Polikistik Böbrek Hastalığı Olası Zebra balığı Modeli: demonte

Medicine

Your institution must subscribe to JoVE's Medicine section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations | Reprints and Permissions

Huang, L., Xiao, A., Wecker, A., McBride, D. A., Choi, S. Y., Zhou, W., Lipschutz, J. H. A Possible Zebrafish Model of Polycystic Kidney Disease: Knockdown of wnt5a Causes Cysts in Zebrafish Kidneys. J. Vis. Exp. (94), e52156, doi:10.3791/52156 (2014).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Introduction

Balığı (Danio rerio) embriyo yaygın böbrek gelişim ve polikistik böbrek hastalığı çalışmak için bir model olarak kullanılmıştır. Orada bir hayvan modeli olarak zebrafish kullanarak pek çok avantajı vardır: genetik etkileşimlerin incelenmesinde fizibilite protein demonte için antisens morpholinos (MO) kullanma yeteneği fırsat hızlı bir şekilde embriyo sayıda tahlil edilmesi ve organ fenotipleri görüntüleme kolaylığı larva 1 yaşayan. pronephros omurgalılarda geliştirmek için ilk böbrek ve larva zebrafish 2 işlevseldir. zebra balığı pronephros yapısının memeli metanephros nispeten basit karşılaştırıldığında, üçüncü ve son böbrek, memelilerde geliştirmektir. nefron zor tek nefron yapısını gözlemlemek için yapım, 500,000-1,000,000 nefron 3,4 ve yaklaşık 13.000 nefron 5 olan her bir fare böbrek arasındaki içeren her insan böbreği ile, böbrek çalışma birimi in insan ya da fare böbrekler. zebra balığı iki nefron vardır ve her zebra balığı nefron glomerülleri ve fareler ve insanlarda 6 ve benzeri özelleştirilmiş böbrek hücre tiplerinin tübüllerde bulunan tüm ana bileşenleri içerir. Kapalı bir sistem 7 çünkü böyle Xenopus gibi diğer omurgalı modellere göre, zebra balığı nefron daha yakından memeli nefron benzer.

Son yıllarda, zebra balığı genom genetik araçlar, geniş mutan kaynakları ve zebra balığı modelleri transgenik raportör hatları koleksiyonları geniş giriş sağlayan dizilenmiştir. 12-72 saat sonra döllenme (hpf) arasında Zebra balığı pronephros formları şeffaf embriyolar kolayca görülebilir. Wilm tümörü proteini WT1 böbrek gelişimi için önemli bir faktördür. Wt1b promoteri Tg kontrolü altında yeşil floresan protein (GFP) ifade eden transjenik zebrabalıkları hatları (wt1b GFP) GFP Expre göstermektedirsalgılanması, özellikle 17 hpf 8 başlayarak, Zebra balığı embriyolarının Pronephric bölgelerde yer. Nefronofitizi (NPHP), otozomal resesif kistik böbrek hastalığı, NPHP genlerinin 9 mutasyonlar neden olur. (Wt1b GFP) morfolino tarafından demonte NPHP4 Tg kist oluşumuna yol açtı. Balık 10 Bu nedenle, bu transjenik balık böbrek gelişimi esnasında böbrek yapıları ve kist oluşumunun gözlenmesi için uygun bir modeldir. Daha da önemlisi, böbrek gelişim modülatörlerinin etkisi, zaman ve iş gücü verimli bir şekilde, bu suşu kullanılarak incelenebilir.

Gen modülasyonu sonrası böbrek kist oluşumuna görselleştirmek için bir model olarak, balık: Bizim kağıt Tg (GFP wt1b) kullanımını tarif etmektedir. Biz zebrafish Wnt5a geni yıkmak için başlangıç ​​ve bağlayıcı sitesi, anti-duyu MOS kullanılır. Wnt5a çeşitli organ ve hücre sonrası gelişiminde önemli bir rol oynar, Wnt ailesinin bir kanonik salgılanan bir glikoprotein olup,Fonksiyon 11. Wnt5a renal tübüler uzama esnasında yönlendirilmiş hücre bölünmesi bir rol oynadığı tespit edilmiştir düzlemsel hücre polarite (PCP) yol da dahil olmak üzere olmayan doğal Wnt yollar üzerinden çalışır. Wnt5a, bundan başka Vangl2 stabilite 12 teşvik VANGL düzlemsel hücre kutup protein 2 (Vangl2) ile bir kompleks oluşturarak Wnt5a sinyal çeviren tirozin kinaz benzeri reseptör (Ryk) ile bir kompleks oluşturarak Wnt / PCP yolu düzenler. PCP yolunda kusurlar rastgele hücre bölünmesi sonucu ve böbrek kist oluşumuna neden olabilir. Wnt5a demonte aşağıdaki böbrek kist oluşumunu gözlemlemek için Zebra balığı çizgi: Biz Tg (GFP wt1b) kullanılır. Tg (wt1b: GFP) Zebra balığı modeli canlı görüntüleme ve böbrek yapısının zamanında gözlem izin verir. Wnt5a demonte sonra, böbrek kist oluşumu 24 hpf başlayan bulundu; 72 hpf, kistler glomeruli ve proksimal tübüllerde bulunamadı. Bu yöntem aynı zamanda s kullanılabilirböbrek kist oluşumuna neden olabilir creen diğer genler.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

NOT: Etik Açıklama: Tüm zebrabalıkları deneyler Eastern Virginia Medical School Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Kurulu tarafından kabul edildi.

1. Morfolino Hazırlık

  1. (Şekil 1A), üreticinin talimatlarına uygun olarak söz konusu gen için tasarım ve sentez için engelleme (AUG-) ve ek yeri engelleyici (Splice-), anti-sens morfolino (MO) oligonükleotidleri. Tablo 1'de üreticinin bilgilerine bakın lütfen.
    NOT: MOs cam şişelerde liyofilize hisse senetleri olarak sevk edilir.
  2. 25 ug / ml'lik bir son konsantrasyona kadar MOS yeniden askıya cam şişelere yüksek dereceli steril su ekle. Oligonükleotid tamamen eriyene emin olun. Bazı katı kalıntılar ise, 5 kısaca dk ve vorteks 10 için 65 ° C'de stok oligonükleotid çözeltisi içeren flakon ısı.
  3. Oda sıcaklığında MO stok solüsyonu saklayın. 4 ° C veya -20 ° C'de saklayın etmeyinC daha düşük sıcaklıklar MO oligonükleotid konteyner duvarına bağlamak için neden olabilir çünkü. Bir spektrofotometre kullanılarak stok çözeltisinin konsantrasyonunu ölçmek, yeni bir MO stok çözeltisi yapılan her zaman (Tablo1 bakınız).
  4. Istenen doz, yüksek dereceli steril su ile stok çözelti seyreltilerek enjeksiyonu gününde, MO çalışma çözeltisi hazırlayın. % 0.05'lik bir konsantrasyon elde etmek üzere% 0.5 fenol-kırmızı ekleyin. Örneğin, 15 ng / nL bir konsantrasyon ile 5 ul çalışma solüsyon elde etmek amacıyla 3 ul MO stok çözeltisi ve 0.5 ul% 0.5 fenol kırmızısı su, 1.5 ul ekle.
    NOT: Bu çalışma konsantrasyonu ile enjeksiyon her damla (500 pl) MO 7.5 ng içerir ve iki damla MO 15 ng içerir.

Enjeksiyon Aparatı 2. Hazırlık

  1. Satınalma cam (Ayrıntılı bilgi için bakınız Tablo 1 lütfen) iğneler önceden çekti. Alternatif olarak, cam enjeksiyon iğnesi wi çekinBir iğne çektirmesi inci.
  2. Hava kompresörü açın ve 50 psi basınç ayarı ayarlayın. Diseksiyon mikroskobu ışık kaynağı ve Pico mikro-enjeksiyon pompası açın ve aşağıdaki gibi ayarları: basıncı 20 psi tutun, basınç 10 psi, yolluk 2,5 ve 100 mikro saniye aralığı süresi değerini çıkarma.
  3. Enjeksiyon çözeltisi 5 ul camını önceden çekti iğne yükleyin ve ucu aşağı bakacak şekilde dikey konumda iğne yerleştirin. Tüm çözüm görünür hava kabarcıkları ile iğne ucu ulaşana kadar bekleyin. Mikroskop yanında uygun bir konumda iğne tutucu yerleştirin ve tutucu içine cam iğne yerleştirin. 45 derece enjeksiyon açısını ayarlayın.
  4. Yüksek sahneden, mikroskop altında görünümü içine iğne ucu getir, ve ucu ince bölgeye odaklanmak. İnce nokta cımbız ile iğne ucu kırın.
  5. Bir cetvel ve mikroskop altında yan 0,15 mm tarafının iç çapa sahip bir kılcal tüp yerleştirin;bir sıvı sütununu yapmak için kılcal borunun bir ucuna solüsyonu enjekte edilir. 1 mm uzunluk sıvı kolon başına her 17 damla ulaşmak için çıkarma zamanı ayarlayın, daha sonra her damla hacmi 1 nl sıvı sütunun = π x yarıçapı 2 x uzunluk (damla hacmi () damla / sayımı () 'dir.
    Not: 0.1 mm bir çapı olan bir damla 500 ul bir enjeksiyon hacmi (damla hacmi = 4/3 x π X yarıçapı 3) elde edilir.

Morpholinos 3. döllenmiş Zebra balığı Embriyolar hazırlanması ve Enjeksiyon

  1. Standart Zebra balığı yetiştiriciliği ve bakım için yayınlanan protokollere göre transgenik zebra balığı üreyen: Tg (GFP wt1b) ayarlayın. Doğal yumurtlama sonra embriyolar toplamak ve E3 su ile dolu bir 10 cm Petri için (5 mM NaCI, 0.17mm KCI, 0.33 mM CaCl2, 0.33 mM MgSO 4) 'de muhafaza edin. Hemen 13 MO enjeksiyon başlatın. Mikroskop altında embriyo morfolojisi izlemek ve emin olun MO enjeksiyon tek olanHücre sahne, ya da dört-hücre aşamasında daha sonra.
    1. Ile 10 cm'lik bir petri tabağına embriyoların transferi olukları agar kama şeklinde tasarlanmış olmasıdır. Ekstra E3 suyu aspire ve yavaşça olukları içine embriyolar basın.
    2. Mikroskop altında 1-hücre aşaması embriyo görselleştirmek için mikropipet ile embriyolar işleyin. Yumurta sarısı (1 damla = 500 ul) içine MO bir iki damla enjekte koryon ve yumurta sarısı nüfuz. E3 su ile 10 cm'lik petri enjekte embriyolar transfer ve 28.5 ° C'de inkübe.
  2. Enjeksiyondan sonra, ölü embriyolar kaldırmak ve enjekte edilen embriyoların sayısını kaydetmek. Çanak, her 24 ila 48 saat içinde E3 suyu değiştirin.

4. Fenotip Kurtarma Deneyler

  1. Kurtarma MO dayanıklı nedenle, farklı bir birincil baz çifti yapısı (genellikle 3-7 baz çifti uyumsuzlukları) sahiptir ve başka türlerden, bir ortolog seçin. Örneğin, bu deneyde, seçtikfare fare Wnt5a mRNA dizisi Zebra balığı diziden farklı olduğu için.
  2. Ileri primer translasyon sitesi ve mRNA kodlama bölgesinin sonuna yakın bir ters primer olarak başlayan bir primer tasarımı. Ileri primer dizisinin 5'-ucunda, bir T7 yükseltici seri ekleyin. Bu deneyde, aşağıdaki primer dizileri kullanılır; ileri: 5'taa tac gac tca cta etiketi gga cta TGA tgc tgc TGA agc TGA a- 3 've ters: 5'tca CTT DHA gac gta ctg gtc- 3'.
  3. Yukarıda tasarlanmış bir primer grubu (her bir primerden 0.5 uM) ve Aşağıdaki PCR programı ile fare Wnt5a cDNA sekansını ihtiva eden 0.1 ug şablon DNA ile birlikte 50 ul Polimeraz Zincir Reaksiyonu (PCR) yapın: 5 dakika boyunca 95 ° C 'de 1 döngü; 95 ° C (30 saniye), 58.5 ° C (30 saniye), 72 ° C (1 dakika) 35 döngü; ve son uzatma adımı, 7 dakika boyunca 72 ° C'de dayanıklılığı.
  4. T bitirdikten sonraO döngüsü, bant doğru boyutta olduğundan emin olmak için% 1 agaroz jel üzerinde PCR ürünü 2 ul çalıştırın. Üreticinin talimatlarına uygun olarak bir PCR saflaştırma kiti ile PCR ürünü saflaştırılır. Bir spektrofotometre ile DNA konsantrasyonu kontrol edin. -20 ° C'de saflaştırılmış PCR ürünü depolamak ya da doğrudan bir sonraki aşamada başlıklı RNA transkripsiyonu kullanın.
  5. Üreticinin talimatlarına göre bir başlıklı bir RNA sentez takımı ile mRNA başlıklı in vitro sentez. 20 ul RNazsız su içinde seyreltilir ve mRNA konsantrasyonunu belirlemek. -80 ° C de, RNA ve mağaza alikosu.
  6. Enjeksiyon gününde, RNaz içermeyen steril su ile bir mRNA çalışma çözeltisi hazırlayın. 40 ug RNA, spesifik ya da toksik etkilere yol açmaz olan en yüksek doz genel olarak bir RNA olduğuna dikkat edin. Buz üzerinde çalışma çözüm tutun. MO ile embriyo ve daha sonra kurtarma mRNA, enjekte veya birlikte hem eş-enjekte. Örneğin, mRNA HAZIRLIK konsantrasyonuHer bir enjeksiyonun aşama 4.5 ed 0.08 ug / ul son konsantrasyon için RNazsız su içinde 4.33 ul mRNA (0.4 ug), 0.67 ul, 0.6 ug / ml, sonra bir damla (500 ul) 40 ug içeren mRNA. Aşama 3'te tarif edildiği gibi MO hazırlayın.

Floresan Görüntüleme Enjekte Embriyolar 5. hazırlanması

  1. 28.5 ° CO kuluçkalandıktan sonra / N, floresan mikroskopi kullanılarak pronephros yapının gözlenmesini etki melanization önlemek için E3 su ile% 0.003, N-feniltiyoüre (PTU) ekleyin. Erken embriyo gelişimini etkiler çünkü Ancak, gastrulasyon önce PTU eklemeyin.
  2. 48 hpf, elle ince cımbız ile embriyolar dechorionate. Bir ışık diseksiyon mikroskobu altında 48 ve 72 hpf embriyoların görüntüleri çekmek.
    NOT: Bu resimler anestezi olmadan alınabilir.
  3. , Flöresanlı mikroskop altında görüntüleme yerleştirerek embriyolar anestezi için yaklaşık 10 dakika önce160 ug / ml tampon Tricaine içeren 10 cm'lik bir petri kabı. 5-10 dakika bekleyin, sonra hafifçe hareket etmeyecek ve bu nedenle anestezi çalıştığını onaylamak için zebrafish dokunun.
  4. Embriyolar anestezi sonra, (Tablo 1 bakınız)% 3 metil selüloz onları monte ve onları mikroskop altında yüzüstü pozisyonda yönlendirmek.
  5. Bir floresan mikroskop altında pronephros yapısını dikkate alınmalıdır (Tablo 1 bakınız) ve farklı büyütme (10X ve 20X) ile fotoğraf çekmek.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Wnt5a yıkmak çeviri MO engelleme getirerek elde edildi (Ağustos-MO) veya bir hücre aşamada Zebra balığı embriyolarının için ekson / intron sınır ekleme MO (ekleme-MO). Ağustos-MO nedenle, hem anne ve zigotik Wnt5a mesajını engeller, başlangıç ​​kodonu hedef ve. ek yeri MO, üçüncü parça verici bölge hedef ve Wnt5a (Şekil 1A) yalnızca zigotik transkript inhibe eder. AUG- ve splice- morphants kıvırcık kuyruk altındaki vücut ekseni ve kalp çevresi ödemine (Şekil 1B) de dahil olmak üzere birden fazla kusurlar birbirine phenocopied. Fare Wnt5a mRNA, kısmi fenotip hedef dışı etkilerine bağlı değildir olduğunu gösterdi morphant fenotipi (Şekil 4B) kurtarır. Tg (wt1b GFP), GFP wt1b endojen ekspresyonu tekrarlar için wt1b promoteri tarafından tahrik edilen GFP ifade eden transgenik zebra balığı, Pronephric yapısını ana hatları için kullanılmıştır. Tg (WT1b: kontrol embriyoları fenol kırmızısı enjekte ise GFP) Balık başına yanal olarak (Şekil 2) uzanan tübüllerin bir "U" şeklinde bir kaynaşık glomerulus oluşturan normal Pronephric gelişme göstermiştir, 48 hpf Wnt5a demonte sonra glomerüler kist oluşumunu gösterdi. 72 hpf, glomerüler yapı daha AUG- ve ekleme-MOS hem glomeruluslarda ve proksimal tübüller (Şekil 3) kist geliştirilen, kolay görüntülendi damar döngüler ile gelişti. 72 hpf morphant embriyoların enine histolojik kesitler H & E boyama, kist oluşumunu ortaya glomerüler yapıları ve dilate böbrek tübülleri (Şekil 4A) bozulur.

Şekil 1,
Şekil 1: Morfolino tasarımı ve 72 saat sonra döllenme (hpf) enjeksiyonu takiben de Zebra balığı embriyolarının ışık mikroskobik görünümüfenol-kırmızı kontrolü, Ağustos-MO, ya da birleşme-MO ile. (A) Diyagram, zebra balığı Wnt5a geni kodlama bölgesini ve AUG- ve splice- MO tarafından hedeflenen bölgelerini gösteren. Wnt5a Ağustos-MO proteini çeviri engellemek için ATG başlangıç ​​kodonu hedef için tasarlanmıştır; bağlantı-MO herhangi ekleme kavşak tam veya kısmi tek ekson silme veya bir tam veya kısmi tek bir intron ekleme ya üretmesi beklenmektedir yöneltilen ekson 3 ve 4. Splice-MO oligo sınır hedef için tasarlanmıştır. Biz özgüllüğünü arttırmak amacıyla, anne ve zigotik mesajı etkileyen bir Ağustos-MO, ve sadece zigotik transkript etkileyen bir ekleme-MO, hem Wnt5a yıkmak için seçti. (B) fenol-kırmızı enjekte embriyo ( enjeksiyon kontrol) normal vücut eğriliği, uzunluk ve perikard gösterdi. Ağustos-MO ile enjekte embriyo bağlayıcı-MO ile enjekte aşağı kıvırcık kuyruk yapısı ve perikard ödem ve embriyo phenocopied gösterdiEmbriyonun görünüm Ağustos-MO ile enjekte. Bar = 2mm.

Şekil 2,
Şekil 2: Tg (wt1b: GFP) Floresan mikroskobik görünümü. Fenol-kırmızı kontrolü, Wnt5a Ağustos-MO veya Wnt5a Splice-MO ile enjeksiyondan sonra 48 hpf Zebra balığı embriyolarının fenol-kırmızı enjeksiyon kontrolünde, pronephros geliştirme 48'de tamamlandı hpf. İki erimiş glomerüller ve proksimal tübüller görülebilir. Kist oluşumu AUG- ve ekleme-MO zebrabalıkları pronephros geliştirme (bar = 100 mikron) sonunda HPF 48 de embriyo hem de glomerüllerde görülebilir.

Şekil 3,
Şekil 3: Tg (wt1b: GFP) Floresan mikroskobik görünümü ile enjeksiyon sonrası 72 hpf Zebra balığı embriyolarının fenol-kırmızıKontrol, Wnt5a Ağustos-MO veya Wnt5a birleşme-MO. 72 hpf anda, glomerüler yapı açıkça görülebilir. Fenol kırmızısı enjeksiyon kontrolünde iki kaynaşık glomerül ve vasküler halkalar görülebilir. Wnt5a yok etme glomeruli ve proksimal tüp şeklindeki bir bölge (bar = 100 um) da dahil olmak üzere görsel olabilir bütün nefron yapıları, kist oluşumuna yol açmıştır.

Şekil 4,
Şekil 4: 72 HPF morphant embriyo enine histolojik kesitlerin (A), H & E boyama, kist oluşumunun ortaya glomerüler yapıları ve genişlemiş renal tüpleri bozulur. Ok: Pronephric glomerüller; ok: Böbrek tübül dilate. Bar = 20 mm. (B) Ağustos-MO fenotip kısmen birincil baz çifti yapısında bir fark MO dayanıklı fare Wnt5a ile kurtarıldı olabilirBöylece fenotip hedef dışı etkilerine bağlı değildir olduğunu ortaya çıkarmaktadır. fark p <0.05 istatistiksel olarak anlamlı idi (* p <0.05 Fenol-kırmızı grup vs; # p <0.05 Ağustos-MO 15 ng gruba karşı).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Polikistik böbrek hastalığı (PKD) insanlarda son dönem böbrek hastalığının önde gelen nedenlerinden biridir ve ilerici kist oluşumu, böbrek genişlemesi, ve anormal tübül geliştirme 14 ile karakterizedir. Otozomal dominant PKD (polikistik böbrek), genetik hastalık olan ya PKD1 mutasyonu, polikistin-1 (PC1) veya PKD2 kodlayan polikistin-2 (PC2) kodlayan, polikistik böbrek sonuçlanır. Diğer birçok gen, birincil cilium bulunan proteinleri kodlayan özellikle, böbrek kist gelişimi dahil olmak üzere düşünce ve bugüne kadar bu genlerin taranması için hiçbir ideal bir araçtır yoktur vardır. Biz zebrafish gen demonte sonra böbrek kist oluşumunu gözlemlemek için hızlı ve kolay bir şekilde açıklayın. Bu yöntem, muhtemelen diğer aday PKD genlerin taranması için kullanılabilir.

Bu tekniğin güçlerinden biri sadeliği. Tg (wt1b: GFP) olarak Zebra balığı, GFP ifadesi bunu belli bir kılan, glomerüller, tübüller ve kanallar içindely uygun bir model tüm Pronephric böbrek yapısını incelemek için. Tg (wt1b: GFP) Zebra balığı geni sonra Pronephric yapısı ve böbrek kist oluşumu doğrudan görselleştirme yıkmak izin verir. Bu Wnt5a Knockdown PCP yolu kusurları ve farelerde böbrek kist oluşumuna neden olabilir düşünüldü. Ancak, Wnt5a küresel nakavt farelerde ölümcül doğum sonrası ve doğumdan sonra böbrek kist oluşumunu gözlemlemek için kullanılan olamazdı. Kısa bir süre içinde, burada tarif edilen yöntemi kullanarak zebrabalıkları demonte Wnt5a böbrek kist oluşumuna neden olduğu tespit edilmiştir. Bu sonuçla, bir sonraki adım böbrek özel Wnt5a nakavt fareler üretmek olacaktır.

Bu teknik aynı zamanda birkaç sınırlaması vardır. İyi bir antikor olmadan MOS etkinliğini tahmin etmek, ve MO fenotip neden ilgisiz bir genin işlevini inhibe olabilir olasılığını ekarte etmek zordur. Kapsamlı kontrol experimeNTS bu sorunların üstesinden gelmek için gereklidir. İki ayrı MOs, Ağustos-MO ve splice- MO Wnt5a demonte değerlendirmek için kullanıldı. Her iki morphants birbirine phenocopied ve fare Wnt5a mRNA enjeksiyonu, birinci baz çift yapısında bir fark sebebi ile bir MOS dirençli fenotip MO "hedef dışı" etkisine bağlı değildir olduğunu gösteren anormal bir fenotip kurtarıldı.

Bizim modeli Wnt5a demonte Zebra balığı embriyolarının böbrek kist oluşumuna neden olduğunu göstermektedir. Bu, basit ve daha az zaman alıcı olduğu gibi bu yöntem, böbrek kist oluşumuna yol açabilmektedirler diğer genleri test etmek için kullanılabilir. O Zebra balığı böbrek kist oluşumu gen mutasyonu sonucu, başka deneyler böbrek kist oluşumu detaylı mekanizmaları araştırmak için yapılabilir gösterilmiştir sonra. Wnt5a küresel nakavt fareler öldürücü doğum sonrası ve kullanılamaz çünkü bu deneyde, ob içindoğumdan sonra böbrek kist oluşumunu hizmet, bir sonraki adım Cre-lox sistemi kullanılarak böbrek özel Wnt5a nakavt fareler üretmek olacaktır.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Acknowledgments

Bu eser (LH DK093625 ve DK069909 ve DK047757 JHL için) NIH tarafından desteklenen ve VA (Başarı Ödülü JHL için I01BX000820). Biz gerekli desteği sağlamak için Pennsylvania Zebra balığı Core Üniversitesi'nden Dr. Michael Paketi ve Dr Jie He teşekkür etmek istiyorum.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
0.5% Phenol-Red Sigma P0290 Color indicator for injection
Morpholino Genn Tools, LLC (customized) Customized designed to the gene of interest
Pre-pulled needle Tritech Research MINJ-PP If large amount of needle is required, you can also purchase a needle puller and prepare the needle in the lab
T7 mMessage Kit Ambion 1344 For in vitro transcription to make capped mRNA for rescue experiment
N-Phenylthiourea Sigma P7629 For prevention of melanization
Tricaine Sigma A5040 Also called ethyl 3-aminobenzoate, for zebrafish anesthesia
Methyl Cellulose Sigma M-0387 For position of zebrafish 
QIAquick PCR Purification Kit  Qiagen 28104 For purification of PCR product for cap RNA synthesis.
dNTP mix Promega U1511 For PCR
Tag DNA Polymerase Invitrogen 10342-053 For PCR
NanoDrop spectrophotometer Thermo Scientific ND-1000 For measure morpholino and RNA concentration
Air Compressor Werther International, Inc. Panther Compact 106 Air source for injection
Pico micro-injection pump World Precision Instruments Inc PV830 Pnematic PicoPump Other types of microinjection system can be used.
Micro-manuplator World Precision Instruments Inc MMJR Right-handed (MMJL for left handed)
Needle holder World Precision Instruments Inc 5430-ALL To hold needle for micromanipulation
Dumont Tweezers Fine Surgical Tools 11253-20 For breaking off the needle tip
Dissecting microscope Leica M205C  For observing and imaging zebrafish embryos
Fluorscence microscope Zeiss Axio Obserer D1m   For imaging zebrafish pronephros
Capillary tube (I.D. 0.15 mm) VitroCom CV1525Q-100 For measure the volume of each injected drop

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Choi, S. Y., et al. Cdc42 deficiency causes ciliary abnormalities and cystic kidneys. J Am Soc Nephrol. 24, (9), 1435-1450 (2013).
  2. Hostetter, C. L., Sullivan-Brown, J. L., Burdine, R. D. Zebrafish pronephros: a model for understanding cystic kidney disease. Dev Dyn. 228, (3), 514-522 (2003).
  3. Nyengaard, J. R., Bendtsen, T. F. Glomerular number and size in relation to age, kidney weight, and body surface in normal man. Anat Rec. 232, (2), 514-201 (1992).
  4. Keller, G., Zimmer, G., Mall, G., Ritz, E., Amann, K. Nephron number in patients with primary hypertension. N Engl J Med. 348, (2), 101-108 (2003).
  5. Cullen-McEwen, L. A., Kett, M. M., Dowling, J., Anderson, W. P., Bertram, J. F. Nephron number, renal function, and arterial pressure in aged GDNF heterozygous mice. Hypertension. 41, (2), 335-340 (2003).
  6. Gerlach, G. F., Wingert, R. A. Kidney organogenesis in the zebrafish: insights into vertebrate nephrogenesis and regeneration. Wiley Interdiscip Rev Dev Biol. 2, (5), 559-585 (2013).
  7. Igarashi, P. Overview: nonmammalian organisms for studies of kidney development and disease. J Am Soc Nephrol. 16, (2), 296-298 (2005).
  8. Zhou, W., Boucher, R. C., Bollig, F., Englert, C., Hildebrandt, F. Characterization of mesonephric development and regeneration using transgenic zebrafish. Am J Physiol Renal Physiol. 299, (5), 1040-1047 (2010).
  9. Liu, S., et al. A defect in a novel Nek-family kinase causes cystic kidney disease in the mouse and in zebrafish. Development. 129, (24), 5839-5846 (2002).
  10. Slanchev, K., Putz, M., Schmitt, A., Kramer-Zucker, A., Walz, G. Nephrocystin-4 is required for pronephric duct-dependent cloaca formation in zebrafish. Hum Mol Genet. 20, (16), 3119-3128 (2011).
  11. Huang, L., et al. The role of Wnt5a in prostate gland development. Dev Biol. 328, (2), 188-199 (2009).
  12. Andre, P., et al. The Wnt coreceptor Ryk regulates Wnt/planar cell polarity by modulating the degradation of the core planar cell polarity component Vangl2. J Biol Chem. 287, (53), 44518-44525 (2012).
  13. Kimmel, C. B., Ballard, W. W., Kimmel, S. R., Ullmann, B., Schilling, T. F. Stages of embryonic development of the zebrafish. Dev Dyn. 203, (3), 253-310 (1995).
  14. Torres, V. E., Harris, P. C., Pirson, Y. Autosomal dominant polycystic kidney disease. Lancet. 369, (9569), 1287-1301 (2007).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics