Eine mögliche Zebrafisch-Modell der Kidney Disease: Knockdown von

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Huang, L., Xiao, A., Wecker, A., McBride, D. A., Choi, S. Y., Zhou, W., Lipschutz, J. H. A Possible Zebrafish Model of Polycystic Kidney Disease: Knockdown of wnt5a Causes Cysts in Zebrafish Kidneys. J. Vis. Exp. (94), e52156, doi:10.3791/52156 (2014).

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Abstract

Introduction

Zebrafisch (Danio rerio) Embryonen wurden allgemein als Modell für die Untersuchung der Nierenentwicklung und polyzystische Nierenerkrankung verwendet. Es gibt viele Vorteile der Verwendung von Zebrafisch als Tiermodell: Die Durchführbarkeit Studium genetischen Wechselwirkungen, die Fähigkeit, Antisense-Morpholino (MO) für die Proteinzuschlags verwenden, die Möglichkeit, schnell zu testen große Anzahl von Embryos und die Betrachtung Organ Phänotypen lebenden Larven 1. Die Vorniere ist die erste Niere bei Wirbeltieren entwickeln und ist funktional in Zebrafisch-Larven 2. Die Struktur der Zebrafisch pronephros ist relativ einfach im Vergleich zu den Säuger Metanephros, um die dritte und letzte Niere in Säugetieren zu entwickeln. Nephronanalog ist die Arbeitseinheit der Niere, wobei jede humane Nieren enthaltend zwischen 500.000-1.000.000 Nephronen 3,4 und jeder Maus Niere mit ungefähr 13.000 Nephronen 5, was es schwierig macht, einzelne Nephron Struktur beobachten in Mensch oder Maus Nieren. Der Zebrafisch besitzt nur zwei Nephronen und jedes Zebrabärbling Nephron enthält alle Hauptkomponenten im Glomerulus und Tubuli von Mäusen und Menschen und 6 ähnlich speziellen Nierenzelltypen gefunden. Im Vergleich zu anderen Wirbeltiermodellen wie Xenopus, Zebrafisch Nephron mehr ähnelt die Säuger Nephron weil es ein geschlossenes System 7 hat.

In den letzten Jahren hat sich die Zebrafisch wurde sequenziert, was die breite Einführung von genetischen Werkzeugen umfangreichen Mutanten Ressourcen und Sammlungen von transgenen Reporterlinien in Zebrafisch-Modelle. Die Zebrafisch Vorniere bildet sich zwischen 12 bis 72 Stunden nach der Befruchtung (HPF) und kann leicht in den durchsichtigen Embryos visualisiert werden. Die Wilms-Tumor Protein WT1 ist ein wesentlicher Faktor für die Nierenentwicklung. Transgenic Zebrafischlinien grün fluoreszierende Protein (GFP) unter der Kontrolle des Promotors wt1b Tg Ausdruck (wt1b: GFP) zeigen GFP expression speziell in pronephric Regionen in Zebrafischembryonen, ab 17 HPF 8. Nephronophthisis (NPHP), eine autosomal-rezessive zystischen Nierenerkrankungen, wird durch Mutationen der Gene NPHP 9 verursacht. NPHP4 durch Morpholino Knockdown verursacht Zystenbildung in der Tg (wt1b: GFP). Fisch 10 Daher ist dieser transgene Fische ein geeignetes Modell zur Beobachtung Nieren Strukturen und Zystenbildung während der Nierenentwicklung. Wichtig ist, dass der Einfluss von Modulatoren der Nierenentwicklung Verwendung dieses Stammes in einer Zeit und Arbeit effizient untersucht werden.

Unser Papier beschreibt die Verwendung von Tg (wt1b: GFP) Fisch als Vorbild zu Nierenzystenbildung nach Genmodulation visualisieren. Wir benutzten Start- und Spleißstellen Antisense-MOs um knock down der Wnt5a Gen in Zebrafisch. Wnt5a ist eine nicht-kanonische sekretierte Glykoprotein des Wnt-Familie, die in der Entwicklung von verschiedenen Organen und postnatalen zellulären eine wichtige Rolle spielt,Funktion 11. Wnt5a wirkt durch nicht-kanonischen Wnt-Signalwege, einschließlich der planaren Zellpolarität (PCP) Weg, die gefunden wurde, um eine Rolle in orientierte Zellteilung während der Nierentubuli Dehnung zu spielen. Wnt5a regelt die Wnt / PCP-Weg, indem ein Komplex mit dem Rezeptor ähnliche Tyrosinkinase (Ryk), die weiter transduziert Wnt5a Signalisierung durch Bildung eines Komplexes mit dem VANGL planaren Zellpolarität protein 2 (Vangl2), wodurch Vangl2 Stabilität 12 fördern. Defekte in der PCP-Weg kann in zufälliger Zellteilung verursachen und eine Nierenzystenbildung. Wir nutzten die Tg (wt1b: GFP) Zebrafisch Linie zu Nierenzystenbildung folgenden Wnt5a Zuschlags beobachten. Die Tg (wt1b: GFP) Zebrafisch-Modell ermöglicht die Live-Darstellung und zeitnahe Beobachtung der Nierenstruktur. Nach Wnt5a Zuschlags wurde Nierenzystenbildung gefunden, beginnend bei 24 HPF; bei 72 HPF, könnte Zysten in den Glomeruli und den proximalen Tubuli gefunden werden. Diese Methode könnte auch zu s verwendet werdencreen andere Gene, die Nierenzystenbildung verursachen könnten.

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Protocol

HINWEIS: Ethik Hinweise: Alle Zebrafisch-Experimente wurden von der Institutional Animal Care und Verwenden Committee an der Eastern Virginia Medical School zugelassen.

1. Morpholino Vorbereitung

  1. Design und Synthese Übersetzung blockier (Aug-) und Spleiß-Hemmung (Spleiß-) Antisense-Morpholino (MO) Oligonukleotide für das Gen von Interesse nach Herstellerangaben (1A). Bitte lesen Sie Informationen des Herstellers, die in Tabelle 1.
    HINWEIS: MOs werden als lyophilisierte Aktien in Glasflaschen geliefert.
  2. Hinzufügen hochwertigen sterilem Wasser auf die Glasflasche zu resuspendieren MOs zu einer Endkonzentration von 25 ug / ul. Stellen Sie sicher, dass das Oligonukleotid vollständig gelöst ist. Wenn einige solide bleibt, heizen das Fläschchen mit dem Lager Oligonukleotid-Lösung bei 65 ° C für 5 bis 10 Minuten und kurz vortexen.
  3. Bewahren Sie die MO-Stammlösung bei RT. Lagern Sie diese nicht bei 4 ° C oder -20 °; C, weil geringere Temperaturen können dazu führen, die MO-Oligonukleotids an der Behälterwand zu binden. Messen Sie die Konzentration der Stammlösung mit einem Spektralphotometer jedes Mal eine neue MO-Stammlösung hergestellt wird (siehe Tabelle 1 beziehen).
  4. Bereiten Sie die MO-Arbeitslösung am Tag der Injektion durch Verdünnung der Stammlösung mit hochgradigen sterilem Wasser auf die gewünschte Dosis. Mit 0,5% Phenol-Rot zu einer Konzentration von 0,05% zu erreichen. Wenn Sie beispielsweise 5 ul Arbeitslösung mit einer Konzentration von 15 ng / nL, fügen 3 ul MO Stammlösung und 0,5 ul 0,5% Phenol-rot bis 1,5 ul Wasser.
    HINWEIS: Mit dieser Arbeitskonzentration, jeder Tropfen (500 pl) der Injektion enthält 7,5 ng MO und zwei Tropfen enthalten 15 ng von MO.

2. Herstellung der Einspritzvorrichtung

  1. Kauf Glas vorgezogen Nadeln (siehe Tabelle 1 für weitere Informationen). Alternativ ziehen Sie das Glas Injektionsnadel with eine Nadel Magnet.
  2. Schalten Sie den Kompressor und stellen Sie die Druckeinstellung auf 50 psi. Schalten Sie den Binokular-Lichtquelle und Pico Mikroeinspritzpumpe und passen Sie die Einstellungen wie folgt: Halten Druck 20 psi, werfen Druck 10 psi, Zeit-Wert von 2,5 und 100 & mgr; s Palette von Gating.
  3. Legen Sie das Glas vor, zog Nadel mit 5 ul der Injektionslösung und setzen Sie die Nadel in vertikaler Position mit der Spitze nach unten. Warten Sie, bis die gesamte Lösung der Nadelspitze ohne sichtbare Luftblasen erreicht. Setzen Sie den Nadelhalter in einer passenden Position neben dem Mikroskop und legen Sie die Glasnadel in die Halterung. Ist der Einspritzwinkel um 45 Grad.
  4. Bringen Sie die Nadelspitze in Sicht unter dem Mikroskop, hoch über der Bühne, und konzentrieren sich auf die dünnsten Bereich der Spitze. Brechen Sie die Nadelspitze mit feinen Spitze Pinzette.
  5. Legen Sie ein Lineal und ein Rohr oder Schlauch mit Innendurchmesser von 0,15 mm nebeneinander unter dem Mikroskop;Injizieren der Lösung in ein Ende des Kapillarröhrchens einen Flüssigkeitssäule bilden. Stellen Sie die Auswurfzeit alle 17 Tropfen je 1 mm Länge Flüssigkeitssäule zu erreichen, wird das Volumen jeder Tropfen ist 1 nl (Tropfenvolumen = π x Radius 2 x Länge (der Flüssigkeitssäule) / count (Tropfen).
    HINWEIS: Ein Tropfen mit einem Durchmesser von 0,1 mm ergibt einen Injektionsvolumen von etwa 500 pl (Tropfenvolumen = 4/3 x π x Radius 3).

3. Herstellung der befruchteten Zebrafischembryonen und Injektion mit Morpholinos

  1. Transgenen Zebrafisch Zuchtpaare nach den veröffentlichten Protokollen für Standard Zebrafischhaltung und Wartung: bis Tg (GFP wt1b) ein. Sammeln Embryonen nach Naturbrut, und halten sie in einer 10 cm Petrischale mit E3 Wasser gefüllt (5 mM NaCl, 0,17 mm KCl, 0,33 mM CaCl 2, 0,33 mM MgSO 4). Starten MO Injektion sofort 13. Überwachen Embryo Morphologie unter dem Mikroskop und stellen Sie sicher, MO Injektion ist im Ein-Zell-Stadium, oder spätestens am Vierzellstadium.
    1. Transfer der Embryonen in einen 10-cm-Petrischale mit Agar Tröge keilförmig. Saugen Sie das zusätzliche E3 Wasser und drücken Sie vorsichtig die Embryonen in die Tröge.
    2. Bearbeiten Sie die Embryonen mit der Mikropipette 1-Zell-Stadium Embryos unter dem Binokular visualisieren. Durchdringen die Chorion und dann das Eigelb, ein oder zwei Tropfen MO in den Dotter (1 Tropfen = 500 pl) zu injizieren. Übertragen Sie die injizierten Embryonen zu einer 10 cm Petrischale mit E3 Wasser und Inkubation bei 28,5 ° C.
  2. Nach den Injektionen, entfernen Sie die toten Embryonen und notieren Sie die Anzahl der injizierten Embryonen. Ersetzen Sie die E3 Wasser in der Schale alle 24 bis 48 Stunden.

4. Phänotyp Rettungsversuche

  1. Auszuwählen, die ein Ortholog von einer anderen Spezies, die eine andere primäre Basispaarstruktur (üblicherweise 3-7 Basenpaar Mismatches) aufweist und daher beständig gegen das MO, zur Rettung. Beispielsweise wird in diesem Experiment haben wir unsMaus weil die Maus Wnt5a mRNA-Sequenz unterscheidet sich von der Zebrafisch-Sequenz.
  2. Entwerfen eines Primers mit der Vorwärtsprimer beginnend beim Translationsstelle und der Reverse-Primer in der Nähe des Endes der mRNA codierende Region eingestellt. Hinzufügen eines T7-Promotorsequenz am 5'-Ende des Vorwärtsprimer-Sequenz. In diesem Experiment verwendeten wir die folgenden Primersequenzen; vorwärts: 5'-taa tac gac tca cta Tag GGA cta tga tgc tgc tga agc tga a- 3 'und umgekehrt: 5'-TCA ctt gca gac gta ctg gtc- 3'.
  3. Durchführen einer 50 ul Polymerase-Kettenreaktion (PCR) mit den Primersatz (0,5 & mgr; M von jedem Primer) vorstehend ausgebildet und 0,1 & mgr; g Matrizen-DNA, die das Maus Wnt5a cDNA-Sequenz mit der folgenden PCR-Programm: 1 Zyklus bei 95 ° C für 5 min; 35 Zyklen von 95 ° C (30 sec), 58,5 ° C (30 sec), 72 ° C (1 min); und abschließende Extension bei 72 ° C für 7 min.
  4. Nach Abschluss ter Zyklus ausführen 2 ul des PCR-Produkts auf 1% Agarosegel, um sicherzustellen, dass die Band die richtige Größe. Man reinige das PCR-Produkt mit einem PCR-Purification-Kit nach den Anweisungen des Herstellers. Überprüfen DNA-Konzentration mit einem Spektralphotometer. Speicherung des gereinigten PCR-Produkts bei -20 ° C oder direkt in verkappter RNA Transkription Verwendung im nächsten Schritt.
  5. Synthetisieren in vitro mRNA mit Cap mit einem verkappten RNA-Synthese-Kits nach den Anweisungen des Herstellers. Verdünnen Sie die mRNA in 20 ul RNase freies Wasser und Bestimmung der Konzentration. Aliquot der RNA und bei -80 ° C.
  6. Am Tag der Injektion, bereiten eine Arbeitslösung der mRNA mit RNase frei sterilem Wasser. Man beachte, daß 40 pg ist im allgemeinen die höchste RNA Dosis, bei der unspezifische oder toxische Wirkung des RNA treten nicht auf. Halten Sie die Arbeitslösung auf Eis. Spritzen Sie die Embryos mit MO und dann die Rettung mRNA, oder Co-spritzen beide zusammen. Wenn beispielsweise die Konzentration der mRNA prepared in Schritt 4.5 ist 0,6 ug / ul, fügen 0,67 ul mRNA (0,4 ug) bis 4,33 & mgr; l RNase-freies Wasser bis zu einer Endkonzentration von 0,08 ug / ul zu ergeben, und ein Tropfen (500 pl) jeder Injektion enthält 40 pg mRNA. Bereiten MO, wie in Schritt 3 beschrieben.

5. Vorbereitung der injizierten Embryonen für Fluorescent Imaging

  1. Nach der Inkubation bei 28,5 ° CO / N, fügen Sie 0,003% N-Phenylthioharnstoff (PTU) mit dem E3 Wasser Melanisierung, die Beobachtung der Vorniere Struktur mittels Fluoreszenzmikroskopie wirkt verhindern. Allerdings PTU nicht vor Gastrulation abgeben, weil es die frühe embryonale Entwicklung betrifft.
  2. Bei 48 HPF, manuell dechorionate die Embryonen mit feinen Pinzette. Nehmen Sie Bilder von 48 und 72 HPF Embryonen unter einem Licht Dissektionsmikroskop.
    Hinweis: Diese Bilder sind ohne Narkose entnommen werden.
  3. Etwa 10 Minuten vor der unter dem Fluoreszenzmikroskop Bildgebung, betäuben die Embryonen, indem Sie sie in10 cm Petrischale mit 160 ug / ml gepufferte Tricaine. Warten Sie 5-10 Minuten, und dann locker am Zebrafisch zu bestätigen, dass sie sich nicht bewegen und damit die Narkose wirkt.
  4. Nachdem die Embryos betäubt werden, montieren sie in 3% Methylcellulose und orientieren sie in Bauchlage unter einem Binokular (siehe Tabelle 1).
  5. Beachten Sie die Vorniere Struktur unter einem Fluoreszenzmikroskop (siehe auch Tabelle 1) und nehmen Sie Bilder mit unterschiedlicher Vergrößerung (10X und 20X).

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Representative Results

Wnt5a niederschlagen wurde durch die Einführung Übersetzung blockieren MO erreicht (August-MO) oder Exon / Intron-Grenze Splice-MO (Splice-MO) auf Zebrafischembryonen an dem einen Zellstadium. Die August-MO zielt auf das Start-Codon und daher hemmt sowohl von Müttern und zygotischen Wnt5a Nachricht. Der Spleiß-MO zielt die dritte Spleißdonorstelle und hemmt nur die zygotischen Transkript Wnt5a (1A). Die Aug- und Spleiß- morphants phenocopied seitig mit mehreren Mängeln, darunter Ringelschwanz hinunter Körperachse und Herzbeutel Ödeme (1B). Maus Wnt5a mRNA teilweise rettet die morphanten Phänotyp (4B), die zeigen, dass der Phänotyp nicht auf Nebeneffekte. Die Tg (wt1b: GFP) transgenen Zebrafisch, das GFP vom wt1b Promotor angetrieben, dass die GFP rekapituliert endogenen Expression wt1b exprimiert, wurde verwendet, um die Struktur pronephric umreißen. Die Tg (WT1b: GFP) Fische zeigten glomerulären Zystenbildung nach Wnt5a Zuschlags bei 48 hpf, während Kontrollembryonen mit Phenol-rot alleine injiziert angezeigten normalen pronephric Entwicklung, unter Erzeugung eines kondensierten Glomerulus in einer "U" -Form mit Röhren, die sich seitlich (Figur 2) erstrecken. Bei 72 HPF, glomeruläre Struktur weiter mit leicht visualisiert Gefäßschlingen entwickelt, sowohl mit Aug- und Spleiß-MOs entwickelt Zysten in den Glomeruli und proximalen Tubuli (Abbildung 3). H & E-Färbung der quer von histologischen Schnitten von 72 hpf morphanten Embryos zeigte Zystenbildung, gestört Glomeruli und der dilatierten Nierentubuli (4A).

Figur 1
Abbildung 1: Morpholino Design und lichtmikroskopische Aussehen des Zebrafischembryonen zu 72 Stunden nach der Befruchtung (HPF) nach der Injektionmit Phenolrot-Steuerung, August-MO oder Spleiß-MO. (A) Schematische Darstellung der Zebrafisch Wnt5a Gen, das die kodierende Region und die Regionen von der Aug- und Spleiß- MO richtet. Die Wnt5a August-MO wurde entwickelt, um die ATG-Startcodon an Protein die Translation; der Spleiß-MO wurde entwickelt, um die Grenze des Exons 3 und 4 Splice-MO Oligo gegen keines Spleißstelle wird erwartet, dass entweder eine vollständige oder teilweise einzigen Exon Deletion oder eine vollständige oder teilweise Einzel Intron Insertion erzeugen gerichtet Ziel. Wir entschieden uns, sowohl mit einer August-MO, die Mütter- und zygotischen Nachricht betrifft, und eine Spleiß-MO, die nur den zygotischen Transkript wirkt niederschlagen Wnt5a, um die Spezifität zu verbessern. (B) Die mit Phenol-rot injiziert Embryo ( Einspritzsteuerung) zeigten normale Körper Krümmung, Länge und Herzbeutel. Der Embryo mit dem August-MO injiziert zeigten nach unten Ringelschwanz Struktur und Herzbeutel Ödeme und den Embryo mit dem Spleiß-MO injiziert phenocopied dieErscheinung des Embryos injiziert mit August-MO. Bar = 2 mm.

Abbildung 2
Abbildung 2: Fluoreszenzmikroskopische Aussehen Tg (wt1b: GFP). Zebrafischembryonen bei 48 HPF nach der Injektion mit Phenolrot-Steuerung, Wnt5a August-MO oder Wnt5a Splice-MO in der Phenolrot-Einspritzsteuerung, war Vorniere Entwicklung abgeschlossen 48 HPF. Zwei kondensierte Glomeruli und der proximalen Tubuli gesehen werden kann. Zystenbildung kann in Glomeruli in sowohl der Aug- und Spleiß-MO Embryonen bei 48 bis zum Ende des Zebrafisch pronephros Entwicklung (Bar = 100 & mgr; m) HPF beachten.

Figur 3
Abbildung 3: Fluoreszenzmikroskopische Aussehen Tg (wt1b: GFP) Zebrafischembryonen bei 72 HPF nach der Injektion mit Phenolrot-Kontrolle, Wnt5a August-MO oder Wnt5a Spleiß-MO. Bei 72 HPF kann glomerulären Struktur deutlich sichtbar gemacht werden. In Phenolrot-Einspritzsteuerung, zwei kondensierten Glomeruli und Gefäßschleifen festzustellen. Wnt5a Zuschlags Folge Zystenbildung in allen Nephronstrukturen, die sichtbar gemacht werden können, einschließlich der Glomeruli und proximalen rohrförmigen Bereich (Bar = 100 & mgr; m).

4
Figur 4: (A) H & E-Färbung der quer von histologischen Schnitten von 72 hpf morphanten Embryos zeigte Zystenbildung, gestört Glomeruli und der dilatierten Nierentubuli. Pfeil: pronephric Glomeruli; Pfeilspitze: dilatative Nierentubuli. Bar = 20 & mgr; m. (B) Die August-MO Phänotyp könnte teilweise mit der Maus Wnt5a, beständig gegen das MO aufgrund einer Differenz in der Grundbasenpaar-Struktur gerettet werden, Was zeigt, dass der Phänotyp nicht auf einem Off-Target-Effekte. Der Unterschied war bei p <0,05 statistisch signifikant (* p <0,05 vs Phenol-rot-Gruppe, # p <0,05 vs August-MO 15 ng Gruppe).

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Discussion

Polyzystische Nierenerkrankung (PKD) ist eine der führenden Ursachen für end-stage renal Krankheit beim Menschen und wird durch fortschreitende Zysten, Nieren Erweiterung und abnorme Entwicklung Röhrchen 14 aus. Autosomal dominante PKD (ADPKD) ist eine Erbkrankheit, bei der die Mutation von entweder PKD1 kodiert Polycystin-1 (PC1) oder PKD2, Polycystin-2 (PC2) kodiert, führt zu Zystennieren. Viele andere Gene, vor allem Proteine, die in der primären Zilien gefunden codiert, wird angenommen, dass bei der Entwicklung von Nierenzysten einbezogen werden, und bisher gibt es keine ideale Werkzeug, um diese Gene zu untersuchen. Wir beschreiben eine schnelle und einfache Möglichkeit, um Nierenzystenbildung nach der Gen-Knockdown im Zebrafisch zu beobachten. Diese Methode kann wahrscheinlich verwendet, um andere Kandidaten PKD-Gene zu screenen.

Eine der Stärken dieser Technik liegt in ihrer Einfachheit. In Tg (wt1b: GFP) Zebrafisch ist die Expression von GFP in den Glomeruli, Röhrchen und Kanäle, die es einem bestimmten machtly geeignetes Modell, um die gesamte pronephric Nierenstruktur zu untersuchen. Die Tg (wt1b: GFP) Zebrafisch ermöglicht die direkte Visualisierung von pronephric Struktur und Nierenzystenbildung nach der Gen-knock down. Es wurde vermutet, dass Wnt5a Zuschlags konnten PCP-Weg Mängel und Nierenzystenbildung bei Mäusen verursachen. Allerdings ist global Knockout von Wnt5a postnatale tödlich bei Mäusen und konnte nicht verwendet werden, um Nierenzystenbildung nach der Geburt zu beobachten. Durch die Verwendung der hier beschriebenen, in einem kurzen Zeitraum Verfahren wurde bestimmt, daß Wnt5a in Zebrafisch-Knockdown Folge Nierenzystenbildung. Mit diesem Ergebnis wird der nächste Schritt sein, Nieren spezifischen Wnt5a knockout Mäuse zu erzeugen.

Diese Technik hat auch ein paar Einschränkungen. Es ist schwierig, die Wirksamkeit von MOs schätzen, ohne eine gute Antikörper und an die Möglichkeit ausschließen, dass die MO könnte die Funktion eines Gens hemmen irrelevant, um den Phänotyp führen. Umfangreiche Kontroll Experiments sind erforderlich, um diese Probleme zu überwinden. Zwei verschiedene MOs, die August-MO und der Spleiß- MO wurden verwendet, um Wnt5a Zuschlags bewerten. Beide morphants phenocopied einander und Injektion von Maus Wnt5a mRNA, gegenüber den MOs aufgrund eines Unterschieds in der primären Basispaarstruktur rettete die abnorme Phänotyp, was zeigt, daß der Phänotyp nicht auf einem "off-target" Effekte der MO.

Unser Modell zeigt, dass Wnt5a Zuschlags verursacht Nierenzystenbildung im Zebrafischembryonen. Diese Methode kann verwendet werden, um viele andere Gene, die im Verdacht stehen, Nierenzystenbildung führen zu testen, da es einfach ist und weniger Zeit. Wenn nachgewiesen wird, dass die Gen-Mutation führt zu Nierenzystenbildung im Zebrafisch, können weitere Versuche durchgeführt, um die detaillierten Mechanismen der Nierenzystenbildung zu untersuchen. Bei diesem Versuch, da die globale Wnt5a knockout Mäuse sind postnatalen tödlich und kann nicht verwendet werden, um OBdienen Nierenzystenbildung nach der Geburt, wird der nächste Schritt sein, um Nierenspezifische Wnt5a Knockout-Mäusen unter Verwendung des Cre-lox-System zu erzeugen.

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Acknowledgments

Diese Arbeit wurde durch die NIH (DK093625 an LH und DK069909 und DK047757 zu JHL) und die VA (Merit Award I01BX000820 zu JHL). Wir möchten Dr. Michael Pack und Dr. Jie er für die Bereitstellung wesentlicher Unterstützung danken an der Universität von Pennsylvania Zebrafisch-Core.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
0.5% Phenol-Red Sigma P0290 Color indicator for injection
Morpholino Genn Tools, LLC (customized) Customized designed to the gene of interest
Pre-pulled needle Tritech Research MINJ-PP If large amount of needle is required, you can also purchase a needle puller and prepare the needle in the lab
T7 mMessage Kit Ambion 1344 For in vitro transcription to make capped mRNA for rescue experiment
N-Phenylthiourea Sigma P7629 For prevention of melanization
Tricaine Sigma A5040 Also called ethyl 3-aminobenzoate, for zebrafish anesthesia
Methyl Cellulose Sigma M-0387 For position of zebrafish 
QIAquick PCR Purification Kit  Qiagen 28104 For purification of PCR product for cap RNA synthesis.
dNTP mix Promega U1511 For PCR
Tag DNA Polymerase Invitrogen 10342-053 For PCR
NanoDrop spectrophotometer Thermo Scientific ND-1000 For measure morpholino and RNA concentration
Air Compressor Werther International, Inc. Panther Compact 106 Air source for injection
Pico micro-injection pump World Precision Instruments Inc PV830 Pnematic PicoPump Other types of microinjection system can be used.
Micro-manuplator World Precision Instruments Inc MMJR Right-handed (MMJL for left handed)
Needle holder World Precision Instruments Inc 5430-ALL To hold needle for micromanipulation
Dumont Tweezers Fine Surgical Tools 11253-20 For breaking off the needle tip
Dissecting microscope Leica M205C  For observing and imaging zebrafish embryos
Fluorscence microscope Zeiss Axio Obserer D1m   For imaging zebrafish pronephros
Capillary tube (I.D. 0.15 mm) VitroCom CV1525Q-100 For measure the volume of each injected drop

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References

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