مضان استنادا تمديد التمهيدي تقنية لتحديد ما الترانسكربتي المنطلقات ومواقع الشق من RNases

Biology

Your institution must subscribe to JoVE's Biology section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Schuster, C. F., Bertram, R. Fluorescence Based Primer Extension Technique to Determine Transcriptional Starting Points and Cleavage Sites of RNases In Vivo. J. Vis. Exp. (92), e52134, doi:10.3791/52134 (2014).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

مضان مقرها تمديد التمهيدي (FPE) هي طريقة الجزيئية لتحديد نقاط الانطلاق النسخي أو مواقع تصنيع جزيئات الحمض النووي الريبي. ويتحقق هذا عن طريق النسخ العكسي من الحمض النووي الريبي من الفائدة باستخدام بادئات fluorescently المسمى محددة والتحليل اللاحق للشظايا [كدنا الناجم عن تغيير طبيعة هلام بولي أكريلاميد الكهربائي. في الوقت نفسه، يتم تشغيل رد فعل التسلسل التقليدي سانجر على جل لرسم نهايات شظايا [كدنا لقواعد المناظرة الدقيقة الخاصة بهم. وعلى النقيض من 5'-RACE (السريع التضخيم من [كدنا ينتهي)، حيث يجب استنساخ المنتج ومرشحين متعددين التسلسل، فإن الجزء الأكبر من شظايا [كدنا] الناتجة عن تمديد التمهيدي يمكن الكشف في وقت واحد في واحدة المدى هلام. وبالإضافة إلى ذلك، فإن الإجراء بأكمله (من النسخ العكسي إلى التحليل النهائي لنتائج) يمكن أن تكتمل في يوم عمل واحد. باستخدام بادئات fluorescently المسمى، واستخدام النظائر المشعة الخطرة وصفت الكواشفويمكن تجنب وخفض أوقات المعالجة كما يمكن الكشف عن المنتجات أثناء إجراء الكهربائي.

في البروتوكول التالي، نحن تصف طريقة تمديد التمهيدي الفلورسنت في الجسم الحي موثوق وسريع لكشف نهايات 5 'من الرنا للاستدلال النسخي نقطة البداية وتجهيز مواقع RNA (على سبيل المثال، من خلال مكونات النظام السم الترياق) في س. الذهبية، E. كولاي وغيرها من البكتيريا.

Introduction

تمديد التمهيدي 1 هي طريقة الجزيئية لتحديد الغايات 5 'من جزيئات RNA محددة تصل إلى قرار قاعدة واحدة. ميزة لأساليب أخرى مثل 5'-RACE (التضخيم السريع ل[كدنا ينتهي) هي الفترة الزمنية السريعة والقدرة على تحليل بسهولة مزيج من أطوال مختلفة من جزيئات الحمض النووي الريبي.

يعمل هذا الأسلوب بإخضاع جزيئات الحمض النووي الريبي لعكس ردود الفعل النسخ باستخدام بادئات محددة الفلورسنت، وتوليد شظايا [كدنا بعض الأطوال. وتدار هذه الجزيئات [كدنا] جنبا إلى جنب مع سانجر تسلسل ردود الفعل التقليدية 2 على تغيير طبيعة المواد الهلامية بولي أكريلاميد ويمكن الكشف عنها بواسطة مضان من جراء استخدام بادئات fluorescently المسمى. ثم يتم تقييم أطوال شظايا [كدنا] من خلال المقارنة لسلم التسلسل، والسماح للرسم الخرائط من 'بنتيجة 5 RNA.

تقليديا، يتم استخدام ردود الفعل تمديد التمهيدي بالاشتراكمع النظائر المشعة للكشف عن جزيئات [كدنا على أفلام الأشعة السينية. بسبب المخاطر الصحية، وقضايا التخلص من النفايات وسهولة التعامل معها والبروتوكولات تستخدم أحدث مضان للكشف عن تمديد التمهيدي مع التعاقب الآلي، وإن كان حساسيتها أقل قليلا. باستخدام بادئات fluorescently المسمى، ويمكن حذف تكرار الإجراء الإذاعة وضع العلامات، والاشعال الفلورسنت مستقرة لفترة طويلة (أكثر من سنة في أيدينا).

طريقة وصفنا هنا يستخدم هلام المنظم الآلي، ولكن مع تعديلات طفيفة، التعاقب الشعرية يمكن أن تستخدم أيضا لفصل [كدنا] والكشف عن 3. طبيعة موازية لتحليل هلام تجعل من الممكن للكشف حتى كمية صغيرة من الانقسام RNA أو المعالجة. ميزة أخرى هي عالية الدقة لهذه الطريقة، والانقسام الطرفي أو تجهيز قاعدة واحدة حتى يمكن الكشف عنها.

في ما يتعلق بالكشف عن انشقاق RNA أو المعالجة، رypically نوعين مختلفين من ملحقات التمهيدي متميزة. في حالة واحدة، ويتم علاج الأنزيمية في المختبر باستخدام انزيم RNA المنقى والمنقى، بينما في الحالة الأخرى، ويتم تجهيز في الجسم الحي ويتم تنقيته من RNA الناتجة عن ذلك. في كلتا الحالتين تتعرض RNA لتنفيذ تمديد التمهيدي في المختبر، ومع ذلك، اعتمادا على مصدر من الحمض النووي الريبي، وطريقة إما يسمى في المختبر أو في الجسم الحي تمديد التمهيدي. في بروتوكول نقدم هنا، ونحن نركز فقط على المجراة التمهيدي التمديد، بسبب سهولة الاستخدام (لا يوجد تنقية البروتينات الضرورية) وإمكانية تحديد نقاط انطلاق النسخي والمعالجة في نفس الوقت. ومع ذلك، في المختبر ملحقات التمهيدي من حيث المبدأ اقامة بنفس الطريقة وهذا البروتوكول يمكن أن تكون بمثابة نقطة الانطلاق.

طريقة موضح هنا يمكن تطبيقها على العديد من الأنواع البكتيرية طالما أنها قابلة للارتفاعالنقاء وعالية الغلة إعداد الأحماض النووية.

البحث في مختبرنا يركز على نطاق تنظيمي نظم السامة الترياق (TA-) 4،5، وهو الحقل الذي يتم استخدام طريقة تمديد التمهيدي على نطاق واسع. TA-النظم هي عناصر جينية صغيرة موجودة في الجينوم بدائية النواة التي تتكون من البروتين السام مستقر ونشط التطور الطبيعي ومعظمها غير مستقر البروتين أو RNA الترياق الذي يصد سمية 6،7. النشاط السم يمارس أحيانا عن طريق تثبيط تكرار، تركيب جدار الخلية أو آليات أخرى، لكن في معظم الأحيان حسب النشاط ريبونوكلياز 8،9. عادة، يتم تحديد ريبونوكلياز خصوصية عن طريق إجراء اختبارات مختلفة، واحدة منها هي طريقة تمديد التمهيدي. ردود الفعل تمديد التمهيدي هي مناسبة تماما لهذا التطبيق، وخليط من شظايا طول المشقوق وكاملة يمكن تحليلها في وقت واحد لتحديد من 5 'تنتهي. باستخدام مزيج من في المختبر وفي الجسم الحي ملحقات التمهيدي، والسم محدد ريبونوكلياز الانقسام، على سبيل المثال، خصوصية التسلسل يمكن تحديد 10-13.

الشكل 1
الشكل 1. نظرة عامة على إجراء تمديد التمهيدي. يتم تحضين الثقافات البكتيرية وعلاجها وفقا لاحتياجات التجريبية. يتم استخراج الحمض النووي الريبي مجموع من الخلايا، وتعامل مع الدناز أنا لإزالة آثار الحمض النووي وتعرض لردة فعل عكس النسخ باستخدام بادئات محددة الهدف الحمض النووي الفلورسنت ذات العوائد [كدنا]. يتم استخراج الحمض النووي الجيني أو البلازميدات وتستخدم بعد ذلك لالفلورسنت ردود الفعل سانجر تسلسل للمقارنة مع حجم شظايا [كدنا]. تدار المنتجات تمديد التمهيدي إلى جانب المنتجات التسلسل سانجر على تغيير طبيعة هلام بولي أكريلاميد اليوريا وتحليلها مع الليزر الآلي والمجهر. قاعدة التسلسل الذي يصطف مع الفرقة [كدنا] هي لاالحادي قاعدة 5 "نهاية [كدنا] (السهم الأزرق). مزيد من المعلومات في Fekete، وآخرون. 3 الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.

لمحة عامة عن الإجراء بأكمله تمديد التمهيدي يمكن العثور عليها في الشكل 1. باختصار، الخلايا البكتيرية هي مثقف، تحصد، بيليه الخلايا هي lysed والحمض النووي الريبي المستخرج. ثم يتم التعامل مع RNA المنقى مع الدناز أنا لإزالة آثار لجزيئات الحمض النووي التي يمكن أن تكون بمثابة نماذج للالناسخ العكسي. تضاف الاشعال الفلورسنت محددة إلى RNA، المهجنة إلى المنطقة في وقت لاحق من الاهتمام وعكس كتب، مما أدى إلى واحد DNA مكملة الذين تقطعت بهم السبل ([كدنا]). يتم إنشاء سلم التسلسل بواسطة التسلسل التقليدي سانجر استخدام بادئات الفلورسنت وفصلها على تغيير طبيعة هلام بولي أكريلاميد جانب من شظايا تمديد التمهيدي [كدنا]. الناتجويتم تحليل هلام بمقارنة العصابات الفلورسنت، مما يسمح بتحديد الغايات 5 'من الفائدة. نقطة الانطلاق النسخي ومواقع المعالجة ثم يتم تقييمها بشكل فردي عن طريق مقارنات تسلسل.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. عالية الإنتاجية التحضير RNA

  1. عزل الحمض النووي الريبي
    وهناك حاجة إلى تركيزات عالية من الحمض النووي الريبي مجموع للتفاعل تمديد التمهيدي: ملاحظة. مجموعات عمود الدوران عادة لا تسفر عن كمية من الحمض النووي الريبي الحاجة (~ 5-16 ميكروغرام في حجم 5 ميكرولتر). ولتنقية باستخدام الحمض guanidinium طريقة استخراج ثيوسيانات-الفينول كلوروفورم يوصى، المبينة أدناه.
    ملاحظة: الفينول هو مادة مسرطنة، السامة والمسببة للتآكل. يرجى قراءة ورقة بيانات سلامة المواد واستخدامها تحت غطاء الدخان مع الحماية المناسبة!
    1. تنمو أو علاج الخلايا البكتيرية (بكتريا المكورة العنقودية البرتقالية أو كولاي في هذا المثال) على النحو المرغوب فيه والحصاد قبل 10 دقيقة الطرد المركزي في 4600 × ز و 4 درجات مئوية. ملاحظة: عادة نحن حصاد OD إجمالي 600 من 20 - 70. الكريات خلية يمكن تخزينها لعدة أسابيع في -20 درجة مئوية.
    2. resuspend الكرية خلية في 1 مل من حمض guanidinium حل ثيوسيانات-الفينول كلوروفورم ونقل إلى2 مل المسمار كوب يحتوي على 0.5 مل من 0.1 ملم الخرز الزجاجي الزركونيوم / السيليكا.
    3. ليز الخلايا ثلاث مرات في الخافق الإعدادية سريع / حبة في 6.5 متر / ثانية لمدة 30 ثانية لثلاث جولات، تبريد العينات على الجليد لمدة 5 دقائق بعد كل شوط. ملاحظة: يمكن تخزين عينة متجانسة في -80 درجة مئوية لعدة أسابيع.
    4. احتضان المحللة لمدة 5 دقائق على RT ثم إضافة 200 ميكرولتر من الكلوروفورم.
    5. هزة بقوة أو دوامة العينة لمدة 30 ثانية لاستخراج الحمض النووي الريبي.
    6. في احتضان RT لمدة 3 دقائق ثم الطرد المركزي لمدة 15 دقيقة في 13،000 - 15،000 × ز و 4 درجات مئوية. ملاحظة: يتم فصل المذيبات العضوية إلى مرحلة أدنى (وردي، ويحتوي على البروتينات)، والطور البيني (أبيض، ويحتوي على الحمض النووي)، والمرحلة المائية العليا (واضحة، ويحتوي على RNA).
      ملاحظة: من هذه الخطوة على استخدام الكواشف فقط ريبونوكلياز حرة والأدوات البلاستيكية!
    7. إعداد جديدة خالية من ريبونوكلياز 1.5 مل أنابيب رد فعل، والتسمية بشكل مناسب وإضافة حوالي 500 ميكرولتر من 100٪ الأيزوبروبانول ريبونوكلياز مجانا كل (استخدم تقريبا نفس فوكما لوم المرحلة المائية في الأنبوب السابق).
    8. عقد أنبوب بزاوية ونقل المرحلة المائية (حوالي 500 ميكرولتر) إلى أنابيب أعدت باستخدام ريبونوكلياز نصائح مجانية. لا تخل البيني.
    9. ترسيب الحمض النووي الريبي التي كتبها قلب عدة مرات واحتضان لمدة 10 دقيقة في RT.
    10. الطرد المركزي عينات لمدة 15 دقيقة عند 13000 - 15000 × ز و 4 درجات مئوية وإزالة طاف بواسطة pipetting أو الطموح (مضخة المياه النفاثة وزجاجة الرضاعة). لا تخل الأبيض بيليه RNA شفافة في القاع.
    11. إضافة 1 مل من 70-80٪ من الإيثانول ريبونوكلياز الحرة (لا الدوامة) لغسل. ملاحظة: RNA في الإيثانول يمكن تخزينها لعدة أسابيع في -20 درجة مئوية.
    12. أجهزة الطرد المركزي لمدة 5 دقائق في 7500 × ز و 4 درجات مئوية، وتجاهل طاف بواسطة pipetting أو يفضل الطموح.
    13. الهواء الجاف بيليه RNA لمدة 15 - 30 دقيقة تحت غطاء الدخان. لا overdry، قد يكون خلاف ذلك من الصعب أن تنحل الكريات.
    14. resuspend الكرية في 50 ميكرولتر من ريبونوكلياز خالية DDH 2 O أو عازلة تخزين الحمض النووي الريبي.
    15. قياس تركيز الحمض النووي الريبي مع microvolume الأشعة فوق البنفسجية فيس معمل أو كوفيت الكوارتز (ومضواء التقليدي)، والشروع في الدناز أنا الهضم.
  2. أنا الدناز الهضم من الحمض النووي الريبي لإزالة آثار الحمض النووي
    ملاحظة: بما أن الحمض النووي قد يكون بمثابة القالب زائفة في رد فعل النسخ العكسي (تمديد التمهيدي)، ينبغي إزالته من العينة. وطرق مختلفة لإزالة الحمض النووي RNA من الحلول المتاحة والتي تعتمد عادة على الدناز الهضم. ويرد وهناك طريقة بسيطة لكنها فعالة وتكلفة فعالة لإزالة الحمض النووي أدناه.
    1. حمام ماء سخن إلى 37 درجة مئوية.
    2. مزيج من المركبات المدرجة في الجدول 1 في أنبوب 1.5 مل التفاعل.
    3. احتضان الخليط لمدة 1 ساعة عند 37 درجة مئوية في حمام مائي، ثم الانتقال مباشرة إلى استخراج الفينول / الكلوروفورم. ملاحظة: لا ينصح تعطيل حرارة الدناز الأول، لأن ذلك قد تحط من الحمض النووي الريبي.
    </ لى>
  3. استخراج الفينول / الكلوروفورم من الحمض النووي الريبي بعد الدناز أنا الهضم
    ملاحظة: يجب تنقية RNA لإزالة النيوكليوتيدات الحرة، شظايا الحمض النووي ومكونات عازلة من الدناز أنا الهضم. استخراج الفينول / الكلوروفورم يسمح لاسترداد عالية وتركيز عينة الحمض النووي الريبي، وبالتالي هو مبين أدناه. ويمكن أيضا أن تستخدم أساليب أخرى لتنقية RNA، إذا كانت تلبية هذه المتطلبات.
    1. تقسيم الدناز 500 ميكرولتر أنا الهضم المزيج إلى قسمين 250 عينات ميكرولتر في 2 مل أنابيب رد فعل.
    2. إضافة 1 الحجم (250 ميكرولتر) من الحمضية P / C / I الحل (في المياه المشبعة الفينول، والكلوروفورم وisopentanol، نسبة 25: 24: 1، ودرجة الحموضة 4،5-5).
      ملاحظة: P / C / I الحل هو مادة مسرطنة، السامة والمسببة للتآكل. يرجى قراءة ورقة بيانات سلامة المواد واستخدامها تحت غطاء الدخان مع الحماية المناسبة!
    3. بقوة دوامة أو مكان في منصة vortexing لل1 - 3 دقيقة.
    4. أجهزة الطرد المركزي لمدة 30 دقيقة عند 13000 - 15000 × ز و 4 درجات مئوية.
    5. جمع (مائي) المرحلة العليا ونقل إلى أنبوب جديد (250 ميكرولتر).
    6. إضافة 1/9 حجم (28 ميكرولتر) من 3 M خلات الصوديوم الهيدروجيني 5.2.
    7. إضافة 2.5-3 مجلدات من الإيثانول النقي (700 ميكرولتر).
    8. مزيج من قبل vortexing فترة وجيزة ومكان في -80 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة أو في -20 درجة مئوية لمدة 2 - 3 في الساعة. إذا لزم الأمر، وتخزين الحمض النووي الريبي O / N في -20 درجة مئوية.
    9. الطرد المركزي لمدة 30 - 60 دقيقة عند 13000 - 15000 × ز و 4 درجات مئوية.
    10. إزالة طاف بواسطة pipetting أو الطموح.
    11. غسل بيليه بإضافة 1 مل من الايثانول 70٪ على بيليه. لا عينة دوامة.
    12. عينة الطرد المركزي لمدة 5 دقائق عند 13000 - 15000 × ز و 4 درجات مئوية.
    13. إزالة طاف بواسطة pipetting أو الطموح.
    14. بيليه الهواء الجاف تحت غطاء الدخان. تخزين بيليه في -20 درجة CO / N إذا لزم الأمر.
    15. حل بيليه في 30 ميكرولتر DEPC المعاملة H 2 O من قبل vortexing لمدة 2 دقيقة واستخدام هذا الحل على حل بيllet من الأنبوب الثاني المناظرة في العينة (30 ميكرولتر الحل لكل زوج استخراج واحد).
    16. قياس تركيز الحمض النووي الريبي، والتأكد من أنه يتجاوز 1 ميكروغرام / ميكرولتر لاستخدامها في تمديد التمهيدي للمن mRNAs أعرب المعدل.
    17. إذا لزم الأمر، وتخزين الحمض النووي الريبي في -20 درجة مئوية لعدة أسابيع إلى عدة أشهر.

2. تمديد التمهيدي رد الفعل

  1. التصميم التمهيدي
    ملاحظة: عند تصميم الاشعال لتجربة التمديد التمهيدي، طاعة المبادئ التوجيهية العامة للPCR التصميم التمهيدي (انظر دليل يرافق الجل المنظم الآلي لمزيد من المعلومات والنقاش القسم في هذه الورقة).
    1. على وجه التحديد، ضمان الاشعال (ط) لا تحتوي على سلاسل من القواعد، (ب) امتلاك G أو C في نهاية 3 '، (الثالث) لديهم متوازن GC: AT النسبة، (د) لديهم درجة الحرارة الصلب من حوالي 55-60 درجة مئوية و (ت) مأزق لا يقل عن 50 شركة بريتيش بتروليوم، أفضل 100 شركة بريتيش بتروليوم المصب في المنطقة ذات الاهتمام لتلقي صور واضحة.
  2. رد فعل تمديد التمهيدي
    ملاحظة: إن رد فعل تمديد التمهيدي ([كدنا] التوليف) تتطلب كميات عالية من قالب الحمض النووي الريبي. إذا تم اختيار كميات من الحمض النووي الريبي المستخدمة إلى الأقل، قد يكون إشارة منخفضة للغاية للكشف! لذا نوصي تنقية الحمض النووي الريبي على النحو المبين أعلاه.
    ملاحظة: تحذير: استخدام الكواشف ريبونوكلياز حرة والبلاستيك وير !!!
    1. سخن الحرارية cycler إلى درجة حرارة 95 درجة مئوية وتنفيذ جميع الخطوات حضانة أخرى في cycler الحرارية لسهولة الاستخدام والتكاثر.
    2. مزيج من المركبات من الجدول 2 في أنبوب PCR لكل عينة الحمض النووي الريبي.
    3. تفسد العينات لمدة 1 دقيقة في 95 درجة مئوية.
    4. وضع أنابيب على الجليد والبرد لمدة 5 دقائق لهجن الرنا والاشعال.
    5. تعيين جهاز PCR إلى 47 درجة مئوية.
    6. في هذه الأثناء تحضير مزيج الرئيسي النسخ العكسي كما هو موضح في الجدول رقم 3.
    7. إضافة 4 ميكرولتر من النسخ العكسي مزيج الرئيسي لكل RNA تهجينعينة.
    8. احتضان الأنابيب لمدة 1 ساعة عند 47 درجة مئوية. ملاحظة: درجة الحرارة المثلى لAMV RT هي 42 درجة مئوية، ودرجات الحرارة المرتفعة ولكن تساعد على التغلب على الهياكل الثانوية من جزيئات الحمض النووي الريبي.
    9. وقف رد فعل عن طريق تسخين العينات إلى 95 درجة مئوية لمدة 2 دقيقة.
      ملاحظة: الفورماميد غير قابلة للتآكل، سمية، ويمكن أن يكون ضارا لطفل لم يولد بعد. يرجى قراءة ورقة بيانات سلامة المواد، والتعامل مع الرعاية والحماية المناسبة ارتداء!
    10. إضافة 6 ميكرولتر من الفورماميد صبغة تحميل (95٪ (V / V) الفورماميد منزوع الأيونات، 10 ملي EDTA، 0.05٪ (ث / ت) برموفينول الأزرق) ومخزن للO / N لمدة أسبوعين في -20 درجة مئوية في الظلام.

3. إعداد سلم التسلسل

ملاحظة: يتطلب رد فعل التسلسل سلم إما كميات معتدلة من البلازميدات أو كميات عالية من الحمض النووي الجيني. كلما أمكن ذلك، فمن المستحسن استخدام البلازميدات في تسلسل رد الفعل نظرا لسهولة العزلة وسيج عاليةنال شدة. في حالات أخرى، ونحن عادة استخدام أسلوب المعتمد من Marmur 5،14 لإعداد الحمض النووي الجيني من E. كولاي و S. الخلايا العنقودية الذهبية دون الحاجة لاستخدام الفينول. من حيث المبدأ أي طريقة يمكن أن ينتج كميات عالية ونقاء من الحمض النووي الجيني يمكن استخدامها.

  1. عزل الحمض النووي الجيني
    1. تنمو 10 مل من E. كولاي أو S. الخلايا العنقودية الذهبية O / N في LB، BM 5 أو TSB المتوسطة.
    2. حصاد الخلايا بواسطة الطرد المركزي لمدة 10 دقيقة في 4600 × ز في أنبوب الصقر 15 مل.
    3. بيليه معلق في 2 مل عازلة P1 كما وجدت في بعض مجموعات إعداد صغيرة (50 ملي تريس، حمض الهيدروكلوريك درجة الحموضة 8.0، 10 ملي EDTA، 100 ميكروغرام / مل ريبونوكلياز A).
    4. خلايا ليز ل45 - 60 دقيقة مع 20 - 40 ليزوستافين ميكرولتر (0.5 ملغ / مل، والتخزين عند درجة حرارة -20 درجة مئوية). ملاحظة: لE. خلايا القولونية والأنزيمية ما قبل المعالجة يمكن أن تكون إما حذف أو يستخدم الليزوزيم.
    5. إضافة 100 ميكرولتر من محلول مشبع SDS-(في الايثانول 45٪) إلى تعليق وincubatه لمدة 5 دقائق عند 37 درجة مئوية.
    6. إضافة 650 ميكرولتر 5 M NaClO 4 والخلايا لفترة وجيزة الدوامة.
      ملاحظة: الكلوروفورم هو مادة مسرطنة محتملة. يرجى قراءة ورقة بيانات سلامة المواد واستخدامها تحت غطاء الدخان مع الحماية المناسبة !!!
    7. إضافة 3 مل من الكلوروفورم / isopentanol (24: 1 نسبة) إلى الخليط ويهز لمدة 60 ثانية على الأقل. ملاحظة: يجب أن يتحول السائل إلى مستحلب أبيض متجانس.
    8. عينة الطرد المركزي لمدة 10 دقيقة في 4600 × ز وRT لفصل مراحل.
    9. نقل بعناية العليا (مائي) مرحلة واضحة لأنبوب جديد. إذا الحل هو عكر، كرر استخراج الكلوروفورم / isopentanol. قياس حجم محلول الحمض النووي وإعداد أنبوب جديد مع 2 مجلدات من الإيثانول (100٪).
    10. صب ببطء أو ماصة الحل الحمض النووي في أنبوب يحتوي على الايثانول. ملاحظة: الحمض النووي يجب أن يعجل شفافة كما، لفائف كثيفة على الجزء السفلي أو عندما المجففة تماما كمجموعة البيضاء العائمة.
    11. استرداد DNA استخدام السنانير المصنوعة من الزجاج الماصات باستور (الشكل 2) وتغسل كل عينة مرتين من قبل غمس في أنبوب الفردية من 1 مل من الايثانول 70٪.
    12. وضع السنانير تستقيم في رف والهواء الجاف بيليه لمدة 60 دقيقة. إذا لزم الأمر، وتخزين الحمض النووي المجففة لعدة أيام في RT.
    13. حل الحمض النووي عن طريق كسر قبالة DNA مغطاة السنانير الزجاج ووضع في أنبوب 2.0 مل رد فعل تحتوي على 100-500 ميكرولتر DDH 2 O. ضبط مستوى الصوت إلى تركيز الحمض النووي الأخير من 1000 - 1500 نانوغرام / ميكرولتر. رد فعل لتسلسل واحد، استخدم 10 - 18 ميكروغرام من الحمض النووي الجيني.

الرقم 2
الرقم 2. التعليمات حول كيفية إنشاء قصبة الصيد DNA. امسك طرف ماصة باستير الزجاج في لهب الموقد بنسن. هذا يتسبب في الزجاج لبدء ذوبان بعد عدة ثوان، وخلق ربط صغير في رانه ينتهي. إزالة بسرعة من اللهب والسماح لتبرد لمدة 1 دقيقة.

  1. عزل البلازميدات
    1. إعداد البلازميدات باستخدام أدوات إعداد مصغرة القياسية وتذوب في شطف العازلة (10 ملي تريس، الكلور، ودرجة الحموضة 8.5). اعتمادا على حجم البلازميد، استخدم 100-500 نانوغرام البلازميد واحد سلم التسلسل.
  2. رد فعل سانجر تسلسل
    ملاحظة: البحث أدناه بروتوكول بسيط يستخدم عدة التسلسل التمهيدي fluorescently المسمى مع 7-deaza-dGTP التي تعمل بشكل جيد لغرض تمديد التمهيدي. الرجوع إلى دليل عدة التسلسل للحصول على معلومات مفصلة. يرجى ملاحظة أن رد الفعل التسلسل يجب استخدام نفس التمهيدي كرد فعل تمديد التمهيدي لخلق منتجات من نفس الطول.
    1. مزيج 12 ميكرولتر من الحمض النووي الجيني (~ 15 - 10 ميكروغرام) مع 1 ميكرولتر DMSO و 1 ميكرولتر التمهيدي fluorescently المسمى (2 بمول / ميكرولتر).
    2. لكل 1 ميكرولتر من أربعة يمزج رد فعل التسلسل (A، C، G أو T)، إضافة 3 ميكرولتر من الحمض النووي / DMSO / مزيج التمهيدي. وضع العينات في جهاز PCR، وتشغيل البرنامج PCR التالية: 95 درجة مئوية لمدة 2 دقيقة. 35 دورات من 95 درجة مئوية لمدة 20 ثانية، 54 درجة مئوية لمدة 20 ثانية، 70 درجة مئوية لمدة 30 ثانية؛ الحفاظ على 4 درجات مئوية إلى الأبد.
    3. بعد تشغيل، وإزالة عينات من الجهاز، إضافة 6 ميكرولتر من صبغة تحميل وتخزين على الجليد (قصيرة الأجل) أو في -20 درجة مئوية لعدة أيام إلى أسابيع.

4. إعداد جل وجهاز تشغيل

ملاحظة: معلومات تفصيلية عن كيفية تجميعها جهاز هلام التسلسل، ويتم إعداد جل وكيف يتم تشغيل هلام يمكن العثور عليها في بروتوكول الشركة المصنعة.

  1. التحضيرات
    1. إعداد 10X TBE كما هو مبين في الجدول رقم 4.
    2. يوم المدى هلام تحضير 1 لتر من العازلة 1X TBE مع عالى النقاء ده 2 O.
    3. إعداد 10٪ (ث / ت) وكالة الأنباء الجزائرية. ملاحظة: يمكن تخزينها في 200 مكل في -20 درجة مئوية لعدة أشهر، ولكن النشاط قد ينخفض ​​مع مرور الوقت <./ لى>
  2. التجمع من هلام غرفة الصب
    1. تجنب الغبار والوبر بين ألواح الزجاج. أسطح العمل وبالتالي نظيفة تماما باستخدام مناديل مبللة.
    2. تنظيف زوج من ألواح الزجاج 25 سم باستخدام مناشف ورقية يمكن التخلص منها والماء المقطر على كلا الجانبين ثم الأيزوبروبانول للجانب الداخلي من ألواح الزجاج.
    3. وضع الفواصل 0.25 ملم على لوحة الزجاج الخلفي وأسفل لوحة زجاج حقق على رأس (الشكل 3).
    4. نعلق على القضبان هلام لكلا الجانبين من لوحات الزجاج مع نهاية حقق والطيارين دخول السكك الحديدية التي تواجه صعودا وتشديد المقابض طفيفة.

الرقم 3
الشكل 3. عرض من هلام لوحات الزجاج الكهربائي انفجرت. وحات الزجاج ينبغي استخدام إتجاهي. رعاية لمواجهة الجانب الداخلي من ألواح الزجاج إلى الداخل والخارجيجنبا إلى الخارج.

الرقم 4
الرقم 4. عرض من جهاز هلام تجميعها. وبعد حقن محلول هلام، يتم وضع فاصل جيب في الحل بين ألواح الزجاج. ثم انزلق لوحة صب بين لوحة من الزجاج الأمامي والقضبان جل وتأمين طريق الربط المقابض السكك الحديدية.

  1. صب جل
    ملاحظة: مادة الأكريلاميد غير بلمرة هو أعصاب! يرجى قراءة ورقة بيانات سلامة المواد واستخدامها مع الحماية المناسبة !!!
    1. إضافة المركبات المدرجة في الجدول رقم 5 في كوب وتخلط باستخدام بقضيب ومحرك مغناطيسي.
    2. فورا بعد إضافة وكالة الأنباء الجزائرية وTEMED، تولي جل الحل في حقنة 50 مل ووضع مرشح 0.45 نانومتر على طرف.
    3. إما الاستمرار على الحافة العلوية للوحة من الزجاج مع يد واحدة أو وضع الشطائرح في صب جل الوقوف إلى إنشاء منحدر الزاوية 10-20 درجة.
    4. الاستغناء ببطء الحل هلام بين ألواح الزجاج بينما تتحرك باستمرار غيض حقنة من جانب واحد على الآخر، ووقف مرة واحدة الحل هلام يلبي نهاية الجزء السفلي.
    5. الانتقال إلى الجانب أو إزالة أي فقاعات تشكلت باستخدام هوك فقاعة.
    6. هل حرك جل جيب (0.25 مم) بين ألواح الزجاج في نهاية حقق، غمر في محلول هلام وإصلاح عن طريق ربط لوحة الصب.
    7. مسامير ربط السكك الحديدية العلوي بخفة (انظر الشكل رقم (4) لجهاز تجميعها بشكل كامل).
    8. السماح لمجموعة هلام 1 - 2 ساعة.
    9. إزالة لوحة الصب وجيب فاصل وتنظيف جيب من الملح وهلام المخلفات.
    10. شطف مع DDH 2 O ويمسح عن حل الزائد مع أوراق الأنسجة.
  2. تشغيل وتصور هلام
    ملاحظة: يتم إخضاع المواد الهلامية التسلسل مباشرة الكهربائي في تصوير هلام، في حينتم الكشف عن مضان في وقت واحد بواسطة المجهر الليزر. وعلى النقيض من هلام الكهربائي التقليدي، حيث يتم تشغيل جل أولا ثم الملون وتصور، يتم إصلاح وحدة الكشف وبفحص العصابات في الوقت الحقيقي لأنها تمر الليزر. دون إجراء لبرنامج جمع البيانات ImagIR على OS / 2 ويرد، والتي يمكن اعتمادها لمزيد من الإصدارات الأخيرة. لمزيد من المعلومات راجع دليل المستخدم.
    1. حرك حامل دبابة عازلة داخل القضبان الجل على لوحات الزجاج الأمامية وتشديد المقابض.
    2. وضع الجل في الخزان السفلي من هلام هلام تصوير الآلي على لوحة التدفئة وإصلاح طريق تحريك دخول الطيار السكك الحديدية في الأقواس الجهاز.
    3. ملء 1X عازلة TBE في غرف عازلة هلام الدنيا والعليا، إغلاق غرفة عازلة الدنيا وربط غرفة عازلة العليا للسلطة باستخدام سلك الطاقة.
    4. إذا كان موجودا، وتنظيف جيب هلام من الملح بقايا من قبل pipetting مرارا عازلة في الجيب.
    5. إغلاق أعلى خزان غرفة عازلة باستخدام غطاء رأس العازلة.
    6. إغلاق باب الجهاز والتبديل على تصوير وجهاز الكمبيوتر والبدء في برنامج جمع قاعدة بيانات ImagIR.
    7. إنشاء ملف مشروع جديد (ملف> جديد ...)، أدخل اسم ملف المشروع، وتحديد نطاقات الليزر المناسبة (700 أو 800 نانومتر) وثبت لOK.
    8. حدد خيارات> السيارات مكاسب ... من القائمة الصورة في الأعلى، انقر فوق تلقائي لبدء صناعة السيارات مكاسب قياس واستعرض الإعدادات بالنقر فوق موافق.
    9. تركيز الليزر عن طريق اختيار خيارات> التركيز ... من قائمة التحكم الماسح الضوئي، والنقر على زر السيارات وقبول الإعدادات بالنقر فوق موافق.
    10. كرر الإجراء لضبط السيارات مكاسب في المنطقة تركز حديثا.
    11. الإعداد لسيطرة الماسح الضوئي وفقا لهذه الإعدادات: 2000 V، 35 أمبير، 45 W، 45 ° C، مرشح المسح الضوئي: 3، سرعة المسح الضوئي: 3.
    12. Prerun الهلام الخالي لمدة 20 دقيقة (الجهد اختر تشغيل واضغط على <Enter> ).
    13. في هذه الأثناء، يسخن سلم التسلسل والمنتجات تمديد التمهيدي في جهاز PCR لمدة 2 دقيقة إلى 90 درجة مئوية، ثم تبرد على الجليد.
    14. وقف الكهربائي، فتح هلام المنظم الآلي وإزالة الجزء العلوي من غطاء خزان العازلة.
    15. إدراج سمك القرش الأسنان في مشط بين ألواح الزجاج واختراق قليلا من الجل مع أسنان سمك القرش (انظر الشكل 5).

الرقم 5
يتم تطبيق الشكل 5. عن قرب عرض من هلام مع أسنان سمك القرش مشط. عينة (البنفسجية) بين أسنان سمك القرش.

  1. ماصة إما 1 - 2 ميكرولتر من المنتجات تمديد التمهيدي أو ردود فعل التسلسل سلم في كل جيب هلام (التي شكلتها وأسنان سمك القرش).
  2. إذا كانت هناك حاجة ليس كل جيوب، وملء جيوب فارغة مع صبغة التحميل لمنع والسلوك تشغيل ثابت.
  3. إغلاق خزان العازلة وباب المنظم هلام.
  4. بدء الكهربائي وتشغيل الليزر (اختر الجهد على والليزر على والصحافة <ENTER>).
  5. وقف الكهربائي مرة واحدة المنطقة ذات الاهتمام اجتاز الليزر.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

كما هو مبين في الشكل (6)، يمكن استخدام رد فعل تمديد التمهيدي لتحديد نقاط الانطلاق النسخي من النصوص ذات الأهمية ويمكن أن يساعد على استخلاص مناطق المروج (التي تم تحديدها عادة من قبل -10 و -35 العناصر). يمثل العلوي (أطول) [كدنا] جزء من "نهاية 5 من مرنا وبالتالي يمكن تعيين بسهولة بالمقارنة مع سلم التسلسل.

الرقم 6
الرقم 6. نتيجة التمثيلية للتفاعل تمديد التمهيدي. على الجانب الأيسر كامل في الجسم الحي التمهيدي تمديد جل من E. ويرد القولونية مع مختلف البلازميدات. كل مجال من مجالات الاهتمام تتضخم. في الجزء العلوي (A)، وصفت تحديد ompA نقطة انطلاق النسخي. توقف النسخ العكسي في 5 "نهاية مرنا وبالتالي يخلق عصابة من طول RNA الكامل (دائرة الهجرة والجنسيةicated بسهم). عن طريق مواءمة الفرقة [كدنا] مع سلم التسلسل، 5 'نهاية مرنا يمكن تحديدها على النحو المبين في تسلسل المصاحب. في الجزء السفلي (B)، يظهر انشقاق من نص ompA من ريبونوكلياز YoeB-seq2. الممرات 1 - 3 عينات تمثل فيه السم YoeB-seq2 مفقود أو غير نشطة، في حين الممرات 5 - 4 عينات تمثل مع ريبونوكلياز نشط، وبالتزامن مع غياب وجود المنتجات [كدنا]. يتم إنشاء انشقاق اثنين من المنتجات الرئيسية على النحو المشار إليها بواسطة الأسهم. وصفت ddNTP المستخدمة في كل حارة وقاعدة RNA المقابلة لسلم التسلسل. يشار إلى أجزاء النص بواسطة الخط الأزرق، عناصر المروج وبداية أغسطس كودون بواسطة الخط البنفسجي. لمزيد من المعلومات؛ راجع المقالة البحثية الأصلية من Nolle وآخرون، علم الأحياء الدقيقة 159، 1575-1585 (2013). من فضلك اضغط هنا للعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

في المثال هو موضح في الشكل (6)، وملعقة شاي من ompA مرنا تقرر أن تكون قاعدة G (ملحوظ مع السهم في تسلسل أدناه هلام). وهذا يتفق مع TSP ompA نشرت قبل 15 عاما. عناصر -35 -10 والمروج يمكن استخلاصه أن تكون TTGTAA وTAGACT 16 مثل الزخارف تختلف فقط قاعدتين كل من متواليات إجماع كل منها (TTGACA وTATAAT على التوالي).

في المقابل إلى وسائل أخرى مثل 5 "RACE، ردود فعل تمديد التمهيدي يمكن استخدامها لتحديد بدقة وقياس الانقسام من جزيئات الحمض النووي الريبي. انشقاق من جزيئات الحمض النووي الريبي يخلق مجاني 5 'الغايات، والتي يمكن الكشف عنها في وقت واحد كما العصابات [كدنا] في هلام. تحديد العديد من المنتجات انشقاق أحد مرنا أكثر صعوبة في 5 "تجارب سباق، إذ لابد من التسلسل العديد من المنتجات PCR للحصول على منتجات الانقسامتمثل سوى جزء صغير من مجموع (غير المصنعة) RNA بكميات كبيرة.

في الجزء السفلي من الشكل (6)، ويصور رسم خرائط الحمض النووي الريبي للانشقاق من قبل ريبونوكلياز. كما هو موضح سابقا وريبونوكلياز YoeB-seq2، جزءا من نظام TA من S. الخيلي 17، يشق من mRNAs قريبة من كودون البداية. هذا الانقسام يمكن مستعمل من قبل المشابهة مضاد للسموم YefM-seq2. عندما ريبونوكلياز YoeB غير موجود أو غير نشطة (حارات 1 - 3)، وتشكل توجد منتجات تمديد التمهيدي بالقرب من رامزة البداية. كلما النشاط ريبونوكلياز هو الحالية (الممرات 4 و 5)، شريطين قوية المصب فترة وجيزة من بدء ظهور كودون. باستخدام هذا النهج، وأنماط الشق يمكن التعرف عليها بسهولة.

ويبين الشكل 7 تجربة تمديد التمهيدي الفاشلة. بسبب RNA الزائدة في رد فعل النسخ العكسي، ومقدار ولدت من [كدنا] يخلق مثل هذه إشارة قوية، بأن الفرقة [كدنا الفرديةS لا يمكن تمييزها. هذا يجعل 5 "RNA تقرير نهاية مستحيلا.

عند استخدام الرنا أعرب غاية في رد فعل تمديد التمهيدي، مثل الحمض النووي الريبي الريباسي (كما هو مبين في الشكل 7)، من خطر الإفراط في زيادة المناطق المكشوفة. لذا، لا بد من ضبط كمية من الحمض النووي الريبي مجموع القالب إلى وفرة من الحمض النووي الريبي من الفائدة. في المقابل، عندما تشكل النصوص ذات الاهتمام كمية صغيرة من الحمض النووي الريبي مجموع فقط، يجب زيادة كمية في رد فعل النسخ العكسي، وإلا فإن الإشارات سوف يكون خافت جدا (لا يظهر). هذا ينطبق أيضا على رد الفعل التسلسل سانجر، كقوالب multicopy في الخلية (مثل جينات الرنا الريباسي أو الجينات المشفرة على البلازميدات) يؤدي إلى إشارات أقوى بكثير.

الرقم 7
الرقم 7. نتيجة التمثيلية للتمديد التمهيدي من فشل نانوغرام> S. الذهبية. 16S RNA وفيرة للغاية في الخلايا البكتيرية. وهذا يؤدي إلى إشارات قوية النسخ العكسي عندما تستخدم كميات معتدلة من الحمض النووي الريبي مجموع. في حالة وصفت هنا، والعصابات [كدنا] قوية تحجب "نهاية وبالتالي تمنع 5" الدقيقة 5 ورسم الخرائط. بالإضافة إلى ذلك، الرنا الريباسي هي منظمة للغاية، وبالتالي يمكن إنهاء النسخ العكسي قبل الأوان، وانتاج المنتجات [كدنا القصيرة التي لا تمثل شظايا طول كامل. في هذه الحالة زيادة في درجة الحرارة النسخ العكسي، جنبا إلى جنب مع الناسخ العكسي مقاومة للحرارة يمكن أن تجعل من السهل لتجميع الهياكل الثانوية الماضية. بسبب نسخ متعددة من تسلسل الحمض النووي في الجينوم، والتسلسل سلم سانجر أقوى من الجينات لنسخة واحدة. لتحسين صورة هلام، RNA و DNA يرقى لالنسخ العكسي وينبغي خفض رد فعل سانجر و / أو أقل من المنتج تطبيقها على هلام._upload / 52134 / 52134fig7large.jpg "الهدف =" _ فارغا "> اضغط هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.

الجدول 1: أنا الدناز هضم الحمض النووي الريبي.

مادة كمية
الحمض النووي الريبي من الخطوة أعلاه 70-100 ميكروغرام
10X الدناز أنا العازلة (100 ملي تريس، ودرجة الحموضة 7.5 و 25 ملي MgCl 5 ملي CaCl 2) 50 ميكرولتر
أنا الدناز، ريبونوكلياز الحرة (2 U / ميكرولتر) 10.0 ميكرولتر (تصل إلى 10 ميكروغرام من الحمض النووي الريبي لكل 1 ميكرولتر من الدناز I)
تحقيق حجم يصل إلى 500 ميكرولتر مع DDH 2 O (DEPC المعالجة)

حجم رد الفعل وكمية من الدناز أنا يمكن تحجيمها صعودا أو هبوطا اعتمادا على كمية ساستخدام و RNA.

الجدول 2: RNA-التمهيدي التهجين.

مركب المبلغ رد فعل واحد
RNA 5-15 ميكروغرام
التمهيدي fluorescently المسمى 2 بمول
تحقيق حجم 6 ميكرولتر مع DDH 2 O (DEPC المعالجة)

إنشاء رد فعل واحد لكل عينة الحمض النووي الريبي والتمهيدي.

الجدول 3: تمديد التمهيدي مزيج الرئيسي.

مركب المبلغ رد فعل واحد
[ده 2 O (DEPC المعالجة) 1.3 ميكرولتر
AMV RT العازلة (10X) 1.0ميكرولتر
dNTPs (10 ملي، ريبونوكلياز مجانا) 1.0 ميكرولتر
ريبونوكلياز المانع 0.2 ميكرولتر
AMV عكس الناسخ (RT) (20-25 U / ميكرولتر) 0.5 ميكرولتر

زيادة لعدد من التفاعلات المطلوبة.

الجدول 4: 10X TBE صفة.

مادة كمية
تريس قاعدة 107.8 ز
حمض البوريك 55.0 ز
EDTA 7.4 ز
جعل حجم ما يصل الى 1000 مل مع DDH 2 O عالى النقاء وفلتر لإزالة الغبار والوبر

تصفية لإزالة الغبار والوبر وتخزينها في 4 درجاتC.

الجدول 5: تسلسل جل وصفة.

مركب كمية
اليوريا 10.5 ز
[ده 2 O (MilliQ) 13.0 مل
10X TBE 2.5 مل
XL الحل السريع هلام 5.0 مل
TEMED (N، N، N '، N' Tetramethylethane-1،2-ديامين) 25 ميكرولتر
وكالة الأنباء الجزائرية (فوق كبريتات الأمونيوم، 10٪) 175 ميكرولتر

حل هلام عملية بسرعة بعد إضافة TEMED وكالة الأنباء الجزائرية.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

تمديد التمهيدي الفلورسنت هو طريقة بسيطة وسريعة لتحديد الغايات 5 'من الرنا، إما لTSP- أو تحديد معالجة RNA الثانوي. بسبب استخدام بادئات الفلورسنت، ويمكن ضبط ردود الفعل صعودا وتشغيل دون احتياطات أمنية إضافية (على عكس في حالة الاشعال المسمى بالإشعاع). كما تم الكشف عن عينات من قبل مضان، ويمكن تصويرها بينما الكهربائي في التقدم الذي يسمح تحليل سريع بالمقارنة مع الطرق الإشعاعية حيث يشيع استخدام أفلام الأشعة السينية.

بشكل عام، ونوعية رد الفعل تمديد التمهيدي تعتمد بشدة على الصف وقدرات ربط التمهيدي. إذا تم اختيار موقع ملزم قريبة جدا إلى المنطقة من الفائدة، قد مسحات التمهيدي تحجب إشارة، في حين أن موقع ملزم بعيدا جدا (> 300 بي بي) من "نهاية 5 قد يؤدي في إشارة الفقيرة.

يجب ربط صبغة الفلورسنت تساهميا ليجب تنقيته 5 "نهاية قليل النوكليوتيد الحمض النووي مخصص خلال التوليف وقليل النوكليوتيد من قبل HPLC لمنع التدخل في رد فعل النسخ العكسي بواسطة الأملاح المتبقية. [أليغنوكليوتيد مع تعديل الصبغة المناسب (انظر قائمة الكواشف الجدول لمزيد من المعلومات حول الأصباغ متوافقة) ويمكن طلب من معظم الشركات التوليف قليل النوكليوتيد ويجب أن يتم تخزينها في الظلام. للأسف، نحن لا علم له بأي التقنيات الأنزيمية إرفاق الصبغة ل[أليغنوكليوتيد الموجودة سابقا، كما هو ممكن مع النيوكليوتيدات radiolabelled.

في نظام التسلسل الموصوفة هنا، وهما الأصباغ الفلورية مختلفة يمكن أن تستخدم لكشف عينتين في وقت واحد، والإثارة الخاصة بهم (حوالي 700 و 800 نانومتر) وأطياف الانبعاث واضح. وبصرف النظر عن الأصباغ المصنعة الأصلية، والأصباغ الأخرى مثل مبين في قائمة الكواشف يمكن استخدامها للحصول على نتائج ممتازة.

وثمة عامل آخر مهم للعلاقات العامةردود الفعل تمديد IMER هي نوعية وكمية RNA. يجب الحرص على إزالة الملوثات الحمض النووي، كما transcriptases العكسي مثل AMV RT يمكن استخدام DNA كقالب 18.

كما هو مبين في الشكل 7، وقوة إشارة الكشف عن العصابات في المدى هلام تعتمد على كمية RNA التي استخدمت في رد فعل النسخ العكسي. ولذلك فمن الضروري ضبط كمية من الحمض النووي الريبي مجموع، وهذا يتوقف على كمية من الحمض النووي الريبي النسبي لمصلحة الحاضر في العينة. انخفاض الحساسية لهذه الطريقة هي أيضا واحدة من سلبياته، كما أعرب الرنا المنخفضة يمكن أن يكون من الصعب الكشف عنها. إذا كان يمكن الكشف عن أي إشارات على الإطلاق، وكمية الحمض النووي الريبي مجموع يمكن زيادة أو الحمض النووي الريبي من الفائدة يمكن overexpressed مصطنع من البلازميد.

هلام حساسية الكشف عن مضان مقرها تمديد التمهيدي حوالي عشر عاملا أقل من 32 أو 33 P P النظائر المشعة استنادا تمديد التمهيدي 19. ولكن هذا العيب يمكن تعويضه عن طريق ضبط كمية [كدنا تحميلها على هلام أو عن طريق زيادة كمية RNA القالب المستخدم في رد فعل النسخ العكسي. في معظم الحالات، حساسية عالية بما فيه الكفاية لمرض النتائج 4،5. وقد تم الإبلاغ عن حساسيات مماثلة لملحقات التمهيدي المشعة عند استخدام بادئات الفلورسنت بالاشتراك مع المنظم الشعرية مع الاستفادة من الأوقات التعرض قصيرة.

تكاليف مقارنات بين التألق والنشاط الإشعاعي يستند إلى ملحقات التمهيدي صعبة، لأنها تعتمد على عدة عوامل مثل آلات المتاحة، الاشعال، وردود الفعل سلم، وتوافر وصيانة مختبر للعمل مع المواد المشعة والتخلص من النفايات المشعة والتدريب والمخاطر الصحية الفردية . الاشعال الفلورسنت حوالي خمس إلى عشر مرات أكثر تكلفة من الاشعال القياسية غير المسمى (بي بي 20). ولكن هذه الاشعال يمكن أن تستخدم على الأقلمن سنة (على الأرجح عدة سنوات) مقارنة ب 32 ف الاشعال المسمى، التي لديها أقصر بكثير نصف الحياة. إعادة وضع العلامات من الاشعال هو مضيعة للوقت ومكلفة، نظرا إلى الحاجة إلى مواد مشعة جديدة في فترات متقاربة. إذا تم استخدام نفس مجموعة الاشعال على مدار فترة زمنية طويلة، الاشعال الفلورسنت هي أرخص من، الاشعال العادية المسمى بالإشعاع. ومع ذلك فإن النقطة الرئيسية ستكون تكلفة المنظم الفلورسنت أو تصوير وشراء هذا الجهاز فقط لغرض ملحقات التمهيدي قد لا تكون فعالة من حيث التكلفة. الطريقة الموصوفة هنا هو ليس للاهتمام للمجموعات التي هي في حيازة أو الحصول على مثل هذا الجهاز.

إذا كان جل المنظم الآلي غير متوفرة، وغيرها من الطرق للكشف عن مضان يمكن أن تستخدم أيضا. في هذه الحالة، يمكن تشغيل الجل في الجهاز الكهربائي القياسية، والمجففة إذا لزم الأمر ومن ثم نقلها إلى جهاز تصوير فلوري (هي النماذج المتاحة التي تشبه إلى فلوريداالماسحات الضوئية atbed). على الرغم من أن الاستفادة من تصور هلام خلال الفترة السابقة وخسر، واستخدام النظائر المشعة يمكن تجنبها بهذه الطريقة، ميزة هامة لالمجرب. بالإضافة إلى ذلك، إذا كان متوفرا، المنظم الشعرية يمكن استخدامها لفصل وكشف في الوقت الحقيقي، والتي يمكن أن تساعد على زيادة حساسية.

وقد نشرت وسائل مختلفة حول كيفية استخدام تمديد التمهيدي الفلورسنت مع آلات التسلسل هلام الآلي أو التعاقب الشعرية، ولكن هذه الطرق غالبا ما تتطلب [كدنا هطول خطوة للتركيز العينة (وإزالة الشوائب) 19. في الطريقة المعروضة هنا، وهطول الأمطار الحمض النووي ليست ضرورية وبالتالي تقليل الوقت اللازم لإعداد. الأهم من ذلك، حذف هذه الخطوة يجعل من الممكن تحديد شبه كميا كمية من جزيئات الحمض النووي الريبي في العينة كما التناقضات الإجراء هطول الأمطار يمكن القضاء عليها.

تجدر الإشارة، أنه على الرغم منينتهي 5 'من جزيئات الحمض النووي الريبي يمكن تعيينها في التفاعلات تمديد التمهيدي ومعالجتها والغايات الأساسية (نقطة الانطلاق النسخي) لا يمكن تمييزها بسهولة. للتحايل على هذه القيود، والتخطيط الدقيق للتجارب مع الضوابط المناسبة أمر ضروري. يمكن للمتواليات المروج واضحة تشير إلى وجود نقطة انطلاق النسخي وتحور أو حذف عناصر المروج ثم ينبغي إلغاء العصابات [كدنا]. من ناحية أخرى، إذا كانت هذه التسلسلات مفقودة أو تسلسل إجماع محددة موجودة، قد يكون السبب في النطاقات معالجة الحمض النووي الريبي. إذا كان من المعروف أن إنزيم تجهيز ويمكن تنقيته، ويمكن في المختبر ملحقات التمهيدي تجلب التوضيح، والنسخ، ويمكن فصل المعالجة. وبالإضافة إلى ذلك، يمكن للأساليب أخرى مثل 5 "RACE (بما في ذلك تخصيب الأنزيمية للجزيئات RNA غير المجهزة) تكمل ملحقات التمهيدي للتمييز بين المواقع بداية النسخي من معالجة RNA.

عشرالبريد طريقة تمديد التمهيدي غالبا ما تتم مقارنة لأساليب أخرى مثل 5 "RACE وS1 المقايسات حماية نوكلياز وبالتالي تم استجواب فائدته في بعض الأحيان. يمكن للتقنيات RNAseq في تركيبة مع الجيل القادم التسلسل على سبيل المثال تساعد على تحديد مواقع TSPs وتجهيز العديد من الرنا في موازاة ذلك، ولكن العبء المالي والعمل bioinformatical المطلوبة جعلها غير اقتصادي بدلا عن الرنا واحدة من الفائدة. 5'-RACE من ناحية أخرى أرخص والنتائج هي أسهل للتحليل، ولكن إذا تم معالجتها الرنا بطرق متعددة أو عدة نقاط انطلاق النسخي موجودة، يجب استنساخ المنتج وكمية كبيرة من المرشحين تحتاج إلى التسلسل ل الحصول على عرض تمثيلي من الرنا من الفائدة.

لذا، على الرغم من الأساليب الجديدة بعد أن نشأت على مر السنين، ملحقات حتى اليوم التمهيدي يكون الهدف من وجودها نظرا لسهولة الاستخدام ومنخفضة التكلفة والفترة الزمنية القصيرة، وهو صحيح خاصةللأسلوب مضان مقرها المقدمة هنا.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
AMV Reverse Transcriptase (20-25 U/µl) NEB / Roche NEB: M0277-T / Roche: 10109118001
DNase I (RNase free) Ambion (life technologies) AM2222
FastPrep-24 Instrument  MPBio 116004500
Fluorescently labeled primers Biomers n/a 5’ DY-681 modification of “ordinary” DNA oligonucleotides. Compatible dyes such as the LICOR IRDye 700/800 are also available from other suppliers such as IDTdna.
Li-Cor 4200 Sequencer incl. ImagIR Data collection software Li-Cor Product discontinued
NanoDrop 2000 Thermo Scientific
Nuclease free water Ambion (life technologies) AM9915G
Plasmid mini preparation kit QIAGEN 12125
RapidGel-XL-40% Concentrate USB US75863
RNA STORAGE BUFFER Ambion (life technologies) AM7000
Roti-Aqua-P/C/I Carl Roth X985.3 Alternative: “Acid-Phenol:Chloroform, pH 4.5 (with IAA, 125:24:1)” from Ambion (AM9720)
SUPERase•In RNase Inhibitor Ambion (life technologies) AM2696
Thermo Sequenase fluorescently labelled primer cycle sequencing kit with 7-deaza-dGTP GE Healthcare RPN2538
TRIzol reagent life technologies 15596-026
Zirconia/Silica Beads 0.1 mm BioSpec 11079101z

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Simpson, C. G., Brown, J. W. Primer extension assay. Methods Mol. Biol. 49, 249-256 (1995).
  2. Sanger, F., Nicklen, S., Coulson, A. R. DNA sequencing with chain-terminating inhibitors. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 74, 5463-5467 (1977).
  3. Fekete, R. A., Miller, M. J., Chattoraj, D. K. Fluorescently labeled oligonucleotide extension: a rapid and quantitative protocol for primer extension. Biotechniques. 35, 90-94 (2003).
  4. Schuster, C. F., et al. Characterization of a mazEF Toxin-Antitoxin Homologue from Staphylococcus equorum. J. Bacteriol. 195, 115-125 (2013).
  5. Nolle, N., Schuster, C. F., Bertram, R. Two paralogous yefM-yoeB loci from Staphylococcus equorum encode functional toxin-antitoxin systems. Microbiology. 159, 1575-1585 (2013).
  6. Yamaguchi, Y., Park, J. H., Inouye, M. Toxin-antitoxin systems in bacteria and archaea. Annu. Rev. Genet. 45, 61-79 (2011).
  7. Schuster, C. F., Bertram, R. Toxin-antitoxin systems are ubiquitous and versatile modulators of prokaryotic cell fate. FEMS Microbiol. Lett. 340, 73-85 (2013).
  8. Goeders, N., Van Melderen, L. Toxin-antitoxin systems as multilevel interaction systems. Toxins. 6, 304-324 (2014).
  9. Yamaguchi, Y., Inouye, M. mRNA interferases, sequence-specific endoribonucleases from the toxin-antitoxin systems. Progress in molecular biology and translational science. 85, 467-500 (2009).
  10. Park, J. H., Yamaguchi, Y., Inouye, M. Bacillus subtilis MazF-bs (EndoA) is a UACAU-specific mRNA interferase. FEBS Lett. 585, 2526-2532 (2011).
  11. Zhu, L., et al. et al.Staphylococcus aureus MazF specifically cleaves a pentad sequence, UACAU, which is unusually abundant in the mRNA for pathogenic adhesive factor SraP. J. Bacteriol. 191, 3248-3255 (2009).
  12. Zhu, L., et al. The mRNA interferases, MazF-mt3 and MazF-mt7 from Mycobacterium tuberculosis target unique pentad sequences in single-stranded RNA. Mol. Microbiol. 69, 559-569 (2008).
  13. Fu, Z., Donegan, N. P., Memmi, G., Cheung, A. L. Characterization of MazFSa, an endoribonuclease from Staphylococcus aureus. J. Bacteriol. 189, 8871-8879 (2007).
  14. Marmur, J. A procedure for the isolation of deoxyribonucleic acid from micro-organisms. J. Mol. Biol. 3, 208-218 (1961).
  15. Emory, S. A., Belasco, J. G. The ompA 5' untranslated RNA segment functions in Escherichia coli as a growth-rate-regulated mRNA stabilizer whose activity is unrelated to translational efficiency. J. Bacteriol. 172, 4472-4481 (1990).
  16. Cole, S. T., Bremer, E., Hindennach, I., Henning, U. Characterisation of the promoters for the ompA gene which encodes a major outer membrane protein of Escherichia coli. Mol. Gen. Genet. 188, 472-479 (1982).
  17. Schleifer, K. H., Kilpper-Bälz, R., Devriese, L. Staphylococcus arlettae sp. nov., S. equorum sp. nov. and S. kloosii sp. nov.: Three New Coagulase-Negative, Novobiocin-Resistant Species from Animals. Syst. Appl. Microbiol. 5, 501-509 Forthcoming.
  18. Yu, H., Goodman, M. F. Comparison of HIV-1 and avian myeloblastosis virus reverse transcriptase fidelity on RNA and DNA templates. J. Biol. Chem. 267, 10888-10896 (1992).
  19. Ying, B. W., Fourmy, D., Yoshizawa, S. Substitution of the use of radioactivity by fluorescence for biochemical studies of RNA. RNA. 13, 2042-2050 (2007).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics