Author Produced

Använda plusTipTracker Programvara för att mäta mikrotubuli Dynamics in

Biology

Your institution must subscribe to JoVE's Biology section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

Welcome!

Enter your email below to get your free 10 minute trial to JoVE!





We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.

If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.

 

Summary

MATLAB-baserade, open source programpaket, plusTipTracker, kan användas för att analysera bild serie fluorescensmärkta + tips för att kvantifiera mikrotubuli dynamik.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Stout, A., D'Amico, S., Enzenbacher, T., Ebbert, P., Lowery, L. A. Using plusTipTracker Software to Measure Microtubule Dynamics in Xenopus laevis Growth Cones. J. Vis. Exp. (91), e52138, doi:10.3791/52138 (2014).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Mikrotubuli (MT) plus-end-tracking proteiner (+ tips) lokalisera de växande plus-ändarna av MT och reglera MT dynamik 1,2. En av de mest kända och allmänt utnyttjade + tips för att analysera MT dynamik är slut bindande protein, EB1, som binder alla växande MT plus-ändar, och därmed är en markör för MT polymerisation 1. Många studier av EB1 beteende inom tillväxt kottar har använt tidskrävande och fördomsfulla datorstödda, handspårningsmetoder för att analysera enskilda MTs 1-3. Vår inställning är att kvantifiera globala parametrar för MT dynamik med hjälp av programpaketet, plusTipTracker 4, efter förvärvet av högupplösta, levande bilder av taggade EB1 i odlade embryonala tillväxtkoner 5. Denna programvara är en MATLAB-baserad, öppen källkod, användarvänligt paket som kombinerar automatiserad upptäckt, spårning, visualisering och analys för filmer av fluorescensmärkta + tips. Här presenterar vi protokollet för att använda plusTipTracker för analys av fluorescensmärkta + tips kometer i odlade Xenopus laevis tillväxt kottar. Dock kan denna programvara också användas för att karaktärisera MT dynamiken i olika celltyper 6-8.

Introduction

Målet med denna metod är att få kvantitativ information om mikrotubuli (MT) plus-end-tracking protein (+ TIP) dynamik i levande tillväxt kottar. MT + Tips är en grupp av proteiner som lokaliserar till plus-ändar MTs 9,10. De utför en rad funktioner för att reglera parametrar för MT dynamisk instabilitet 11, däribland andelen polymerisation, katastrof, och räddning. En väl använd metod för analys av MT dynamik är att spåra beteende + TIP EB1, som binder specifikt till växande MT plus slutar 1,12. EB1 är känd för att rekrytera flera andra proteiner att växa MT plus slutar 13,14, och har nyligen etablerats som en MT mognadsfaktor 15, främja både MT tillväxt och katastroffrekvensen 15,16.

Många studier av MT dynamiken i tillväxt kottar har använt handspårningsmetoder för att mäta förändringar i EB1-GFP dynamik över tiden 1-3, som EB1 localizatitill MT plus gränder kan användas som markör för MT polymerisation. En viktig fördel för att pröva EB1-GFP kometer som en proxy för MT tillväxt är att MT dynamik kan mätas även i regioner med betydande MT överlappning. Även metoden för hand tracking EB1-GFP kometer har gett nyttiga insikter MT beteenden 1-3, det är tidskrävande och kan vara partisk. Dessutom så avvikande tillväxt kon beteenden är troligen ett resultat av små förskjutningar i cytoskelettala dynamik, analysera endast en liten delmängd av MT (oftast nödvändigt när hand tracking) kan missa viktig information.

Därför mäter vi globala MT dynamik parametrar med programpaketet plusTipTracker 4, efter förvärvet av högupplösta, levande bilder av taggade EB1 i odlade embryonala tillväxtkoner 5. Denna programvara, som utvecklats i Danuser Lab, har använts i flera studier som kännetecknar MT dynamiken i olika celltyper 6-8. Det är en öppen källkod, osser med barn, MATLAB-baserade paket som inkluderar automatisk detektering, spårning, visualisering och analys för filmer av fluorescensmärkta + tips. En lång lista med specifika parametrar för MT dynamik beräknas av denna programvara (se referens 4 för detaljer), men för analys av MT dynamiken i tillväxt kottar, de mest användbara parametrarna är MT tillväxtspåret hastigheten (i mikrometer / minut), tillväxtspåret livslängd (i sekunder), och tillväxt banlängd (i mikrometer). Programvaran kan laddas ner direkt från Danuser Lab webbplats (under "Programvara"). Medan Danuser Lab stödjer för närvarande en nyare gränssnitt för + TIP spårning analys, som är införlivat ett programpaket som kallas u-spår 2,0, originalet, fristående programvara förblir tillgängliga. De underliggande algoritmerna mellan de två programmen är samma (åtminstone från och med 2014), med bara en skillnad på gränssnitt och analys utgångar. För nybörjare med lite MATLAB och / eller beräkningsanalys experihet har plusTipTracker mer användarvänliga funktioner, inklusive automatiserade statistiska parameter utgångar.

Här beskriver vi följande steg för att analysera bilder av EB1-GFP dynamiken i odlade Xenopus laevis tillväxtkoner. Detta protokoll användes nyligen i en pappers undersöker MT dynamik 17. Se även Lowery et al. 2012 5 för detaljerade instruktioner om odling tillväxt kottar uttrycker EB1-GFP. Även denna uppsats främst inriktad på att undersöka EB1-GFP dynamiken i tillväxt kottar, kan samma protokoll användas för andra celltyper 17. För alla celltyper, bör tidsintervallet mellan bilderna vara mellan 0,5-2 sek för optimal + TIP spårning. Ett tidsintervall på upp till 4 sekunder mellan ramar är möjligt, men denna ökade intervalltid ger ytterligare spårningsfel.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Detta protokoll och video är tänkt att fungera som ett komplement till den ursprungliga papper som beskriver programpaketet mer i detalj 4, liksom den tekniska rapporten som kommer med nedladdning på Danuser Lab webbplats. Läsarna uppmanas att granska dessa dokument noggrant om det finns ytterligare frågor om hur du använder programvaran.

1 Före bildanalys

  1. Konvertera varje time-lapse-film till en sekvens av TIFF (Tagged Image File Format) bildfiler. Om det finns flera tillväxt koner / celler i en viss film, för första skörd varje tillväxt kon / cell skapar en egen bildsekvensen.
    OBS: Detta är inte nödvändigt, eftersom enskilda regioner av intresse (ROI) kan väljas inom plusTipTracker. Men med hjälp av mindre bildens dimensioner ökar hastigheten på beräknings bearbetning, så detta steg rekommenderas om det finns betydande tomrum i bilden.
  2. Spara varje TIFF serie i sin egenmapp som heter "bilder" i en bana som MATLAB är inställd på TV (observera att "bilder" är skiftlägeskänsligt). För att lägga till en ny väg, navigera till den aktuella filen katalogen i "Current Folder" fönstret, högerklicka på ikonen katalogen och välj "Lägg till Path - Valda mappar och undermappar". Det är viktigt att mappen plusTipTracker mjukvaran sättas till Path, liksom.

2. plusTipGetTracks

Obs: Det första steget i bildanalys är att upptäcka de EB1-GFP kometer, länka kometer i spår, och fastställa parametrarna för mikrotubuli dynamik. Detta uppnås med kommandot "plusTipGetTracks" 4.

  1. Till att börja analys, öppna MATLAB ansökan och skriv "plusTipGetTracks" i kommandofönstret. Detta kommer att orsaka en ny dialogruta visas.
  2. Klicka på "Set Up Nya projekt" och välj ett (eller more) av den tidigare TIFF bildserie genom att välja vissa "bilder" mappen (eller kataloger som innehåller "bilder" mappar). Vid slutförandet av detta steg, en filkatalog (roi_1) skapas (i samma mapp som håller "bilder") som ska innehålla de framtida datafiler. Notera: "Set Up Nya projekt" steg kan fyllas i förväg, under en särskild session.
  3. Ett nytt fönster visas: "Välj en polygon, högerklicka på sista punkten, och klicka på" Skapa Mask '". Klicka på "OK". Den första bilden i det valda bildserien kommer sedan att visas. Använd musen för att klicka och skapa en polygon som innefattar helheten av tillväxten konen. Dubbelklicka med musen för att stänga polygonen.
  4. När polygon har stängts, kommer en dialogruta att visas: "Vill du välja en annan ROI?" Om bilden har en annan tillväxt kotte att analysera, välj "Ja"; annars ärutvalda "Nej".
  5. Markera de projekt som kommer att omedelbart analyseras. Klicka på "Välj projekt" och välj mapp (roi_X) att analysera.
  6. En listSelectGUI skärm visas. Markera projektet (s) från den vänstra sidan av skärmen och flytta dem över till höger sida av skärmen. Klicka på "OK". Välj en plats att spara projektlistan och klicka på "Spara".
  7. Välj "Detection", "Tracking" och "Post-Processing". När dessa val är gjorda, kommer den högra sidan i dialogrutan blir konfigurerbar. Konfigurera varje alternativ.
    1. Dessa parametrar används för att länka upptäckta kometer i MT spår. Mer information om att välja dessa styrparametrar för spårning finns på sidorna 9-10 i den tekniska rapporten PDF som åtföljer programpaket nedladdning; Läs denna rapport noggrant om problem uppstår. För att spåra EB1-GFP kometer i Xenoposs laevis tillväxt kottar, använd följande Tracking inställningar: Sök Radius Range (bildpunkter) 5-12, Minimum Underspårlängd (frames) 3; Max Gap Längd (frames) 8; Max Krympning Factor 0.8, Max vinkel framåt 50, Max vinkel bakåt 10, Fluktuationer Radius 2.5. Dessa inställningar visas i figur 1.

    OBS: Max Factor Svinn är inställd på att minska antalet "efterblivna luckor" upptäckta, som "efterblivna luckor" inte är användbara för att analysera inom ramen för tillväxtkoner, med tanke på de trånga förhållanden och sannolikt fel i spår bindningar. Dessutom är både Max Framåt vinkel samt Fluktuationer Radius satt relativt högt, eftersom tillväxt kon MT uppvisar små täta sloka utöver utväxter och krympningar, och öka dessa kontrollinställningar tillåter denna ökade rörelse under länksteget.
    1. Fyll i efterbearbetning inställningar beroende på de önskade specifika bildförvärvs inställningar.
    </ Li>
  8. När inställningarna har konfigurerats, klicka på "Start". Programvaran kommer att köra det som inställningarna har valts. Detta kan ta minuter till timmar, beroende på antalet utvalda projekt och deras storlek. Kommandofönstret visar den beräknade tid som återstår för varje funktion. När plusTipGetTracks steget är klar kommer kommandofönstret DISPLAY "Kom!"
    Obs: En lång lista med specifika parametrar för MT dynamiken har nu beräknats av denna programvara (se referens 4 för detaljer), men för analys av MT dynamiken i tillväxt kottar, de mest användbara parametrar för att undersöka är MT tillväxtspåret hastigheten (i mikrometer / minut), tillväxt spår livslängd (i sekunder), och tillväxt banlängd (i mikrometer).

3. plusTipSeeTracks

Notera: Nu när mikrotubuli spår har definierats, är funktionen "plustipSeeTracks" används för spår visualisering 4. Denna funktionkan ge flera utgångar för visualisering, inklusive rumsliga MT dynamik kartor och hastighets filmer, men här ligger fokus enbart på att använda "Track filmer" för att visa MT spår lagrade på tillväxt kon bilderna. Medan plusTipGetTracks kan analysera flera filmer åt gången, kan plusTipSeeTracks bara analysera en film i taget.

  1. Skriv "plusTipSeeTracks" i kommandofönstret.
  2. När dialogrutan laster, klicka på "Select Project". Välj den överordnade katalogen som innehåller projektet för att visualisera och klicka på "Välj mapp". Ett nytt fönster visas: "Välj det projekt du vill visualisera". Välj filen för att visualisera och klicka på "OK".
  3. Klicka sedan på "Välj sparade ROI". Navigera till samma roi_X mapp som du valde i föregående steg och markera filen med namnet "roiYX".
  4. Klicka på "Välj Output Directory" för att beteckna wHär MATLAB kommer spara visualiseringsfiler spår. OBS: Vi rekommenderar att du använder samma mapp som innehåller resten av uppgifterna.
  5. Välj "Gör Track film" och en skärm visas med alla spår plusTipGetTracks beräknas från + tips kometer. Detta steg sparar spårade tidsserier i en film format i filen "allTracks_X_X_X". Det finns ett alternativ för att spara filmen som en AVI, annars standardformatet är som en Quicktime.mov fil.

4. plusTipGroupAnalysis

OBS: Denna sista funktion används för att skapa grupper med filmer för analys och jämförelse av deras spårparametrar MT.

  1. Skriv "plusTipGroupAnalysis" i kommandofönstret. För att välja grupperna manuellt jämföra, första de-välja "Auto grupp från hierarki". Klicka sedan på "Välj projekt". Navigera till moder kataloger som innehåller alla roi_X mapparatt analysera.
  2. En listSelectGUI skärm visas. Markera alla de projekt som ingår i grupperna från den vänstra sidan av skärmen och flytta dem över till höger sida av skärmen. Klicka på "OK". Välj en plats att spara projektlistan och klicka på "Spara".
  3. Ett fönster visas: "Välj första gruppen i listan". Klicka på "OK". Den listSelectGUI fönster visas igen. Den här gången väljer bara de filer som motsvarar den första gruppen som ska sammanföras. Klicka på "OK".
  4. Ange sedan gruppnamnet, och klicka på "OK". Ett fönster visas: "Välj en annan grupp?" Svar om detta och fortsätta välja grupper. Ett fönster visas: "Välj en plats att spara grupplistan". Navigera till platsen och klicka på "Spara".
  5. Klicka på "Välj Output Directory" för att välja var utgångs mappar blirlagras.
  6. Välj vilken typ av grupp analys för att genomföra - om MT spåren bör slås samman för varje grupp eller per cellanalys bör utföras. De rekommenderade statistiska tester är redan utsedda. Om du vill inkludera alla spåren i analysen, avmarkera "Ta bort spår på början / slutet av filmen". Annars har den här rutan väljs bort alla MT tillväxtspår som finns i processen som filmen börjar eller slutar.
  7. Efter koncernen Analysis urval görs, välj "jämför grupper".

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Genom att använda denna programvara som beskrivs här kommer att ge flera filer med information som kvantifierar + tips dynamik i levande celler.

Funktions plusTipGetTracks identifierar spåren (med hjälp av exempel på inställningar som visas i figur 1), och sedan ger parametrar rörande + tips spår. Om du vill visa information som programmet har fått, gå in på roi_X katalogen som skapades i steg 2.2. Den "feat" mappen innehåller "overlayImages", som är en serie bilder som visar de upptäckta kometer. Att undersöka dessa bilder med hjälp av bildanalys programvara kan visa riktigheten i kometen upptäckt. Den "meta"-mappen innehåller också detaljerad information om + TIP komet statistik, däribland "projData" fil, liksom den "statistik" filen. För att visa "Stats" fil, dra den till en öppen kalkylblad i ett kalkylprogram. Den här filen innehåller beräknad mikrotubuli parametrar för varje film (Figur 2). Som nämnts ovan, är en lång lista av specifika parametrar för MT dynamik beräknas av denna programvara (se referens 4 för detaljer), inklusive MT tillväxtspåret hastigheten (i mikrometer / minut), tillväxtspåret livslängd (i sekunder) och tillväxten spårlängd (i mikrometer).

Funktionen plusTipSeeTracks sparar en film av de spårade kometer, vilket kan ses genom att öppna filen "allTracks_X_X_X" (Figur 3).

Funktionen plusTipGroupAnalysis kombinerar flera enskilda datamängder i grupper och skapar mappar (som heter perCell eller pooledData, beroende på vilken analys väljs) som innehåller gruppparameterdata, inklusive histogram, tomter och kalkylblad för att jämföra grupper och enskilda parametrar inom varje grupp (Figur 4).

Figur 1 Figur 1. PlusTipGetTracks inställningar som används för EB1-GFP kometer i Xenopus laevis tillväxt kottar. Denna figur visar de specifika inställningarna för "Detection", "Tracking" och "Post-Processing" åtgärder som kan användas för analys av EB1-GFP kometer i Xenopus laevis tillväxt kottar. Den plusTipParamSweepGUI verktyget tillgängligt inom plusTipTracker paketet, kan användas för att optimera spårningsinställningar för andra modellorganismer och / eller celltyper 7.

Figur 2
Figur 2 Skärmdump av MT parametrar erhållna från plusTipGetTracks-analys. "Meta"-mappen, skapad av kör plusTipGetTracks, innehåller information om + TIP cOMET statistik. Genom att dra "Stats" fil i ett kalkylprogram, kan mikrotubuli dynamik parametrar undersökas.

Figur 3
Figur 3 Skärmdump av MT spår film erhållits från plusTipSeeTracks analys. PlusTipSeeTracks möjliggör inte bara för mikrotubuli spår visualisering, men också fungerar som ett kontrollverktyg genom att tillåta användare att se giltigheten av de uppgifter som erhållits från plusTipGetTracks.

Figur 4
Figur 4 Skärmdump av MT parametrar erhållna från plusTipGroupAnalysis. PlusTipGroupAnalysis erbjuder användaren en enkel metod för att jämföra grupper och enskilda parametrar between inom varje grupp genom att kombinera flera enskilda datamängder och generera statistiska resultatet, som kan prövas i ett kalkylprogram.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

PlusTipTracker ger ett enkelt, grafiskt användargränssnitt för att snabbt och automatiskt upptäcka praktiskt taget alla synliga EB1-GFP kometer i en cell eller tillväxt kon, länka kometer i spår, och beräkna MT parametrar. Andra publikationer har rapporterat konstruktionen av liknande typer av mjukvara (t.ex. Marx et al. Utnyttjas också kvantitativ analys av etikette EB1 dynamik i tillväxtkoner 18). Men verkar detta program att vara unik i sin lättillgänglighet, eftersom det är fritt nedladdningsbara från webbplatsen för Danuser Lab, som är specialiserat på att designa öppen källkod, nyckel program användbar för cellens biologiska samhället. Även tillgång till MATLAB krävs, behöver man inte vara helt bekant med denna datorprogram för att utnyttja programmet. Men det finns några punkter som behöver åtgärdas för enkel användning.

Först av allt, en av de vanligaste frågorna som uppstår vid användning av SOFtware och datorprogram för första gången är relaterad till sökvägen. Om detta fel uppstår (med uppmaningen "Fel att använda cd -. Argument måste innehålla en sträng Fel i formatPath ..."), så den enklaste lösningen är att se till att plusTipTracker programvara, samt katalogen med alla "bilder" underkataloger, är båda i samma "MATLAB" sökväg. Det bästa är om dessa inte är i "Program Files" katalogen, eftersom det har föreslagits att utrymmet i "Program Files" namn kan vara ett problem. Relaterat till detta är det viktigt att notera att plusTipTracker sparar sökvägen som användes vid första beräkning av plusTipGetTracks analys, och som sådan måste denna sökväg behållas när data hämtas och anställd av en annan komponent av programvaran. Funktionerna plusTipGetTracks, plusTipSeeTracks och plusTipGroupAnalysis alla använda den ursprungliga sparade sökvägen, och därmed försöker calla dessa funktioner för en viss film, efter att ha flyttat filerna till en annan väg, kommer att resultera i ett fel.

Ett annat vanligt fel inträffar under analysen är när Tracking misslyckas under plusTipGetTracks steget. Detta inträffar om en ram i bilden serien innehåller inga detekterbara kometer. Detta kommer helt stoppa analysen och ingen efterbearbetning kommer att ske. En enkel fix för att kringgå det här problemet och låta analysen att gå vidare, är att skapa en modell komet på bilden i ett område där det inte kommer att felaktigt kopplade till några egentliga spår. Detta kommer inte att påverka den slutliga spårparametrar, som någon komet som inte finns i ett minsta antal på varandra följande ramar kommer att filtreras bort i den slutliga analysen.

En annan fråga som kan uppkomma är felaktig komet upptäckt. Detta kan vanligtvis fastställas genom att förbättra regionen av intresse valde i steg 2.3. Det är viktigt att dra regionen av intresse tätt runt cellen och inte att dra awider regionen än nödvändigt. Programvaran använder denna region för att bestämma bakgrunds används under komet upptäckt. Om kometen upptäckt fortfarande är suboptimal med standardinställningarna, kan inställningarna justeras i plusTipGetTracks fönstret (under steg 2.7).

Efter någon analys är det viktigt att validera de automatiserade spår kopplingar med ögat, använder plusTipSeeTracks. Spårnings inställningar kan behöva ändras för att minska antalet falskt positiva eller falskt negativa komet kopplingar. Se den ursprungliga plusTipTracker dokumentation 4 samt tekniska rapporten PDF som medföljer ladda ner programvara för detaljer om hur du optimerar inställningarna. Utförandet av denna programvara i jämförelse med handspårning har tidigare testats i icke-neuronala celler 4. Tillväxt koner utgör en något annorlunda utmaning emellertid som tillväxt cone MTs uppvisar frekventa sloka i alla riktningar 17, förutom MT tillväxt och krympning. En Issue som inte visade sig vara ett stort problem är om de tätt packade MT i tillväxt kottar pose spårning svårigheter 17. Eftersom endast en delmängd av MT är i växande fas, med EB1-GFP på ändarna, lösa och spåra enskilda EB1-GFP kometer inte var problematisk. Det bör dock noteras att dessa tidigare studier användes Xenopus laevis tillväxt kottar, som särskilt valts på grund av sin relativt stora tillväxten konen storlek (ca 10 mikrometer), jämfört med andra ryggradsdjur tillväxt kottar. Med hjälp av dessa större tillväxt kottar möjliggör mer exakt EB1-GFP komet analys.

För att bedöma nyttan och riktigheten i denna programvara för att analysera EB1-GFP spår i Xenopus laevis tillväxt kottar, jämförde vi erfarenhet av att använda plusTipTracker med hand-spårning av ett identiskt dataserier (data visas ej). Den tid det tog att lämna spåriga EB1-GFP kometer i en genomsnittlig tillväxt kon av 39 komet spår (i en 1 minut time-lapse series, med 2 sekunder mellan varje ram) var över två timmar, jämfört med två minuter med programvaran. Parametrarna som erhålls med de två metoderna var liknande för MT tillväxthastigheten (7.4 mikrometer per minut för automatiserad spårning kontra 7,0 mikrometer per minut för hand tracking). Men för tillväxt livslängd och längd leder programvara analys till betydligt kortare spår (efter ungefär halva tiden och avstånd). Detta beror på att tillväxtspår som delas av programvaran om en komet går in och ut ur fokus över tid. Medan det mänskliga ögat lätt kan identifiera att det är samma komet, gör programvaran inte. Denna fråga är inte problematiskt men, om man använder programmet för att jämföra flera villkor. Eftersom identiska spårning parametrar används för alla förhållanden (och förutsatt att kometer gå in och ut ur fokus i samma takt i flera villkor), då de relativa livstider och längder är fortfarande ganska användbara mätningar för jämförelse. När det gäller automatiserad analys error råttaes, dessa beror i hög grad på kvaliteten på bilderna. I höga signal-till-brus-filmer, är procent av misjoined eller felaktiga låtar i ensiffriga tal. Även i lägre kvalitet filmer (där enskilda kometer fortfarande klart synliga med blotta ögat, men bakgrundsbruset är större), felprocenten är fortfarande tillräckligt låg (5-15%) att den betydande tid som sparas med hjälp av programvaran är värt kostnader i fel. Detta gäller särskilt vid analys hundratals tillväxt kottar (60-8 tillväxt kottar per tillstånd analyserades i en tidigare studie 17).

Det är viktigt att notera att denna programvara har utformats för att upptäcka + tips kometer som bara binder till växande MT ändar, såsom EB1-GFP. Med tanke på att länk och spårning algoritmer räknar med att kometer bara finns på polymerisation MTS, med hjälp av denna programvara för att analysera dynamiken i en fluorescensmärkt + TIP som binder till krympande MT slutar förutom växande ändarna kommer att leda till felaktiga uppgifteravseende beräknade MT tillväxthastigheter.

En av de unika funktionerna i detta program jämfört med andra single-partikel-mjukvara, är att det tar hänsyn till kända MT beteenden för att beräkna inte bara polymerisations parametrar, men även krympnings parametrar. Det gör detta genom att koppla ett EB1-GFP komet som har försvunnit med en som nyligen har bildats direkt bakom den på samma bana (detta kallas en backgap eller bgap spår). Även denna algoritm fungerar bra för vissa celltyper, såsom HeLa-celler 4, är det en mindre effektiv funktion vid analys MT dynamiken i tillväxt kottar. Detta beror på att MT spår ofta följer varandra längs exakt samma banor i tillväxtkottar (ofta efter längs F-aktin buntar), och så är det oftast omöjligt att säga om bgap kopplingar är korrekta. Därför är det inte rekommenderat att utnyttja bgap datautgångar i tillväxtkottar.

Trots dessa mindre risker och frågorsom måste beaktas vid användning plusTipTracker (och de flesta någon automatisk bildbehandlingsprogram), kan detta program vara ett mycket användbart verktyg för att analysera tusentals EB1-GFP kometer på relativt kort tid.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
plusTipTracker software Danuser Lab http://lccb.hms.harvard.edu/software.html This software may be hosted by another website in the future.  If the listed site does not exist, search "Danuser Lab Software" on a web search engine to find the site.
MATLAB software Mathworks http://www.mathworks.com/products/matlab/

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Stepanova, T., et al. Visualization of microtubule growth in cultured neurons via the use of EB3-GFP (end-binding protein 3-green fluorescent protein). The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 23, 2655-2664 (2003).
  2. Lee, H., et al. The microtubule plus end tracking protein Orbit/MAST/CLASP acts downstream of the tyrosine kinase Abl in mediating axon guidance. Neuron. 913-926 (2004).
  3. Purro, S. A., et al. Wnt regulates axon behavior through changes in microtubule growth directionality: a new role for adenomatous polyposis coli. The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 28, 8644-8654 (2008).
  4. Applegate, K. T., et al. plusTipTracker: Quantitative image analysis software for the measurement of microtubule dynamics. Journal of structural biology. 176, 168-184 (2011).
  5. Lowery, L. A., Faris, A. E., Stout, A., Van Vactor, D. Neural Explant Cultures from Xenopus laevis. Journal of visualized experiments : JoVE. (68), e4232 (2012).
  6. Long, J. B., et al. Multiparametric analysis of CLASP-interacting protein functions during interphase microtubule dynamics. Molecular and cellular biology. 33, 1528-1545 (2013).
  7. Myers, K. A., Applegate, K. T., Danuser, G., Fischer, R. S., Waterman, C. M. Distinct ECM mechanosensing pathways regulate microtubule dynamics to control endothelial cell branching morphogenesis. The Journal of cell biology. 192, 321-334 (2011).
  8. Nishimura, Y., Applegate, K., Davidson, M. W., Danuser, G., Waterman, C. M. Automated screening of microtubule growth dynamics identifies MARK2 as a regulator of leading edge microtubules downstream of Rac1 in migrating cells. PLoS One. 7, e41413 (2012).
  9. Akhmanova, A., Steinmetz, M. O. Tracking the ends: a dynamic protein network controls the fate of microtubule tips. Nature reviews. Molecular cell biology. 9, 309-322 (2008).
  10. Schuyler, S. C., Pellman, D. Microtubule 'plus-end-tracking proteins': The end is just the beginning. Cell. 105, 421-424 (2001).
  11. Mitchison, T., Kirschner, M. Dynamic instability of microtubule growth. Nature. 312, 237-242 (1984).
  12. Mimori-Kiyosue, Y., Shiina, N., Tsukita, S. The dynamic behavior of the APC-binding protein EB1 on the distal ends of microtubules. Current biology : CB. 10, 865-868 (2000).
  13. Dixit, R., et al. Microtubule plus-end tracking by CLIP-170 requires EB1. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106, 492-497 (2009).
  14. Li, W., et al. EB1 promotes microtubule dynamics by recruiting Sentin in Drosophila cells. The Journal of cell biology. 193, 973-983 (2011).
  15. Maurer, S. P., et al. EB1 accelerates two conformational transitions important for microtubule maturation and dynamics. Current biology : CB. 24, 372-384 (2014).
  16. Zanic, M., Widlund, P. O., Hyman, A. A., Howard, J. Synergy between XMAP215 and EB1 increases microtubule growth rates to physiological levels. Nature cell biology. 15, 688-693 (2013).
  17. Lowery, L. A., et al. Growth cone-specific functions of XMAP215 in restricting microtubule dynamics and promoting axonal outgrowth. Neural development. 8, 22 (2013).
  18. Marx, A., et al. Xenopus cytoplasmic linker-associated protein 1 (XCLASP1) promotes axon elongation and advance of pioneer microtubules. Molecular biology of the cell. 24, 1544-1558 (2013).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics