Fluorescens Basert Primer Extension Technique fastslår Transkripsjon utgangspunkt og Cleavage Nettsteder av RNases
1Department of Microbial Genetics, Interfaculty Institute of Microbiology and Infection Medicine Tübingen (IMIT), Faculty of Science, University of Tübingen

Published 10/31/2014
0 Comments
  CITE THIS  SHARE 
Biology

Your institution must subscribe to JoVE's Biology section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

Welcome!

Enter your email below to get your free 10 minute trial to JoVE!





By clicking "Submit", you agree to our policies.

 

Summary

Cite this Article

Copy Citation

Schuster, C. F., Bertram, R. Fluorescence Based Primer Extension Technique to Determine Transcriptional Starting Points and Cleavage Sites of RNases In Vivo. J. Vis. Exp. (92), e52134, doi:10.3791/52134 (2014).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Fluorescens basert primer extension (FPE) er en molekylær metode for å bestemme transkripsjonsutgangspunkter eller områder for behandling av RNA-molekyler. Dette er oppnådd ved revers transkripsjon av RNA av interesse med bestemte fluorescensmerkede primere og etterfølgende analyse av de resulterende cDNA-fragmenter ved denaturerende polyakrylamidgelelektroforese. Samtidig blir en tradisjonell Sanger-sekvenseringsreaksjon kjørt på gelen for å kartlegge endene av cDNA-fragmenter i deres eksakte tilsvarende baser. I motsetning til 5'-RACE (Rapid Forsterkning av cDNA Ends), der produktet skal være klonet og flere kandidater sekvensert, kan mesteparten av cDNA fragmenter generert av primer extension samtidig bli oppdaget i en gel løp. I tillegg kan hele prosedyren (fra revers transkripsjon til endelig analyse av resultatene) være ferdig i en arbeidsdag. Ved hjelp av fluorescensmerkede primere, bruk av farlige radioaktiv isotop merket reagenserkan unngås, og behandlingstiden er redusert som produkter kan oppdages under elektroforese prosedyren.

I det følgende protokoll, beskriver vi en in vivo fluorescerende primer extension metode for å pålitelig og raskt oppdage 5 'endene av RNA å utlede transkripsjonen utgangspunkt og RNA prosessering områder (for eksempel ved gift antitoksin systemkomponenter) i S. aureus, E. coli og andre bakterier.

Introduction

Primerforlengelse 1 er en molekyl metode for å bestemme den 5 'ende av spesifikke RNA-molekyler opp til en basisoppløsning. Fordelen med andre metoder som for eksempel 5'-RACE (rask amplifikasjon av cDNA-ender) er den raske behandlingstid og muligheten til enkelt å analysere en blanding av forskjellige lengder av RNA-molekyler.

Denne metoden fungerer ved å utsette RNA-molekyler til å reversere transkripsjons reaksjoner ved bruk av spesifikke fluorescerende primere, genererer cDNA fragmenter av visse lengder. Disse cDNA-molekyler som blir drevet ved siden av tradisjonelle Sanger-sekvenseringsreaksjoner 2 på denaturerende polyakrylamidgeler og kan påvises ved deres fluorescens på grunn av bruk av fluorescensmerkede primere. Lengdene av cDNA-fragmentene blir så vurdert ved sammenligning av sekvenserings-stige, slik at tilordningen av de 5 'ender RNA.

Tradisjonelt blir primerekstensjonsreaksjoner brukes i forbindelsemed radioaktive isotoper til å oppdage cDNA molekyler på X-ray filmer. På grunn av helsefare, avfallshåndtering problemer og enkel håndtering, nyere protokoller utnytte fluorescens for påvisning av primer extension med automatiserte sequencere, om enn deres følsomhet er noe lavere. Ved hjelp av fluorescensmerkede primere kan gjentakende radiomerking prosedyre utelates, som fluorescerende primere er stabile over lang tid (mer enn et år i våre hender).

Metoden vi beskriver her benytter en automatisert gel sequencer, men med litt modifikasjoner, kan kapillær sequencere også brukes for cDNA separasjon og deteksjon tre. Den parallelle arten av gel-analyse gjør det mulig å påvise selv en liten mengde av RNA-spaltning eller foredling. En annen fordel er den høye oppløsning av denne fremgangsmåten, som terminal spaltning eller foredling av enda en base kan detekteres.

Med hensyn til påvisning av RNA-spaltning eller foredling, typically to forskjellige typer primer utvidelser skilles. I ett tilfelle blir den enzymatiske behandling utføres in vitro ved anvendelse av renset RNA og renset enzym, mens i det andre tilfellet blir behandlingen utført in vivo, og det resulterende RNA blir renset. I begge tilfeller RNA underkastes en primer-forlengelse utføres in vitro, men avhengig av kilden av RNA, er fremgangsmåten kalles en enten in vitro eller in vivo primer-forlengelse. I protokollen vi presenterer her, har vi fokus utelukkende på in vivo primerforlengelse, på grunn av enkel bruk (ingen rensede proteiner nødvendig) og muligheten for å bestemme transkripsjonelle startpunkter og behandling på samme tid. Imidlertid in vitro primer utvidelser er i prinsippet satt opp på samme måte, og denne protokollen kan tjene som et utgangspunkt.

Metoden som er illustrert her, kan anvendes på mange bakteriearter, så lenge de er mottagelig for høyrenhet og high-yield utarbeidelse av nukleinsyrer.

Forskningen i vår lab fokuserer på den regulatoriske omfanget av toksin-antitoxin (TA) systemer 4,5, et felt der primer extension-metoden er mye brukt. TA-systemer er små genetiske elementer som finnes i prokaryote genomer som består av et stabilt og aktivt endogent toksisk protein og en for det meste ustabil protein eller RNA-antitoxin som motvirker giftighet 6,7. Toxin-aktivitet er noen ganger som utøves av inhibering av replikasjon, celleveggsyntese eller andre mekanismer, men oftest ved RNase-aktivitet 8,9. Vanligvis er RNase spesifisitet bestemmes ved å utføre forskjellige tester, hvorav den ene er den primereksten metoden. Primerekstensjonsreaksjoner er vel egnet for denne anvendelse, som en blanding av full lengde og spaltede fragmenter kan samtidig analysert for å bestemme deres 5 'ender. Ved hjelp av en blanding av in vitro og in vivo primer utvidelser, denbestemt toksin RNase cleavage, f.eks sekvens spesifisitet kan bestemmes 10-13.

Figur 1
Figur 1. Oversikt over primer-forlengelsesprosedyren. Bakterielle kulturer ble inkubert og behandlet i henhold til de eksperimentelle behov. Total RNA ekstraheres fra cellene, som ble behandlet med DNase for å fjerne DNA-spor og underkastet en reverstranskripsjonsreaksjon under anvendelse av mål-spesifikke primere ettergivende fluorescerende DNA-cDNA. Genomisk DNA eller plasmider er trukket ut og senere brukes til fluorescerende Sanger-sekvenseringsreaksjoner for sammenligning størrelse med cDNA fragmenter. Primer-ekstensjonsprodukter er kjørt sammen med Sanger-sekvenseringsprodukter på en denaturerende urea-polyakrylamidgel og analysert med en automatisert laser og mikroskop. Sekvenser base som kommer på linje med cDNA båndet er last base av 5'-ende-cDNA (blå pil). Mer informasjon i Fekete, et al. 3 Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

En oversikt over hele primereksten prosedyren kan finnes i figur 1. I korthet ble bakteriecellene blir dyrket, høstet, lysert cellepelleten og RNA ekstrahert. Renset RNA blir deretter behandlet med DNase for å fjerne spor av DNA-molekyler som kan virke som templater for den reverse transkriptase. Spesifikke fluorescerende primere tilsettes til RNA hybridisert til området av interesse og deretter reverstranskribert, noe som resulterer i enkeltkjedet komplementært DNA (cDNA). En sekvense stigen er laget av tradisjonelle Sanger-sekvensering ved anvendelse av fluorescerende primere og separert på en denaturerende polyakrylamidgel sammen av cDNA-fragmenter primer-forlengelse. Den resulterendeGelen blir analysert ved sammenligning av de fluoriserende bånd, slik at identifikasjon av 5 'ender av interesse. Transkripsjonsutgangspunkter og områder for behandling blir så vurdert individuelt av sekvenssammenligninger.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. High Yield RNA Forberedelse

  1. RNA Isolation
    MERK: Høye konsentrasjoner av total RNA er nødvendig for primerekstensjonsreaksjon. Sentrifugekolonnesett som regel ikke gir mengden av RNA nødvendig (~ 5-16 ug i 5 ul volum). Derfor er rensing ved hjelp av syre guanidiniumtiocyanat-fenol-kloroform-ekstraksjon fremgangsmåte anbefales, er beskrevet nedenfor.
    MERK: Fenol er kreftfremkallende, giftig og etsende. Vennligst les sikkerhetsdatablad og bruke under en avtrekkshette med riktig beskyttelse!
    1. Vokser eller behandle de bakterielle celler (S. aureus E. coli, eller i dette eksemplet) som ønsket, og høsting av 10 min sentrifugering ved 4600 x g og 4 ° C. Merk: Typisk vi høste en total OD 600 av 20 - 70. Cellepelleter kan lagres i flere uker ved -20 ° C.
    2. Resuspender cellepelleten i 1 ml av syre guanidiniumtiocyanat-fenol-kloroform-oppløsning og overføre til en2 ml beger inneholdende skrue 0,5 ml 0,1 mm glass zirkonium / silisiumdioksyd-perler.
    3. Lyse cellene tre ganger på en rask prep / perle beater på 6.5 m / sek i 30 sekunder i tre runder, kjøling prøvene på is i 5 min etter hvert løp. Merk: homogenisert prøve kan bli lagret ved -80 ° C i flere uker.
    4. Inkuber lysat i 5 min ved RT og deretter legge til 200 mL kloroform.
    5. Rist eller vortex prøven i 30 sekunder for å trekke RNA.
    6. Inkuber ved RT i 3 min og deretter sentrifugere i 15 min ved 13 000 - 15 000 x g og 4 ° C. Merk: Løsemidler er adskilt i en nedre organisk fase (rosa, inneholder proteiner), en interfase (hvitt, inneholder DNA) og en øvre vandig fase (klar, inneholder RNA).
      MERK: Fra dette trinnet på bruk RNase frie reagenser og plast ware!
    7. Forbered fersk RNase-free 1.5 ml reaksjonsrørene, etikett på riktig måte og legge til ca 500 mL av 100% RNase frie isopropanol hver (bruker omtrent samme volume som den vandige fase i det foregående rør).
    8. Holde røret i en vinkel og overføre den vandige fase (ca. 500 ul) til de rør fremstilt ved hjelp av RNase-frie tips. Ikke forstyrr den inter.
    9. RNA utfelles ved å snu på glasset flere ganger, og inkubere i 10 minutter ved RT.
    10. Sentrifuger prøvene i 15 min ved 13 000 - 15 000 x g og 4 ° C og supernatanten fjernes ved pipettering eller aspirasjon (vannstrålepumpe og tåteflaske). Ikke forstyrr den hvite gjennomsiktige RNA pellet nederst.
    11. Tilsett 1 ml 70-80% RNase free etanol (ikke vortex) å vaske. Merk: RNA i etanol kan lagres i flere uker ved -20 ° C.
    12. Sentrifuger i 5 min ved 7500 x g og 4 ° C og kast supernatant ved pipettering eller fortrinnsvis aspirasjon.
    13. Lufttørke RNA pellet for 15-30 min under avtrekkshette. Ikke overdry, ellers pellets være vanskelig å oppløse.
    14. Resuspender pelleten i 50 mL av RNase free DDH 2 O eller RNA lagring buffer.
    15. Mål-RNA med en konsentrasjon microvolume UV-Vis spektrofotometer eller en kvarts kuvette (og konvensjonelle fotometer) og fortsette til DNase I-fordøyelse.
  2. DNase I-fordøyelse av RNA for å fjerne spor av DNA
    MERK: Siden DNA kan virke som et templat i den uekte revers transkripsjon (primerforlengelse) reaksjon, bør det fjernes fra prøven. Forskjellige metoder for å fjerne DNA fra RNA-løsninger er tilgjengelige som vanligvis er avhengige av DNase-behandling. En enkel, men effektiv og kostnadseffektiv metode for fjerning av DNA er skissert nedenfor.
    1. Forvarm vannbad til 37 ° C.
    2. Bland de forbindelser som er oppført i tabell 1 i et 1,5 ml reaksjonsrøret.
    3. Inkuber blandingen i 1 time ved 37 ° C i et vannbad, og deretter fortsette direkte til fenol / kloroform-ekstraksjon. Merk: Varmeinaktivering av DNase anbefales ikke, da dette kan forringe RNA.
    </ Li>
  3. Fenol / kloroform ekstraksjon av RNA etter DNase Fordøyelse
    MERK: RNA må renses for å fjerne frie nukleotider, DNA-fragmenter og bufferkomponenter fra DNase I-fordøyelse. Fenol / kloroform-ekstraksjon gir mulighet for høy gjenvinning og konsentrasjon av RNA-prøven, og er derfor beskrevet nedenfor. Andre fremgangsmåter for rensing av RNA kan også brukes, hvis de tilfredsstiller disse kravene.
    1. Splitte 500 mL DNase I fordøyelsen bland inn to 250 ul prøver i 2 ml reaksjonsrørene.
    2. Tilsett 1 volum (250 ul) av surt P / C / I-løsning (i vann mettet fenol, kloroform og isopentanol, forhold på 25: 24: 1, pH-verdi 4,5 til 5).
      MERK: P / C / I løsningen er kreftfremkallende, giftig og etsende. Vennligst les sikkerhetsdatablad og bruke under en avtrekkshette med riktig beskyttelse!
    3. Kraftig vortex eller sted i en virvling plattform for 1 - 3 min.
    4. Sentrifuger i 30 minutter ved 13 000 - 15 000 x g og 4 ° C.
    5. Samle den øvre (vandige) fase og overføring til friskt rør (250 ul).
    6. Legg 1/9 volum (28 ul) av 3 M natriumacetat pH 5,2.
    7. Legg 2,5-3 volumer av ren etanol (700 mikroliter).
    8. Bland ved virvling og kort tid sted ved -80 ° C i 30 min eller ved -20 ° C i 2 - 3 timer. Hvis det er nødvendig, lagre RNA O / N ved -20 ° C.
    9. Sentrifuger i 30 - 60 min ved 13 000 - 15 000 x g og 4 ° C.
    10. Fjern supernatanten ved pipettering eller aspirasjon.
    11. Vask pelleten ved å tilsette 1 ml av 70% etanol på pelleten. Ikke vortex prøven.
    12. Sentrifuger prøven i 5 min ved 13 000 - 15 000 x g og 4 ° C.
    13. Fjern supernatanten ved pipettering eller aspirasjon.
    14. Air tørr pellet under avtrekkshette. Oppbevar ved -20 ° pellet CO / N hvis nødvendig.
    15. Oppløs pelleten i 30 ul DEPC behandlet H 2 O ved å virvle i 2 min og bruke denne løsningen for å oppløse peklumpen av den tilsvarende andre rør per prøve (30 pl av en løsning pr ekstraksjon par).
    16. Mål RNA konsentrasjon, og sørge for at den overstiger 1 mg / mL for bruk i primer forlengelse av gjennomsnittlig kan uttrykt mRNA
    17. Hvis nødvendig, lagre RNA ved -20 ° C i flere uker, opp til noen få måneder.

2. primerforlengelsesreaksjon

  1. Grunning design
    MERK: Når du utformer primere for en primer extension eksperiment, adlyde generelle retningslinjer av PCR primer design (se bruksanvisningen som følger med automatisert gel sequencer for mer informasjon og diskusjonskapittelet i denne artikkelen).
    1. Nærmere bestemt, at primerne (i) ikke inneholder kjøringer av baser, (ii) har en G eller C i 3'-enden, (iii) har en balansert GC: AT-forhold, (iv) har en glødetemperatur på ca. 55-60 ° C, og (v) binder minst 50 bp, 100 bp bedre nedstrøms for regionen av interesse for å motta klare bilder.
  2. Primerforlengelsesreaksjon
    MERK: primer-forlengelsesreaksjon (cDNA-syntese) krever høye mengder av RNA-templat. Hvis mengdene av RNA som brukes er valgt til lav, kan signalet være for lav til å detektere! Vi anbefaler derfor rensing av RNA som beskrevet ovenfor.
    MERK: FORSIKTIG: Bruk RNase frie reagenser og plast ware !!!
    1. Forvarm termo-cycler til en temperatur på 95 ° C og utføre alle ytterligere ruge trinn i en termo-cycler for enkel bruk og reproduserbarhet.
    2. Blande forbindelsene fra tabell 2 i en PCR-rør for hvert RNA-prøven.
    3. Denaturere prøvene i 1 min ved 95 ° C.
    4. Plasser rørene på is og chill for 5 min å hybridisere RNA og primere.
    5. Sett PCR maskin til 47 ° C.
    6. I mellomtiden fremstille revers transkripsjon konsentrat-blanding som beskrevet i tabell 3.
    7. Tilsett 4 mL av revers transkripsjon mester mix til hver hybridiserte RNAprøven.
    8. Inkuber rørene i 1 time ved 47 ° C. Merk: Den optimale temperatur for AMV RT er 42 ° C, men høyere temperaturer hjelper til å overkomme sekundærstrukturer av RNA-molekyler.
    9. Stopp reaksjonen ved å oppvarme prøvene til 95 ° C i 2 min.
      MERK: Formamid er etsende, giftig og kan være skadelig for det ufødte barnet. Vennligst les sikkerhetsdatablad, håndtere med forsiktighet og bruke egnet beskyttelse!
    10. Legg 6 ul formamid laste fargestoff (95% (v / v) deionisert formamid, 10 mM EDTA, 0,05% (w / v) bromfenol blå) og lagre for O / N til to uker ved -20 ° C i mørke.

3. Klargjøring av Sekvense Ladder

MERK: sekvense stigen reaksjon krever enten moderate mengder av plasmider eller høye mengder av genomisk DNA. Når det er mulig, er bruk av plasmider i den rekkefølge som reaksjon anbefales på grunn av den letthet av isolasjon og høy signal intensitet. I andre tilfeller, kan vi bruke en rutinemessig metode adoptert fra 5,14 Marmur å fremstille genomisk DNA fra E. coli og S. aureus-celler uten behov for å bruke fenol. I prinsippet kan brukes en metode som gir store mengder og renhet av genomisk DNA.

  1. Genomisk DNA Isolation
    1. Grow 10 ml E. coli eller S. aureus celler O / N i LB, BM 5 eller TSB medium.
    2. Høste cellene ved sentrifugering i 10 min ved 4600 x g i en 15 ml Falcon-rør.
    3. Pelleten ble resuspendert i 2 ml buffer P1 som funnet i noen mini forberedelse kits (50 mM Tris-HCl pH 8,0, 10 mM EDTA, 100 pg / ml RNase A).
    4. Lyse-celler for 45 - 60 minutter med 20 - 40 ul lysostafin (0,5 mg / ml, lagring ved -20 ° C). Merk: For E. coli-celler av den enzymatiske forbehandling kan enten utelates eller brukes lysozym.
    5. Tilsett 100 ul av mettet SDS-løsning (45% i etanol) til suspensjonen og incubate i 5 min ved 37 ° C.
    6. Legg 650 mL 5 M NaCIO 4 og kort virvel celler.
      MERK: Kloroform er et potensielt kreftfremkallende. Vennligst les sikkerhetsdatablad og bruke under en avtrekkshette med passende vern !!!
    7. Tilsett 3 ml kloroform / isopentanol (24: 1 forhold) til blandingen og det hele rystes i minst 60 sek. Merk: Væsken skal slå inn i en homogen hvit emulsjon.
    8. Sentrifuger prøven i 10 minutter ved 4600 x g og RT for å separere fasene.
    9. Overføre den klare øvre (vandige) fase nøye til et friskt rør. Dersom løsningen er grumsete, gjenta kloroform / isopentanol utvinning. Måle volumet av DNA-løsningen og fremstille et nytt rør med 2 volumdeler etanol (100%).
    10. Sakte dekanter eller pipettere DNA-løsningen inn i etanol inneholdende rør. Merk: DNA bør felles ut som gjennomsiktige, tette spoler på bunnen eller når du er helt dehydrert som en flytende hvit klynge.
    11. Hente DNA ved hjelp av kroker laget av glass Pasteur pipetter (figur 2) og vask to ganger for hver prøve ved dypping i et individuelt rør av 1 ml 70% etanol.
    12. Plasser krokene oppreist i et rack og lufttørker pellet i 60 min. Om nødvendig, lagre tørket DNA i flere dager på RT.
    13. Løs opp DNA ved å bryte av DNA dekket glass kroker og plassere i en 2,0 ml reaksjonsrøret som inneholder 100-500 mL DDH 2 O. Juster volum til et endelig DNA-konsentrasjon på 1,000 - 1,500 ng / ul. For en sekvenseringsreaksjon, bruker 10-18 mikrogram av genomisk DNA.

Figur 2
Figur 2. Instruksjon om hvordan du oppretter en DNA fiskestang. Hold spissen av et glass Pasteur pipette inn i flammen fra en Bunsen-brenner. Dette fører glasset til å begynne å smelte etter noen sekunder, og skaper en liten krok på than ende. Raskt fjerne fra flammen og la avkjøles i 1 min.

  1. Plasmid Isolation
    1. Forbered plasmider ved anvendelse av standard mini forberedelse kits og oppløses i elueringsbuffer (10 mM Tris-Cl, pH 8,5). Avhengig av plasmid størrelse, bruk 100-500 ng av plasmid for en sekvenserings-stige.
  2. Sanger Sekvense reaksjon
    MERK: Finn under en enkel protokoll som bruker et fluorescensmerket primer sekvenserings-settet med 7-deaza-dGTP som fungerer godt for formålet med primer-forlengelse. Se i sekvense kit manual for detaljert informasjon. Vær oppmerksom på at sekvenseringsreaksjon må bruke den samme primeren som den primer-forlengelsesreaksjonen for å fremstille produkter med samme lengde.
    1. Bland 12 ul av genomisk DNA (~ 10 - 15 pg) med 1 pl DMSO og 1 ul fluorescensmerkede primer (2 pmol / ul).
    2. Til hver 1 pl av de fire sekvenseringsreaksjonsblandinger (A, C, G eller T), tilsett 3 ul av DNA / DMSO / primerblanding. Plassere prøvene i et PCR-maskin, og kjøre følgende PCR-program: 95 ° C i 2 minutter; 35 sykluser av 95 ° C i 20 sek, 54 ° C i 20 sek, 70 ° C i 30 sek; holde ved 4 ° C for alltid.
    3. Etter kjøringen, fjerne prøvene fra maskinen, legg 6 mL av lasting fargestoff og butikken på is (kort sikt) eller ved -20 ° C i flere dager til uker.

4. Gel Setup og Apparatus Run

MERK: Detaljert informasjon om hvordan sekvense gel anordningen er sammenstilt, blir gelen fremstilles, og hvor gelen er drevet kan bli funnet i produsentens protokoll.

  1. Forberedelser
    1. Forbered 10x TBE som angitt i tabell 4.
    2. På dagen for gelen run forberede en liter 1x TBE buffer med ultrarent DDH 2 O.
    3. Forbered 10% (w / v) APS. Merk: Kan lagres i 200 mL alikvoter ved -20 ° C i flere måneder, men aktivitet kan avta over tid <./ Li>
  2. Montering av gel støpekammeret
    1. Unngå støv og lo mellom glassplatene. Derfor grundig rene arbeidsflater som bruker våtservietter.
    2. Rengjøre et par av 25 cm glassplater ved hjelp av engangs papirhåndklær og destillert vann på begge sider og deretter isopropanol til den indre side av glassplatene.
    3. Plasser 0,25 mm avstandsstykker på bakre glassplate og senk tannglassplate på toppen (figur 3).
    4. Fest gel rails til begge sider av glassplatene med hakket og jernbane oppføring piloter vendt oppover og skru knottene lett.

Figur 3
Figur 3. utspilt riss av de gel-elektroforese glassplater. Glassplatene må brukes retnings. Ta vare til ansikt innsiden av glassplatene innover og den ytresiden vender utover.

Figur 4
Se Figur 4. av en sammensatt gel apparatur. Etter injeksjon av gelen løsning, er lommen avstandsstykke plassert i løsningen mellom glassplatene. Støpingen Platen er så gled mellom frontglassplate og gel rails og sikret ved å feste skinne knotter.

  1. Casting gelen
    MERK: non polymerisert akrylamid er nevrotoksisk! Vennligst les sikkerhetsdatablad og bruke med passende vern !!!
    1. Legg forbindelsene som er oppført i tabell 5 i et begerglass og bland ved å bruke en rørestav og en magnetrører.
    2. Umiddelbart etter å ha lagt APS og TEMED, ta opp gel løsning i en 50 ml sprøyte og plassere en 0,45 nm filter på spissen.
    3. Enten hold den øverste kanten av glassplaten med en hånd eller plasser totalah i en gel støpe stå for å lage en skråning vinklet 10 - 20 °.
    4. Sakte dispensere geloppløsning mellom glassplatene mens kontinuerlig bevegelig sprøytetuppen fra den ene siden til den andre og stoppe så snart gelen løsning møter den nedre ende.
    5. Flytte til side eller fjerne helt eventuelle dannet bobler med en boble kroken.
    6. Skyv gel lomme spacer (0,25 mm) mellom glassplatene på hakket, senk ned i gel løsning og fikse ved å feste støpeplate.
    7. Fest øvre skinneskruer lett (Se figur 4 for fullstendig montert apparat).
    8. La gel sett 1 - 2 timer.
    9. Fjern støpeplaten og lomme spacer og rengjør lommen fra salt og gel rester.
    10. Skyll med DDH 2 O og tørk opp overflødig løsning med vev papirer.
  2. Løping og visualisere gelen
    MERK: sekvense gels er direkte utsatt for elektroforese i gel imager, mensfluorescens blir detektert samtidig av en lasermikroskop. I motsetning til konvensjonell gelelektroforese, der gelen er drevet først og deretter farget og visualiseres, blir deteksjonsenheten fast og avsøker båndene i sann tid som de passerer laseren. Under en prosedyre for ImagIR Datainnsamling programvare på OS / 2 er skissert, noe som kan bli vedtatt til nyere versjoner. For mer informasjon, se bruksanvisningen.
    1. Skyv buffertank holderen inn gelen skinner på de fremre glassplater og stram skruene.
    2. Plasser gel inn i den nedre gel tank av automatiserte gel imager mot varmeplaten og fest ved å skyve skinnen oppføring pilot i apparatet parentes.
    3. Fyll 1x TBE buffer inn i de nedre og øvre gelbuffer kamrene, lukk lavere bufferkammer og koble den øvre bufferkammeret til makten ved hjelp av strømledningen.
    4. Hvis den finnes, rengjør gel pocket fra salt-rester ved gjentatte ganger å pipettere buffer i lommen.
    5. Lukk toppbuffertank kammer bruke den øverste buffer lokket.
    6. Lukk maskindøren og slå på imager og datamaskinen og starte Base ImagIR Datainnsamling programvare.
    7. Opprett et nytt prosjekt fil (Fil-> Ny ...), angir et prosjekt filnavn, velg passende laser serier (700 eller 800 nm) og bekreft med OK.
    8. Velg Alternativer> Auto gain ... frå menyen øverst, klikk på Auto for å starte automatisk styrkemåling og jeg aksepterer innstillinger ved å klikke på OK.
    9. Fokusere laseren ved å velge Alternativer> Fokus ... fra skannerkontrollmenyen, klikke på Auto-knappen og akseptere innstillingene ved å klikke på OK.
    10. Gjenta automatisk styrke fremgangsmåte for å justere til den nylig fokusert regionen.
    11. Oppsett skannerkontroll i henhold til disse innstillingene: 2000 V, 35 mA, 45 W, 45 ° C, Scan filter: 3, Skannehastighet: 3.
    12. Prerun den tomme gel i 20 min (velg spenning PÅ og trykk på <Enter> ).
    13. I mellomtiden, oppvarme sekvenserings-stige og primerekstensjonsprodukter i en PCR-maskin i 2 minutter til 90 ° C, deretter avkjølt på is.
    14. Stopp elektroforese, åpner automatiserte gel sequencer og fjerne den øvre buffertank lokket.
    15. Sett hai tann-kam i mellom glassplatene og litt pierce gel med haien tennene (se figur 5).

Figur 5
Figur 5. Nærbilde av gel med hai tann kam. Sample (lilla) er brukt i mellom haitenner.

  1. Pipetter enten 1 - 2 ul av primer-ekstensjonsprodukter eller sekvenseringsreaksjoner stige i hver lomme gel (dannet ved hai tenner).
  2. Hvis ikke alle lommer er nødvendig, fylle tomme lommer med lasting fargestoff for å hindre ikonsekvent kjører atferd.
  3. Lukk buffertanken, og dør av gel sequencer.
  4. Begynn elektroforese og slå på laser (Velg Spenning PÅ og Laser PÅ og trykk <ENTER>).
  5. Stopp elektroforese gang region av interesse har passert laseren.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Som vist i figur 6, kan en primerekstensjonsreaksjon benyttes for å bestemme de transkripsjonelle startpunkter av transkripter av interesse, og kan bidra til å utlede promotorregioner (vanligvis identifisert ved -10 og -35 elementer). Den øverste (lengste) cDNA-fragment representerer den 5 'ende av mRNA og således lett kan kartlegges i forhold til sekvenserings-stige.

Figur 6
Figur 6. Representative resultat av en primerekstensjonsreaksjon. På venstre side en full in vivo primerforlengelse gel fra E. coli med forskjellige plasmider er vist. Individuelle områder av interesse er forstørret. I den øverste del (A), er bestemmelsen av ompA transkripsjonelle startpunktet avbildet. Den revers transkripsjon stopper ved 5 'enden av mRNA og således skaper et bånd av den fulle lengde RNA (indicated med en pil). Ved å justere cDNA band med sekvenseringsstige, kan 5'-enden av mRNA bestemmes som vist på den medfølgende sekvens. I den nedre del (B), er spaltningen av ompA-transkriptet ved YoeB-seq2 RNase vist. Baner 1-3 representerer prøver hvor toksinet YoeB-seq2 mangler eller er inaktive, mens banene 4-5 representerer prøver med en aktiv RNase, samtidig med fravær og nærvær av cDNA-produkter. To hoved spaltningsproduktene er laget som indikert ved pilene. Den ddNTP brukes i hvert kjørefelt og den tilsvarende base av RNA-sekvenserings-stigen er merket. Transkripsjon deler er angitt med blå skrift, promoterelementer og august startkodon av magenta skrift. For mer informasjon; se den opprinnelige forskningsartikkel fra Nolle et al., mikrobiologi 159, 1575-1585 (2013). Klikk her for åse en større versjon av denne figuren.

I eksempelet vist i figur 6, ble den TSP av ompA-mRNA bestemt til å være en G base (markert med en pil i sekvensen nedenfor gelen). Dette er konsistent med ompA TSP publisert før 15.. De -35 og -10 elementer av promoteren kan utledes å være TTGTAA og TAGACT 16 som motivene bare skiller to baser hver fra sine respektive konsensussekvenser (henholdsvis TTGACA og TATAAT).

I motsetning til andre metoder som for eksempel 5'-RACE, primerekstensjonsreaksjoner kan anvendes for å nøyaktig bestemme og kvantifisere spalting av RNA-molekyler. Spalting av RNA-molekyler skaper frie ender 5 ', som kan bli detektert samtidig som cDNA-båndene i gelen. Identifisering av flere spaltnings-produkter av en mRNA er mer vanskelig i 5 'RACE-eksperimenter, siden flere PCR-produkter må bli sekvensert for å oppnå spaltningsproduktenesom bare representerer en liten fraksjon av det totale (ubehandlet) RNA bulk.

I den nedre delen av figur 6, blir RNA kartlegging av spalting av en RNase avbildet. 5 Som tidligere beskrevet, den RNase-YoeB seq2, en del av en TA-systemet fra S. equorum 17, spalter mRNA nær startkodonet. Denne spaltning kan inhiberes ved anti-toksin kognat YefM-seq2. Når RNase YoeB ikke er tilstede eller inaktiv (søyle 1 - 3), er ingen primer ekstensjonsprodukter dannet nær startkodonet. Når RNase-aktivitet er tilstede (søyle 4 og 5), to sterke bånd kort tid nedstrøms fra startkodonet til syne. Ved å bruke denne tilnærmingen, kan cleavage mønstre lett identifiseres.

Figur 7 viser en mislykket primereksten eksperiment. På grunn av overskudd av RNA i revers transkripsjonsreaksjon, skaper den genererte mengden av cDNA som for et sterkt signal, at individuelle cDNA båndets kan ikke skjelnes. Dette gjør 5 'RNA slutten besluttsomhet umulig.

Ved bruk av høyt uttrykte RNA i primer-forlengelsesreaksjon, for eksempel en ribosomal RNA (som vist i figur 7), er risikoen for over-eksponerte områder øker. Derfor må mengden av totalt RNA templat bli justert til overflod av RNA av interesse. I motsetning til dette, når transkripter av interesse utgjør bare en liten mengde av den totale RNA, mengden i den motsatte transkripsjonsreaksjon må økes, ellers signalene blir for svak (ikke vist). Dette gjelder også for Sanger-sekvenseringsreaksjon, som multikopi maler per celle (slik som rRNA-gener eller gener som er kodet på plasmider) resultere i mye sterkere signaler.

Figur 7
Figur 7. Representant resultat av en mislykket primerforlengelse fra ng> S. aureus 16S RNA. er svært rik på bakterieceller. Dette fører til sterke reverse transkripsjonssignaler når moderate mengder Totalt RNA blir benyttet. I tilfellet avbildet her, de sterke cDNA-båndene maskere den nøyaktige 5'-enden og derfor hindre 5'-kartlegging. I tillegg, ribosomale RNA er sterkt strukturert, og derfor kan terminere revers transkripsjon for tidlig, å produsere korte cDNA-produkter som ikke representerer full lengde fragmenter. I dette tilfellet øker revers transkripsjon temperatur, sammen med et varmebestandig revers transkriptase kan gjøre det lettere å syntetisere siste sekundære strukturer. På grunn av flere kopier av sekvensen i det genomiske DNA, er den Sanger-sekvenserings-stige sterkere enn for enkeltkopigener. For å forbedre den gel-bilde, RNA og DNA-mengder for revers transkripsjon og Sanger reaksjonen bør bli redusert og / eller mindre produkt påført på gelen._upload / 52134 / 52134fig7large.jpg "target =" _ blank "> Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Tabell 1: DNase I-fordøyelse av RNA.

Stoff Beløp
RNA fra trinnet over 70-100 mikrogram
10x DNase I-buffer (100 mM Tris, pH 7,5, 25 mM MgCl2, 5 mM CaCl2) 50 ul
DNase, RNase gratis (2 U / mL) 10,0 ul (opp til 10 ug RNA pr 1 pl av DNase I)
Ta med volum opp til 500 mL med DDH 2 O (DEPC behandlet)

Reaksjonsvolum og mengden av DNase I som kan skaleres opp eller ned, avhengig av mengden of RNA brukt.

Tabell 2: RNA-primer-hybridisering.

Compound Beløp for en reaksjon
RNA 5-15 mikrogram
Fluoresceinmerket primer 2 pmol
Ta med volum på 6 ul med DDH 2 O (DEPC behandlet)

Sett opp en reaksjon per RNA prøve og primer.

Tabell 3: Primer forlengelse mester mix.

Compound Beløp for en reaksjon
DDH 2 O (DEPC behandlet) 1,3 mL
AMV RT Buffer (10x) 1.0pl
dNTPs (10 mm, RNase free) 1,0 mL
RNase inhibitor 0,2 mL
AMV revers transkriptase (RT) (20 - 25 U / mL) 0,5 pl

Skalere opp til antall reaksjoner som trengs.

Tabell 4: 10 x TBE oppskrift.

Stoff Beløp
Tris Base 107,8 g
Borsyre 55,0 g
EDTA 7,4 g
Ta med volum opp til 1000 ml med ultrarent DDH 2 O og filter for å fjerne støv og lo

Filter for å fjerne støv og lo og oppbevar ved 4 °C.

Tabell 5: Sekvense gel oppskrift.

Compound Beløp
Urea 10,5 g
DDH 2 O (MilliQ) 13,0 ml
10x TBE 2,5 ml
XL Rapid gel løsning 5,0 ml
TEMED (N, N, N ', N'-Tetramethylethane-1,2-diamin) 25 pl
APS (Ammonium persulfat, 10%) 175 mL

Prosess geloppløsning raskt etter tilsetning av TEMED og APS.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Fluorescerende primer-ekstensjon er en enkel og hurtig metode for å bestemme den 5 'ende av RNA, enten for TSP- eller sekundær RNA-prosessering identifikasjon. På grunn av bruken av fluorescerende primere, kan reaksjonene bli satt opp og kjøre uten ytterligere sikkerhetsforholdsreglene (i motsetning til i tilfellet med radioaktivt merkede primere). Som prøvene blir detektert ved fluorescens, kan de bli avbildet mens elektroforese pågår som tillater rask analyse i forhold til radioaktive metoder hvor røntgenfilmer blir vanligvis brukes.

Generelt, er kvaliteten av primerekstensjonsreaksjon sterkt avhengig av karakteren og egenskapene til binde primer. Hvis bindingssetet er valgt for nær området av interesse, kan primer utstryk maskere signal, mens et bindingssete for langt unna (> 300 bp) fra 5'-enden, kan resultere i et dårlig signal.

Det fluorescerende fargestoffet må være kovalent bundet til5'-enden av den tilpassede DNA-oligonukleotid under syntesen, og oligonukleotidet skal renses ved hjelp av HPLC for å unngå interferens med den reverstranskripsjonsreaksjon ved å gjenværende salter. Oligonukleotidene med passende fargestoff justering (se reagenser liste tabell for mer informasjon om kompatible fargestoffer) kan bestilles fra de fleste oligonukleotidsyntese selskaper og bør oppbevares mørkt. Dessverre, er vi ikke klar over noen enzymatiske teknikker for å feste fargestoffet til tidligere eksisterende oligonukleotider, som er mulig med radiomerkede nukleotider.

I sekvenseringssystem som er beskrevet her, kan to forskjellige fluorescerende fargestoffer kan brukes for samtidig å detektere to prøver, som deres eksitering (omtrent 700 og 800 nm), og emisjonsspektra er distinkte. Bortsett fra den opprinnelige produsenten fargestoffer, kan også andre fargestoffer som er angitt i listen reagenser kan brukes til å produsere gode resultater.

En annen viktig faktor for prIMER Ekstensjonsreaksjonene er RNA kvalitet og mengde. Forsiktighet bør utvises for å fjerne DNA forurensninger, som revers transskriptaser som AMV RT kan bruke DNA som en mal 18.

Som vist i figur 7, er signalstyrken av båndene i gelen løp detektert avhengig RNA-mengde som benyttes i den motsatte transkripsjonsreaksjon. Det er derfor viktig å justere mengden av totalt RNA, avhengig av den forholdsmessige mengde av RNA av interesse tilstede i prøven. Den lave følsomheten for denne fremgangsmåte er også en av sine ulemper, så lave uttrykt RNA kan være vanskelig å påvise. Hvis det ikke kan påvises noen signaler i det hele tatt, kan mengden av total RNA økes eller RNA av interesse kan være kunstig overexpressed fra et plasmid.

Gel følsomhet for fluorescens basert primer extension handler om faktor ti lavere enn 32 P eller 33 P radioisotop basert primer extension 19. Imidlertid kan denne ulempe kompenseres ved å justere mengden av cDNA lastet på gelen, eller ved å øke mengden av RNA-templat anvendes i revers transkripsjonsreaksjon. I de fleste tilfeller er tilstrekkelig høy følsomhet for tilfredsstillende resultater 4,5. Sensitiviteter ligner på radioaktive primer utvidelser har blitt rapportert ved bruk av fluorescerende primere i kombinasjon med en kapillær sequencer 3, med fordelen av korte eksponeringstider.

Kostnader sammenligninger mellom fluorescens og radioaktivitet basert primer utvidelser er vanskelig, ettersom de er avhengig av flere faktorer som for eksempel tilgjengelige maskiner, grunning, stige reaksjoner, tilgjengelighet og vedlikehold av et laboratorium for arbeid med radioaktive stoffer, deponering av radioaktivt avfall, opplæring og individuelle helserisiko . Fluorescent primere er omtrent fem til ti ganger dyrere enn ikke-merkede standard primere (20 bp). Men disse primere kan anvendes for i det minsteet år (mer sannsynlig flere år) sammenlignet med 32 P merkede primere, som har en mye kortere halveringstid. Re-merking av primere er tidkrevende og kostbart, på grunn av behovet for ny radioaktivt materiale i hyppige intervaller. Hvis det samme settet med primere blir brukt i løpet av en lang tidsperiode, fluorescerende primere er billigere enn vanlige, radioaktivt merkede primere. Den største kostnaden punktet vil imidlertid være den fluorescerende sequencer eller imager og kjøpe dette apparatet kun til det formål primer utvidelser kan ikke være kostnadseffektivt. Metoden som beskrives her er ganske interessant for grupper som er i besittelse av eller har tilgang til en slik maskin.

Hvis en automatisert sekvens gel ikke er tilgjengelig, kan andre metoder for fluorescenspåvisning brukes i tillegg. I dette tilfelle kan gelen bli kjørt i en standard elektroforese apparat, tørket om nødvendig og deretter overført til en fluorescerende imager (modeller er tilgjengelige som er lik en flatbed skannere). Selv om fordelen av å visualisere gelen under kjøringen er tapt, kan anvendelse av radioaktive isotoper unngås på denne måten, en viktig fordel for experimenter. I tillegg, hvis det finnes, et kapillar-sequencer kan anvendes for separasjon og sporing i sanntid, som kan bidra til å øke følsomheten.

Ulike metoder har blitt publisert på hvordan du bruker fluoriserende primer extension med automatisert gel sekvense maskiner eller kapillær sequencere, men disse metodene krever ofte en cDNA nedbør skritt å konsentrere prøven (og fjerne urenheter) 19. I fremgangsmåten som presenteres her, er DNA-utfelling ikke nødvendig og dermed redusere forberedelsestid. Enda viktigere er imidlertid utelate dette trinnet gjør det mulig å semi-kvantitativt bestemme mengden av RNA-molekyler i prøven som stemmer av utfellingen prosedyren kan bli eliminert.

Det bør bemerkes, at selvden 5 'ende av RNA-molekyler kan bli kartlagt i primerekstensjonsreaksjoner, behandlet og primær ender (transkripsjonelle startpunkter) ikke kan være lett skilles fra hverandre. For å omgå disse begrensningene, er viktig nitid planlegging av forsøkene med hensiktsmessige kontroller. Åpenbare promotersekvenser kan indikere nærværet av en transkripsjonsstartpunktet og muterende eller slette promotorelementene bør da avskaffe cDNA-båndene. På den annen side, dersom slike sekvenser mangler eller spesifikke konsensussekvensene er til stede, båndene kan være forårsaket av behandling av RNA. Dersom behandlingen enzym er kjent og kan renses, kan in vitro-primer utvidelser bringe avklaring, som transkripsjon og prosessering kan separeres. I tillegg kan andre metoder såsom 5 'RACE (inkludert enzymatisk anrikning av ubearbeidede RNA-molekyler) utfyller utvidelser for å skille primer-transkripsjonelle start områder fra RNA-prosessering.

The primer extension metoden er ofte sammenlignet med andre metoder som 5 'RACE og S1 nuclease beskyttelse analyser og dermed dens nytte er noen ganger avhørt. RNAseq teknikker i kombinasjon med neste generasjons sekvensering for eksempel kan bidra til å fastslå TSP-ene og områder for behandling av mange av RNA i parallell, men den økonomiske byrden og bioinformatical arbeidet som kreves gjør det heller uøkonomisk for enkelt RNA av interesse. 5'-RACE på den annen side er billigere og resultatene er lettere å analysere, men hvis RNAer er behandlet på flere måter eller flere transkripsjonelle startpunkter er til stede, må produktet bli klonet og en stor mengde kandidater som trenger å bli sekvensert for å oppnå en representativ visning av RNA av interesse.

Derfor, til tross for nye metoder som har oppstått i løpet av årene, selv i dag primer utvidelser har sin raison d'être grunn av brukervennlighet, lave kostnader og kort behandlingstid, noe som er spesielt santfor fluorescens basert metode som presenteres her.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
AMV Reverse Transcriptase (20-25 U/µl) NEB / Roche NEB: M0277-T / Roche: 10109118001
DNase I (RNase free) Ambion (life technologies) AM2222
FastPrep-24 Instrument  MPBio 116004500
Fluorescently labeled primers Biomers n/a 5’ DY-681 modification of “ordinary” DNA oligonucleotides. Compatible dyes such as the LICOR IRDye 700/800 are also available from other suppliers such as IDTdna.
Li-Cor 4200 Sequencer incl. ImagIR Data collection software Li-Cor Product discontinued
NanoDrop 2000 Thermo Scientific
Nuclease free water Ambion (life technologies) AM9915G
Plasmid mini preparation kit QIAGEN 12125
RapidGel-XL-40% Concentrate USB US75863
RNA STORAGE BUFFER Ambion (life technologies) AM7000
Roti-Aqua-P/C/I Carl Roth X985.3 Alternative: “Acid-Phenol:Chloroform, pH 4.5 (with IAA, 125:24:1)” from Ambion (AM9720)
SUPERase•In RNase Inhibitor Ambion (life technologies) AM2696
Thermo Sequenase fluorescently labelled primer cycle sequencing kit with 7-deaza-dGTP GE Healthcare RPN2538
TRIzol reagent life technologies 15596-026
Zirconia/Silica Beads 0.1 mm BioSpec 11079101z

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Simpson, C. G., Brown, J. W. Primer extension assay. Methods Mol. Biol. 49, 249-256 (1995).
  2. Sanger, F., Nicklen, S., Coulson, A. R. DNA sequencing with chain-terminating inhibitors. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 74, 5463-5467 (1977).
  3. Fekete, R. A., Miller, M. J., Chattoraj, D. K. Fluorescently labeled oligonucleotide extension: a rapid and quantitative protocol for primer extension. Biotechniques. 35, 90-94 (2003).
  4. Schuster, C. F., et al. Characterization of a mazEF Toxin-Antitoxin Homologue from Staphylococcus equorum. J. Bacteriol. 195, 115-125 (2013).
  5. Nolle, N., Schuster, C. F., Bertram, R. Two paralogous yefM-yoeB loci from Staphylococcus equorum encode functional toxin-antitoxin systems. Microbiology. 159, 1575-1585 (2013).
  6. Yamaguchi, Y., Park, J. H., Inouye, M. Toxin-antitoxin systems in bacteria and archaea. Annu. Rev. Genet. 45, 61-79 (2011).
  7. Schuster, C. F., Bertram, R. Toxin-antitoxin systems are ubiquitous and versatile modulators of prokaryotic cell fate. FEMS Microbiol. Lett. 340, 73-85 (2013).
  8. Goeders, N., Van Melderen, L. Toxin-antitoxin systems as multilevel interaction systems. Toxins. 6, 304-324 (2014).
  9. Yamaguchi, Y., Inouye, M. mRNA interferases, sequence-specific endoribonucleases from the toxin-antitoxin systems. Progress in molecular biology and translational science. 85, 467-500 (2009).
  10. Park, J. H., Yamaguchi, Y., Inouye, M. Bacillus subtilis MazF-bs (EndoA) is a UACAU-specific mRNA interferase. FEBS Lett. 585, 2526-2532 (2011).
  11. Zhu, L., et al. et al.Staphylococcus aureus MazF specifically cleaves a pentad sequence, UACAU, which is unusually abundant in the mRNA for pathogenic adhesive factor SraP. J. Bacteriol. 191, 3248-3255 (2009).
  12. Zhu, L., et al. The mRNA interferases, MazF-mt3 and MazF-mt7 from Mycobacterium tuberculosis target unique pentad sequences in single-stranded RNA. Mol. Microbiol. 69, 559-569 (2008).
  13. Fu, Z., Donegan, N. P., Memmi, G., Cheung, A. L. Characterization of MazFSa, an endoribonuclease from Staphylococcus aureus. J. Bacteriol. 189, 8871-8879 (2007).
  14. Marmur, J. A procedure for the isolation of deoxyribonucleic acid from micro-organisms. J. Mol. Biol. 3, 208-218 (1961).
  15. Emory, S. A., Belasco, J. G. The ompA 5' untranslated RNA segment functions in Escherichia coli as a growth-rate-regulated mRNA stabilizer whose activity is unrelated to translational efficiency. J. Bacteriol. 172, 4472-4481 (1990).
  16. Cole, S. T., Bremer, E., Hindennach, I., Henning, U. Characterisation of the promoters for the ompA gene which encodes a major outer membrane protein of Escherichia coli. Mol. Gen. Genet. 188, 472-479 (1982).
  17. Schleifer, K. H., Kilpper-Bälz, R., Devriese, L. Staphylococcus arlettae sp. nov., S. equorum sp. nov. and S. kloosii sp. nov.: Three New Coagulase-Negative, Novobiocin-Resistant Species from Animals. Syst. Appl. Microbiol. 5, 501-509 Forthcoming.
  18. Yu, H., Goodman, M. F. Comparison of HIV-1 and avian myeloblastosis virus reverse transcriptase fidelity on RNA and DNA templates. J. Biol. Chem. 267, 10888-10896 (1992).
  19. Ying, B. W., Fourmy, D., Yoshizawa, S. Substitution of the use of radioactivity by fluorescence for biochemical studies of RNA. RNA. 13, 2042-2050 (2007).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Video Stats