نموذج الزرد ممكن من مرض الكلى المتعدد الكيسات: ضربة قاضية لل

Medicine

Your institution must subscribe to JoVE's Medicine section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations | Reprints and Permissions

Huang, L., Xiao, A., Wecker, A., McBride, D. A., Choi, S. Y., Zhou, W., Lipschutz, J. H. A Possible Zebrafish Model of Polycystic Kidney Disease: Knockdown of wnt5a Causes Cysts in Zebrafish Kidneys. J. Vis. Exp. (94), e52156, doi:10.3791/52156 (2014).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Introduction

وقد استخدمت على نطاق واسع الزرد (دانيو rerio) الأجنة كنموذج لدراسة تطوير الكلى ومرض الكلى المتعدد الكيسات. وهناك العديد من المزايا لاستخدام الزرد كنموذج للحيوانات: جدوى دراسة التفاعلات الوراثية، والقدرة على استخدام العقاقير morpholinos (MO) للبروتين ضربة قاضية، وفرصة لفحص بسرعة أعداد كبيرة من الأجنة، وسهولة عرض الظواهر الجهاز في اليرقات 1 الحية. وسليفة الكلوة هي الكلى الأول لتطوير في الفقاريات وهي وظيفية في الزرد اليرقات 2. هيكل سليفة الكلوة الزرد مقارنة بسيطة نسبيا إلى الكلوة التالية الثدييات، والكلى الثالث والأخير لتطوير في الثدييات. نفرون هو وحدة عمل الكلى، مع كل الكلى البشرية تحتوي على ما بين 500،000-1،000،000 النيفرون 3،4 وكل الكلى الماوس وجود ما يقرب من 13،000 النيفرون مما يجعل من الصعب مراقبة هيكل كليون واحد طن كلى الانسان أو الماوس. الزرد اثنين فقط النيفرون، ولكل كليون الزرد يحتوي على كافة المكونات الرئيسية وجدت في الكبيبة والأنابيب من الفئران والبشر 6 وأنواع الخلايا الكلوية المتخصصة مماثلة. بالمقارنة مع النماذج الفقاريات الأخرى مثل الضفدع، وكليون الزرد أكثر شبها نفرون الثدييات لأنه يحتوي على نظام مغلق 7.

في السنوات الأخيرة، تم التسلسل الجينوم الزرد، والسماح للمقدمة واسعة من الأدوات الوراثية، والموارد متحولة واسعة، ومجموعات من خطوط مراسل المعدلة وراثيا في نماذج الزرد. أشكال سليفة الكلوة الزرد بين 12-72 ساعة بعد الإخصاب (HPF) ويمكن تصور بسهولة في الأجنة شفافة. بروتين ورم في WILM في WT1 هو عامل أساسي للتنمية الكلى. خطوط الزرد المعدلة وراثيا التعبير عن بروتين الفلورية الخضراء (GFP) تحت سيطرة المروج wt1b تيراغرام (wt1b: GFP) تظهر GFP expression تقع تحديدا في المناطق سليفة الكلوة في الأجنة الزرد، بدءا من 17 HPF 8. سحاف الكلية (NPHP)، جسمية متنحية أمراض الكلى الكيسي، والتي تسببها طفرات الجينات NPHP 9. NPHP4 ضربة قاضية من قبل morpholino تسبب تشكيل الكيس في تيراغرام (wt1b: GFP). الأسماك 10 لذلك، هذا السمك المعدلة وراثيا هو نموذج مناسب لمراقبة الهياكل الكلى وتشكيل الكيس أثناء التطور الكلى. الأهم من ذلك، تأثير جهري التنمية الكلى يمكن دراستها باستخدام هذه السلالة في وقت وبكفاءة العمل.

وتصف ورقتنا استخدام تيراغرام (wt1b: GFP) الأسماك كنموذج لتصور تشكيل الكيس الكلى بعد تعديل الجينات. كنا البدء ولصق الموقع مكافحة الشعور المنظمات الأعضاء لاسقاط الجين wnt5a في الزرد. Wnt5a هو بروتين سكري يفرز غير متعارف عليه من عائلة WNT التي تلعب دورا هاما في تطوير مختلف الأجهزة وبعد الولادة الخلويةوظيفة 11. Wnt5a يعمل من خلال مسارات WNT غير متعارف عليها، بما في ذلك قطبية خلية مستو (PCP) المسار، الذي تم العثور على لعب دور في انقسام الخلايا الموجهة خلال استطالة الأنبوبية الكلوية. Wnt5a ينظم WNT / PCP المسار من خلال تشكيل مجمع مع مستقبلات التيروزين كيناز مثل (ريك)، والتي transduces مزيد Wnt5a الإشارات من خلال تشكيل مجمع مع VANGL البروتين قطبية خلية مستو 2 (Vangl2)، وبالتالي تعزيز الاستقرار Vangl2 12. عيوب في مسار PCP يمكن أن يؤدي إلى انقسام الخلايا بشكل عشوائي وتسبب تشكيل الكيس الكلوي. استخدمنا تيراغرام (wt1b: GFP) خط الزرد لمراقبة تشكيل الكيس الكلى التالية wnt5a ضربة قاضية. تيراغرام (wt1b: GFP) نموذج الزرد يسمح التصوير الحي والمراقبة في الوقت المناسب من هيكل الكلى. بعد wnt5a ضربة قاضية، تم العثور على تشكيل الكيس الكلى ابتداء من الساعة 24 HPF. في 72 HPF، الخراجات يمكن العثور عليها في الكبيبات والأنابيب القريبة. ويمكن أيضا أن هذه الطريقة يمكن استخدامها إلى screen الجينات الأخرى التي قد تتسبب في تشكيل الكيس الكلى.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

بيان الأخلاق: ملاحظة: تمت الموافقة على جميع التجارب الزرد من قبل لجنة رعاية واستخدام الحيوان المؤسسي في مدرسة الطب في فيرجينيا الشرقية.

1. إعداد Morpholino

  1. تصميم وتركيب الترجمة حجب (AUG-) وتثبيط لصق (Splice-) لمكافحة الشعور morpholino (MO) [أليغنوكليوتيد لهذا الجين من الفائدة وفقا لتعليمات الشركة الصانعة (الشكل 1A). يرجى الاطلاع على معلومات الشركة المصنعة في الجدول 1.
    يتم شحن المنظمات الأعضاء كما أسهم مجفف بالتجميد في عبوات زجاجية: ملاحظة.
  2. إضافة عالية الجودة الماء المعقم للنفايات وقوارير زجاجية على اعادة تعليق أشهر للتركيز النهائي من 25 ميكروغرام / ميكرولتر. تأكد من أن قليل النوكليوتيد يذوب تماما. وإذا كان بعض بقايا صلبة، تسخين قارورة تحتوي على محلول المخزون قليل النوكليوتيد عند 65 درجة مئوية لمدة 5 إلى 10 دقائق ودوامة لفترة وجيزة.
  3. تخزين محلول المخزون MO في RT. لا تخزينها في 4 درجات مئوية أو -20 °، C بسبب انخفاض درجات الحرارة يمكن أن يسبب قليل النوكليوتيد MO لربط الجدار حاوية. قياس تركيز محلول المخزون باستخدام مقياس الطيف الضوئي (يرجى الرجوع إلى TABLE1) في كل مرة يتم حل الأسهم MO الجديد.
  4. إعداد الحل العمل MO في يوم حقن عن طريق تمييع الحل الأسهم مع الدرجة العالية الماء المعقم إلى الجرعة المطلوبة. إضافة 0.5٪ الفينول الأحمر للوصول إلى تركيز 0.05٪. على سبيل المثال، لجعل الحل العمل 5 ميكرولتر مع تركيز 15 نانوغرام / NL، إضافة 3 ميكرولتر MO حل سهم و 0.5 ميكرولتر 0.5٪ الفينول الأحمر إلى 1.5 ميكرولتر من الماء.
    ملاحظة: مع هذا تركيز العمل، كل قطرة (500 رر) الحقن يحتوي على 7.5 نانوغرام من MO واثنين من قطرات تحتوي على 15 نانوغرام من MO.

2. إعداد جهاز حقن

  1. الزجاج شراء الإبر وانسحب قبل (انظر الجدول 1 للحصول على معلومات مفصلة). بدلا من ذلك، وسحب الإبرة واي حقن الزجاجث مجتذب الإبرة.
  2. بدوره على ضاغط الهواء وضبط ضغط الإعداد ل50 رطل. بدوره على المجهر مصدر الضوء تشريح وبيكو مضخة حقن الصغرى وضبط الإعدادات كما يلي: عقد ضغط 20 رطل، إخراج ضغط 10 رطل، قيمة الفترة من 2.5 و 100 μsec مجموعة من النابضة.
  3. تحميل الزجاج إبرة قبل سحبها مع 5 ميكرولتر من محلول الحقن ووضع الإبرة في وضع عمودي مع طرف إلى الانخفاض. الانتظار حتى يصل كل الحل طرف الإبرة مع عدم وجود فقاعات الهواء مرئية. ضع حامل إبرة في الموقف المناسب المقبل لالمجهر وادخال الإبرة الزجاج في حامل. ضبط زاوية الحقن الى 45 درجة.
  4. جلب رأس الإبرة في عرض تحت المجهر، وارتفاع قبالة المرحلة، والتركيز على نحافة المنطقة من غيض. قطع رأس إبرة مع ملاقط نقطة غرامة.
  5. وضع مسطرة وأنبوب شعري مع القطر الداخلي من 0.15 ملم جنبا إلى جنب تحت المجهر.حقن المحلول في واحدة من نهاية الأنابيب الشعرية لجعل عمود السائل. ضبط الوقت الإخراج لتصل إلى كل 17 قطرات لكل 1 ملم طول عمود السائل، ثم حجم كل قطرة من 1 NL (حجم قطرة = π س دائرة نصف قطرها 2 × طول (من عمود السائل) / عدد (قطرات).
    ملاحظة: انخفاض يبلغ قطرها 0.1 ملم تعطي حجم الحقن حوالي 500 رر (حجم قطرة = 4/3 س س π دائرة نصف قطرها 3).

3. إعداد أسمدة اسماك الزرد الأجنة وحقن مع Morpholinos

  1. إعداد تيراغرام (wt1b: GFP) المعدلة وراثيا أزواج تربية الزرد وفقا لبروتوكولات تنشر لتربية الزرد القياسية والصيانة. جمع الأجنة بعد تفرخ الطبيعي، والاحتفاظ بها في 10 سم طبق بتري مملوءة بالماء E3 (5MM كلوريد الصوديوم، 0.17mM بوكل، 0.33 ملي CaCl 0.33 ملي MgSO 4). بدء حقن MO على الفور 13. مراقبة الجنين التشكل تحت المجهر والتأكد من حقن MO هو في واحدة-مرحلة الخليوي، أو في موعد لا يتجاوز المرحلة أربعة خلايا.
    1. نقل الأجنة إلى طبق بتري 10 سم مع إسفين على شكل أحواض أجار. نضح الماء E3 اضافية واضغط بلطف الأجنة في أحواض.
    2. التلاعب في الأجنة مع ممص مكروى لتصور 1 خلية الأجنة مرحلة تحت المجهر تشريح. اختراق المشيمه ثم صفار البيض لحقن واحدة أو قطرتين من MO في صفار البيض (1 قطرة = 500 رر). نقل الأجنة المحقونة إلى 10 سم طبق بتري بالماء E3 واحتضان عند 28.5 درجة مئوية.
  2. بعد الحقن، وإزالة الأجنة الميتة وتسجيل عدد من الأجنة المحقونة. استبدال الماء E3 في طبق كل 24 إلى 48 ساعة.

4. التجارب النمط الظاهري الإنقاذ

  1. حدد orthologue من الأنواع آخر لديه مختلف بنية الزوج القاعدة الأساسية (عادة 3-7 عدم التطابق الزوج القاعدة) وذلك، من مقاومة للMO، للانقاذ. على سبيل المثال، في هذه التجربة، اخترناالماوس لأن تسلسل الماوس Wnt5a مرنا يختلف عن تسلسل الزرد.
  2. تصميم التمهيدي مع مجموعة من التمهيدي إلى الأمام بدأت في موقع متعدية والتمهيدي العكسي عند مقربة من نهاية المنطقة الترميز مرنا. إضافة تسلسل T7 المروج في 5'- نهاية تسلسل التمهيدي إلى الأمام. في هذه التجربة، وكنا ما يلي تسلسل التمهيدي. إلى الأمام: 5'- TAA تاك GAC TCA CTA العلامة GGA CTA TGA TGC TGC TGA AGC TGA أ 3 "وعكس: 5'- TCA CTT الائتلاف GAC GTA CTG gtc- 3".
  3. إجراء 50 ميكرولتر البلمرة المتسلسل (PCR) مع مجموعة التمهيدي (0.5 ميكرومتر من كل التمهيدي) مصممة فوق و 0.1 ميكروغرام قالب DNA التي تحتوي على الماوس تسلسل Wnt5a [كدنا مع برنامج PCR التالية: 1 دورة في 95 درجة مئوية لمدة 5 دقائق. 35 دورات من 95 درجة مئوية (30 ثانية)، 58.5 ° C (30 ثانية)، 72 ° C (1 دقيقة)؛ وخطوة التمديد النهائي في 72 درجة مئوية لمدة 7 دقائق.
  4. بعد الانتهاء رانه دورة، تشغيل 2 ميكرولتر من المنتج PCR على agarose هلام 1٪ للتأكد من أن الفرقة هو الحجم الصحيح. تنقية المنتج PCR مع مجموعة تنقية PCR وفقا لتعليمات الشركة الصانعة. تحقق من تركيز الحمض النووي مع معمل. تخزين المنتج PCR المنقى في -20 ° C أو استخدامها مباشرة في توج النسخ RNA في الخطوة التالية.
  5. توليف في المختبر توج مرنا مع مجموعة تخليق الحمض النووي الريبي توج وفقا لتعليمات الشركة الصانعة. تمييع مرنا في 20 ميكرولتر المياه مجانا ريبونوكلياز وتحديد تركيز. قسامة الحمض النووي الريبي وتخزينها في -80 ° C.
  6. في يوم من الحقن، وإعداد محلول العمل في مرنا مع ريبونوكلياز الماء المعقم مجانا. لاحظ أن 40 خريج عموما أعلى جرعة RNA الذي آثار غير محددة أو السامة من الحمض النووي الريبي لا تحدث. حافظ على حل العمل على الجليد. حقن الجنين مع MO ثم مرنا الإنقاذ، أو شارك في حقن كلاهما معا. على سبيل المثال، إذا كان تركيز prepar مرناإد في الخطوة 4.5 هو 0.6 ميكروغرام / ميكرولتر، إضافة 0.67 ميكرولتر من الرنا المرسال (0.4 ميكروغرام) إلى 4.33 ميكرولتر من ريبونوكلياز المياه مجانا لجعل تركيز النهائي من 0.08 ميكروغرام / ميكرولتر، ثم قطرة واحدة (500 رر) من كل حقنة يحتوي على 40 خريج من مرنا. إعداد MO كما هو موضح في الخطوة 3.

5. إعداد الأجنة المحقونة التصوير الفلورسنت

  1. بعد مرور فترة الحضانة في 28.5 درجة CO / N، إضافة 0.003٪ N-الفنيل (PTU) إلى الماء E3 لمنع التصبغ، مما يؤثر مراقبة هيكل سليفة الكلوة باستخدام المجهر مضان. ومع ذلك، لا تضيف PTU قبل تكون المعيدة، لأنه يؤثر على التطور الجنيني المبكر.
  2. في 48 HPF، dechorionate الأجنة مع ملاقط غرامة يدويا. التقاط صور ل48 و 72 الأجنة HPF تحت المجهر تشريح الضوء.
    ملاحظة: يمكن أن تؤخذ هذه الصور من دون تخدير.
  3. ما يقرب من 10 دقيقة قبل التصوير تحت المجهر مضان، تخدير الأجنة عن طريق وضعها في10 سم طبق بتري تحتوي على 160 ميكروغرام / مل مخزنة تريكين. الانتظار لمدة 5-10 دقائق، ثم مسة خفيفة الزرد للتأكد من أنها لا تتحرك وبالتالي التخدير هو العمل.
  4. بعد أن يتم تخدير الأجنة، جبل لهم في 3٪ السليلوز الميثيل وتوجيهها في وضعية الرقود تحت المجهر تشريح (يرجى الرجوع إلى الجدول 1).
  5. مراقبة هيكل سليفة الكلوة تحت المجهر مضان (يرجى الرجوع إلى الجدول رقم 1) والتقاط الصور في تكبير مختلفة (10X 20X و).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

وقد تحقق Wnt5a نهدم عن طريق إدخال الترجمة حجب MO (AUG-MO) أو اكسون / إنترون لصق الحدود MO (لصق-MO) إلى الأجنة الزرد في مرحلة خلية واحدة. وAUG-MO يستهدف كودون بداية، وبالتالي يمنع كلا رسالة wnt5a الأم واقحي. ولصق-MO يستهدف الموقع الثالث المانحة لصق ويمنع فقط نص اقحي من wnt5a (الشكل 1A). وAUG- وmorphants splice- phenocopied بعضها البعض مع عيوب متعددة، بما في ذلك الذيل أسفل محور الجسم مجعد وذمة التامور (الشكل 1B). الماوس Wnt5a مرنا ينقذ جزئيا النمط الظاهري morphant (الشكل 4B)، مما يدل على أن النمط الظاهري لا يعود إلى تأثيرات خارج الهدف. تيراغرام (wt1b: GFP) الزرد المعدلة وراثيا، والذي يعبر GFP مدفوعا المروج wt1b بحيث GFP يلخص التعبير الذاتية للwt1b، كان يستخدم لتحديد البنية سليفة الكلوة. تيراغرام (WT1ب: GFP) أظهرت الأسماك تشكل كيس الكبيبي بعد wnt5a ضربة قاضية في 48 HPF، في حين أن الأجنة السيطرة حقن مع الفينول الأحمر عرض وحده تنمية سليفة الكلوة العادية، وتشكيل الكبيبة تنصهر في "U" الشكل مع الأنابيب التي تمتد أفقيا (الشكل 2). في 72 HPF، تطوير بنية الكبيبي مع مزيد من الحلقات الوعائية تصور بسهولة، مع كل من AUG- ولصق-المنظمات الأعضاء الخراجات في الكبيبات والأنابيب القريبة (الشكل 3) المتقدمة. H & E تلطيخ الأقسام النسيجية عرضية من 72 HPF الأجنة morphant كشف تشكيل الكيس، تعطلت الهياكل الكبيبي والأنابيب الكلوية المتوسعة (الشكل 4A).

الشكل (1)
الشكل 1: تصميم Morpholino والمظهر المجهري ضوء الأجنة الزرد في 72 ساعة بعد الإخصاب (HPF) بعد الحقنمع الفينول الأحمر السيطرة، AUG-MO، أو لصق-MO. (A) رسم بياني للالجين الزرد wnt5a، المنطقة الترميز، والمناطق المستهدفة من قبل AUG- وsplice- MO. تم تصميم wnt5a AUG-MO لاستهداف بداية رامزة ATG لمنع الترجمة البروتين. تم تصميم لصق-MO لاستهداف الحدود من الإكسونات 3 و 4. لصق-MO بنسبة ضئيلة الموجهة ضد يتوقع أي تقاطع لصق لتوليد إما حذف اكسون واحد كامل أو جزئي أو الإدراج الكامل أو الجزئي إنترون واحد. اخترنا لاسقاط wnt5a مع كل من AUG-MO، مما يؤثر رسالة الأمهات واقحي، ولصق-MO، الذي يؤثر فقط على نسخة اقحي، من أجل تعزيز خصوصية. (B) الجنين حقن الفينول الحمراء ( وأظهرت السيطرة حقن) العادي انحناء الجسم والطول والتامور. أظهر الجنين حقن مع AUG-MO هيكل مجعد أسفل الذيل وذمة التامور، والجنين حقن مع لصق-MO phenocopied للمظهر الجنين حقن مع AUG-MO. شريط = 2mm في.

الشكل 2
الشكل 2: مظهر المجهري مضان من تيراغرام (wt1b: GFP). الأجنة الزرد في 48 HPF بعد الحقن مع الفينول الأحمر السيطرة، wnt5a AUG-MO أو wnt5a لصق-MO في السيطرة حقن الفينول الأحمر، كانت تنمية سليفة الكلوة كاملة في 48 HPF. ويمكن رؤية اثنين من الكبيبات تنصهر والأنابيب القريبة. ويمكن ملاحظة تشكيل الكيس في الكبيبات في كل من AUG- ولصق-MO أجنة في 48 HPF بنهاية التنمية سليفة الكلوة الزرد (شريط = 100 ميكرون).

الشكل (3)
الشكل 3: ظهور المجهري مضان من تيراغرام (wt1b: GFP) الأجنة الزرد في 72 HPF بعد الحقن مع الفينول الأحمرالسيطرة، wnt5a AUG-MO أو wnt5a لصق-MO. وفي 72 HPF، بنية الكبيبي يمكن تصور بوضوح. في السيطرة حقن الفينول الأحمر، وهما الكبيبات تنصهر والحلقات الوعائية يمكن ملاحظتها. Wnt5a أسفرت ضربة قاضية في تشكيل الكيس في جميع الهياكل كليون التي يمكن أن تصور، بما في ذلك الكبيبات والمنطقة القريبة أنبوبي (شريط = 100 ميكرون).

الشكل (4)
الشكل (4): (A) H & E تلطيخ الأقسام النسيجية عرضية من 72 الأجنة HPF morphant كشف تشكيل الكيس، تعطلت الهياكل الكبيبي والأنابيب الكلوية المتوسعة. السهم: الكبيبات سليفة الكلوة. رأس السهم: المتوسعة النبيبات الكلوية. شريط = 20 ميكرون. (B) والنمط الظاهري AUG-MO يمكن انقاذ جزئيا مع الماوس Wnt5a، مقاومة للMO بسبب وجود اختلاف في قاعدة الأولية بنية الزوج، مما يدل على أن النمط الظاهري لم يكن بسبب تأثيرات خارج الهدف. وكان فرق دال إحصائيا عند P <0.05 (* P <0.05 مقابل مجموعة الفينول الحمراء؛ # P <0.05 مقابل AUG-MO مجموعة 15 نانوغرام).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

مرض الكلى المتعدد الكيسات (PKD) هي واحدة من الأسباب الرئيسية للنهاية مرحلة المرض الكلوي في البشر ويتميز تشكيل التدريجي الكيس، وتضخم الكلى، والتنمية أنبوب صغير غير طبيعية 14. راثي PKD السائد (ADPKD) هو مرض وراثي الذي تحور إما PKD1، ترميز polycystin-1 (PC1)، أو PKD2، ترميز polycystin-2 (PC2)، والنتائج في الكلى المتعدد الكيسات. العديد من الجينات الأخرى، وخاصة تلك ترميز البروتينات الموجودة في هدب الابتدائي، ويعتقد أن تشارك في تطوير الكيسات الكلوية، وحتى الآن لا يوجد أي أداة مثالية لفحص هذه الجينات. نحن تصف طريقة سريعة وسهلة لمراقبة تشكيل الكيس الكلى بعد ضربة قاضية الجينات في الزرد. يمكن على الأرجح هذه الطريقة يتم استخدامها لفحص الجينات الأخرى PKD مرشح.

واحدة من نقاط القوة في هذه التقنية هو بساطته. في تيراغرام (wt1b: GFP) الزرد، والتعبير عن GFP في الكبيبات، الأنابيب والقنوات، مما يجعله معينلاي نموذج مناسب لدراسة هيكل الكلى سليفة الكلوة بأكمله. تيراغرام (wt1b: GFP) الزرد يسمح التصور المباشر للهيكل سليفة الكلوة وتشكيل الكيس الكلى بعد الجين تدق إلى أسفل. ويشتبه في أن Wnt5a ضربة قاضية يمكن أن يسبب تشوهات مسار PCP وتشكيل الكيس الكلى في الفئران. ومع ذلك، خروج المغلوب العالمي للWnt5a هو ما بعد الولادة قاتلة في الفئران، ويمكن أن لا يمكن استخدامها لمراقبة تشكيل الكيس الكلى بعد الولادة. باستخدام الطريقة الموصوفة هنا، في فترة قصيرة من الزمن تقرر أن wnt5a ضربة قاضية في الزرد أسفرت عن تشكيل الكيس الكلى. وبهذه النتيجة، فإن الخطوة المقبلة ستكون لتوليد الكلى محددة الفئران خروج المغلوب Wnt5a.

يحتوي هذا الأسلوب أيضا عدد قليل من القيود. ومن الصعب تقدير فعالية المنظمات الأعضاء دون الأجسام المضادة جيدة، واستبعاد إمكانية أن MO قد تمنع وظيفة جين ذي صلة أن يسبب النمط الظاهري. واسعة النطاق السيطرة experimeمطلوبة اليلة للتغلب على هذه المشاكل. واستخدمت اثنين من المنظمات الأعضاء متميزة، وAUG-MO وMO splice- لتقييم wnt5a ضربة قاضية. كلا morphants phenocopied بعضها البعض، وحقن الفأر Wnt5a مرنا، ومقاومة للموس بسبب اختلاف في بنية الزوج قاعدة الابتدائي، انقاذ النمط الظاهري غير طبيعية، مما يدل على أن النمط الظاهري لم يكن بسبب الآثار "بعيدا عن الهدف" من MO.

يوضح نموذج لدينا أن wnt5a ضربة قاضية تسبب تشكيل الكيس الكلى في الأجنة الزرد. يمكن استخدام هذه المنهجية لاختبار العديد من الجينات الأخرى التي يشتبه أن تسبب تشكيل الكيس الكلوي، كما هو بسيط وأقل استهلاكا للوقت. مرة واحدة ثبت أن نتائج طفرة جينية في تشكيل الكيس الكلى في الزرد، ويمكن إجراء مزيد من التجارب للتحقيق في آليات تفصيلية لتشكيل الكيس الكلى. في هذه التجربة، منذ Wnt5a الفئران خروج المغلوب العالمي هي قاتلة بعد الولادة والتي لا يمكن استخدامها لأوبخدمة تشكيل الكيس الكلى بعد الولادة، فإن الخطوة المقبلة ستكون لتوليد الفئران Wnt5a خروج المغلوب الكلى الخاصة باستخدام نظام جنة المساواة العرقية، السلمون المدخن.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Acknowledgments

وأيد هذا العمل من قبل المعاهد الوطنية للصحة (DK093625 لLH، وDK069909 وDK047757 إلى JHL) وVA (جائزة الاستحقاق I01BX000820 إلى JHL). ونود أن نشكر الدكتور مايكل حزمة والدكتور جي وفي جامعة ولاية بنسلفانيا اسماك الزرد الأساسية لتوفير الدعم الضروري.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
0.5% Phenol-Red Sigma P0290 Color indicator for injection
Morpholino Genn Tools, LLC (customized) Customized designed to the gene of interest
Pre-pulled needle Tritech Research MINJ-PP If large amount of needle is required, you can also purchase a needle puller and prepare the needle in the lab
T7 mMessage Kit Ambion 1344 For in vitro transcription to make capped mRNA for rescue experiment
N-Phenylthiourea Sigma P7629 For prevention of melanization
Tricaine Sigma A5040 Also called ethyl 3-aminobenzoate, for zebrafish anesthesia
Methyl Cellulose Sigma M-0387 For position of zebrafish 
QIAquick PCR Purification Kit  Qiagen 28104 For purification of PCR product for cap RNA synthesis.
dNTP mix Promega U1511 For PCR
Tag DNA Polymerase Invitrogen 10342-053 For PCR
NanoDrop spectrophotometer Thermo Scientific ND-1000 For measure morpholino and RNA concentration
Air Compressor Werther International, Inc. Panther Compact 106 Air source for injection
Pico micro-injection pump World Precision Instruments Inc PV830 Pnematic PicoPump Other types of microinjection system can be used.
Micro-manuplator World Precision Instruments Inc MMJR Right-handed (MMJL for left handed)
Needle holder World Precision Instruments Inc 5430-ALL To hold needle for micromanipulation
Dumont Tweezers Fine Surgical Tools 11253-20 For breaking off the needle tip
Dissecting microscope Leica M205C  For observing and imaging zebrafish embryos
Fluorscence microscope Zeiss Axio Obserer D1m   For imaging zebrafish pronephros
Capillary tube (I.D. 0.15 mm) VitroCom CV1525Q-100 For measure the volume of each injected drop

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Choi, S. Y., et al. Cdc42 deficiency causes ciliary abnormalities and cystic kidneys. J Am Soc Nephrol. 24, (9), 1435-1450 (2013).
  2. Hostetter, C. L., Sullivan-Brown, J. L., Burdine, R. D. Zebrafish pronephros: a model for understanding cystic kidney disease. Dev Dyn. 228, (3), 514-522 (2003).
  3. Nyengaard, J. R., Bendtsen, T. F. Glomerular number and size in relation to age, kidney weight, and body surface in normal man. Anat Rec. 232, (2), 514-201 (1992).
  4. Keller, G., Zimmer, G., Mall, G., Ritz, E., Amann, K. Nephron number in patients with primary hypertension. N Engl J Med. 348, (2), 101-108 (2003).
  5. Cullen-McEwen, L. A., Kett, M. M., Dowling, J., Anderson, W. P., Bertram, J. F. Nephron number, renal function, and arterial pressure in aged GDNF heterozygous mice. Hypertension. 41, (2), 335-340 (2003).
  6. Gerlach, G. F., Wingert, R. A. Kidney organogenesis in the zebrafish: insights into vertebrate nephrogenesis and regeneration. Wiley Interdiscip Rev Dev Biol. 2, (5), 559-585 (2013).
  7. Igarashi, P. Overview: nonmammalian organisms for studies of kidney development and disease. J Am Soc Nephrol. 16, (2), 296-298 (2005).
  8. Zhou, W., Boucher, R. C., Bollig, F., Englert, C., Hildebrandt, F. Characterization of mesonephric development and regeneration using transgenic zebrafish. Am J Physiol Renal Physiol. 299, (5), 1040-1047 (2010).
  9. Liu, S., et al. A defect in a novel Nek-family kinase causes cystic kidney disease in the mouse and in zebrafish. Development. 129, (24), 5839-5846 (2002).
  10. Slanchev, K., Putz, M., Schmitt, A., Kramer-Zucker, A., Walz, G. Nephrocystin-4 is required for pronephric duct-dependent cloaca formation in zebrafish. Hum Mol Genet. 20, (16), 3119-3128 (2011).
  11. Huang, L., et al. The role of Wnt5a in prostate gland development. Dev Biol. 328, (2), 188-199 (2009).
  12. Andre, P., et al. The Wnt coreceptor Ryk regulates Wnt/planar cell polarity by modulating the degradation of the core planar cell polarity component Vangl2. J Biol Chem. 287, (53), 44518-44525 (2012).
  13. Kimmel, C. B., Ballard, W. W., Kimmel, S. R., Ullmann, B., Schilling, T. F. Stages of embryonic development of the zebrafish. Dev Dyn. 203, (3), 253-310 (1995).
  14. Torres, V. E., Harris, P. C., Pirson, Y. Autosomal dominant polycystic kidney disease. Lancet. 369, (9569), 1287-1301 (2007).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics