importanza delle comunità microbiche in ecosistemi marini 1-4. È evidente che i cambiamenti nella comunità batteriche e virali sono strettamente associati con il degrado complessivo degli ambienti marini 5. Questi cambiamenti possono essere agevolati da geochimica alterato nella colonna d'acqua, come la disponibilità di ossigeno o remineralizzazione carbonio 6,7. Come risultato l'interdipendenza tra la macrorganismi, chimica dell'acqua e microbiche anelli di retroazione di attività può accelerare la velocità di degradazione dell'ecosistema 8.

Negli anni 1970 e '80 sono stati fatti diversi tentativi di svelare cicli biogeochimici negli ecosistemi marini 9-11. Una delle principali sfide per questi primi studi è stata la mancanzadi approcci standardizzati per misurare i parametri biogeochimici valutati. Anche se c'erano protocolli disponibili, principalmente su acqua di mare nutrienti 12,13, la valutazione della dinamica del carbonio e la struttura della comunità microbica sono stati limitati dagli strumenti e metodi disponibili. Con il metodo di confronto JGOFS EqPac, Sharp et al. 14 suggerito per la prima volta un protocollo affidabile e standardizzato per valutazioni carbonio organico disciolto (DOC) di concentrazione. Nei primi anni 2000 le sfide analitiche per determinare le risorse disponibili per la comunità microbica era così stato in gran parte risolti e approcci per la caratterizzazione delle comunità microbiche in ambienti di coltura controllati era stato stabilito (vedi DeLong 15). I metodi di sequenziamento tradizionali, a quel tempo in gran parte affidamento su colture clonali coltivate. All'inizio sequenziamento del gene ambientale di campioni naturali rivelato, tuttavia, che la maggior parte della biodiversità microbica era stata persa da cultivmetodi basati zione-16. Nel 2002, Breitbart et al. 17 utilizzato sequenziamento shotgun per la prima volta a descrivere la comunità virale in campioni di acqua marina ambientali stabilisce un metodo per sequenziare l'intero genoma delle comunità virali marini incolte.

Nell'ambito delle valutazioni microbici esistenti, i virus rimangono ancora particolarmente sotto-studiato, come la maggior parte sono difficili da coltivare e non hanno un indicatore universalmente conservato come il 16S RNA ribosomiale (rRNA) geni tipicamente utilizzati per valutare la diversità e la comunità profiling. L'approccio di sequenziamento metagenomica offre un'alternativa ai metodi di coltura-dipendente e gene targeting per l'analisi di comunità virali complessi. Mentre i primi metagenomi virali generati da acqua di mare sono stati sequenziati utilizzando il sequenziamento Sanger 17, lo sviluppo di tecnologie di sequenziamento di nuova generazione e le tecniche molecolari miglioramento ha portato ad un rapido aumento negli studi metagenomiche 18 19-21.

Per approfondire la conoscenza esistente virale, microbica e il funzionamento biochimico in ecosistemi acquatici, confrontando i set di dati nei vari sistemi in tutto il mondo è essenziale. Tuttavia, sono stati ampiamente sviluppati i protocolli stabiliti per gli ambienti vicino alla costa con strutture di laboratorio facilmente accessibili. Pertanto, la mancanza di metodi standardizzati campo ostacola questi confronti tra ecosistema. Qui introduciamo accuratamente testato e ben standardizzato adattamenti di stato dei protocolli di ricerca dell'arte per l'utilizzo in posizioni di campo remote. Questi metodi sono stati dimostrati con successo in diversi studi che misurano l'ultima decade 5,22 e sono attualmente utilizzati da diversi laboratori marini nonché sulla NOAAReef Valutazione e programma di monitoraggio (RAMP) in tutto l'Oceano Pacifico 4. I protocolli di campionamento sono i parametri dell'acqua di chimica (concentrazioni carbonio organico e inorganico, di concentrazione dei nutrienti inorganici), abbondanza virale e microbico (conta batterica diretti, conta virali diretti, e citometria a flusso per valutare autotroph vs rapporti eterotrofi), e la struttura della comunità microbica e virale e potenziale metabolico attraverso l'analisi metagenomica (per una rassegna si veda la Figura 1). I risultati ottenuti dai metodi qui descritti sono necessari al fine di chiarire i parametri di fondo biogeochimici chiave necessarie per caratterizzare completo ecosistemi acquatici.

Protocol

1. Preparazione degli strumenti

  1. Preparazione del programma di installazione di filtrazione
    1. Preparare una soluzione al 5% di acido cloridrico (HCl) (0,5-0,6 M, aggiungere 250 ml di 32-36% di HCl al 4,75 L di acqua distillata per fare 5 L di soluzione finale). Conservare in un polietilene ad alta densità contenitore (HDPE) per 2 settimane.
    2. Lasciare tutte le parti che entrano a contatto con il campione (tranne i filtri) per 24 ore nella soluzione di HCl 5% a sanguisuga i potenziali carbonio organico disciolto (DOC) i contaminanti. Dopo ogni evento di campionamento sciacquare tutti i componenti e le linee a filo con circa 30 ml di soluzione al 5% di HCl per prevenire la contaminazione di carbonio (ad esempio, da esalazioni di gas, olio, barche, spray antizanzare).
    3. Tenere tutti gli elementi di campionamento avvolti in un foglio di alluminio pre-combusto o innevate fino a immediatamente prima dell'uso per.
    4. Precombust 25 millimetri GF / F filtri avvolto in un foglio di alluminio in un forno a muffola a 550 ° C per 12 ore a volatilizzarsi fuori tutto il carbonio e di memorizzarli in un ambiente pulito e asciuttoposto fino al momento dell'uso. Utilizzare pinze lavata con acidi e sterili, guanti senza polvere per gestire i filtri precombusted in ogni momento.
  2. Preparazione del virali metagenoma Materiali di campionamento
    1. Lavare accuratamente quattro pieghevoli damigiane 20 L a bassa densità di polietilene e quattro 20 L in polietilene ad alta densità secchi e coperchi con il 10% di candeggina.
    2. Successivamente lavare tutti gli elementi 3x con acqua distillata e poi campione e richiudere damigiane con rubinetto.
    3. Filtri Lavare flusso tangenziale (TFF) dopo ogni utilizzo secondo il seguente protocollo, e pulire preventivamente se il filtro non è stato utilizzato negli ultimi 5 giorni.
    4. Sciogliere 50 g di pellet di NaOH al 5 L di acqua in un secchio di lavaggio.
    5. Attaccare un TFF bagnato al tubo e assemblare secondo la figura 3.
    6. Eseguire pompa peristaltica a ~ 30 rpm senza contropressione di spostare alcuni della soluzione di lavaggio NaOH attraverso il sistema. Una volta lavaggio fluisce dalla linea di ritorno, spostare il trasferimento di lavare secchioper completare la circolazione di soluzione.
    7. Applicare contropressione al sistema posizionando un morsetto sulla linea di ritorno a valle del TFF. Questo costringerà soluzione di lavaggio la linea filtrato. Tempo eccessivo (5 min) a inondare l'esterno del TFF e produrre filtrato è indicativo di un TFF degradato.
    8. Eseguire il sistema finché tutta la soluzione di NaOH è nelle linee. Quindi rimuovere contropressione, soluzione a corto di sistema ed eliminare.
    9. Risciacquare TFF dall'acqua corrente sotto contropressione finché il pH dell'acqua che scorre dalle linee di ritorno e filtrato è pH 7-8.
    10. Rimuovere il tubo dalla pompa peristaltica e TFF. Richiudere TFF per la conservazione. Assicurarsi che il TFF rimane bagnato fino al prossimo utilizzo.

2. Raccolta dei campioni

NOTA: Durante il trasporto tutti i campioni raccolti devono essere conservati al fresco (se possibile 4 ° C) e non esposte alla luce diretta del sole fino al procedimento successivo.

  1. Campionaturaper Carbon, nutrienti, Microscopia, citometria a flusso, e microbiche Metagenomica
    1. Prendete due unità Hatay Niskin per evento di campionamento (con conseguente acqua campione 4 L). Aprire i vasi di campionamento appena prima di immergersi (altrimenti l'aria intrappolata impedirà discendente).
    2. In ciascun sito, lavare l'interno del recipiente di campionamento con dell'acqua campione aprendo entrambe le estremità e spostando il cilindro lungo l'asse polare attraverso l'acqua.
    3. Prendere il campione e chiudere con cura il contenitore di campionamento. Assicurarsi che il sito di campionamento è a monte dalla barca e subacquei per evitare la contaminazione.
  2. Campionamento per virali Metagenomica
    1. Sul sito di destinazione montare pompa di sentina a 20 L damigiana.
    2. Riempire damigiana mira pompa di sentina in ogni area e la tenuta di mira damigiana con il relativo rubinetto.
    3. Raccogliere 4 damigiane di acqua di mare filtrata (tutti insieme 80 L) da ciascun sito di campionamento.

3. Sample preparazione

NOTA: elaborare i campioni nell'ordine indicato qui, a partire da DOC per ridurre al minimo le possibilità di contaminazione. Utilizzare guanti senza polvere per l'intera procedura.

  1. Carbonio organico disciolto (DOC)
    1. Montare una delle due aliquote unità Hatay Niskin nella rispettiva scanalatura del set filtrazione. Collegare il tubo di uscita che conduce al rispettivo portafiltro. Collegare il tubo dell'aria in pressione (0,2 bar) per l'unità di Hatay Niskin (vedere la figura 2).
    2. Lavare tutte le linee con 100 ml di acqua campione prima di inserire filtri portafiltri. Mettere 25 millimetri pre-incombusti GF / F filtro nel supporto filtro utilizzando l'acido lavato pinze. Sciacquare ogni bottiglia DOC e tappare 3 volte con circa 20 ml di acqua di campionamento filtrati.
    3. Riempire la bottiglia con circa 40 ml (~ 2/3 pieno) di acqua di campionamento. Raccogliere almeno duplicati di campioni DOC di avere una copia di backup in caso di potenziale contaminazione o perdita durante il trasporto.
    4. Fbottiglie di campionamento reeze in piedi in posizione verticale a -20 ° C fino al momento dell'analisi.
  2. Particolato organico (POM)
    1. Dopo i campioni DOC sono state raccolte continuano filtraggio fino a un totale di 500 ml hanno superato il filtro GF / F, tra cui quello che ha attraversato, mentre la raccolta di campioni DOC.
    2. Supporto del filtro in linea Svitare.
    3. Rimuovere il filtro per l'analisi POM con pinze e filtro posto all'interno di un quadrato di foglio di alluminio pre-combusti, piegare il lato superiore rivolto ripiegata su se stessa, e avvolgere.
    4. Fermo filtri a -20 ° C per una conservazione fino sottoposto ad analisi elementare ed isotopica.
  3. Nutrienti inorganici
    1. Mettere un filtro da 0,2 micron Track-Inciso in ciascun portafiltro. Rimontare le cassette del filtro.
    2. Lavare ogni 20 ml bottiglia di plastica di scintillazione tre volte con acqua di campionamento. Riempire ogni bottiglia alla spalla (~ 18 ml).
    3. Congelare a -20 ° C fino al momento dell'analisi tardi.
  4. Microscopy (SYBR oro e DAPI)
    1. Togliere il supporto del filtro.
    2. Raccogliere 1 ml di acqua in ciascuna delle due provette da microcentrifuga.
    3. Aggiungere 66 ml 32% paraformaldeide ad una delle aliquote (di seguito SYBR oro colorazione). Aggiungere 12 ml 25% glutaraldeide al corrispondente altro (per dopo colorazione DAPI).
    4. Mescolare delicatamente, e con i campioni di "fissare" per almeno 15 minuti a temperatura ambiente al buio.
  5. Citometria a flusso
    1. Inserire un filtro di policarbonato 8,0 micron di uno dei portafiltri escludere detriti e grandi cellule eucariotiche.
    2. Far passare l'acqua attraverso il campionamento per riempire 2 cryovials da ogni sito di campionamento con 1 ml di campione.
    3. Aggiungere 5 ml di 25% glutaraldeide per ogni esageratamente (concentrazione finale = 0,125%).
    4. Inverti fiale per mescolare.
    5. Lasciare che il campione di fissare per 15-30 minuti a temperatura ambiente. Non superare i 30 min.
    6. Congelare i campioni Flash in azoto liquido.
    7. Conservare i campioni a -80 ° C o in liquid azoto dry shipper fino al momento dell'analisi su un citometro a flusso.
  6. Microbica del campione metagenomica
    1. Rimuovere in portafiltri linea.
    2. Direttamente montare un filtro cilindrico 0,22 micron sulla rispettiva linea.
    3. Filtro acqua rimanente campione di entrambe le unità Hatay Niskin da ogni sito (per un totale di 3-4 L per filtro) attraverso un filtro.
    4. Dopo la filtrazione spingere l'acqua rimanente su ciascun filtro utilizzando una siringa da 10 ml pulito riempito di aria.
    5. Mettere filtro in confezione originale e sigillare il pacchetto con nastro laboratorio.
    6. Conservare filtri confezionati singolarmente a -20 ° C.
  7. Viral campione metagenomica
    1. Trasferire i campioni metagenoma virali immediatamente nei secchi lavati per garantire l'assenza di campione viene perso o contaminata dall'ambiente.
    2. Pre-filtro con maglie larghe dimensioni di nylon dei pori (25-100 micron) per rimuovere i detriti e materiale cellulare prima di concentrazione 19.
    3. Impostare TFF come mostrato in Figura 3, posizionando la linea di alimentazione in un secchio di esempio, e lasciando le linee di ritorno e filtrato in esecuzione in un lavandino.
    4. Accendere la pompa peristaltica e le linee di flusso con 1-2 litri di acqua del campione.
    5. Mettere linea di ritorno nel secchio del campione per completare il ciclo, aggiungere 0,7 bar di contropressione.
    6. Pur concentrando l'acqua di mare, rabboccare serbatoio campione come il livello scende. Quando il livello dell'acqua scende al di sotto della linea di aspirazione nel secchio, il trasferimento in un concentrato, triplo risciacquo tripour bicchiere di candeggina-lavato e continuare a concentrarsi.
    7. Se bicchiere serbatoio è vuoto, rimuovere contropressione, aumentare la velocità della pompa e spingere l'intero campione attraverso le linee, recuperando nel tripour.
    8. Passare il concentrato con 0,45 micron filtri cilindrici per rimuovere la maggior parte dei batteri, mentre non discriminare alcun lignaggi virali.
    9. Modificare 0,45 micron filtri cilindrici dopo ogni 150 ml. Raccogliere il 0,45 micron-filconcentrato virale trato in provette da 50 ml.
    10. Aggiungere 250 ml di cloroformio per ciascuna aliquota di 50 ml di concentrato virale filtrata per eliminare i batteri residui. Miscelare, e conservare, in posizione verticale a 4 ° C fino al successivo trattamento.
    11. Asciugare i 0,45 micron filtri e memorizzarli come descritto nei passi 3.6.5 e 3.6.6.

4. Il trattamento di Microscopia Campioni

NOTA: Sciacquare torri filtro con candeggina al 10% seguito da etanolo al 95% per evitare potenziali macchie o residui biologici tra le piste. Campioni al microscopio di processo all'interno di 1 ora ed evitare macchie di esporre e filtri colorati di luce, se possibile.

  1. Monte
    1. Aggiungere 100 ml di 10% di acido ascorbico a 4,9 ml di PBS 1x, e mescolare accuratamente.
    2. Aggiungere 5 ml di 100% glicerolo, e mescolare accuratamente.
    3. Montaggio filtro con un 0,02 micron matrice di allumina filtro siringa monouso, aliquota e conservare a -20 ° C.
  2. SYBROro colorazione
    1. Pipettare un'aliquota di 500 microlitri di ciascun campione fissate con paraformaldeide al 2% concentrazione finale in una provetta da microcentrifuga.
    2. Aggiungere 0,5 ml di soluzione 1,000x SYBR Gold ciascuna delle aliquote.
    3. Mescolare il campione delicatamente e metterlo al buio per 10 min.
    4. Collocare un filtro matrice di allumina 0,02 micron con anulare anello di supporto in polipropilene su ogni supporto filtro del sistema pompa per vuoto e fissare le torri filtri (Figura 4). Assicurarsi che il filtro 0,02 micron è posto sul supporto filtro in plastica rivolta verso l'alto, in quanto questi filtri hanno una duplice porosità.
    5. Con la pompa a vuoto spenta, aggiungere 500 ml di SYBR macchiato del campione, insieme con 2 ml di 0,02 micron di virus filtrata acqua libera per garantire il campione si sviluppa in modo uniforme attraverso il filtro.
    6. Accendere la pompa a vuoto per creare una pressione negativa di non più di 1 bar per evitare di danneggiare i virus e microbi stati filtrati.
    7. Lasciare che l'intero campione di andareattraverso.
    8. Utilizzando pinze (non la stessa coppia come quello usato per la DOC), rimuovere con attenzione ogni filtro dal filtro torre, e passare un compito delicato pulire per garantire il filtro sia asciutto.
    9. Pipettare 10 ml di montaggio su un vetrino da microscopia e asciugare il filtro contenente il campione colorato sulla goccia del monte.
    10. Aggiungere 10 microlitri montare all'inizio di ciascun filtro prima di aggiungere un coprioggetto.
    11. Premere delicatamente il vetrino coprioggetto verso il basso. Cercate di eliminare le bolle d'aria, se possibile, ed evitare di lato il movimento del coprioggetto.
    12. Disporre il vetrino in una slidebox e conservare a -20 ° C.
  3. Colorazione DAPI
    1. Mettere un filtro matrice di allumina 0,2 micron con anulare anello di supporto in polipropilene su ogni supporto filtro e collegare le torri del filtro.
    2. Con la pompa a vuoto spenta, aggiungere 2 ml di 0,02 micron acqua filtrata senza virus per ogni torre usata.
    3. Pipettare 1 ml del campione glutaraldeide-fisso in ogni torre, con conseguente in un volume o totalef 3 ml in ogni torre filtro.
    4. Attiva pompa a vuoto per creare una pressione negativa non superiore a 1 bar.
    5. Filtro intero campione sul filtro matrice di allumina 0,2 micron.
    6. Rimuovere con cautela il filtro dalla filtrazione torre con pinze (non è la stessa coppia come quello usato per la DOC).
    7. Posizionare il filtro su una soluzione DAPI 100 goccia pl [25 mg / ml] in una capsula di Petri mantenere il filtro giusto rivolto verso l'alto e lasciare che la macchia del campione per 15 minuti. Evitare la luce durante il processo di colorazione.
    8. Dopo l'15 min, rimuovere il filtro dalla macchia, passare sopra un compito delicato wipe ad asciugare e versare in un calo di 100 ml di acqua priva di 0,02 micron virus filtrato, ancora una volta tenendo il filtro in posizione normale, per lavare via rimanente macchia DAPI per 1 min. Ripetere questo lavaggio una volta.
    9. Filtro Montare su vetrino da microscopio modo identico come descritto per i campioni SYBR Gold.

5. Estrazione del DNA

  1. Microbica metagenomica DNA
    1. Scongelare i filtri cilindrici per almeno 20 minuti a temperatura ambiente.
    2. Rimuovere acqua di mare residua nel filtro utilizzando una siringa da 10 ml. Tappare l'estremità inferiore del filtro cilindrico con un tappo sbiancato e sterilizzati in autoclave.
    3. Per ogni filtro, mescolare 360 ​​ml T1 "pre-lisi" buffer e 50 ml proteinasi K, e quindi dispensare la miscela nel filtro. Tappare l'estremità aperta.
    4. Incubare la reazione di lisi in un forno rotante O / N (o almeno 2 ore) a 55 ° C.
    5. Rimuovere uno dei il tappo e aggiungere 200 ml B3 "lisi" buffer nel filtro al campione pre-Lyse. Ri-tappo e incubare la miscela in un forno rotante per 10-20 minuti a 70 ° C.
    6. Estrarre l'intero volume del filtro cilindrico con una siringa da 3 ml succhiando il liquido con il filtro capovolto.
    7. Espellere il campione lisato in una nuova provetta per microcentrifuga e aggiungere 200 ml di etanolo al 100%.
    8. Mescolare bene, caricare l'intero campione sul girocolonna, e procedere secondo le istruzioni del protocollo del produttore.
    9. Quantificare il DNA utilizzando un test con immunofluorescenza-based.
  2. Marine virale Metagenomica
    1. Purificante e concentrazione dei fagi particelle (modificato da Thurber et al. 19)
      1. Sciogliere CsCl in acqua di mare per preparare le soluzioni di 1,7 g / ml, 1,5 g / ml, 1,35 g / ml, 1,2 g / ml (calibrato pesando 1 ml di soluzione). Filtro ciascuna frazione con 0,02 micron filtro prima dell'uso.
        NOTA: Assicurarsi che la densità di ogni frazione ha una precisione di tre cifre significative prima di usare le soluzioni e filtrare tutte le soluzioni con un filtro 0,02 micron prima dell'uso. Usare acqua di mare o acqua di mare saturi di CsCl per abbassare o aumentare la densità, rispettivamente.
      2. Fare un vetrino da 1 ml di reagenti combinati come descritto al paragrafo 4.2 per assicurare che tutti i reagenti sono privi di virus prima di procedere.
      3. Aggiungere 9 g CsCl a 45 ml di concentrato virale TFF peruna densità finale di 1,12 g / ml. Mettete in frigorifero durante l'impostazione del passo gradiente di CsCl.
      4. A partire dalla g / ml di soluzione 1.7 aggiungere successivamente 1 ml di ciascuna sequenza frazione meno densa lentamente in ogni provetta con pipette sierologiche. Segnare il livello di ogni singolo menisco e garantire che i pycnoclines tra i decimali non vengono disturbati. Per ulteriori dettagli si veda il documento compagna (Lim et al. 2014).
      5. Con un carico pipetta sierologica 7,5 ml di campione in ciascuno dei 6 tubi e centrifugare a ~ 83.000 xg, a 4 ° C per 2 ore.
      6. Senza interrompere i gradienti di densità scaricano il rotore e perforare il tubo appena sotto il già segnato 1,5 g / ml strato densità (Figura 5) con un ago da 18 G in una siringa da 3 ml. Aspirare 1,5 ml di VLP purificate e trasferire in una nuova provetta. Ripetere l'operazione per tutti i campioni.
      7. Aggiungere 0,2 volumi di cloroformio alle VLP purificate, mescolare energicamente, incubare a temperatura ambiente per 10 minuti.
      8. Aggiungere 150 &# 181; l di tampone 10x DNAse ad ogni provetta.
      9. Spin a 16.000 xg per 5 min, e raccogliere la fase acquosa. Se il cloroformio non aggregata sul fondo della provetta, aggiungere più tampone DNAsi, mescolare e ripetere.
      10. Aggiungere DNasi I (concentrazione finale = 2,5 unità / ml) e incubare a 37 ° C per 2 ore, poi inattivare l'attività DNasi incubando a 65 ° C per 15 min.
    2. Estrazione del DNA da particelle virali simili (VLP)
      1. In modo uniforme in comune le VLP purificate da ogni campione in due provette Oak Ridge puliti e sterilizzati in autoclave.
      2. Aggiungere 0,1 Volume 2 M Tris-HCl (pH 8,5) con 0,2 M EDTA, 0,01 volume di 0,5 M EDTA, 1 volume di formammide, 10 microlitri glicogeno (10 mg / ml). Mescolare bene e incubare a temperatura ambiente per 30 min.
      3. Riferendosi a nuovo volume, aggiungere 2 volumi RT 100% di etanolo. Mescolare e incubare a 4 ° C per più di 30 min.
      4. DNA pellet dopo la rotazione dei tubi di Oak Ridge a 17.200 xg per 60 minuti, al 4 & #176; C.
      5. Rimuovere il surnatante. Lavare il pellet di DNA due volte con ghiacciata etanolo al 70% con pipette sierologiche.
      6. Rimuovere tutti etanolo (ri-filatura brevemente se necessario), copertura e permettere pellet asciugare a temperatura ambiente per> 15 min.
      7. Risospendere il pellet di DNA per> 15 minuti in 567 ml di tampone 1X TE (pH 8,0). Trasferire i 567 ml di DNA risospeso in una nuova provetta da 1,5 ml microcentrifuga.
      8. Aggiungere 30 ml di 10% SDS (pre-calda a 65 ° C prima dell'uso) e 3 ml di proteinasi K (20 mg / ml), mescolare accuratamente e incubare per 1 ora a 56 ° C.
      9. Aggiungere 100 ml di NaCl 5 M e mescolare accuratamente. Aggiungere 80 ml di soluzione CTAB NaCl pre-riscaldato, vortice, e incubare per 10 min a 65 ° C.
      10. Aggiungere 0,2 parti di volume di cloroformio, vortex e centrifugare a 16.000 xg per 2 minuti. Trasferire il surnatante in una nuova provetta da 1,5 ml microcentrifuga.
      11. Aggiungere un volume uguale di fenolo cloroformio isoamil 25: 24: 1 soluzione, agitare per miscelare,e girare a 16.000 xg per 2 minuti. Trasferire il surnatante in una nuova provetta 1,5 ml.
      12. Aggiungere pari volume di cloroformio, vortice, e far girare a 16.000 xg per 2 minuti. Trasferire il surnatante in una nuova provetta 1,5 ml.
      13. Aggiungere 0,7 volumi di isopropanolo alla frazione supernatante e incubare a -20 ° C per almeno 30 minuti per precipitare il DNA.
      14. Pellet il DNA facendo girare a 16.000 xg per 20 minuti a 4 ° C. Pipettare il surnatante e lavare il pellet due volte con 500 ml di ghiacciata etanolo al 70%.
      15. Spin a 16.000 xg ed eliminare l'etanolo residua dal tubo. Far asciugare il pellet per 15 min.
      16. Pellet di DNA Risospendere con 50 ml di tampone di eluizione (5 mM Tris, pH 7,5) o Tris-EDTA pH 8,0 per almeno 5 minuti a temperatura ambiente.
      17. Quantificare il DNA con alta sensibilità del test basato sulla fluorescenza.

Representative Results

Microscopia

Campioni Microscopia possono e devono essere analizzati immediatamente per assicurare che siano della qualità desiderata. Per misurare l'abbondanza e la distribuzione delle dimensioni della comunità batterica, diapositive DAPI saranno esaminate mediante microscopia in epifluorescenza (eccitazione / emissione: 358/461 nm, vedere McDole et al 2012). (Figura 6A). Conta delle cellule e le dimensioni possono essere raccolti mediante software di imaging (ad esempio, ImagePro o ImageJ). Dalla volumi lunghezza e in larghezza cellulari (V) sono derivati ​​facendo l'ipotesi che tutte le cellule hanno la forma di cilindri con tappi emisferiche utilizzando la seguente equazione:

V = π / 4 × w 2 (L - w / 3)

dove L è la lunghezza e w è la larghezza di ciascuna cella di 23,4. Biomassa microbica può essere stimata utilizzando le relazioni dipendenti dalle dimensioni precedentemente stabiliti for comunità microbiche marine 24. Generalmente batteri marini variano in lunghezza 0,1-4 micron, ma andare fino a ~ 8 micron di alcune località.

Mentre i filtri (0.2 micron) colorati con DAPI verranno visualizzati solo i batteri, i filtri utilizzati per la macchia SYBR Gold (0,02 micron) contengono batteri e virus. Misurare l'abbondanza di virus segue lo stesso protocollo per i microbi, tuttavia una eccitazione di 325-375 nm sarà utilizzato e il massimo di emissione è a 537 nm (Figura 6B).

Per generare dati quantitativi il volume di campionamento può essere necessario regolare seconda dell'abbondanza virale nel campione originale. Il volume corretto per filtrare è meglio determinata empiricamente per una data massa di acqua. Esempi di micrografie contenenti campioni con concentrazioni variabili virali sono illustrati nella Figura 7.

I risultati di studi precedenti suggeriscono che il virus di Microborapporti (VMR) variano generalmente da 1 a 50 nei sistemi acquatici 25-29, e tra 3 e 20, con una media di circa 6 nei sistemi di barriera corallina (Knowles dati non pubblicati).

Citometria a flusso

Oltre ai conteggi diretti e stima della dimensione della comunità microbica, la valutazione del rapporto tra autotrofi a microbi eterotrofi tramite citometria di flusso possono essere ulteriormente estratti dai campioni raccolti (flusso esemplare citometria uscita indicato nella Figura 8). Per determinare il numero totale di cellule batteri, i campioni vengono colorati con SYBR Green e un tubo fotomoltiplicatore con un filtro passa-banda 530/30 viene utilizzato per il rilevamento. Un canale per la clorofilla (torna specchi LP back determinata in una gamma di 675-735 nm) e (filtro passa-banda 585/42) phycoerytherin viene usato per contare l'abbondanza di autotrofi in campioni non colorati. Per determinare l'abbondanza di microbi eterotrofi, autotrofi i conteggi della nonparte macchiato sono quindi sottratto dal conteggio SYBR-tinto totale (McDole et al. submitted).

Metagenomica virali

Metagenomica virale utilizza un approccio molecolare cultura indipendente all'ecologia virale, utilizzando le informazioni di totale sequenza genomica per determinare la struttura e la funzione della comunità. Metagenomica fa progredire la nostra comprensione della complessità e la diversità delle comunità virali a livello locale da 17 a scala globale 30. Il recente sviluppo di una vasta gamma di strumenti bioinformatici per l'analisi dei dati metagenomiche virale è diminuita colli di bottiglia di calcolo, consentendo una visione più completa della della virosphere attraverso la lente della metagenomica.

I metodi qui presentati evidenziano l'isolamento e l'arricchimento di particelle virali dall'acqua di mare usando una combinazione di prefiltrazione con ampio nylon dimensione dei pori della maglia per rimuovere i detriti e materiale cellulare, concentrazione dicampioni con TFF (figura 3) ed una successiva 0,45 micron filtrazione per rimuovere le cellule più grandi. Questo metodo produce circa un 100x campione concentrato (figure 5B-5E), che ci permette di eseguire processi a valle in volumi più piccoli. Al fine di prevenire la crescita di eventuali cellule microbiche rimanenti nel lisato virale e quindi le variazioni di abbondanza virale del campione durante il lungo tempo di transito tra la stazione di campo e di laboratorio, il cloroformio viene spesso aggiunto ad una concentrazione finale del 2% per la conservazione. Dopo isolamento e purificazione di VLP, epifluorescenza con coloranti acidi nucleici come SYBR oro vengono utilizzati per verificare la presenza e la purezza delle particelle virali (figure 5B-5E).

Qui, vi presentiamo due metagenomi virali dalla barriera corallina Island Line meridionale, in particolare, la Starbuck (star7) e Millennium (CAR9, precedentemente conosciuto come Caroline) isole. Un volume totale di 120 L samacqua ple è stato raccolto da ciascun sito ad una profondità di 10 metri e lavorata come descritto al punto 3.7 e 5.2. Le VLP purificate dal gradiente di cloruro di cesio centrifugazione erano 3,3 x 10 8 particelle / ml per CAR9 (Figura 5D) e 2,9 x 10 9 particelle per ml per star7 come verificato secondo il metodo descritto nel paragrafo 4 (Figura 5B). La quantità totale di DNA isolato da questi campioni sono stati di circa 400 ng basa sulla misurazione NanoDrop. Il DNA è stato amplificato utilizzando Phi29 polimerasi e sequenziato dalla facilità Environmental Genomics Nucleo nel 2011. Le caratteristiche dei dati di sequenza è presentato in Tabella 1. Sulla base di ricerche di somiglianza con database esistenti, la maggior parte (> 70%) delle sequenze spesso causato non caratterizzate, cioè, origini sconosciute e funzioni. Allo stesso modo, i due viromes presentati qui presentati oltre il 97% delle sequenze sconosciute. Come risultato, non di databaseanalisi dipendente è stato utilizzato per l'analisi e ha aperto un nuovo braccio di opportunità di ricerca sulla "materia oscura" in metagenomica virali (Seguritan et al. in corso di stampa).

Microbica Metagenomica

L'analisi di metagenomi microbici permette la caratterizzazione della comunità microbica presente e la descrizione funzionale di queste comunità. Gli esempi includono le stime della presenza di agenti patogeni e virulenza 5,22 o confronti tra i cambiamenti nella struttura della comunità macrobial o nutrienti disponibili e l'abbondanza delle specie e dei loro predominanti vie metaboliche (Figura 9; Kelly et al 2014.).

Chimica dell'acqua

Parametri chimici dell'acqua in genere prendono vasta elaborazione analitica per generare i dati desiderati; campioni per analisi DOC saranno misurati tramite ossidazione catalitica ad alta temperatura 31,32, particolato organico (POM) mediante spettrometria di massa a rapporto isotopico accoppiato ad un analizzatore elementare 33-35, e nutrienti inorganici da Flow Injection Analysis 36,12,37. Dopo il completamento di tutte le analisi, le informazioni come mostrato nella tabella 1 sarà disponibile per completare la caratterizzazione delle comunità microbiche e virali. Queste informazioni possono essere complimentato con rapporti di isotopi stabili di campioni di carbonio e di azoto organico (Vedi Haas et al. 35) e il rapporto tra autotrofi ed eterotrofi (McDole et al. Submitted).

Figura 1
Figura 1. Panoramica dei metodi descritti nella sezione del protocollo. Clicca qui per vedere una versione più grande di questo FIGUri.

Figura 2
Figura 2. Esempio di configurazione di elaborazione rig. La messa a punto di filtrazione introdotto qui (disegno schematico a sinistra, immagine reale pannello di destra) non è necessariamente tenuto a produrre campioni, ma sarà accelerare il processo in modo significativo. La configurazione consiste di una piastra posteriore, su cui sono montate le unità Hatay Niskin (1). In uscita rivolta verso il basso, le unità Hatay Niskin sono collegate con tubi in silicone ai possessori filtro in linea (2). Questi lasciano passare l'acqua campionata attraverso il rispettivo filtro nelle fiale di campionamento HDPE (3) montato proprio sotto. Il processo di filtrazione viene accelerato tramite aria in pressione (4), e regolato da un manometro (5). Una cassa di espansione impedisce la fuoriuscita d'acqua durante il cambiamento delle fiale HDPE o filtrazione POM. Si prega diclicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.

Figura 3
Acqua di campionamento Figura 3. tangenziale scaletta filtro flusso (modificato da Thurber et al. 19). Nylon Mesh filtrata viene pompata dal serbatoio (1) mediante una pompa peristaltica (2) per un filtro a flusso tangenziale (3). I campioni di acqua torna al serbatoio (1) lungo la linea di ritorno (4) in assenza di contropressione. Quando contropressione viene applicata attraverso una fascetta (5) sulla linea di ritorno, l'acqua passa attraverso il filtro e viene scartato o consegnato al serbatoio filtrato (6). Acqua campione è sostituito come è concentrata la linea filtrato fino a quando tutta l'acqua campione è concentrata nelle linee di tubi.

Figura 4
Figura 4. Microscopio impostazione filtrazione diapositiva.Per distribuire uniformemente DAPI e SYBR oro campioni colorati sul rispettivo filtro matrice di allumina (1), filtri devono essere messi in una torre del filtro (2) e lo stelo del collettore filtrazione e fissato con un morsetto (4). Un vuoto regolata pressione (5) sarà accelerare il processo di filtrazione (in alto disegno schematico, attuale pannello inferiore dell'immagine). Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.

Figura 5
Figura 5. Purificazione e concentrazione di particelle fagiche. Un totale di 1 ml di ciascuna gradiente di densità cloruro di cesio è strato sopra l'altro prima che porta il campione pretrattato (A). Ogni strato deve essere marcato all'esterno del tubo per facilitare l'estrazione dopo ultracentrifugazione. Freccia segni rossi dove il tubo viene trafitto a extratto la frazione VLP. (BE) Micrografie di concentrati virali: microscopio a epifluorescenza di 0,45 concentrati virali rappresentativi micron-filtrati di star7 (B) e CAR9 (D). Le particelle più grandi, tra cui le cellule batteriche erano visibili dalle 0,45 micron-filtrati da entrambi (D) campioni star7 (B) e CAR9, mentre solo VLP (frecce bianche) rimangono dopo gradiente di cloruro di cesio ultracentrifugazione; Stella 7 (C) e CAR9 (E). Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.

Figura 6
Figura 6. Esempio di DAPI e l'analisi al microscopio SYBR oro. Schermata dall'analisi di (A) e DAPI (B) SYBR oro macchiato esempio diapositiva. (A) lunghezza e larghezza (micron) di tutti evidenziati particelle(= Microbi) possono essere valutate con l'ausilio di un programma di imaging. Nota l'aggregazione nel centro dell'immagine. Questi gruppi dovranno essere esclusi dalla successiva analisi. (B) Durante i virus e batteri di analisi devono essere raggruppati in base alla soglia di grandezza in VLP e forcelle di dimensioni cellulari (VLP rosso, verde cellulare). Si noti che di solito ci sono alcune deboli VLP Uncategorized dal rispettivo programma di imaging. Questi VLP che appaiono come puntini bianchi deboli devono essere contati manualmente e aggiunti ai conti virali automatizzati. Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.

Figura 7
Figura 7. Le concentrazioni di SYBR oro macchiato campioni. Micrografie di un filtro di 0,02 matrice di allumina contenente vari numeri di SYBR macchiato campioni del virus. Pannello A mostra afiltro contenente una quantità adeguata di acqua di mare filtrata, mentre le concentrazioni sul filtro mostrato in B sono troppo elevati e in C troppo basso per i conteggi affidabili. Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.

Figura 8
Figura 8. Risultati di citometria a flusso in uscita l'analisi di un campione di reef-acqua. Pannello (A) mostra l'acqua di grado molecolare solo con microsfere di colore giallo-verde fluorescente (0,75 micron), utilizzati per verificare sfondo minimalista con le impostazioni dello strumento. Pannello (B) rappresenta l'uscita della corsa campione di acqua barriera corallina con le stesse impostazioni e il layout come in A. Si noti che le perle sono ancora visibili nella stessa posizione, insieme a diverse popolazioni di autotrofi. (C) (B), utilizzato per eseguire il cancello del citometro a flusso, il targeting SYBR eventi positivi (autotrofi eterotrofi + count) e minimizzando sfondo. (D) Il campione rappresentativo reef-acqua colorati con SYBR Green I. Utilizzo il gating con sede in (C), sono stati generati totale conta microbica, e microbi eterotrofi ed autotrofi partizionati dalla clorofilla autofluorescenza (vedi McDole et al. 4). Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.

Figura 9
Figura 9. Esempio di dati metagenoma microbiche. Modelli tra i dati di sequenza metagenomiche microbiche e del sito variabili dipendenti. Qui, l'abbondanza relativa di Synechococcus Pelagibacter spp. non è stato (a sinistra pannelli). La via metabolica per il trasferimento coniugativo era positivamente correlata con concentrazioni di nitrati, mentre la via metabolica per la riparazione del DNA è stato coerente tra tutti metagenomi (pannelli a destra). Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.

Stella 7 CAR9
Numero totale di letture 939.311 591.600
Numero di pre-elaborato Letture 579.664 360.246
Media Sequenza Lunghezza (bp) 395 ± 131 451 ± 159
Sequenze annotato (%) 42.218 (7,3%) 9.117 (2,5%)
Sconosciuto (%) 537.446 (92,7%) 351.129 (97,5%)

Tabella 1. Caratteristiche dei dati di due viromes generati dalle Isole linea sud, Starbuck e Millennium. Il grado di annotazione è basata su BLAT utilizzando il server MG-RAST.

Tabella 2
Tabella 2. Risultati rappresentativi che mostrano i dati da vari siti durante una spedizione. I parametri qui valutati dispongono inoltre di acqua misurazioni di chimica in coppia con microbica e abbondanze virali. La tabella contiene inoltre i nomi dei file relativi ai rispettivi dati metagenomiche per ogni punto di campionamento. Le concentrazioni di carbonio e nutrienti inorganici sono dati in mmol / l. Si prega diclicca qui per vedere una versione più grande di questa tabella.

Discussion

I metodi qui presentati fornirà uno strumento per generare una valutazione globale delle dinamiche virali e microbiche in ecosistemi acquatici. Essi sono mirati a quantificare lo stock in piedi delle risorse organiche e inorganiche a disposizione delle comunità microbiche e per caratterizzare la composizione della comunità microbica e virale presente. Accanto a quantificare l'abbondanza virale e abbondanza microbica e la biomassa, le informazioni sequenza genomica rivela la loro struttura e la funzione della comunità. Tutti i metodi sono stati sviluppati o modificati per consentire l'impiego in ambienti campo remote. Tuttavia la mancanza di applicazioni di laboratorio crea di per sé un po 'di possibilità di errori. Qui si discute alcuni avvertimenti associati a ciascuno dei parametri valutati. Accanto al potenziale di contaminazione durante la manipolazione del campione alcuni dei parametri anche produrre possibilità di errore nel processo analitico.

Il carbonio organico disciolto

Contaminazione carbonio può verificarsi durante le procedure di campionamento (campionamento a valle, o in prossimità di una barca o subacqueo), durante la preparazione del campione (contaminazione di attrezzature o manipolazione involontaria), e anche durante la conservazione del campione (altri campioni in congelatore contenente organica solventi / sostanze volatili). Per evitare le varie fonti di comportamento contaminazione pochi passi di manipolazione possibile, in quanto ogni trasferimento del campione pone un'ulteriore fonte di contaminazione. Il campione non deve entrare in contatto con qualsiasi elemento non acido lavato o bruciato. Infine, designa un congelatore archiviazione esclusivamente per campioni non contenenti sostanze organiche volatili garantisce l'integrità dei campioni durante periodi di inattività. Se i campioni non possono essere mantenute congelate nel corso di un lungo periodo di tempo l'acidificazione dei campioni DOC con HCl concentrato (come descritto 38-41) può essere un'alternativa applicabile. Per verificare i materiali di riferimento di consenso DOC precisione di misura devono essere utilizzati reglarmente durante la misurazione DOC viene eseguito. Soprattutto acqua di mare profondo (> 2.000 m) i riferimenti sono utili nella valutazione della performance della macchina analitica in quanto è molto stabile nel suo contenuto DOC 42.

Particolato organico

Oltre ad evitare la contaminazione carbonio organico, campionamento POM richiede una particolare attenzione per assicurare l'accuratezza del volume filtrato. Se il volume mirato di 500 ml deve discostarsi per qualsiasi motivo potenziale questo deve essere notato che l'entità di POM catturato sul filtro al filtrato di cui è stato prelevato.

Nutrienti inorganici

Come nel caso di campionamento di carbonio organico, l'attenzione deve essere rivolta alla possibile contaminazione del campione di nutrienti generati da varie fonti come imbarcazioni o scarichi di acque reflue 12. Filtri utilizzati per il campionamento di carbonio organico con un valore nominale di dimensione dei pori di 0,8 micron, non possono escludere tutta la biomassa microbica e shbbe quindi essere modificata a 0,2 micron filtri per questa fase di filtrazione. Inoltre, i limiti di rilevazione costituiscono un problema con campioni di cibi; soprattutto in acque di superficie oligotrofico intorno decine di citta 'della barriera corallina (ad esempio, Cotner et al. 43). Limiti di rilevabilità sono più o meno intorno a 0,1, 0,2, e 0,1 mmol / L per ammonio, nitrati e nitriti, e orto-fosfato, rispettivamente (vedi 36,12,37)

Microscopia

Accanto a variazioni della concentrazione di campioni di analisi delle immagini da diapositive di microscopia produce ulteriore possibilità di errori. Ad esempio, le immagini possono risultare fuori fuoco in alcune zone del campo visivo, e nel fuoco in altri. Come un filtro matrice di allumina di elevata purezza è un tipo di filtro molto rigido, i detriti sotto il filtro può causare l'intero filtro di sedersi su un angolo alla diapositiva. Di conseguenza, le immagini possono essere costantemente fuori fuoco in varie parti del campo di vista per un determinato filtro, riindipendente- di allineamento microscopio. Rimontaggio filtri, assicurando la parte inferiore del filtro è pulito, può migliorare questo se si osserva. Inoltre, in alcuni casi ci possono essere due piani focali in cui virus e microbi possono essere trovati. Questo è il risultato di oggetti colorati si stacchi dal filtro sul supporto e galleggianti fino alla parte inferiore del vetrino che può rendere conteggi inaffidabile. Pertanto si consiglia sempre di verificare la qualità dei campioni durante il processo.

Citometria a flusso

Come con i campioni di microscopia, ci possono essere naturalmente differenze tra citofluorimetria campioni che richiedono aggiustamenti del processo analitico. Ad esempio, a seconda della sensibilità dello strumento, debolmente fluorescenti cellule Prochlorococcus può essere inferiore al livello di rumore e non saranno quantificati. Perline servono come controllo campione interna (ad esempio, per confermare che risp dello strumentoOnse ai segnali fluorescenti è coerente da un giorno all'altro (e rimane stabile durante la corsa stessa). Se aggiunta al campione a concentrazione nota, possono anche servire come controllo interno per verificare la corsa volume del campione. Tuttavia, si raccomanda di eseguire sempre una aliquota di un campione di acqua marina precedentemente congelata "standard" che viene scongelato e macchiato con i campioni di interesse per fornire un controllo biologico aggiuntivo per la movimentazione tra corse piastre da 96 pozzetti campione. A seconda della posizione, campioni di acqua marina possono sembrare molto diversi tra loro. Ordinamento popolazioni "rappresentativi" e quindi la visualizzazione al microscopio epifluorescente (EM) può essere un buon modo per verificare rapidamente le popolazioni di fitoplancton sia come Synechococcus sp. O eucarioti fotosintetici. Prochlorococcus cellule non sono in genere visibili sotto EM perché svaniscono troppo in fretta. Oltre alla clorofilla a, Synechococcus sp. Contenere anche il phphycoeurythrin otopigment (PE), che emette luce a lunghezze d'onda più corte (540-630 nm) di clorofilla A (660-700 nm). Quando le cellule Synechococcus sono eccitati con luce blu / verde (470-490 nm), appariranno d'oro se visto sotto un filtro per le emissioni che rimuove tutte le lunghezze d'onda della luce al di sotto di 510 nm. In confronto, la frazione eucariotica sarà rosso, quando eccitato con la stessa lunghezza d'onda della luce.

Metagenomica virali

È importante notare che il processo di concentrazione VLP e stoccaggio influenza la comunità recuperato. Perdita di particelle virale può verificarsi in qualsiasi fase del processo, e quindi, la selezione dei protocolli di purificazione e di arricchimento virali può in definitiva influenzare la composizione tassonomica osservata e la diversità delle metagenomi virali risultanti 44,45,18. La concentrazione dei campioni può essere fatto utilizzando TFF 19 o 20 flocculazione chimica-based. In base chimico-approccio, positvamente addebitato ioni di ferro si legano le particelle virali naturalmente con carica negativa che formano grandi (> 8 micron) di ferro-virale complessi che flocculare dalla soluzione e possono essere recuperati utilizzando 8 micron filtri. Successivamente il ferro è chelato le particelle virali e ri-sciolto utilizzando magnesio, acido ascorbico, e EDTA, lasciando particelle virali concentrate per l'estrazione dell'acido nucleico 20. Dopo aver confrontato questi due metodi attuali, abbiamo concluso che il metodo di cloruro di ferro richiede meno tempo di quanto la concentrazione virale TFF, ma può dare alcuni avvertimenti. Abbiamo scoperto che la dissociazione e la dissoluzione del ferro-virale richiede una duplice soluzione di magnesio-acido ascorbico-EDTA più concentrato di quello riportato 20, al fine di scioglimento di procedere, prima che le degrada l'acido ascorbico. A parte questo problema, il protocollo purifica particelle virali per dimensione-frazionamento da solo, la rimozione di contaminanti microbici con 0,2 micron di filtrazione. Grandi virus non passano attraverso il filter (ad esempio, Yang et al. 46) e che quindi non essere rilevato nel metagenoma, mentre alcuni batteri fanno (McDole, dati non pubblicati). Ciò si traduce in una contaminazione batterica, mentre discriminare grandi virus.

Tale problema specifico tuttavia è importante anche per la rimozione di microbi in connessione con la concentrazione TFF. Poiché il trattamento cloroformio è stato dimostrato per rimuovere virus cloroformio-sensibile con membrane lipidiche esterni 47 alcuni studi suggeriscono che 0,22 micron filtrazione può essere usato per rimuovere la maggior parte dei batteri. Va inoltre notato che il metodo presentato rivolge prevalentemente batteriofago, il più abbondante vettore di materiale genetico in ambienti marini. Poiché fago sono generalmente ritenuto non contengono comunemente lipidi 48 che sono più resistenti al trattamento cloroformio. A nostra conoscenza di un metodo di "catch-all" non esiste fino ad oggi. Il metodo qui presentato è tratto dal ouesperienza sul campo r nel corso degli ultimi 10 anni in diversi ambienti marini tropicali si estendono ai sistemi artiche.

Microbica Metagenomica

La costruzione di librerie metagenomiche di microbi (ad esempio, batteri e di archeobatteri) è più semplice di quanto metagenomi virali in quanto è più facile per generare le concentrazioni minime di DNA necessari per la preparazione biblioteca. Amplificazione fucile librerie Linker (LASLs) 17,49,50 e intero genoma di amplificazione in base a più di spostamento di amplificazione (MDA) sono i due metodi più comunemente utilizzati per la generazione di DNA sufficiente per il sequenziamento. A volte è necessario l'utilizzo di MDA per ottenere elevate concentrazioni di DNA in metagenomi microbiche. Questo però può causare artefatti nei dati di sequenza, come ad esempio la overamplification di minicircoli dinoflagellati. Metodi di MDA sono noti per amplificare preferenzialmente il DNA a singolo filamento e circolare, con conseguente risultati non quantitativi 51,52. I LASLs ottimizzati avvicinano 50 può quindi serve come un'alternativa migliore in amplificando sia microbica e DNA virale metagenomica per il sequenziamento. È importante notare che l'approccio LASLs ha più passaggi, richiede attrezzature sofisticate, ed è limitata ai modelli dsDNA. Inoltre, il kit di estrazione del DNA dei tessuti ha dimostrato di estrarre il DNA da entrambe phyla negativo Gram positivi e Gram, ma non è stato verificato taxa microbica efficace lyse recalcitrante o le loro strutture associate (ad esempio, alcuni archeobatteri, endospore o spore fungine) . Quindi un pestaggio passo tallone può essere necessario per ottenere il DNA da alcuni microbi.

Queste valutazioni globali si tradurrà in una migliore comprensione del funzionamento degli ecosistemi virale e microbico. Anche se alcuni studi hanno assunto l'impegno di valutare tutti i parametri proposti, molti hanno indagato quelli selezionati. Nelson et al. 53 suggerito una connessione between habitat di scogliera specifico e esaurimento in entrambe le concentrazioni di DOC e batterioplancton relativi alle acque al largo. Questi cambiamenti di concentrazione sono state accompagnate da differenziazioni distinte delle comunità batterioplancton. Dinsdale et al. 5 hanno mostrato che maggiore impatto antropico è stato accompagnato da 10x abbondanze elevate di cellule microbiche e particelle virus-simili. Comunità microbiche in acque marine circostanti isole abitate avevano anche più grandi frazioni di eterotrofi e potenziali agenti patogeni 5. Infine McDole et al. 4 hanno mostrato, con l'introduzione del punteggio microbialization, che le attività umane stanno spostando energia per i microbi, a spese dei macrobes. Questi studi, incentrati sui parametri microbiologici e chimici dell'acqua specifici, forniscono nuove intuizioni nella struttura biochimica degli ecosistemi marini. Combinando i dati tradizionali delle attività di monitoraggio degli ecosistemi - come temperatura e pH, valori di biomassa di pesce e diversificazionety, la copertura bentonici, o l'esposizione a impatto umano - con la chimica dell'acqua e valutazioni microbiche, probabilmente porterà a sforzi di monitoraggio ambientale più sensibili, che possono portare a sforzi di conservazione più specificamente mirati.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Niskin collection and processing units (Hatay Niskins) Figure 1
Filtration setup Figure 1
32-36% Hydrochloric acid (HCl) Fisher Sci A508-212
High-density polyethylene (HDPE) container e.g., 5 Gallon HDPE UN Certified Pail with Snap-On Lid
Combustion oven (550 °C)
60 ml HDPE vials  Fisher Sci 02-896-2B
25 mm GF/F filter Fisher Sci 09-874-64
Forceps  Fisher Sci XX62-000-06
Sterile, non-powdered gloves Fisher Sci 19-170-010B
Bilge pump  e.g., Thirsty Mate 124PF
20 L collapsible low-density polyethylene carboy e.g., Reliance Fold A Carrier II
Tangential flow filter (TFF) ultrafiltration hollow fiber cartridges Amersham CFP-2-E-9A
Platinum-cured silicon tubing for TFF Cole Parmer 96440-82
Hose clamps Cole Parmer P-68007-23
Peristaltic pump Cole Parmer EW-77410-10
Sodium hydroxide (NaOH) solution Electron Microscopy Sciences 21162
0.2 µm Polycarbonate track-etched membrane filter Fisher Sci 09-300-61
8.0 µm Polycarbonate track-etched membrane filter Fisher Sci 09-300-57
0.22 µm Polyvinylidene difluoride cylindrical filter Fisher Sci SVGP01050
0.45 µm Polyvinylidene difluoride cylindrical filter Fisher Sci SVHV010RS
Synthetic nylon mesh Sefar 03-125-37
20 ml Plastic scintillation bottle Fisher Sci 03-341-72C
Clean bucket (10-20 L)
32% Paraformaldehyde Electron Microscopy Science 15714
25% Glutaraldehyde Electron Microscopy Science 16220
Liquid nitrogen
0.02 µm High-purity alumina matrix filter with annular polypropylene support ring  Fisher Sci 6809-6002
0.2 µm High-purity alumina matrix filter with annular polypropylene support ring Fisher Sci 6809-6022
10,000x SYBR Gold nucleic acid stain Invitrogen S11494
DAPI solution 25 µg/ml Invitrogen D1306
Molecular grade water sigma aldrich W-4502
Ascorbic acid Fisher Sci BP351-500
Phosphate Buffered Saline (PBS) Fisher Sci BP399-500
Glycerol Fisher Sci G31-500
Microscope slide Fisher Sci 12-550-123
Coverslip Fisher Sci 12-548-5M
Delicate task wipe  Fisher Sci 06-666A
Slide station with vacuum pump Figure 3
DNA extraction kit Macherey-Nagel 740952.1 Nucleospin tissue kit
Proteinase K (20 mg/ml) Lifetechnologies AM2546
200-proof Ethanol Electron Microscopy Sciences 15058
Red cap: Male Luer with Lock Ring x Female Luer Coupler  Cole Parmer EW-45503-88
Cesium chloride (CsCl) Fisher Sci bp1595-500
60 ml Syringe Fisher Sci 13-6898
0.02 µm Alumina matrix disposable syringe filter Fisher Sci O992613
Ultra-clear centrifuge tubes Beckman Coulter 344059
Ultra-swinging bucket rotor Beckman Coulter 333790 SW41 Ti Rotor 
DNase I (100 units/µl) Calbiochem 260913
0.5 M EDTA Fisher Sci BP2482-500
Formamide Fisher Sci BP228-100
Glycogen sigma aldrich G-1767
1x Tris-EDTA (TE) pH 8.0 Fisher Sci BP2473-500
Sodium Dodecyl Sulfate (SDS) Fisher Sci 02674-25
20 μg/ml Proteinase K Fisher Sci BP1700-500
Chloroform Fisher Sci BP1145-1
Phenol:Chloroform:Isoamyl alcohol 25:24:1 sigma aldrich p3803
Isopropanol Fisher Sci BP2618-500
50 ml Oak Ridge tube Fisher Sci 05-562-16B

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

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