טכניקת הארכת פריימר בהתבסס הקרינה לקביעת נקודות התחלת תעתיק ומחשוף אתרים של RNases
1Department of Microbial Genetics, Interfaculty Institute of Microbiology and Infection Medicine Tübingen (IMIT), Faculty of Science, University of Tübingen

Biology

Your institution must subscribe to JoVE's Biology section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Schuster, C. F., Bertram, R. Fluorescence Based Primer Extension Technique to Determine Transcriptional Starting Points and Cleavage Sites of RNases In Vivo. J. Vis. Exp. (92), e52134, doi:10.3791/52134 (2014).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

הארכת הקרינה מבוססת פריימר (FPE) היא שיטה מולקולרית כדי לקבוע נקודת התחלת שעתוק או אתרי עיבוד של מולקולות RNA. זו מושגת על ידי שעתוק לאחור של ה- RNA של עניין באמצעות פריימרים שכותרתו fluorescently ספציפיים וניתוח בדיעבד של שברי cDNA וכתוצאה מכך על ידי denaturing ג'ל אלקטרופורזה polyacrylamide. במקביל, תגובה סנגר רצף מסורתי מנוהלת על הג'ל למפות את הקצוות של שברי cDNA לבסיסים המקביל המדויקים שלהם. בניגוד ל5'-RACE (Rapid ההגברה של קצות cDNA), שבו המוצר חייב להיות משובט ומספר מועמדים רבים רצף, התפזורת של שברי cDNA נוצרו על ידי סיומת פריימר יכולה להתגלות בו זמנית בטווח ג'ל אחד. בנוסף, ההליך כולו (משעתוק לאחור לניתוח סופי של התוצאות) ניתן להשלים ביום עבודה אחד. על ידי שימוש בפריימרים שכותרתו fluorescently, השימוש באיזוטופ רדיואקטיבי מסוכן שכותרתו חומרים כימייםניתן להימנע וזמני עיבוד צומצמו ניתן לאתר מוצרים במהלך הליך אלקטרופורזה.

בפרוטוקול הבא, אנו מתארים שיטת סיומת פריימר ניאון in vivo באופן מהיר כדי לזהות קצוות '5 של RNAs להסיק תעתיק נקודות התחלה ואתרי עיבוד RNA (למשל, על ידי רכיבי מערכת רעלן-אַנְטִיטוֹקסִין) בס aureus, E. coli וחיידקים אחרים.

Introduction

סיומת פריימר 1 היא שיטה מולקולרית כדי לקבוע קצוות '5 של מולקולות RNA ספציפיות עד רזולוציה בסיסית אחד. היתרון לשיטות אחרות כגון 5'-RACE (הגברה מהירה של cDNA מסתיימת) הוא זמן אספקה ​​המהיר והיכולת לנתח תערובת של אורכים שונים של מולקולות RNA בקלות.

שיטה זו פועלת על ידי חשיפת מולקולות RNA להפוך תגובות שעתוק באמצעות פריימרים ספציפיים ניאון, יצירה שברי cDNA של אורכים מסוימים. מולקולות cDNA אלה לרוץ לצד תגובות סנגר רצף מסורתי 2 על ג'לים polyacrylamide denaturing ויכולות להיות מזוהות על ידי הקרינה שלהם בשל השימוש בפריימרים שכותרתו fluorescently. האורכים של ברי cDNA מוערכים על ידי השוואה לסולם הרצף, המאפשרים המיפוי של 5 קצות RNA ".

באופן מסורתי, תגובות סיומת פריימר משמשות בשילובעם איזוטופים רדיואקטיביים לזיהוי תרכובות cDNA על צילומי רנטגן. בשל סכנות בריאותיות, בעיות סילוק פסולת ולהקל על טיפול, פרוטוקולים חדשים יותר לנצל הקרינה לגילוי סיומת פריימר עם sequencers האוטומטי, אם כי הרגישות שלהם נמוכה במקצת. באמצעות פריימרים שכותרתו fluorescently, ניתן להשמיט את הליך רדיו תיוג החוזר, כצבעי יסוד ניאון הם יציבים במשך זמן רב (יותר משנה בידיים שלנו).

השיטה שאנו מתארים כאן מנצלת רצף ג'ל אוטומטי, אך עם שינויים קלים, sequencers נימים יכול לשמש גם להפרדת cDNA וגילוי 3. הטבע המקביל של ניתוח ג'ל מאפשר לזהות אפילו כמות קטנה של מחשוף RNA או עיבוד. יתרון נוסף הוא ברזולוציה הגבוהה של שיטה זו, כמחשוף או עיבוד של אף אחד בסיס מסוף ניתן לאתרם.

בהקשר לזיהוי של מחשוף RNA או עיבוד, typically שני סוגים שונים של הרחבות פריימר הם מכובדים. במקרה אחד, הטיפול אנזימטי נעשה במבחנה באמצעות RNA מטוהר ואנזים מטוהר, ואילו במקרה האחר, העיבוד נעשה in vivo ו- RNA וכתוצאה מכך הוא מטוהרים. בשני המקרים RNA הוא נתון לרחבת פריימר בוצעה במבחנה, עם זאת, בהתאם למקור של RNA, השיטה היא גם נקראת סיומת פריימר vivo במבחנה או ב. בפרוטוקול אנו מציגים כאן, אנו מתמקדים אך ורק על in vivo סיומת פריימר, בגלל קלות שימוש (אין חלבונים מטוהרים צורך) ואת האפשרות לקבוע נקודות התחלת תעתיק ועיבוד באותו הזמן. עם זאת, במבחנה הרחבות פריימר באופן עקרוני להגדיר באותה הצורה ופרוטוקול זה יכול לשמש כנקודת התחלה.

השיטה מאוירת כאן יכולה להיות מיושמת על מינים רבים של חיידקים, כל עוד הם ניתנים לגבוהיםהכנת טוהר ותשואה גבוהה של חומצות גרעין.

המחקר במעבדה שלנו מתמקד בהיקף הרגולציה של מערכות רעלן-נסיוב (ת א) 4,5, תחום שבו נעשתה שימוש נרחב בשיטת הרחבה פריימר. מדד ת"א מערכות אלמנטים גנטיים קטנים הנמצאים בגנומים פרוקריוטים שמורכבים מחלבון רעיל יציב ואופן אנדוגני פעיל וחיסון אנטי-חלבון או RNA בעיקר לא יציב שמנטרל רעילות 6,7. לפעמים פעילות רעלן מופעלת על ידי עיכוב של שכפול, סינתזת דופן תא או מנגנונים אחרים, אבל לרוב על ידי פעילות RNase 8,9. בדרך כלל, סגוליות RNase נקבע על ידי ביצוע בדיקות שונות, שאחד מהם היא שיטת סיומת פריימר. תגובות סיומת פריימר הם גם מתאימות ליישום זה, כתערובת של שברי אורך בקעו ומלאים ניתן לנתח בו זמנית כדי לקבוע את '5 מסתיים. באמצעות שילוב של במבחנה וברחבות פריימר vivo,מחשוף RNase רעלן ספציפי, לדוגמא, ניתן לקבוע סגוליות רצף 10-13.

איור 1
איור 1. סקירה כללית של הליך סיומת פריימר. תרבויות חיידקים מודגרת וטופלו בהתאם לצרכי הניסוי. RNA סה"כ מופק מהתאים, שטופל בDNase אני כדי להסיר עקבות DNA ונתונים לתגובת שעתוק לאחור באמצעות פריימרים יעד ספציפיים ניאון DNA מניב cDNA. DNA או פלסמידים הגנומי מופקים ולאחר מכן משמש לתגובות סנגר רצף ניאון להשוואת גודל עם שברי cDNA. מוצרי סיומת פריימר מנוהלים על צד מוצרים סנגר רצף על ג'ל polyacrylamide האוריאה denaturing וניתחו עם לייזר ומיקרוסקופ אוטומטיים. בסיס הרצף ששורות עם להקת cDNA הוא להרח בסיס של 5 סוף cDNA '(החץ הכחול). מידע נוסף ב Fekete, et al. 3 אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

ניתן למצוא סקירה של ההליך כולו סיומת פריימר באיור 1. בקצרה, תאי חיידקים בתרבית, שנקטפו, התא גלולה lysed וRNA חילוץ. RNA המטוהר לאחר מכן טופל בDNase אני כדי להסיר עקבות של מולקולות DNA אשר יכול לפעול כתבניות לטרנסקריפטאז ההפוך. פריימרים ניאון ספציפיים מתווספים ל- RNA, כלאה אל האזור של עניין, ולאחר מכן להפוך את תמלילי עדויות, וכתוצאה מכך דנ"א יחיד שנתקע משלים (cDNA). סולם רצף נוצר על ידי סנגר רצף מסורתי העסקת פריימרים ניאון ומופרד על ג'ל polyacrylamide denaturing צד של שברי cDNA סיומת פריימר. וכתוצאה מכךג'ל מנותח על ידי השוואת להקות ניאון, המאפשרת זיהוי של קצוות '5 של עניין. נקודות התחלת תעתיק ואתרי עיבוד מוערכים בנפרד על-ידי השוואות רצף.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. תשואה גבוהה RNA הכנה

  1. בידוד RNA
    הערה: ריכוזים גבוהים של רנ"א הכל יש צורך בתגובת סיומת פריימר. ערכות טור ספין בדרך כלל לא תניב את כמות הרנ"א צורך (~ 5-16 מיקרוגרם ב5 μl נפח). לכן טיהור תוך שימוש בשיטת חילוץ thiocyanate-פנול, כלורופורם guanidinium החומצה מומלצת, המפורטים להלן.
    הערה: פנול הוא מסרטנת, רעיל ומאכל. אנא קראו את גיליונות נתוני בטיחות חומרים ושימוש במנדף עם הגנה מתאימה!
    1. לגדול או לטפל בתאי החיידקים (ס aureus או E. coli בדוגמא זו) כרצוי וקציר על ידי צנטריפוגה 10 דקות ב 4,600 × גרם ו -4 מעלות צלזיוס. הערה: בדרך כלל אנחנו קוצרי OD כולל של 600 20 - 70. כדורי תא יכולים להיות מאוחסנים במשך כמה שבועות ב -20 מעלות צלזיוס.
    2. Resuspend התא גלולה ב 1 מיליליטר של תמיסת thiocyanate-פנול, כלורופורם guanidinium החומצה ולהעביר ל2 מיליליטר לדפוק כוס המכילה 0.5 מיליליטר של חרוזים זירקוניום / סיליקה זכוכית 0.1 מ"מ.
    3. Lyse התאים שלוש פעמים במקצף הכנה מהירה / חרוז על 6.5 מ '/ שנייה למשך 30 שניות לשלושה סיבובים, קירור דגימות קרח למשך 5 דקות אחרי כל הסיבוב. הערה: מדגם הומוגני יכול להיות מאוחסן ב -80 מעלות צלזיוס למשך מספר שבועות.
    4. דגירה lysate למשך 5 דקות ב RT ולאחר מכן להוסיף 200 μl של כלורופורם.
    5. במרץ לנער או מערבולת במדגם למשך 30 שניות כדי לחלץ RNA.
    6. לדגור על RT במשך 3 דקות אז צנטריפוגות במשך 15 דקות ב13,000 - 15,000 × גרם ו -4 מעלות צלזיוס. הערה: ממסים מופרדים לשלב אורגני נמוך יותר (ורוד, מכיל חלבונים), שלבי ביניים (לבנים, מכילים DNA) ושלב מימי עליון (ברור, מכיל RNA).
      הערה: משלב זה על שימוש רק RNase ריאגנטים חופשיים וכלי פלסטיק!
    7. הכן טרי RNase ללא צינורות 1.5 מיליליטר תגובה, תווית כראוי ולהוסיף כ -500 μl של 100% isopropanol RNase ללא כל (השתמש בערך באותו VOlume כשלב המימי בצינור הקודם).
    8. החזק את הצינור בזווית ולהעביר את השלב המימי (כ -500 μl) לצינורות שהוכנו באמצעות RNase עצות חינם. נא לא להפריע הביניים.
    9. לזרז את הרנ"א על ​​ידי היפוך כמה פעמים ודוגרים במשך 10 דקות ב RT.
    10. צנטריפוגה הדגימות במשך 15 דקות ב13,000 - 15,000 × גרם ו 4 מעלות צלזיוס ולהסיר supernatant ידי pipetting או שאיפה (משאבת סילון מים ובקבוק האכלה). נא לא להפריע גלולה RNA השקופה הלבנה בתחתית.
    11. הוסף 1 מיליליטר של 70-80% אתנול RNase חינם (לא מערבולת) כדי לשטוף. הערה: RNA באתנול יכול להיות מאוחסן במשך כמה שבועות ב -20 מעלות צלזיוס.
    12. צנטריפוגה במשך 5 דקות בg 7,500 × ו -4 ° C וזורקים supernatant ידי pipetting או רצוי שאיפה.
    13. גלולה אוויר יבשה RNA במשך 15 - 30 דקות מתחת למכסת מנוע קטר. אל overdry, אחרת כדורים עלולים להיות קשים לredissolve.
    14. Resuspend גלולה ב 50 μl של DDH RNase חינם 2 O או חיץ אחסון RNA.
    15. למדוד את ריכוז RNA עם ספקטרופוטומטר microvolume UV-Vis או קובט קוורץ (ופוֹטוֹמֶטֶר הקונבנציונלי) ולהמשיך DNase אני עיכול.
  2. אני DNase עיכול של RNA כדי להסיר עקבות של ה- DNA
    הערה: מאחר שה- DNA יכול לשמש כתבנית מזויפת בתגובת שעתוק לאחור (סיומת פריימר), יש להרחיקה מהמדגם. שיטות שונות להסרת DNA מפתרונות RNA זמינות אשר בדרך כלל מסתמכים על עיכול DNase. שיטה יעילה פשוטה אך יעילה ועלות להסרת DNA מפורטת להלן.
    1. אמבט מים מחממים עד 37 מעלות צלזיוס.
    2. מערבבים את החומרים המפורטים בטבלה המס '1 בצינור 1.5 מיליליטר תגובה.
    3. דגירה את התערובת למשך שעה 1 על 37 מעלות צלזיוס באמבט מים, ולאחר מכן להמשיך ישירות למיצוי פנול / כלורופורם. הערה: איון חום שלי DNase אינו מומלץ, שכן הדבר עלול לבזות את RNA.
    </ Li>
  3. חילוץ פנול / כלורופורם של RNA לאחר DNase אני עיכול
    הערה: RNA חייב להיות מטוהר כדי להסיר נוקלאוטידים חופשיים, שברי DNA ורכיבי חיץ מעיכול DNase אני. חילוץ פנול / כלורופורם מאפשר התאוששות גבוהה וריכוז של מדגם RNA ולכן מפורט להלן. גם שיטות אחרות לטיהור RNA עשויות לשמש, אם הם עומדים בדרישות האלה.
    1. לפצל את DNase 500 μl אני עיכול לערבב לתוך שתי 250 דגימות μl ב 2 מיליליטר צינורות תגובה.
    2. הוסף 1 נפח (250 μl) של P חומצי / C / פתרון (במים רוויים פנול, כלורופורם וisopentanol, יחס של 25: 24: 1, pH 4.5 - 5).
      הערה: P / C / פתרון הוא מסרטנת, רעיל ומאכל. אנא קראו את גיליונות נתוני בטיחות חומרים ושימוש במנדף עם הגנה מתאימה!
    3. מרץ מערבולת או מקום בפלטפורמת vortexing 1 - 3 דקות.
    4. צנטריפוגה למשך 30 דקות ב 13,000 - 15,000 × גרם ו -4 מעלות צלזיוס.
    5. אסוף את השלב העליון (המימי) ולהעביר לצינור טרי (250 μl).
    6. להוסיף 1/9 נפח (28 μl) של 3 M pH נתרן אצטט 5.2.
    7. להוסיף 2.5-3 כרכים של אתנול טהור (700 μl).
    8. מערבבים על ידי vortexing זמן קצר והמקום ב -80 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות או ב -20 מעלות צלזיוס 2 - 3 שעות. במידת הצורך, לאחסן RNA O / N ב -20 מעלות צלזיוס.
    9. צנטריפוגה במשך 30-60 דקות ב13,000 - 15,000 × גרם ו -4 מעלות צלזיוס.
    10. הסר supernatant ידי pipetting או שאיפה.
    11. לשטוף גלולה ידי הוספת 1 מיליליטר של אתנול 70% על גלולה. האם לא מדגם מערבולת.
    12. מדגם צנטריפוגה במשך 5 דקות ב13,000 - 15,000 × גרם ו -4 מעלות צלזיוס.
    13. הסר supernatant ידי pipetting או שאיפה.
    14. גלולה האוויר יבשה מתחת למכסת מנוע קטר. אחסן את גלולה ב -20 CO ° / N במידת צורך.
    15. ממיסים את גלולה בDEPC 30 μl טופל H 2 O על ידי vortexing למשך 2 דקות ולהשתמש בפתרון זה כדי לפזר את PEllet של הצינור השני המתאים לדגימה (30 פתרון μl לכל זוג חילוץ אחד).
    16. למדוד את ריכוז RNA, ולוודא שהיא עולה על מיקרוגרם / μl 1 לשימוש בסיומת פריימר של mRNAs הביע בממוצע.
    17. במידת הצורך, לאחסן RNA ב -20 מעלות צלזיוס במשך כמה שבועות עד כמה חודשים.

תגובת 2. פריימר Extension

  1. עיצוב פריימר
    הערה: בעת תכנון פריימרים לניסוי סיומת פריימר, לציית להנחיות כלליות של עיצוב פריימר PCR (ראה המדריך המלווה את רצף ג'ל האוטומטי במשך יותר מדור מידע ודיון במאמר זה).
    1. באופן ספציפי, להבטיח שפריימרים (i) אינם מכילים ריצות של בסיסים, (ii) יש G או C בסוף '3, (iii) יש GC מאוזן: AT יחס, (iv) יש חישול בטמפרטורה של כ 55-60 מעלות צלזיוס ו( v) נ"ב לאגד לפחות 50, טובים יותר 100 נ"ב במורד הזרם של האזור של עניין לקבל תמונות ברורות.
  2. תגובת סיומת פריימר
    הערה: תגובת סיומת פריימר (סינתזת cDNA) דורשת כמויות גבוהות של RNA תבנית. אם הכמויות של RNA המשמשות נבחרות לנמוך, האות עלולה להיות נמוכה מדי כדי לזהות! לכן אנו ממליצים לטיהור של RNA כמתואר לעיל.
    הערה: שים לב: כלי ריאגנטים ופלסטיק חופשיים השימוש RNase !!!
    1. מחממים את התרמו-Cycler לטמפרטורה של 95 מעלות צלזיוס ולבצע את כל שלבי דגירה נוספים בתרם-Cycler עבור קלות שימוש ושחזור.
    2. מערבבים את החומרים מטבלה 2 בצינור PCR עבור כל דגימת RNA.
    3. לפגל דגימות דקות 1 על 95 מעלות צלזיוס.
    4. מניחים את הצינורות על קרח וקור במשך 5 דקות כדי להכליא RNAs ופריימרים.
    5. להגדיר את מכשיר ה- PCR ל- 47 מעלות צלזיוס.
    6. בינתיים מכין את תערובת מאסטר השעתוק לאחור כמתואר בטבלה 3.
    7. הוסף 4 μl של תמהיל אב שעתוק לאחור לכל RNA הכלאהמדגם.
    8. דגירה הצינורות עבור השעה 1 ב 47 מעלות צלזיוס. הערה: הטמפרטורה האופטימלית לAMV RT היא 42 מעלות צלזיוס, טמפרטורה גבוהה יותר לעומת זאת לעזור להתגבר על מבנים משניים של מולקולות RNA.
    9. לעצור את התגובה על ידי חימום הדגימות עד 95 מעלות צלזיוס למשך 2 דקות.
      הערה: Formamide הוא מאכל, רעיל ויכול להזיק לעובר. אנא קראו את גיליונות נתוני בטיחות חומרים, להתמודד עם טיפול וללבוש הגנה ראויה!
    10. הוסף 6 μl של טעינת צבע פוראמיד (95% (v / v) פוראמיד deionized, 10 mM EDTA, 0.05% (w / v) bromophenol הכחול) והחנות לO / N לשבועיים ב -20 מעלות צלזיוס בחושך.

3. הכנת סולם הרצף

הערה: תגובת סולם הרצף דורשת גם כמויות מתונות של פלסמידים או כמויות גבוהות של הדנ"א הגנומי. במידת האפשר, השימוש בפלסמידים בתגובת הרצף מומלץ בשל הקלות של בידוד וגבוה sigעוצמה סופית. במקרים אחרים, אנו משתמשים באופן שיגרתי בשיטה שאומצה ממרמור 5,14 להכין הדנ"א הגנומי מא coli וס תאי aureus ללא צורך בשימוש בפנול. בעיקרון ניתן להשתמש בכל שיטה שמניבה סכומים ובטוהר של הדנ"א הגנומי גבוהים.

  1. בידוד הדנ"א הגנומי
    1. לגדול 10 מיליליטר של א ' coli או S. תאי aureus O / N ב LB, BM 5 או בינוני TSB.
    2. קציר תאים על ידי צנטריפוגה במשך 10 דקות בגובה של 4,600 × גרם בצינור בז 15 מיליליטר.
    3. גלולה Resuspended ב 2 P1 מיליליטר החיץ כפי שנמצא בכמה ערכות הכנת מיני (50 טריס-HCl pH 8.0 מ"מ, 10 מ"מ EDTA, 100 מיקרוגרם / מיליליטר RNase).
    4. תאי lyse 45 - 60 דקות עם 20-40 lysostaphin μl (0.5 מ"ג / מיליליטר, אחסון ב -20 ° C). הערה: E. קולי תאים האנזימטית מראש הטיפול יכול גם להיות מושמט או יזוזים משמשים.
    5. הוספת 100 μl של SDS-פתרון רווי (ב -45% אתנול) על השעיית וincubatדואר במשך 5 דקות על 37 מעלות צלזיוס.
    6. להוסיף 650 μl 5 M NaClO 4 והתאים בקצרה מערבולת.
      הערה: כלורופורם הוא מסרטן פוטנציאלי. אנא קראו את גיליונות נתוני בטיחות חומרים ושימוש במנדף עם הגנה מתאימה !!!
    7. הוסף 3 מיליליטר של כלורופורם / isopentanol (24: 1 יחס) לתערובת ולנער במשך לפחות 60 שניות. הערה: הנוזל צריך להפוך לתחליב לבן אחיד.
    8. מדגם צנטריפוגות במשך 10 דקות ב 4,600 × גרם וRT להפריד שלבים.
    9. להעביר בזהירות את השלב ברור העליון (המימי) לצינור טרי. אם הפתרון הוא עכור, לחזור על מיצוי כלורופורם / isopentanol. מדוד את עוצמת הקול של פתרון ה- DNA ולהכין צינור טרי עם 2 כרכים של אתנול (100%).
    10. לאט למזוג או פיפטה פתרון ה- DNA לתוך אתנול המכיל צינור. הערה: ה- DNA צריך לזרז סלילים שקופים, צפופים בתחתית או כאשר לחלוטין מיובש כאשכול לבן צף.
    11. אחזר את DNA באמצעות קרסים עשויים טפטפות פסטר זכוכית (איור 2) ולשטוף כל דגימה פעמיים על ידי טבילה לתוך צינור בודד של 1 מיליליטר של אתנול 70%.
    12. הנח את הווים זקופים במעמד ואוויר יבש גלולה במשך 60 דקות. במידת צורך, לאחסן את ה- DNA המיובש במשך כמה ימים על RT.
    13. לפזר DNA על ידי ניתוק ווי זכוכית DNA מכוסה והצבה בצינור 2.0 מיליליטר תגובה מכיל 100-500 μl DDH 2 O. התאם את עוצמת קול לריכוז ה- DNA של 1,000 - 1,500 ng / μl. לתגובת סידור אחד, להשתמש 10-18 מיקרוגרם של ה- DNA הגנומי.

איור 2
איור 2. הדרכה על איך ליצור חכת DNA. החזק את קצה פיפטה פסטר זכוכית לתוך הלהבה של מבער בונזן. זה גורם לזכוכית כדי להמס לאחר מספר שניות, יצירת וו קטן בtהוא בסופו של. להסיר במהירות מהאש ומצנן דקות 1.

  1. בידוד פלסמיד
    1. הכן פלסמידים באמצעות ערכות הכנת מיני סטנדרטית ולפזר במאגר elution (10 מ"מ טריס-Cl, pH 8.5). בהתאם לגודל פלסמיד, להשתמש 100 - של פלסמיד 500 ng לסולם רצף אחד.
  2. תגובה סנגר רצף
    הערה: מצא מתחת פרוטוקול פשוט שמשתמש בערכת רצף פריימר שכותרתו fluorescently עם 7-deaza-dGTP שפועל היטב לצורך הרחבות פריימר. עיין במדריך לערכת הרצף לקבלת מידע מפורט. שים לב שתגובת סידור חייבת להשתמש באותו צבע היסוד כתגובת סיומת פריימר כדי ליצור מוצרים באותו האורך.
    1. מערבבים 12 μl של הדנ"א הגנומי (~ 10-15 מיקרוגרם) עם μl DMSO 1 ו 1 פריימר μl שכותרתו fluorescently (2 pmol / μl).
    2. לכל μl 1 של ארבע תערובות תגובת סידור (A, C, G או T), להוסיף 3 μl של ה- DNA / DMSO / תערובת פריימר. מניחים את הדגימות למכונת PCR, ולהפעיל את תכנית ה- PCR הבאה: 95 מעלות צלזיוס למשך 2 דקות; 35 מחזורים של 95 מעלות צלזיוס למשך 20 שניות, 54 מעלות צלזיוס למשך 20 שניות, 70 מעלות צלזיוס למשך 30 שניות; לשמור על 4 מעלות צלזיוס לנצח.
    3. לאחר הריצה, להסיר את הדגימות מהמכונה, להוסיף 6 μl של צבע טעינה ולאחסן על קרח (לטווח קצר) או ב -20 מעלות צלזיוס במשך כמה ימים עד שבועות.

4. התקנת ג'ל ומכשירי הפעלה

הערה: מידע מפורט על איך מנגנון ג'ל הרצף מורכב, ג'ל מוכן וניתן למצוא כמה ג'ל מנוהל בפרוטוקול היצרן.

  1. הכנות
    1. הכן 10x TBE כמצוין בטבלה 4.
    2. ביום של ריצת ג'ל להכין 1 ליטר של חיץ 1x TBE עם ultrapure DDH 2 O.
    3. הכן 10% (w / v) APS. הערה: ניתן לאחסן 200 aliquots μl ב -20 מעלות צלזיוס במשך כמה חודשים, אך הפעילות עלולה לגרום לירידה לאורך זמן <./ Li>
  2. הרכבה של תא ליהוק ג'ל
    1. הימנע מאבק ומוך בין לוחות הזכוכית. משטחי עבודה ולכן יש לנקות ביסודיות באמצעות מגבונים לחים.
    2. נקה זוג לוחות זכוכית 25 סנטימטר באמצעות מגבות נייר חד פעמיות ומים מזוקקים בשני הצדדים ולאחר מכן isopropanol לצד הפנימי של לוחות הזכוכית.
    3. הנח 0.25 מ"מ מפרידי על צלחת הזכוכית האחורית ולהפחית את צלחת זכוכית מחורצת על גבי (איור 3).
    4. הצמיד את פסי ג'ל לשני הצדדים של לוחות הזכוכית עם המגרעת וטייסי כניסת הרכבת יפנו כלפי מעלה ולהדק ידיות קלות.

איור 3
איור 3. התפוצץ נוכח לוחות זכוכית ג'ל אלקטרופורזה. יש להשתמש בצלחות זכוכית directionally. תשמור על עצמך כדי להתמודד עם הצד הפנימי של לוחות הזכוכית פנימה וחיצוניצד כלפי חוץ.

איור 4
איור 4. מבט של מנגנון ג'ל התאסף. לאחר שהזריק פתרון ג'ל, spacer הכיס ממוקם בפתרון בין לוחות הזכוכית. צלחת הליהוק החליקה אז בין צלחת הזכוכית הקדמית ומסילות ג'ל ומאובטחת על ידי הידוק ידיות הרכבת.

  1. יציקת ג'ל
    הערה: acrylamide פולימר שאינו רעיל למערכת עצבים היא! אנא קרא את גיליונות נתוני בטיחות חומרים ולהשתמש בהגנה מתאימה !!!
    1. הוסף את התרכובות המופיעות בטבלה 5 לתוך כוס ומערבבים באמצעות בר ומערבב ובוחש מגנטי.
    2. מייד לאחר הוספת APS וTEMED, לקחת את פתרון ג'ל במזרק 50 מ"ל ולמקם את מסנן 0.45 ננומטר על הקצה.
    3. כך או להחזיק את הקצה העליון של צלחת הזכוכית ביד אחת או הנח את sandwich בליהוק ג'ל לעמוד ליצור מדרון בזווית 10 - 20 מעלות.
    4. לאט לאט לוותר פתרון ג'ל בין לוחות הזכוכית תוך כדי התנועה ברציפות קצה המזרק מצד אחד למשנהו ולהפסיק ברגע שפתרון ג'ל פוגש את הקצה התחתון.
    5. לעבור לצד או להסיר לחלוטין את כל בועות שנוצרו באמצעות וו בועה.
    6. חלק את spacer כיס ג'ל (0.25 מ"מ) בין לוחות הזכוכית בסוף מחורצים, לצלול לתוך תמיסת ג'ל ולתקן על ידי הצמדת צלחת הליהוק.
    7. ברגים עליון רכבת לְכַפתֵר קל (ראו תרשים 4 למכשירים מורכבים בשלמות).
    8. בואו סט ג'ל ל1 - 2 שעות.
    9. הסר את spacer כיס הצלחת והליהוק ולנקות את כיס משאריות מלח וג'ל.
    10. לשטוף עם DDH 2 O ומנגב את הפתרון עודף עם ניירות רקמה.
  2. פועל באופן חזותי את הג'ל
    הערה: ג'לים הרצף ישירות נתונים לאלקטרופורזה בג'ל תרמי, תוךהקרינה מזוהה בו זמנית על ידי מיקרוסקופ לייזר. בניגוד לג'ל אלקטרופורזה הקונבנציונלית, שבו ג 'מנוהל ראשון ולאחר מכן מוכתמת ומדמיין, יחידת האיתור קבועה וסורקת את הלהקות בזמן אמת כפי שהם עוברים את הלייזר. להלן נוהל לתוכנת אוסף ImagIR נתונים על OS / 2 המתואר, אשר יכול להיות מאומץ לגרסות מאוחרות יותר. לקבלת מידע נוסף, ראה מדריך למשתמש.
    1. חלק את מחזיק טנק חיץ לפסי ג'ל על לוחות הזכוכית הקדמיים ולהדק את הידיות.
    2. הנח ג'ל לתוך טנק ג'ל התחתון של תרמי ג'ל האוטומטי נגד צלחת החימום ולתקן על ידי הזזה טייס כניסת הרכבת לסוגר המנגנון.
    3. מלא חיץ TBE 1x לתאי חיץ ג'ל התחתונים ועליונים, לסגור את תא החיץ הנמוך ולחבר את תא החיץ העליון לכח באמצעות כבל החשמל.
    4. אם קיימים, לנקות את כיס ג'ל ממלח-שאריות על ידי pipetting שוב ושוב חיץ לכיס.
    5. סגור את מיכל חיץ התא העליון באמצעות מכסה החיץ העליון.
    6. סגור את דלת המכונה ולעבור על תרמי והמחשב ולהפעיל את תוכנת אוסף Base ImagIR נתונים.
    7. צור קובץ פרויקט חדש (File-> New ...), הזן שם קובץ פרויקט, לבחור את טווחי הלייזר המתאימים (700 או 800 ננומטר) ואשר בלחיצה על אישור.
    8. בחר רווח אפשרויות-> אוטומטי ... מתפריט התמונה בחלק העליון, לחץ על Auto להתחיל מדידת רווח אוטומטית וקיבלתי את הגדרות על ידי לחיצה על אישור.
    9. פוקוס הלייזר על ידי בחירת אפשרויות-> פוקוס ... מתפריט שליטת סורק, לחיצה על לחצן האוטומטי ולקבל את ההגדרות על ידי לחיצה על אישור.
    10. חזור על תהליך העלייה האוטומטית כדי להתאים לאזור ממוקד החדש.
    11. הגדרת שליטת הסורק בהתאם להגדרות הבאות: 2,000 V, 35 מילי-אמפר, 45 W, 45 ° C, מסנן סריקה: 3, מהירות סריקה: 3.
    12. Prerun את הג'ל הריק במשך 20 דקות (במתח בחר ולחצו על <Enter> ).
    13. בינתיים, מחמם את סולם הרצף ומוצרי סיומת פריימר במכונה PCR במשך 2 דקות עד 90 מעלות צלזיוס, ולאחר מכן לצנן על קרח.
    14. עצור את אלקטרופורזה, לפתוח את רצף ג'ל האוטומטי ולהסיר את מיכל חיץ העפעף העליון.
    15. הכנס את השיניים מסרק הכריש בין לוחות הזכוכית ומעט לנקב את הג'ל עם שיני הכריש (ראה תרשים 5).

איור 5
איור 5. תצוגת תקריב של ג'ל עם מסרק שן כריש. לדוגמא (סגולה) מוחלת בין שיני הכריש.

  1. פיפטה או 1 - 2 μl של מוצרי המשך האו תגובות סולם רצף פריימר לכל כיס ג'ל (שהוקם על ידי שיני הכריש).
  2. אם יש צורך לא כל הכיסים, למלא את הכיסים ריקים עם צבע טעינה כדי למנוע בעקבית ריצת התנהגות.
  3. סגור את מיכל החיץ ודלת של רצף ג'ל.
  4. התחל אלקטרופורזה ולהדליק לייזר (בחר מתח ובליזר ובעיתונות <ENTER>).
  5. להפסיק אלקטרופורזה פעם אחת באזור של העניין עבר את הלייזר.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

כפי שמתואר באיור 6, תגובת סיומת פריימר ניתן להשתמש כדי לקבוע את נקודות התחלת תעתיק של תמלילים של עניין ויכולה לעזור להסיק אזורי אמרגן (מזוהה בדרך כלל על ידי -10 ו-35 אלמנטים). בר cDNA העליון (הארוך ביותר) מייצג את הקצה 5 'של ה- mRNA, ולכן יכול להיות ממופה בקלות בהשוואה לסולם הרצף.

איור 6
איור 6. תוצאת נציג תגובת סיומת פריימר. בצד השמאל in vivo ג'ל סיומת פריימר מלא מא coli עם פלסמידים שונים מוצג. אזורים בודדים של ריבית מוגדלים. בחלק העליון (A), קביעת נקודת התחלת תעתיק ompA מתוארת. השעתוק לאחור עוצר בסוף '5 של mRNA וכך יוצר להקה של RNA באורך המלא (indicated על ידי חץ). על ידי יישור להקת cDNA עם סולם הרצף, סוף '5 של ה- mRNA ניתן לקבוע, כפי שמוצג ברצף הנלווה. בחלק התחתון (B), המחשוף של תמליל ompA על ידי RNase YoeB-seq2 מוצג. נתיבים 1 - 3 מייצגים דגימות שבי YoeB-seq2 הרעל חסר או לא פעילה, ואילו נתיבי 4 - 5 מייצגות דגימות עם RNase פעיל, בד בבד עם ההעדר והנוכחות של מוצרי cDNA. שני מוצרי מחשוף עיקריים נוצרים כפי שצוינו על ידי החצים. DdNTP משמש בנתיב אחד ובסיס RNA המקביל של סולם הרצף מסומן. חלקי תמליל מסומנים על ידי גופן כחול, אלמנטים של פרומוטר ותחילת אוגוסט קודון על ידי גופן מגנטה. לקבלת מידע נוסף; עיין במאמר המחקר המקורי מאל Nolle et., 159 מיקרוביולוגיה, 1575-1585 (2013). לחצי כאן ללצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

בדוגמא שמוצגת באיור 6, כפית של mRNA ompA הייתה נחושה להיות בסיס G (מסומן בחץ ברצף מתחת לג'ל). זה עולה בקנה אחד עם כפית ompA פורסמה לפני 15. האלמנטים -35 ו -10 של האמרגן ניתן להסיק להיות TTGTAA וTAGACT 16 כמוטיבים שונים רק שני בסיסים כל מרצפי הקונצנזוס שלהם (TTGACA וTATAAT בהתאמה).

בניגוד לשיטות אחרות, כגון 5 RACE ', ניתן להשתמש בתגובות סיומת פריימר לקבוע במדויק ולכמת את המחשוף של מולקולות RNA. מחשוף של מולקולות RNA יוצר קצוות 5 'חופשיים, אשר יכול להתגלות בו-זמנית כלהקות cDNA בג'ל. זיהוי מספר מוצרי מחשוף של אחד mRNA הוא יותר קשה ב5 ניסויי גזע ', שכן כמה מוצרי ה- PCR חייבים להיות רצף לקבלת מוצרי מחשוףשרק מייצג חלק קטן מכלל כמות גדולה RNA (לא מעובד).

בחלק התחתון של איור 6, מיפוי RNA של המחשוף על ידי RNase מתואר. כפי שתואר 5, RNase YoeB-seq2, חלק ממדד ת"א מערכת מס בעבר equorum 17, mRNAs הקרוב לקודון ההתחלה דבק. מחשוף זה יכול להיות מעוכב על ידי YefM-seq2 אנטי-רעלן מאותו המקור. כאשר YoeB RNase לא קיים או לא פעיל (מסלולים 1 - 3), לא מוצרי סיומת פריימר נוצרים קרוב לקודון ההתחלה. בכל פעם שפעילות RNase קיים (נתיבי 4 ו -5), שתי להקות חזקות זמן קצר במורד הזרם של תחילת קודון מופיע. שימוש בגישה זו, ניתן לזהות דפוסי מחשוף בקלות.

איור 7 מראה ניסוי סיומת פריימר נכשל. בשל RNA העודף בתגובת השעתוק לאחור, הסכום שנוצר של cDNA יוצר אות כזה חזק, שלהקת cDNA בודדתזה לא יכול להיות מכובד. זה עושה את נחישות סוף RNA של 5 בלתי אפשרית.

בעת השימוש בRNAs הביע מאוד בתגובת סיומת פריימר, כגון RNA ריבוזומלי (כמתואר באיור 7), הסיכון של עליית אזורים חשופות מעל. לכן, כמות הכוללת RNA התבנית חייבת להיות מותאמת לשפע של RNA של עניין. בניגוד לכך, כאשר תמלילים של העניין מהווים כמות קטנה של RNA הכולל בלבד, הסכום בתגובת השעתוק לאחור יש להגדיל, אחרת האותות יהיו חלשים מדי (לא מוצג). זה חל גם על התגובה סנגר רצף, כתבניות multicopy לתא (כגון גנים או גנים מקודדים בפלסמידים rRNA) לגרום לאותות חזקים בהרבה.

איור 7
איור 7. תוצאת נציג סיומת פריימר נכשלה מ ng> ס aureus. 16S RNA הוא נרחב ביותר בתאי חיידקים. זה מוביל לאותות שעתוק לאחור חזקים כאשר כמויות מתונות של רנ"א הכל משמשות. במקרה המתואר כאן, להקות cDNA חזקות להסוות את 'הסוף ולכן למנוע 5' המדויק 5 מיפוי. בנוסף, RNAs ריבוזומלי הם מובנים מאוד ולכן יכול לסיים שעתוק לאחור בטרם עת, ייצור מוצרי cDNA קצרים, שאינו מייצגים ברים באורך מלאים. במקרה זה הגדלת טמפרטורת שעתוק לאחור, יחד עם transcriptase ההפוך עמידה בחום יכול לעשות את זה יותר קל לסנתז מבנים משניים האחרונים. בשל מספר עותקים של הרצף בהדנ"א הגנומי, הסולם סנגר רצף חזק יותר לגנים עותק יחידים. כדי לשפר את תמונת ג'ל, RNA ו- DNA מסתכמים לשעתוק לאחור ותגובה סנגר צריכה להיות מופחת ו / או פחות מוצר להחיל את הג'ל._upload / 52,134 52134fig7large.jpg "target =" / _ blank "> לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

טבלה 1: DNase אני עיכול של RNA.

חומר הסכום
RNA מצעד מעל 70-100 מיקרוגרם
10x DNase אני הצפת (100 מ"מ טריס, pH 7.5, 25 מ"מ MgCl 2, 5 מ"מ CaCl 2) 50 μl
אני DNase, (2 U / μl) RNase ללא 10.0 μl (עד 10 מיקרוגרם של RNA לפי μl 1 של DNase I)
להעלות את הנפח ל -500 μl עם DDH 2 O (DEPC שטופל)

נפח תגובה וכמות DNase אני וניתן לשנותם למעלה או למטה בהתאם לo הכמותמשמש ו RNA.

טבלה 2: הכלאת רנ"א-פריימר.

מתחם הסכום לתגובה אחת
RNA 5 - 15 מיקרוגרם
פריימר שכותרתו fluorescently 2 pmol
תביא נפח של עד 6 μl עם DDH 2 O (שטופל DEPC)

הגדרת תגובה אחת לדגימה RNA ופריימר.

טבלה 3: תערובת אמן סיומת פריימר.

מתחם הסכום לתגובה אחת
DDH 2 O (שטופל DEPC) 1.3 μl
AMV RT חוצץ (10x) 1.0μl
dNTPs (10 מ"מ, RNase חינם) 1.0 מיקרוליטר
RNase מונעי 0.2 μl
AMV ההפוך transcriptase (RT) (20-25 U / μl) 0.5 μl

בהיקף של עד מספר התגובות הדרושות.

לוח 4: מתכון TBE 10x.

חומר הסכום
טריס בסיס 107.8 g
חומצת בור 55.0 g
EDTA 7.4 גר '
להעלות את הנפח ל -1,000 מיליליטר עם DDH 2 O ultrapure ומסנן כדי להסיר אבק ומוך

לסנן להסרת אבק ומוך ולאחסן ב 4 °ג

לוח 5: מתכון ג'ל רצף.

מתחם הסכום
אוריאה 10.5 g
DDH 2 O (MilliQ) 13.0 מיליליטר
TBE 10x 2.5 מיליליטר
פתרון ג'ל XL המהיר 5.0 מיליליטר
TEMED (N, N, N ', N'-Tetramethylethane-1,2-diamine) 25 μl
APS (persulfate אמוניום, 10%) 175 μl

פתרון ג'ל התהליך במהירות לאחר התוספת של TEMED וAPS.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

סיומת פריימר ניאון היא שיטה פשוטה ומהירה לקביעת קצוות "5 של RNA, או לTSP- או הזדהות עיבוד RNA משנית. בשל השימוש בצבעי יסוד ניאון, ניתן להגדיר את התגובות ולרוץ ללא אמצעי אבטחה נוסף (שלא כמו במקרה של פריימרים שכותרתו רדיואקטיבית). כדגימות זוהו על ידי הקרינה, הם יכולים להיות צילמו תוך אלקטרופורזה היא בהתקדמות המאפשרת ניתוח מהיר בהשוואה לשיטות רדיואקטיביים שבו צילומי רנטגן משמשים בדרך כלל.

באופן כללי, האיכות של תגובת סיומת פריימר תלויה מאוד על הכיתה ויכולות המחייבות של פריימר. אם אתר הקישור נבחר קרוב מדי לאזור של עניין, מריחות צבע יסוד עשויות להסוות את האות, ואילו אתר קישור רחוק מדי (> 300 נ"ב) מהקצה 5 'עלול לגרום לאות עניה.

צבע פלואורסצנטי חייב להיות מקושר קוולנטית ל'5 סוף oligonucleotide DNA המותאם אישית במהלך הסינתזה וoligonucleotide צריך להיות מטוהר על ידי HPLC כדי למנוע הפרעה לתגובת השעתוק לאחור על ידי מלחים שיורית. אוליגונוקלאוטידים עם שינוי צבע מתאים (ראה טבלת רשימת ריאגנטים לקבלת מידע נוספת על צבעים תואמים) ניתן להזמין מרוב החברות סינתזת oligonucleotide ויש לאחסן בחושך. למרבה הצער, אנחנו לא מודעים לכל טכניקות האנזימטית לצרף הצבע לאוליגונוקלאוטידים קיימים בעבר, כפי שניתן עם נוקלאוטידים radiolabelled.

במערכת הרצף המתוארת כאן, ניתן להשתמש בשני צבעי ניאון שונים כדי לזהות בו-זמנית שתי דוגמאות, כמו העירור שלהם (כ 700 ו 800 ננומטר) וספקטרום פליטה נבדלים. מלבד צבעי יצרן המקוריים, ניתן להשתמש בצבעים אחרים, כגון שצוין ברשימת חומרים כימיים כדי לייצר תוצאות מצוינות.

גורם חשוב נוסף ליחסי ציבורתגובות סיומת imer היא איכות RNA והסכום. יש להקפיד להסרת מזהמי DNA, כפי שtranscriptases ההפוך כגון RT AMV יכול להשתמש בדנ"א כתבנית 18.

כפי שניתן לראות באיור 7, עוצמת האות המזוהות של להקות בטווח ג'ל היא תלויה בכמות RNA משמשת בתגובת השעתוק לאחור. לכן זה חיוני כדי להתאים את הכמות של רנ"א הכל, בהתאם לכמות היחסית של RNA של הווה עניין במדגם. הרגישות הנמוכה של שיטה זו היא גם אחד החסרונות שלה, כפי שבא לידי ביטוי RNAs הנמוך יכול להיות קשה לזהות. אם ניתן לאתר שום אותות בכלל, הסכום של רנ"א הכל יכול להיות מוגבר או RNA של עניין יכול להיות ביטוי יתר באופן מלאכותי מפלסמיד.

רגישות גילוי ג'ל לקרינת סיומת פריימר המבוססת היא על גורם עשר נמוך יותר מאשר 32 P או 33 רדיו-איזוטופי P סיומת פריימר 19 מבוססים. עם זאת, חסרון זה יכול להיות מתוגמל על ידי התאמת כמות cDNA הועמס על ג'ל או על ידי הגדלת הכמות של תבנית RNA משמשת בתגובת השעתוק לאחור. ברוב המקרים, רגישות גבוהה מספיק ל4,5 תוצאות משביע רצון. רגישויות דומות לסיומות פריימר רדיואקטיבי דווחו בעת שימוש בפריימרים ניאון בשילוב עם רצף נימים 3, עם היתרון של זמני חשיפה קצרים.

עולה השוואה בין הקרינה ורדיואקטיביות הרחבות פריימר המבוססת קשה, כפי שהם תלויים במספר גורמים כגון מכונות זמינות, פריימרים, תגובות סולם, זמינות ותחזוקה של מעבדה לעבודה עם חומרים רדיואקטיביים, סילוק פסולת רדיואקטיבית, הכשרה וסיכוני בריאות פרט . פריימרים פלורסנט עומדים 09:55 פעמים יקרות יותר מאשר פריימרים שכותרתו אינם סטנדרטיים (20 נ"ב). עם זאת פריימרים אלה יכולים לשמש לפחותשנה (כמה שנים סבירה יותר) בהשוואה לפריימרים 32 P שכותרתו, שיש להם זמן מחצית חיים קצרים בהרבה. Re-התיוג של פריימרים הוא זמן רב ויקר, בשל הצורך בחומר רדיואקטיבי חדש במרווחים תכופים. אם אותה הקבוצה של פריימרים משמש לאורך תקופת זמן ארוכה, פריימרים ניאון הם זולים יותר מאשר פריימרים רגילים, שכותרתו רדיואקטיבית. נקודת העלות העיקרית עם זאת תהיה ברצף הניאון או תרמי ורכישת מכשיר זה אך ורק לצורך הרחבות פריימר לא יכול להיות חסכוני. השיטה המתוארת כאן היא מעניינת למדי עבור קבוצות שנמצאות ברשותו של או לקבל גישה למכשיר כזה.

אם רצף ג'ל אוטומטי אינו זמין, ניתן להשתמש בשיטות אחרות לגילוי הקרינה וכן. במקרה זה, את הג'ל ניתן להפעיל במכשיר אלקטרופורזה סטנדרטי, מיובש במידת צורך ולאחר מכן הועבר לתרמי ניאון (דגמים זמינים אשר דומים לflסורקי atbed). למרות היתרון לדמיין את ג 'בזמן הריצה הולך לאיבוד, ניתן להימנע מהשימוש באיזוטופים רדיואקטיביים בדרך זו, יתרון חשוב לנסיין. בנוסף, אם קיים, ברצף נימים יכול לשמש להפרדה וזיהוי בזמן אמת, מה שיכול לעזור כדי להגביר את הרגישות.

שיטות שונות שפורסמו על אופן שימוש בהרחבת פריימר ניאון עם מכונות רצף ג'ל האוטומטי או sequencers נימים, לעומת זאת שיטות אלה לעתים קרובות דורשות צעד ממטרים cDNA להתרכז במדגם (ולהסיר זיהומים) 19. בשיטה המוצגת כאן, המשקעים DNA אין צורך וכך להקטין את זמן ההכנה. יותר מכך זאת, השמטת צעד זה מאפשרת חצי כמותית לקבוע את כמות מולקולות RNA במדגם כפי שניתן לבטל את חוסר העקביות של הליך המשקעים.

יש לציין, כי למרות שקצוות '5 של מולקולות RNA יכולים להיות ממופים בתגובות סיומת פריימר, מעובד וקצוות ראשוניים (נקודות התחלת תעתיק) לא יכולים להבחין בקלות. כדי לעקוף את ההגבלות הללו, תכנון קפדני של הניסויים עם בקרות מתאימות הוא חיוני. רצפי אמרגן ברורים יכולים להעיד על הנוכחות של נקודת התחלת שעתוק ואלמנטי אמרגן מוטציה או מחיקה אז צריכים לבטל את להקות cDNA. מצד השני, אם רצפים בן חסרים או רצפי קונסנסוס מסוימים נמצאים, הלהקות עלולות להיגרם על ידי עיבוד של ה- RNA. אם אנזים העיבוד ידוע ויכול להיות מטוהר, במבחנה הרחבות פריימר יכולות להביא הבהרה, כשעתוק ועיבוד יכול להיות מופרד. בנוסף, כגון 5 RACE 'שיטות אחרות (כולל העשרה האנזימטית של מולקולות RNA לא מעובדות) יכול להשלים סיומות פריימר להבחין אתרים להתחיל תעתיק מעיבוד RNA.

השיטת סיומת פריימר דואר לעתים קרובות לעומת שיטות אחרות כגון 5 RACE 'ומבחני הגנת nuclease S1 ולכן התועלת שלה היא לעתים בספק. טכניקות RNAseq בשילוב עם רצף של הדור הבא לדוגמא יכולות לעזור לקבוע TSPs ואתרי עיבוד רב של RNA במקביל, אך הנטל הכספי ועבודת bioinformatical נדרש לעשות את זה ולא-כלכלי לRNAs אחד של עניין. 5'-RACE מצד שני הוא זול יותר והתוצאות הן קלים יותר לנתח, אבל אם RNAs מעובד במספר דרכים או כמה נקודות התחלת תעתיקם נוכחי, חייב להיות משובטות המוצר וכמות גדולה של מועמדים צריכה להיות רצף ל לקבל מבט נציג RNAs של עניין.

לכן, למרות שיטות חדשות שהתגלו לאורך השנים, יש הרחבות גם היום תחל סיבת קיומם בשל קלות שימוש, עלות נמוכה וזמן אספקה ​​קצר, וזה נכון במיוחדלשיטת הקרינה מבוססת שהוצגה כאן.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
AMV Reverse Transcriptase (20-25 U/µl) NEB / Roche NEB: M0277-T / Roche: 10109118001
DNase I (RNase free) Ambion (life technologies) AM2222
FastPrep-24 Instrument  MPBio 116004500
Fluorescently labeled primers Biomers n/a 5’ DY-681 modification of “ordinary” DNA oligonucleotides. Compatible dyes such as the LICOR IRDye 700/800 are also available from other suppliers such as IDTdna.
Li-Cor 4200 Sequencer incl. ImagIR Data collection software Li-Cor Product discontinued
NanoDrop 2000 Thermo Scientific
Nuclease free water Ambion (life technologies) AM9915G
Plasmid mini preparation kit QIAGEN 12125
RapidGel-XL-40% Concentrate USB US75863
RNA STORAGE BUFFER Ambion (life technologies) AM7000
Roti-Aqua-P/C/I Carl Roth X985.3 Alternative: “Acid-Phenol:Chloroform, pH 4.5 (with IAA, 125:24:1)” from Ambion (AM9720)
SUPERase•In RNase Inhibitor Ambion (life technologies) AM2696
Thermo Sequenase fluorescently labelled primer cycle sequencing kit with 7-deaza-dGTP GE Healthcare RPN2538
TRIzol reagent life technologies 15596-026
Zirconia/Silica Beads 0.1 mm BioSpec 11079101z

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Simpson, C. G., Brown, J. W. Primer extension assay. Methods Mol. Biol. 49, 249-256 (1995).
  2. Sanger, F., Nicklen, S., Coulson, A. R. DNA sequencing with chain-terminating inhibitors. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 74, 5463-5467 (1977).
  3. Fekete, R. A., Miller, M. J., Chattoraj, D. K. Fluorescently labeled oligonucleotide extension: a rapid and quantitative protocol for primer extension. Biotechniques. 35, 90-94 (2003).
  4. Schuster, C. F., et al. Characterization of a mazEF Toxin-Antitoxin Homologue from Staphylococcus equorum. J. Bacteriol. 195, 115-125 (2013).
  5. Nolle, N., Schuster, C. F., Bertram, R. Two paralogous yefM-yoeB loci from Staphylococcus equorum encode functional toxin-antitoxin systems. Microbiology. 159, 1575-1585 (2013).
  6. Yamaguchi, Y., Park, J. H., Inouye, M. Toxin-antitoxin systems in bacteria and archaea. Annu. Rev. Genet. 45, 61-79 (2011).
  7. Schuster, C. F., Bertram, R. Toxin-antitoxin systems are ubiquitous and versatile modulators of prokaryotic cell fate. FEMS Microbiol. Lett. 340, 73-85 (2013).
  8. Goeders, N., Van Melderen, L. Toxin-antitoxin systems as multilevel interaction systems. Toxins. 6, 304-324 (2014).
  9. Yamaguchi, Y., Inouye, M. mRNA interferases, sequence-specific endoribonucleases from the toxin-antitoxin systems. Progress in molecular biology and translational science. 85, 467-500 (2009).
  10. Park, J. H., Yamaguchi, Y., Inouye, M. Bacillus subtilis MazF-bs (EndoA) is a UACAU-specific mRNA interferase. FEBS Lett. 585, 2526-2532 (2011).
  11. Zhu, L., et al. et al.Staphylococcus aureus MazF specifically cleaves a pentad sequence, UACAU, which is unusually abundant in the mRNA for pathogenic adhesive factor SraP. J. Bacteriol. 191, 3248-3255 (2009).
  12. Zhu, L., et al. The mRNA interferases, MazF-mt3 and MazF-mt7 from Mycobacterium tuberculosis target unique pentad sequences in single-stranded RNA. Mol. Microbiol. 69, 559-569 (2008).
  13. Fu, Z., Donegan, N. P., Memmi, G., Cheung, A. L. Characterization of MazFSa, an endoribonuclease from Staphylococcus aureus. J. Bacteriol. 189, 8871-8879 (2007).
  14. Marmur, J. A procedure for the isolation of deoxyribonucleic acid from micro-organisms. J. Mol. Biol. 3, 208-218 (1961).
  15. Emory, S. A., Belasco, J. G. The ompA 5' untranslated RNA segment functions in Escherichia coli as a growth-rate-regulated mRNA stabilizer whose activity is unrelated to translational efficiency. J. Bacteriol. 172, 4472-4481 (1990).
  16. Cole, S. T., Bremer, E., Hindennach, I., Henning, U. Characterisation of the promoters for the ompA gene which encodes a major outer membrane protein of Escherichia coli. Mol. Gen. Genet. 188, 472-479 (1982).
  17. Schleifer, K. H., Kilpper-Bälz, R., Devriese, L. Staphylococcus arlettae sp. nov., S. equorum sp. nov. and S. kloosii sp. nov.: Three New Coagulase-Negative, Novobiocin-Resistant Species from Animals. Syst. Appl. Microbiol. 5, 501-509 Forthcoming.
  18. Yu, H., Goodman, M. F. Comparison of HIV-1 and avian myeloblastosis virus reverse transcriptase fidelity on RNA and DNA templates. J. Biol. Chem. 267, 10888-10896 (1992).
  19. Ying, B. W., Fourmy, D., Yoshizawa, S. Substitution of the use of radioactivity by fluorescence for biochemical studies of RNA. RNA. 13, 2042-2050 (2007).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics