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में microtubule गतिशीलता उपाय plusTipTracker सॉफ्टवेयर का उपयोग

Biology

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Summary

MATLAB आधारित, खुला स्रोत सॉफ्टवेयर पैकेज, plusTipTracker, microtubule गतिशीलता यों fluorescently लेबल + सुझावों की छवि श्रृंखला का विश्लेषण करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है.

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Stout, A., D'Amico, S., Enzenbacher, T., Ebbert, P., Lowery, L. A. Using plusTipTracker Software to Measure Microtubule Dynamics in Xenopus laevis Growth Cones. J. Vis. Exp. (91), e52138, doi:10.3791/52138 (2014).

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Abstract

Microtubule (मीट्रिक टन) से अधिक अंत ट्रैकिंग प्रोटीन (टिप्स) लाख टन की बढ़ती प्लस छोर तक स्थानीय बनाना और मीट्रिक टन गतिशीलता 1,2 विनियमित. मीट्रिक टन गतिशीलता का विश्लेषण करने के लिए सबसे अच्छी तरह से जाना जाता है और + व्यापक रूप से उपयोग किया सुझावों में से एक सब से बढ़ मीट्रिक टन से अधिक छोर बांध जो अंत बाध्यकारी प्रोटीन, EB1, है, और इस प्रकार, मीट्रिक टन polymerization 1 के लिए एक मार्कर है. विकास शंकु के भीतर EB1 व्यवहार के कई अध्ययनों से व्यक्तिगत लाख टन 1-3 विश्लेषण करने के लिए समय लेने वाली और पक्षपाती कंप्यूटर की मदद से, हाथ से ट्रैकिंग तरीकों का इस्तेमाल किया है. हमारा दृष्टिकोण उच्च संकल्प, सुसंस्कृत भ्रूण विकास शंकु 5 में चिह्नित EB1 का जीना छवियों के अधिग्रहण के बाद सॉफ्टवेयर पैकेज, plusTipTracker 4 का उपयोग मीट्रिक टन गतिशीलता के वैश्विक मानकों, जिसका अंदाजा है. इस सॉफ्टवेयर fluorescently लेबल + सुझावों की फिल्मों के लिए स्वचालित पहचान, ट्रैकिंग, दृश्य, और विश्लेषण को जोड़ती है कि एक MATLAB आधारित, खुला स्रोत, उपयोगकर्ता के अनुकूल पैकेज है. यहाँ, हम plusTipT प्रयोग करने के लिए प्रोटोकॉल पेशसुसंस्कृत Xenopus laevis विकास शंकु में fluorescently लेबल + टिप धूमकेतु के विश्लेषण के लिए racker. हालांकि, इस सॉफ्टवेयर को भी विभिन्न प्रकार की कोशिकाओं 6-8 में मीट्रिक टन गतिशीलता चिह्नित करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है.

Introduction

इस पद्धति का लक्ष्य मात्रात्मक microtubule (एमटी) के बारे में जानकारी के साथ साथ अंत ट्रैकिंग प्रोटीन (टिप) विकास शंकु रहने में गतिशीलता प्राप्त करने के लिए है. मीट्रिक टन + युक्तियाँ लाख टन 9,10 के प्लस छोर तक स्थानीयकरण कि प्रोटीन का एक समूह है. वे polymerization, तबाही, और बचाव की दरों सहित मीट्रिक टन गतिशील अस्थिरता 11, के मापदंडों को विनियमित करने के लिए कार्यों की एक श्रृंखला प्रदर्शन करते हैं. मीट्रिक टन गतिशीलता का विश्लेषण करने के लिए एक अच्छी तरह से इस्तेमाल किया विधि से बढ़ मीट्रिक टन करने के लिए विशेष रूप से बांध प्लस समाप्त होता 1,12 जो + टिप EB1 के व्यवहार को ट्रैक करने के लिए है. EB1 बढ़ रही मीट्रिक टन करने के लिए कई अन्य प्रोटीनों की भर्ती के लिए जाना जाता प्लस समाप्त होता मीट्रिक टन वृद्धि और तबाही आवृत्ति 15,16 दोनों को बढ़ावा देने, 13,14, और हाल ही में एक लाख टन परिपक्वता कारक 15 के रूप में स्थापित किया गया है.

विकास शंकु के भीतर मीट्रिक टन गतिशीलता के कई अध्ययनों EB1 localizati के रूप में, समय 1-3 से अधिक EB1-GFP गतिशीलता में परिवर्तन को मापने के लिए हाथ से ट्रैकिंग विधियों का उपयोग किया हैमीट्रिक टन करने पर अधिक सिरों मीट्रिक टन polymerization के लिए एक मार्कर के रूप में इस्तेमाल किया जा सकता है. मीट्रिक टन के विकास के लिए एक प्रॉक्सी के रूप में EB1-GFP धूमकेतु की जांच के लिए एक प्रमुख लाभ मीट्रिक टन गतिशीलता भी महत्वपूर्ण मीट्रिक टन ओवरलैप के क्षेत्रों में मापा जा सकता है. हाथ ट्रैकिंग EB1-GFP धूमकेतु की विधि मीट्रिक टन में उपयोगी अंतर्दृष्टि प्रदान की गई है जबकि यह समय लेने वाली है और पक्षपाती किया जा सकता है, 1-3 व्यवहार. महत्वपूर्ण जानकारी याद कर सकते हैं इसके अतिरिक्त, न्यायपालिका विकास के रूप में कोन व्यवहार संभावना (हाथ से ट्रैकिंग जब आम तौर पर आवश्यक) लाख टन की ही एक छोटे सबसेट विश्लेषण cytoskeletal गतिशीलता में मिनट बदलाव का परिणाम हैं.

इस प्रकार, हम उच्च संकल्प, सुसंस्कृत भ्रूण विकास शंकु 5 में चिह्नित EB1 का जीना छवियों के अधिग्रहण के बाद, सॉफ्टवेयर पैकेज, plusTipTracker 4 का उपयोग वैश्विक मीट्रिक टन गतिशीलता मापदंडों को मापने. Danuser लैब में विकसित इस सॉफ्टवेयर, विभिन्न प्रकार की कोशिकाओं 6-8 में मीट्रिक टन गतिशीलता निस्र्पक कई अध्ययनों में इस्तेमाल किया गया है. यह हमें एक खुला स्रोत हैएर के अनुकूल है, fluorescently लेबल + सुझावों की फिल्मों के लिए स्वचालित पहचान, ट्रैकिंग, दृश्य, और विश्लेषण भी शामिल है कि MATLAB आधारित पैकेज. मीट्रिक टन गतिशीलता के विशिष्ट मापदंडों इस सॉफ्टवेयर से गणना कर रहे हैं की एक लंबी सूची (विवरण के लिए संदर्भ 4 देखें), लेकिन विकास शंकु में मीट्रिक टन गतिशीलता के विश्लेषण के लिए, सबसे उपयोगी मानकों (माइक्रोन / मिनट में) मीट्रिक टन की वृद्धि ट्रैक वेग हैं, विकास ट्रैक (सेकंड में) जीवनकाल, और (माइक्रोन में) वृद्धि ट्रैक की लंबाई. सॉफ्टवेयर ("सॉफ्टवेयर" के तहत) Danuser लैब वेबसाइट से सीधे डाउनलोड किया जा सकता है. Danuser लैब वर्तमान में मूल, खड़े अकेले सॉफ्टवेयर उपलब्ध रहेगा एक सॉफ्टवेयर पैकेज बुलाया U-ट्रैक 2.0, में शामिल किया है जो + टिप ट्रैकिंग विश्लेषण, के लिए एक नया इंटरफेस का समर्थन करता है. दो कार्यक्रमों के बीच अंतर्निहित एल्गोरिदम इंटरफेस और विश्लेषण outputs के केवल एक अंतर के साथ, (कम से कम 2014 के रूप में) एक ही हैं. थोड़ा MATLAB और / या कम्प्यूटेशनल विश्लेषण अनुभव के साथ नौसिखिए उपयोगकर्ता के लिएखिलाडि़यों, plusTipTracker स्वचालित सांख्यिकीय पैरामीटर outputs सहित अधिक उपयोगकर्ता के अनुकूल सुविधाओं, है.

यहाँ, हम सुसंस्कृत Xenopus laevis विकास शंकु में EB1-GFP गतिशीलता की छवियों का विश्लेषण करने के लिए कदम का वर्णन. इस प्रोटोकॉल मीट्रिक टन गतिशीलता 17 की जांच हाल ही में एक समाचार पत्र में उपयोग किया गया था. भी Lowery एट अल देखें. 2012 5 EB1-GFP व्यक्त संवर्धन विकास शंकु के संबंध में विस्तृत निर्देश के लिए. इस पत्र में मुख्य रूप से विकास शंकु में EB1-GFP गतिशीलता की जांच पर ध्यान केंद्रित किया है, जबकि एक ही प्रोटोकॉल अन्य प्रकार की कोशिकाओं 17 के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. सभी प्रकार की कोशिकाओं के लिए, फ्रेम के बीच समय अंतराल इष्टतम + टिप ट्रैकिंग के लिए 0.5-2 सेकंड के बीच होना चाहिए. फ्रेम के बीच अप करने के लिए 4 सेकंड के एक समय अंतराल संभव है, लेकिन यह अतिरिक्त ट्रैकिंग त्रुटियों में अंतराल समय परिणामों में वृद्धि हुई.

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Protocol

इस प्रोटोकॉल और वीडियो और अधिक विस्तार 4 में सॉफ्टवेयर पैकेज का वर्णन मूल कागज के एक साथी है, साथ ही Danuser लैब वेबसाइट पर सॉफ्टवेयर डाउनलोड के साथ आता है कि तकनीकी रिपोर्ट के रूप में सेवा के लिए होती हैं. पाठकों सॉफ्टवेयर का उपयोग कर के बारे में अतिरिक्त प्रश्न हैं अगर ध्यान से इन दस्तावेजों की समीक्षा करने के लिए प्रोत्साहित किया जाता है.

1 पहले छवि विश्लेषण करने के लिए

  1. झगड़ा (टैग्ड इमेज फ़ाइल फ़ॉर्मेट) छवि फ़ाइलों के एक दृश्य में हर बार चूक फिल्म में कनवर्ट करें. कई विकास शंकु / कोशिकाओं एक दिया फिल्म में कर रहे हैं, पहली फसल प्रत्येक विकास शंकु / सेल की अपनी छवि अनुक्रम बनाने के लिए.
    नोट: यह आवश्यक नहीं है, निजी क्षेत्रों के हित (आरओआई) plusTipTracker के भीतर चयनित किया जा सकता है. हालांकि, छोटे छवि आयामों का उपयोग कम्प्यूटेशनल प्रसंस्करण की गति बढ़ जाती है, तो छवि में महत्वपूर्ण खाली जगह नहीं है अगर इस कदम की सिफारिश की है.
  2. अपनी ही में एक झगड़ा श्रृंखला सहेजेंMATLAB का उपयोग करने के लिए सेट कर दिया जाता है कि एक पथ के भीतर "छवियों" नामक फ़ोल्डर ("छवियों" मामले के प्रति संवेदनशील है कि ध्यान दें). "वर्तमान फ़ोल्डर" खिड़की में प्रासंगिक फाइल निर्देशिका के लिए, एक नया मार्ग को जोड़ने से नेविगेट करने के लिए, निर्देशिका आइकन पर राइट क्लिक करें, और "पथ को जोड़ें - चयनित फ़ोल्डर और उप फ़ोल्डर" का चयन करें. यह plusTipTracker सॉफ्टवेयर फ़ोल्डर के रूप में अच्छी तरह से, पथ में जोड़ा जाना जरूरी है.

2 plusTipGetTracks

नोट: छवि विश्लेषण में पहला कदम है, EB1-GFP धूमकेतु का पता लगाने पटरियों में धूमकेतु लिंक, और microtubule गतिशीलता के मापदंडों का निर्धारण करने के लिए है. यह आदेश "plusTipGetTracks" 4 के साथ प्राप्त की है.

  1. विश्लेषण, खुला MATLAB आवेदन शुरू और कमांड विंडो में "plusTipGetTracks" टाइप करें. यह एक नया संवाद बॉक्स प्रदर्शित करने के लिए कारण होगा.
  2. "नए प्रोजेक्ट्स सेट" पर क्लिक करें और एक (या mor चयनई) उपयुक्त "छवियों" फ़ोल्डर (या "छवियों" फ़ोल्डरों) युक्त निर्देशिका का चयन करके पिछले झगड़ा छवि श्रृंखला की. इस चरण के पूरा होने पर, एक फाइल निर्देशिका (roi_1) ("छवियों" रखती है कि एक ही फ़ोल्डर में) बनाया जाएगा भविष्य डेटा फ़ाइलों में होगा. नोट: "सेट अप नई परियोजनाओं" कदम एक अलग सत्र के दौरान, समय के आगे पूरा किया जा सकता है.
  3. "अंतिम बिंदु पर राइट क्लिक करें, एक बहुभुज का चयन करें, और 'मुखौटा बनाने' पर क्लिक करें": एक नया विंडो दिखाई देगा. "ठीक है" पर क्लिक करें. चयनित छवि श्रृंखला के पहले छवि फिर प्रदर्शित किया जाएगा. क्लिक करें और विकास शंकु की संपूर्णता शामिल एक बहुभुज बनाने के लिए माउस का प्रयोग करें. डबल बहुभुज बंद करने के लिए माउस क्लिक करें.
  4. बहुभुज बंद कर दिया गया है एक बार, एक संवाद बॉक्स दिखाई देगा: "आप एक और आरओआई का चयन करना चाहते हैं?" छवि, "हाँ" का चयन का विश्लेषण करने के लिए एक और वृद्धि कोन है; अन्यथा हैचुनाव "नहीं".
  5. तुरंत विश्लेषण किया जाएगा कि परियोजनाओं का चयन करें. "परियोजनाओं का चयन" पर क्लिक करें और विश्लेषण करने के लिए फ़ोल्डर (roi_X) का चयन करें.
  6. एक listSelectGUI स्क्रीन दिखाई देगा. स्क्रीन के बाईं ओर से परियोजना (ओं) का चयन करें और स्क्रीन के दाईं ओर करने के लिए उन पर चलते हैं. "ठीक है" पर क्लिक करें. परियोजना सूची को बचाने और "सहेजें" पर क्लिक करने के लिए एक स्थान चुनें.
  7. "पहचान", "ट्रैकिंग", और "बाद के प्रसंस्करण" का चयन करें. इन सेलेक्शन लाए जाने के बाद, संवाद बॉक्स के दाईं ओर विन्यास बन जाएगा. प्रत्येक विकल्प विन्यस्त करें.
    1. इन मानकों मीट्रिक टन पटरियों में पता चला धूमकेतु लिंक करने के लिए उपयोग किया जाता है. ट्रैकिंग के लिए इन नियंत्रण के मानकों को चुनने के लिए विवरण पृष्ठों सॉफ्टवेयर पैकेज डाउनलोड के साथ जुडा हुआ है जो तकनीकी रिपोर्ट पीडीएफ के 9-10 पर शामिल किए गए हैं; समस्याओं का सामना कर रहे हैं ध्यान से अगर इस रिपोर्ट को पढ़ा. Xenop में EB1-GFP धूमकेतु पर नज़र रखने के प्रयोजनों के लिएहमें विकास शंकु, उपयोग laevis निम्नलिखित ट्रैकिंग सेटिंग: खोज त्रिज्या रेंज (पिक्सल) 5-12, न्यूनतम उप ट्रैक की लंबाई (फ्रेम) 3; अधिकतम अंतर लंबाई (फ्रेम) 8; अधिकतम संकोचन फैक्टर 0.8, अधिकतम कोण फॉरवर्ड 50, अधिकतम कोण पिछड़े 10, अस्थिरता त्रिज्या 2.5. इन सेटिंग्स चित्र 1 में दिखाया जाता है.

    नोट: अधिकतम संकोचन फैक्टर 'पिछड़े अंतराल "के रूप में, पता चला" पिछड़े अंतराल "की संख्या को कम करने के लिए सेट कर दिया जाता ट्रैक संबंधों में भीड़ की स्थिति और संभावना त्रुटियों को देखते हुए विकास शंकु के संदर्भ में विश्लेषण करने के लिए उपयोगी नहीं हैं. विकास शंकु लाख टन वृद्धि और shrinkages के अलावा छोटे अक्सर अनुवादन प्रदर्शन, और इन पर नियंत्रण सेटिंग्स बढ़ती उठाना चरण के दौरान इस वृद्धि की आवाजाही के लिए अनुमति देता है के रूप में इसके साथ ही, दोनों मैक्स फॉरवर्ड कोण के साथ ही अस्थिरता त्रिज्या, अपेक्षाकृत उच्च सेट कर रहे हैं.
    1. वांछित विशिष्ट छवि अधिग्रहण सेटिंग के आधार पर पोस्ट प्रसंस्करण सेटिंग्स में भरें.
    </ ली>
  8. सेटिंग विन्यस्त किया गया है एक बार, "प्रारंभ" पर क्लिक करें. सॉफ्टवेयर चयनित किया गया है, जो भी सेटिंग चलेंगे. यह चयनित परियोजनाओं और उनके आकार की संख्या पर निर्भर करता है, घंटे के लिए मिनट लग सकते हैं. कमान विंडो प्रत्येक समारोह के लिए अनुमानित समय शेष प्रदर्शित करता है. PlusTipGetTracks कदम पूरा हो गया है, कमांड विंडो "तैयार!" प्रदर्शित करेगा
    नोट: माइक्रोन में (मीट्रिक टन गतिशीलता के विशिष्ट मापदंडों अब इस सॉफ्टवेयर द्वारा गणना की गई है की एक लंबी सूची (विवरण के लिए संदर्भ 4 देखें), लेकिन विकास शंकु में मीट्रिक टन गतिशीलता के विश्लेषण के लिए, की जांच करने के लिए सबसे उपयोगी मापदंडों मीट्रिक टन की वृद्धि ट्रैक वेग हैं / मिनट), सेकंड में वृद्धि ट्रैक जीवनकाल (), और माइक्रोन में वृद्धि ट्रैक की लंबाई ().

3 plusTipSeeTracks

नोट: अब microtubule पटरियों परिभाषित किया गया है कि, "समारोह plustipSeeTracks" ट्रैक दृश्य 4 के लिए प्रयोग किया जाता है. इस समारोहस्थानिक मीट्रिक टन गतिशीलता नक्शे और गति फिल्मों सहित दृश्य के लिए कई outputs, प्रदान करते हैं, लेकिन यहां फोकस विकास शंकु छवियों पर आरोपित मीट्रिक टन पटरियों प्रदर्शित करने के लिए "ट्रैक सिनेमा" के प्रयोग पर पूरी तरह से कर सकते हैं. PlusTipGetTracks एक समय में कई फिल्मों का विश्लेषण कर सकते हैं, plusTipSeeTracks केवल एक समय में एक फिल्म का विश्लेषण कर सकते हैं.

  1. कमांड विंडो में "plusTipSeeTracks" टाइप करें.
  2. संवाद बॉक्स भार के बाद, "चयन परियोजना" पर क्लिक करें. कल्पना और "फ़ोल्डर चुनें" पर क्लिक करने के लिए परियोजना युक्त मूल निर्देशिका का चयन करें. एक नई विंडो दिखाई देगा: "आप कल्पना करना चाहते परियोजना का चयन करें". कल्पना और "ठीक है" पर क्लिक करने के लिए फ़ाइल चुनें.
  3. अगला, "चयन सहेजा आरओआई" पर क्लिक करें. पिछले चरण में चयनित एक के रूप में एक ही roi_X फ़ोल्डर में नेविगेट और "roiYX" नामक फ़ाइल का चयन करें.
  4. डब्ल्यू नामित करने के लिए "आउटपुट निर्देशिका का चयन करें" पर क्लिक करेंयहाँ MATLAB ट्रैक दृश्य फ़ाइलों की बचत होगी. नोट: हम डेटा के बाकी है जिसमें एक ही फ़ोल्डर का उपयोग करना चाहिये.
  5. चुनें "ट्रैक मूवी बनाएं" और एक स्क्रीन + टिप धूमकेतु से गणना की पटरियों plusTipGetTracks के सभी प्रदर्शित दिखाई देगा. यह कदम फ़ाइल "allTracks_X_X_X" में, एक फिल्म प्रारूप में ट्रैक समय श्रृंखला बचाता है. एक AVI के रूप में फिल्म को बचाने के लिए एक विकल्प अन्यथा डिफ़ॉल्ट स्वरूप एक Quicktime.mov फ़ाइल के रूप में है, वहाँ है.

4 plusTipGroupAnalysis

नोट: इस अंतिम समारोह विश्लेषण और उनके मीट्रिक टन ट्रैक मापदंडों की तुलना के लिए फिल्मों का समूह बनाने के लिए प्रयोग किया जाता है.

  1. कमांड विंडो में "plusTipGroupAnalysis" टाइप करें. मैन्युअल तुलना करने के लिए समूहों का चयन करने के लिए, पहले "पदानुक्रम से ऑटो समूह" de-चयन करें. फिर, "परियोजनाओं का चयन करें" पर क्लिक करें. सभी roi_X फ़ोल्डरों वाले माता पिता निर्देशिका में संचरण करेंविश्लेषण करने के लिए.
  2. एक listSelectGUI स्क्रीन दिखाई देगा. स्क्रीन के बाईं ओर से समूह में शामिल हैं और स्क्रीन के दाईं ओर करने के लिए उन पर स्थानांतरित करने के लिए परियोजनाओं का चयन करें. "ठीक है" पर क्लिक करें. परियोजना सूची को बचाने और "सहेजें" पर क्लिक करने के लिए एक स्थान चुनें.
  3. एक विंडो दिखाई देगा: "सूची से पहले समूह का चयन करें". "ठीक है" पर क्लिक करें. listSelectGUI खिड़की फिर से प्रदर्शित होगी. इस बार एक साथ जमा किया जाना चाहिए कि पहले समूह के अनुरूप है कि केवल उन फ़ाइलों का चयन करें. "ठीक है" पर क्लिक करें.
  4. फिर, समूह का नाम दर्ज करें, और "ठीक" पर क्लिक करें. तदनुसार उत्तर और समूहों का चयन जारी रखने के "एक और समूह का चयन करें?": एक विंडो दिखाई देगा. एक विंडो दिखाई देगा: "अपने सूची को बचाने के लिए एक स्थान का चयन करें". स्थान पर जाएँ और "सहेजें" पर क्लिक करें.
  5. उत्पादन फ़ोल्डरों होगा जहां चयन करने के लिए "का चयन करें आउटपुट निर्देशिका" पर क्लिक करेंसंग्रहीत.
  6. संचालन करने के लिए समूह विश्लेषण किस प्रकार का चयन करें - मीट्रिक टन पटरियों प्रदर्शन किया जाना चाहिए प्रत्येक समूह के लिए या सेल विश्लेषण के अनुसार जमा किया जाना चाहिए. सिफारिश सांख्यिकीय परीक्षण पहले ही नामित कर रहे हैं. विश्लेषण में पटरियों के सभी शामिल करने के लिए de-चयन "फिल्म की शुरुआत / अंत में पटरियों निकालें". अन्यथा, चयनित इस बॉक्स वाले फिल्म शुरू होता है या समाप्त हो जाती है के रूप में की प्रक्रिया में हैं कि किसी भी मीट्रिक टन वृद्धि पटरियों हटा.
  7. समूह विश्लेषण चयन किया जाता है के बाद, "समूह की तुलना करें" का चयन करें.

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Representative Results

यहाँ वर्णित जीवित कोशिकाओं में + टिप गतिशीलता यों कि जानकारी की कई फाइलें प्रदान करेगा के रूप में इस सॉफ्टवेयर का उपयोग करना.

समारोह plusTipGetTracks (चित्र 1 में दिखाया उदाहरण सेटिंग्स का उपयोग) पटरियों की पहचान है, और फिर + टिप पटरियों के बारे में मापदंडों प्रदान करता है. सॉफ्टवेयर प्राप्त किया है कि जानकारी देखने के लिए, कदम 2.2 में बनाया गया था कि roi_X निर्देशिका में चलते हैं. "करतब" फ़ोल्डर का पता चला धूमकेतु दिखा छवियों की एक श्रृंखला है, जो "overlayImages" शामिल हैं. धूमकेतु का पता लगाने की सटीकता का प्रदर्शन कर सकते हैं छवि विश्लेषण सॉफ्टवेयर का उपयोग कर इन छवियों की जांच करना. "मेटा" फोल्डर भी विस्तृत "projData" फाइल सहित + टिप धूमकेतु आँकड़ों के बारे में जानकारी, साथ ही "आँकड़े" फ़ाइल है. "आँकड़े" फाइल देखने के लिए, एक स्प्रेडशीट आवेदन का एक खुला वर्कशीट में खींचें. इस फ़ाइल की गणना में शामिलप्रत्येक फिल्म (चित्रा 2) के लिए डी microtubule मापदंडों. ऊपर बताया गया है, मीट्रिक टन गतिशीलता के विशिष्ट मानकों की एक लंबी सूची मीट्रिक टन की वृद्धि ट्रैक वेग (माइक्रोन में / मिनट), (सेकंड में) वृद्धि ट्रैक जीवनकाल, और विकास ट्रैक की लंबाई सहित (विवरण के लिए संदर्भ 4 देखें) इस सॉफ्टवेयर से गणना कर रहे हैं (माइक्रोन में).

समारोह plusTipSeeTracks फ़ाइल "allTracks_X_X_X" (चित्रा 3) खोलने के द्वारा समीक्षा की जा सकती है, जो पता लगाया धूमकेतु, की एक फिल्म की बचत होती है.

समारोह plusTipGroupAnalysis समूहों में कई व्यक्तिगत डेटा सेट को जोड़ती है और फ़ोल्डरों प्रत्येक समूह के भीतर समूहों और व्यक्तिगत मापदंडों की तुलना के लिए histograms, भूखंडों, और स्प्रेडशीट सहित समूह पैरामीटर डेटा, होते हैं कि (, जिस पर विश्लेषण का चयन किया है, उसके आधार पर नामित perCell या pooledData) बनाता है (चित्रा 4).

चित्रा 1 Xenopus laevis विकास शंकु में EB1-GFP धूमकेतु के लिए इस्तेमाल किया चित्रा 1 PlusTipGetTracks सेटिंग्स. यह आंकड़ा EB1-GFP के विश्लेषण के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है कि "पहचान", "ट्रैकिंग", और "बाद के प्रसंस्करण" चरणों के लिए विशिष्ट सेटिंग्स को दिखाता है Xenopus laevis विकास शंकु में धूमकेतु. plusTipTracker पैकेज के भीतर उपलब्ध plusTipParamSweepGUI उपकरण, अन्य मॉडल जीवों और / या सेल प्रकार 7 के लिए ट्रैकिंग सेटिंग्स का अनुकूलन करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है.

चित्रा 2
PlusTipGetTracks विश्लेषण से प्राप्त मीट्रिक टन मापदंडों के चित्रा 2 स्क्रीनशॉट. "मेटा" फ़ोल्डर, चल plusTipGetTracks द्वारा बनाई गई हैं, + टिप सी के बारे में जानकारी शामिल हैंOMET आंकड़े. एक स्प्रेडशीट आवेदन में "आँकड़े" फाइल खींचकर, microtubule गतिशीलता मापदंडों की जांच की जा सकती है.

चित्रा 3
PlusTipSeeTracks विश्लेषण से प्राप्त मीट्रिक टन ट्रैक फिल्म की चित्रा 3 स्क्रीनशॉट. PlusTipSeeTracks microtubule ट्रैक दृश्य के लिए अनुमति देता है, लेकिन यह भी उपयोगकर्ता plusTipGetTracks से प्राप्त आंकड़ों की वैधता देखने के लिए अनुमति देकर एक सत्यापन उपकरण के रूप में कार्य करता है न केवल.

चित्रा 4
PlusTipGroupAnalysis से प्राप्त मीट्रिक टन मापदंडों के 4 चित्र स्क्रीनशॉट. PlusTipGroupAnalysis की तुलना समूहों और betwee व्यक्तिगत मापदंडों के लिए उपयोगकर्ता एक सरल तरीका प्रदान करता हैकई व्यक्तिगत डेटा सेट के संयोजन और एक स्प्रेडशीट आवेदन में जांच की जा सकती है, जो सांख्यिकीय उत्पादन, उत्पन्न करके प्रत्येक समूह के भीतर एन.

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Discussion

PlusTipTracker जल्दी और स्वचालित रूप से, एक सेल या विकास शंकु में लगभग सभी दृश्य EB1-GFP धूमकेतु का पता लगाने पटरियों में धूमकेतु लिंक, और मीट्रिक टन मापदंडों की गणना करने के लिए एक सरल, ग्राफिकल यूजर इंटरफेस प्रदान करता है. अन्य प्रकाशनों (. उदाहरण के लिए, मार्क्स एट अल विकास शंकु 18 में चिह्नित EB1 गतिशीलता का भी उपयोग किया मात्रात्मक विश्लेषण) सॉफ्टवेयर के समान प्रकार के डिजाइन की सूचना दी है. लेकिन, इस सॉफ्टवेयर यह स्वतंत्र रूप से, खुले स्रोत डिजाइन करने में माहिर हैं जो Danuser लैब की वेबसाइट से डाउनलोड टर्नकी सेल जैविक समुदाय के लिए उपयोगी सॉफ्टवेयर है, का उपयोग के अपने आसानी में अद्वितीय प्रतीत होता है. MATLAB के लिए उपयोग की आवश्यकता है, जबकि एक सॉफ्टवेयर का उपयोग करने के क्रम में यह कंप्यूटर अनुप्रयोग के साथ पूरी तरह से परिचित होने की जरूरत नहीं है. हालांकि, उपयोग में आसानी के लिए संबोधित किया जाना चाहिए कि वहाँ कुछ कहते हैं.

सबसे पहले, sof उपयोग कर उठता है कि जब सबसे आम समस्याओं में से एकपहली बार के लिए tware और कंप्यूटर अनुप्रयोग फ़ाइल पथ से संबंधित है. इस त्रुटि (". सीडी का उपयोग कर त्रुटि - एक स्ट्रिंग formatPath में त्रुटि ... शामिल होना चाहिए तर्क" शीघ्र) के साथ होता है, तो सबसे आसान समाधान "छवियों" सभी के साथ कि plusTipTracker सॉफ्टवेयर, साथ ही निर्देशिका सुनिश्चित करने के लिए है उपनिर्देशिका, वही "MATLAB" फ़ाइल पथ में दोनों हैं. इन "प्रोग्राम फ़ाइलें" निर्देशिका में नहीं हैं, तो यह "प्रोग्राम फ़ाइलें" नाम में अंतरिक्ष एक मुद्दा हो सकता है कि सुझाव दिया गया है, क्योंकि यह सबसे अच्छा है. इस से संबंधित है, यह plusTipTracker पहले plusTipGetTracks विश्लेषण जब कंप्यूटिंग का उपयोग किया गया था कि फ़ाइल पथ बचाता है, और इस डेटा पहुँचा और सॉफ्टवेयर की एक और घटक से कार्यरत है जब इस तरह के रूप में, इस फ़ाइल पथ बनाए रखा जाना चाहिए कि नोट करना महत्वपूर्ण है. कार्यों plusTipGetTracks, plusTipSeeTracks, और plusTipGroupAnalysis सभी ग की कोशिश कर रहा है, इस प्रकार मूल बचाया फ़ाइल पथ का उपयोग, औरकिसी दिए गए फिल्म के लिए उन सभी कार्यों, एक और रास्ता करने के लिए फाइल आगे बढ़ के बाद, एक त्रुटि में परिणाम होगा.

ट्रैकिंग plusTipGetTracks चरण के दौरान विफल रहता है जब विश्लेषण के दौरान होने की एक और सामान्य त्रुटि है. छवि श्रृंखला में एक फ्रेम नहीं detectable धूमकेतु है यदि यह हो जाएगा. यह पूरी तरह से विश्लेषण को रोकने जाएगा और कोई पोस्ट प्रसंस्करण हो जाएगा. आगे बढ़ने के लिए विश्लेषण इस मुद्दे को दरकिनार और अनुमति देने के लिए एक आसान तय, यह गलत तरीके से किसी भी वास्तविक पटरियों से लिंक नहीं किया जाएगा, जहां एक क्षेत्र में छवि पर एक नकली धूमकेतु बनाने के लिए है. लगातार तख्ते की एक न्यूनतम संख्या में मौजूद नहीं है कि कोई भी धूमकेतु अंतिम विश्लेषण के बाहर फिल्टर किया जायेगा, क्योंकि यह अंतिम ट्रैक मापदंडों को प्रभावित नहीं करेंगे.

उत्पन्न हो सकती है कि एक अन्य मुद्दा दोषपूर्ण धूमकेतु का पता लगाने है. यह आमतौर पर 2.3 कदम में क्षेत्र के हित चयन में सुधार के द्वारा निर्धारित किया जा सकता है. यह ओ सेल के आसपास बारीकी से ब्याज के क्षेत्र आकर्षित और नहीं आकर्षित करने के लिए महत्वपूर्ण हैसे Ider क्षेत्र के लिए आवश्यक है. सॉफ्टवेयर धूमकेतु का पता लगाने के दौरान इस्तेमाल पृष्ठभूमि निर्धारित करने के लिए इस क्षेत्र का उपयोग करता है. धूमकेतु का पता लगाने अभी भी डिफ़ॉल्ट सेटिंग्स के साथ उप इष्टतम है, तो सेटिंग्स (कदम 2.7 के दौरान) plusTipGetTracks खिड़की में समायोजित किया जा सकता.

किसी भी विश्लेषण करने के बाद, यह plusTipSeeTracks का उपयोग कर, आँखों से स्वचालित ट्रैक संबंधों को मान्य करने के लिए महत्वपूर्ण है. ट्रैकिंग सेटिंग्स झूठी सकारात्मक या नकारात्मक झूठी धूमकेतु संबंधों की संख्या कम करने के लिए संशोधित करने की आवश्यकता हो सकती है. मूल plusTipTracker प्रलेखन 4 के रूप में अच्छी तरह से सेटिंग के अनुकूलन पर जानकारी के लिए सॉफ्टवेयर डाउनलोड के साथ जुडा हुआ है कि तकनीकी रिपोर्ट पीडीएफ देखें. हाथ से ट्रैकिंग की तुलना में इस सॉफ्टवेयर का प्रदर्शन पहले से गैर neuronal कोशिकाओं 4 में परीक्षण किया गया है. विकास शंकु लाख टन मीट्रिक टन वृद्धि और दबाव के अलावा, सभी दिशाओं 17 में लगातार अनुवादन प्रदर्शन के रूप में विकास शंकु, तथापि, एक अलग चुनौती. एक issuएक प्रमुख चिंता का विषय होना नहीं पाया गया है कि ई विकास शंकु में कसकर बांध लाख टन ट्रैकिंग कठिनाइयों 17 ढोंग है कि क्या है. लाख टन के रूप में केवल एक सबसेट को हल करने और व्यक्तिगत EB1-GFP धूमकेतु समस्याग्रस्त नहीं था ट्रैकिंग, सिरों पर EB1-GFP के साथ बढ़ रही है, के चरण में हैं. हालांकि, यह ध्यान दिया जाना चाहिए कि विशेष रूप से अन्य हड्डीवाला विकास शंकु की तुलना में, क्योंकि उनके अपेक्षाकृत बड़े विकास शंकु आकार (लगभग 10 माइक्रोन) के चुने गए हैं जो Xenopus laevis विकास शंकु इस्तेमाल किया इन पिछले अध्ययनों. इन बड़े विकास शंकु का उपयोग अधिक सटीक EB1-GFP धूमकेतु विश्लेषण के लिए अनुमति देता है.

Xenopus laevis विकास शंकु में EB1-GFP पटरियों का विश्लेषण करने के लिए इस सॉफ्टवेयर की उपयोगिता और सटीकता का आकलन करने के लिए, हम एक समान डेटा श्रृंखला के हाथ से नज़र रखने के साथ plusTipTracker का उपयोग करने का अनुभव तुलना में (नहीं दिखाया डेटा). समय हाथ से यह ट्रैक करने के लिए ले लिया EB1-GFP धूमकेतु 39 धूमकेतु पटरियों (की औसत वृद्धि कोन में एक 1 मिनट समय चूक सेरी मेंतों, प्रत्येक फ्रेम के बीच 2 सेकंड) के साथ सॉफ्टवेयर के साथ दो मिनट की तुलना में दो घंटे से अधिक था. दो तरीकों के साथ प्राप्त मानकों (हाथ से ट्रैकिंग के लिए प्रति मिनट 7.0 माइक्रोन बनाम ट्रैकिंग स्वचालित के लिए प्रति मिनट 7.4 माइक्रोन) मीट्रिक टन वृद्धि वेग के लिए इसी तरह के थे. हालांकि, विकास जीवनकाल और लंबाई के लिए, सॉफ्टवेयर विश्लेषण (लगभग आधा समय और दूरी के अनुसार) काफी कम पटरियों की ओर जाता है. एक धूमकेतु में और ध्यान से बाहर समय खत्म हो जाता है, तो यह सॉफ्टवेयर द्वारा विभाजित किया जा रहा है विकास पटरियों की वजह से है. मानव आंख आसानी से यह वही धूमकेतु है कि पहचान कर सकते हैं, सॉफ्टवेयर नहीं करता है. एक कई स्थितियों की तुलना करने के क्रम में सॉफ्टवेयर का उपयोग कर रहा है, तो यह समस्या है, हालांकि समस्याग्रस्त नहीं है. समान ट्रैकिंग पैरामीटर सभी स्थितियों के लिए उपयोग किया जाता है (और धूमकेतु कई स्थितियों में एक ही दर पर और ध्यान से बाहर जाना यह सोचते हैं कि) कर रहे हैं, तो सापेक्ष जन्मों और लंबाई अभी भी तुलना के लिए काफी उपयोगी माप हैं. स्वचालित विश्लेषण त्रुटि चूहे के रूप मेंतों, इन छवियों की गुणवत्ता पर काफी निर्भर करते हैं. उच्च संकेत करने वाली शोर फिल्मों में, misjoined या गलत पटरियों का प्रतिशत एक अंक में है. यहां तक ​​कि (व्यक्तिगत धूमकेतु अभी भी आंखों से स्पष्ट रूप से दिखाई दे रहे हैं, लेकिन पृष्ठभूमि शोर अधिक है) कम गुणवत्ता फिल्मों में, त्रुटि दर अभी भी सॉफ्टवेयर का उपयोग करके बचाया महत्वपूर्ण समय के लायक है कि (5-15%) काफी कम कर रहे हैं त्रुटि में खर्च होती है. यह विशेष रूप से विकास शंकु का विश्लेषण सैकड़ों (हालत प्रति 60-8 विकास शंकु पिछले एक अध्ययन 17 में विश्लेषण किया गया) जब मामला है.

यह इस सॉफ्टवेयर केवल ऐसे EB1-GFP के रूप में बढ़ मीट्रिक टन समाप्त होता है, कि बाँध + टिप धूमकेतु का पता लगाने के लिए डिजाइन किया गया था कि नोट करना महत्वपूर्ण है. लिंकेज और ट्रैकिंग एल्गोरिदम धूमकेतु केवल मीट्रिक टन सिकुड़ को बांधता है कि एक fluorescently टैग + टिप की गतिशीलता का विश्लेषण करने के लिए इस सॉफ्टवेयर का उपयोग कर, लाख टन polymerizing पर मौजूद उम्मीद करते हैं कि यह देखते हुए कि गलत जानकारी के लिए नेतृत्व करेंगे बढ़ रही सिरों के अलावा समाप्त होता हैगणना मीट्रिक टन वृद्धि वेग के बारे में.

अन्य एकल कण ट्रैकिंग सॉफ्टवेयर की तुलना में इस सॉफ्टवेयर की अनूठी विशेषताओं में से एक है, यह न केवल polymerization के मापदंडों, लेकिन यह भी संकोचन मापदंडों की गणना करने के लिए खाते में जाना मीट्रिक टन व्यवहार में लेता है. यह हाल एक ही प्रक्षेपवक्र में सीधे इसके पीछे का गठन किया है कि एक साथ गायब हो गया है कि एक EB1-GFP धूमकेतु जोड़ने के द्वारा इस करता है (यह एक backgap, या bgap ट्रैक कहा जाता है). इस एल्गोरिथ्म ऐसे HELA कोशिकाओं 4 के रूप में कुछ प्रकार की कोशिकाओं, के लिए अच्छी तरह से काम करता है, जबकि विकास शंकु में मीट्रिक टन गतिशीलता का विश्लेषण करते हैं, यह एक कम प्रभावी सुविधा है. मीट्रिक टन अक्सर विकास शंकु में ठीक उसी पथ (अक्सर एफ actin बंडलों साथ निम्न) के साथ एक दूसरे का पालन पटरियों, और इसलिए यह bgap लिंकेज सही हैं बताने के लिए अगर आम तौर पर असंभव है क्योंकि यह है. इस कारण से, यह विकास शंकु में bgap डेटा outputs का उपयोग करने की सिफारिश नहीं है.

इन नाबालिग निरंतर और मुद्दों के बावजूदplusTipTracker का उपयोग करते समय ध्यान में रखा (और सबसे अधिक किसी भी स्वचालित इमेज प्रोसेसिंग प्रोग्राम) होना चाहिए, जो इस सॉफ्टवेयर समय की एक अपेक्षाकृत कम राशि में EB1-GFP धूमकेतु के हजारों का विश्लेषण करने के लिए एक बहुत ही उपयोगी उपकरण हो सकता है.

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Materials

Name Company Catalog Number Comments
plusTipTracker software Danuser Lab http://lccb.hms.harvard.edu/software.html This software may be hosted by another website in the future.  If the listed site does not exist, search "Danuser Lab Software" on a web search engine to find the site.
MATLAB software Mathworks http://www.mathworks.com/products/matlab/

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