Author Produced

الماوس زرع الكلى: نماذج من طعم خيفي رفض

* These authors contributed equally
Medicine

Your institution must subscribe to JoVE's Medicine section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Tse, G. H., Hesketh, E. E., Clay, M., Borthwick, G., Hughes, J., Marson, L. P. Mouse Kidney Transplantation: Models of Allograft Rejection. J. Vis. Exp. (92), e52163, doi:10.3791/52163 (2014).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Introduction

وكان أول وصف زرع الكلى الناجحة لعلاج الفشل الكلوي في عام 1955 بين التوائم الزيجوت منذ ذلك الحين أصبح علاج الثورية لمرضى الفشل الكلوي في نهاية المرحلة في جميع أنحاء العالم، وتقدم كل من التحسن في طول ونوعية الحياة 2. ومع بقاء الكسب غير المشروع على المدى الطويل قد تعوقها العديد من العمليات المرضية مما أدى إلى أضرار المزمن طعم خيفي 3.

رفض الكلى المزروعة في البشر لا يزال سببا رئيسيا للاعتلال، على الرغم من التحسينات الكبيرة في نظم immunosupporessive. والهدف من تطوير نموذج الفأر من زرع الكلى هو تكرار عن كثب عملية وعلم الأمراض الموجودة في زرع الكلى البشري 4. Skoskiewicz آخرون وصفت أول نموذج الفأر من زرع الكلى في عام 1973 5. على الرغم من أن المهارات المطلوبة المجهرية المتقدمة، بل هو قيمة رمونغوشيفيتش لعدة أسباب: تم ​​جينوم الفأر تتميز بشكل جيد وهناك مجموعة كبيرة ومتنوعة من الأساليب والتقنيات المتاحة للدراسات الماوس التجريبية.

وقد استخدمت العديد من المجموعات باستخدام نموذج الفأر من زرع الكلى زرع الكلى كجهاز دعم الحياة، ولكن في دراسات أخرى وفي منهجيتنا وصف أحد الكلى الماوس المستلم الأصلي تبقى في الموقع لمدة التجربة 4. صالح هو أن الماوس يخضع لتخدير واحد والعملية مما يؤدي إلى خفض معدلات الاعتلال على الماوس وخطر الموت من الإجراء الثاني. بالإضافة إلى ذلك الفأر لا يعاني من الآثار السلبية للفشل الكلوي التدريجي.

على الرغم من الرفض خيفي نماذج موجودة في الأجهزة الأخرى مثل القلب والجلد، وهذه ليست دائما ذات الصلة مباشرة لزرع الكلى. هناك أدلة على أن هذه النماذج تثير سائط مختلفة ودىnamics الرفض، على سبيل المثال مدار الساعة من الرفض في القلب المزروع وطعم خيفي كلوي يختلف بشكل ملحوظ في بعض مجموعات الضغط 6. وأظهر هذا النموذج وصفناها أنماط رفض طعم خيفي كلوي حاد في BALB / ج المانحين في الفئران غير المعدلة وراثيا FVB / NJ إصابة بوساطة الخلوية مع تراكم خلايا تي والضامة 7. بدلا من ذلك وصفناها أيضا نموذجا للضرر المزمن طعم خيفي التي يسلك التليف الخلالي وضمور أنبوبي، وهذا ناتج عن زرع الكلى من C57BL / 6 BM12 المانحين في C57BL / 6 المتلقين، كما تتميز هذه الفئران عن طريق واحدة MHC الدرجة الثانية سوء مواضع -match 8.

وقد تم دراسة جوانب متعددة من زرع باستخدام نموذج الفأر من زرع الكلى بما في ذلك الرفض الحاد والرفض الخلوية والخلطية، نقص التروية إصابة ضخه، وتجريب العوامل العلاجية الرواية. قمنا بتعديل ر الجراحيةechnique إلى تقليل وقت التشغيل وتحسين سهولة الجراحة. خاصة وصفناها المانحة في وقت واحد وإعداد المتلقي وتقنية مفاغرة وعائية مبسطة من خلال الاستفادة من التصحيح مستمرة مفاغرة الشريان الأبهر. وهذا الفيديو ومخطوطة توفر نقاط رئيسية للمساعدة في إنشاء هذه التقنية.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

يجب أن تكون الأخلاق المؤسسية الوطنية والمحلية المناسبة في المكان قبل تنفيذ التجارب على الحيوانات. وتحديدا في المملكة المتحدة أجريت التجارب التالية تحت الحيوانات (الإجراءات العلمية) قانون 1986. أين هما microsurgeons المتاحة للعمل في وقت واحد الجراح المانحة يجب تنفيذ الخطوات 1،1-1،16 ثم 3،1-3،5، بينما الجراح يقوم المتلقي 2،1-2،8 . لمشغل واحد الخطوات يمكن اتباعها بالتسلسل.

1. المانحة إعداد

ملاحظة: الإجراء المقدمة هنا هو لالمانحة C57BL / 6 BM12 والمتلقي C57BL / 6 الفئران الذكور الذين تتراوح أعمارهم بين 8 إلى 16 أسابيع من العمر مع وزن الجسم أكبر من 20 غراما. بيد أن هذا الإجراء لا يمكن أن يؤديها بتكاثر على مجموعة متنوعة من سلالات الماوس. تم الحصول على البيانات المقدمة في قسم نتائج ممثلة من C57BL / 6، C57BL / 6 BM12 وBALB / ج الفئران.

  1. إجراءات سير النقيبز الأدوات الجراحية المعقمة والمواد الاستهلاكية (تعقيمها)، مع المساعي للحفاظ على منطقة التشغيل معقمة قدر الإمكان. أداء إعداد المانحين بالتزامن مع إعداد المتلقي إذا نوعان من الجراحين المتاحة.
  2. تخدير الفأر مع حقنة داخل الصفاق (31G إبرة) من medetomidine (0.5 ملغ / كلغ) والكيتامين هيدروكلوريد (200 ملغ / كغ). هذه النتائج في طائرة التخدير التي يتم الاحتفاظ لمدة 4 ساعة توفير ما يكفي من الوقت لإجراء العملية كلها التي يتعين القيام بها. التخدير التكميلي ليست ضرورية.
  3. تأكد من أن الفأر هو إفقاد إحساس (أي استجابة لقرصة أخمص قدميه).
  4. حلق البطن الماوس وإزالة أي الشعر فضفاض مع شريط لاصق.
  5. ضع الماوس على ظهرها على حصيرة ساخنة رايات sterilely وفضفاضة لشل حركة أطرافه مع معقم اخفاء الشريط.
  6. مراقبة الماوس في جميع أنحاء الداخلي للحروق الحرارية. إذا أمكن استخدام مصدر حرارة غير كهربائي.
  7. تطبيق مواد التشحيم العين وساnitize جدار البطن بمحلول مخفف من اليود.
  8. جعل شق خط الوسط في البطن لدخول التجويف البريتوني وإدراج 3 سم Calibri ضام البطن.
  9. تطبيق المالحة استعد للحفاظ على الأمعاء ومنطقة الجراحية رطبة وتجنب تجفيف لزوم لها من الأحشاء.
  10. تغطية الماوس مع الستائر معقمة وتحريك الأمعاء إلى اليسار المشغل (يمين الماوس) لفضح الشريان الأبهر، الوريد الأجوف والكلية اليسرى.
  11. تطبيق forcep صعد إلى المعدة وسحب متفوق لفضح السفن الكبرى والكلية اليسرى بالكامل. حزمة مسحات معقمة رطبة (2 ملم × 2 ملم) في البطن لسحب الأنسجة بعيدا عن المنطقة الجراحية، مثل فصوص الكبد، والحويصلات المنوية، والأمعاء.
  12. عزل الكلية اليسرى من adventia المحيطة والدهون والغدة الكظرية اليسرى في التجويف البريتوني عن طريق تشريح بصراحة النسيج الضام باستخدام ملقط غيض غرامة. وضع نصائح مغلقة من ملقط بين المناطق التي شمال شرقإد لفصلها والسماح ببطء نصائح forcep لفتح لتشريح الفضاء.
  13. عزل الوريد الكلوي الأيسر من ligating ثم تقسيم اليسار الوريد الكظرية والغدد التناسلية مع ترك الوريد 9 / O النايلون. وضع خياطة قريبة من الوريد الكلوي.
  14. Ligate وتقسيم الحالب مع 7 / O الحرير خياطة قريبة من المثانة ترك خياطة تنتهي طويلة. وسوف تستخدم هذه الغايات خياطة طويلة عندما يتم حصاد الكلى والتي تكون ضرورية لمفاغرة الحالب.
  15. تعبئة وتشريح الشريان الأورطي بالكامل والوريد الأجوف متفوق وأدنى من الشريان والوريد الكلوي استخدام ملقط غيض غرامة لتشريح بصراحة الأوعية اللمفاوية والدهون من الأمام والجانبين من السفن.
  16. العثور على طائرة الأنسجة بين الشريان الأبهر والوريد الأجوف وتنتشر ببطء ملقط. فتح ببطء نصائح من الرؤوس ملقط غرامة لنشر الأنسجة مع الحد الأدنى من الصدمة.
  17. ربط فضفاضة 7 / O الحرير حول الشريان الأورطي متميز وأقل شأنا من الشريان الكلوي عن طريق تمرير غرامة الزاويةالملقط تلميح حول الجزء الخلفي من السفن ورسم خياطة من خلال. سيتم تشديد هذه الغرز قبل استرجاع الكلى للسماح نضح الوراء من جامعة ويسكونسن الحل.

2. مستلم إعداد

وفقا لمتابعة إعداد المانحة الخطوات 1،2-1،8.

  1. تحريك الأمعاء إلى اليمين المشغل (يسار الماوس) لفضح الشريان الأبهر، الوريد الأجوف. تغطية الأمعاء مع ملحي معقم غارقة مسحة.
  2. إجراء استئصال الكلية اليمنى بواسطة ligating الشريان الكلوي الأيمن والوريد مع 7/0 الحرير خياطة ثم تقسيم.
  3. Ligate الحالب الأيمن مع 7 / O خياطة الحرير والانقسام.
  4. تعبئة وتشريح الشريان الأورطي بالكامل والوريد الأجوف السفلي إلى الشريان الكلوي والوريد كما هو موضح في الخطوة 1.14 و 1.15. ضمان تشريح كامل بين الشريان الأبهر والوريد الأجوف. العناية للحفاظ على الشريان المنوي الداخلي الذي يمتد الأمامي إلى الوريد الأجوف وaortوجنبا إلى جنب مع حزمة اللمفاوية.
  5. تحديد السفن قطني تعمل في الحيز خلف الصفاق من الوريد الأجوف والوريد إلى العمود الفقري، مع ligate 9 / O الحرير في الاستمرارية، وليس هناك حاجة لتقسيم السفن.
  6. تحديد مساحة كافية لوضع المشابك الاوعية الدموية الدقيقة مع الفضاء بين لanastomoses الأوعية الدموية.
  7. إدارة الهيبارين عن طريق الحقن الوريدي (5 وحدات) عن طريق الوريد الظهري القضيب.

3. المانحة الكلى استرجاع

تشديد العلاقات الحرير 7 / O التي وضعت حول الشريان الأورطي أدنى وأعلى لعزل الكلى من التداول الشرياني.

  1. لبث الوراء الباردة 0،2-0،5 مل من جامعة ويسكونسن حل مع إبرة (31G) في الشريان الأورطي.
  2. تقسيم الشريان الأورطي داخل الغرز وتقسيم الوريد الكلوي في تقاطع مع الوريد الأجوف لإزالة الكلى والشريان الكلوي بطول الشريان الأبهر. تقسيم السفن أسفل الظهر الناتجة عن الشريان الأبهر، إذا كانت موجودة، ثithout ربط.
  3. وضع الكلى في المياه المالحة الباردة على مسحة معقمة في صحن الثقافة.
  4. الموت ببطء الماوس المانحة خلع عنق الرحم.

4. زرع الكلى - إعداد الكلى

  1. تهيئة التصحيح الأبهر بقسمة جدار الشريان الأورطي طوليا مباشرة قبالة الشريان الكلوي. تحديد أي شمعة سفينة في التصحيح التي يجب تجنبها و ligated أو عند إجراء مفاغرة شريانية.
  2. وضع خياطة 10 / O من الخارج إلى داخل التجويف الوريد الكلوي متفوق وخياطة منفصلة الثانية دون المستوى. الغرز المستخدمة لتقسيم الوريد الكظرية والغدد التناسلية الوريد يمكن استخدامها لتوجيه السفينة.
  3. وضع الكلى في الجهة اليمنى من المتلقي (الشكل 1.1)، وضمان وضع الغرز جيدا لضمان anastomoses الأوعية الدموية يمكن أن تكتمل دون أن تصبح خيوط تتشابك في مسحات أو غيرها من الصكوك.

5. الكلى Transplanالكساء - التحام الأوعية الدموية

تطبيق المشابك الاوعية الدموية الدقيقة الأولى دون المستوى ثم متفوق تشمل الوريد الأجوف والشريان الأورطي.

  1. جعل ventomy بإبرة (31G) من خلال ثقب في الجدار الأمامي من الوريد الأجوف. تدفق الدم من الوريد الأجوف عن طريق ضخ ما يقرب من 50 ميكرولتر من كلوريد الصوديوم 0.9٪.
  2. توسيع فصد باستخدام ملقط غيض غرامة من خلال فتح لهم داخل فصد بحيث يكون طول ما يعادل قطر الوريد الكلوي المانحة.
  3. وضع خياطة متفوقة 10 / O (التي هي بالفعل في تجويف الوريد الكلوي) لأول مرة في ذروة فصد (الشكل 1.2) والانضمام إلى الجدار الخلفي للمفاغرة في خياطة تشغيل حتى يتم الوصول إلى قمة أدنى (الشكل 1.3).
  4. وضع 10 / O خياطة رديئة وربطة عنق أولا مع عقدة واحدة (الشكل 1.4) ثم ادراك التعادل لخياطة يمتد من الحائط الخلفي.
  5. باستخدام خياطة أدنى خلق وول الأماميلتر من مفاغرة (الشكل 1.5) مع خياطة تشغيل وربطة عنق حتى نهاية خياطة متفوقة على قمة أعلى (الشكل 1.6).
  6. إنشاء بضع الأبهر عن طريق التقاط جدار الشريان الأورطي مع ملقط وقطع التصحيح بيضاوي الشكل مع مقص (ما يقرب من بضع الأبهر يجب أن تكون خمس محيط الشريان الأورطي وثلاث مرات لمعة الشريان الكلوي في الطول).
  7. وضع 10 / O خياطة عند نقطة متفوقة من التصحيح الأبهر من الخارج إلى الداخل (الشكل 1.7) ويمر عبر الشريان الأورطي إلى التعادل خارج الأوعية في ذروة أعلى من بضع الأبهر.
  8. إنشاء مفاغرة شريانية مع خياطة تبدأ تشغيل متفوق (الشكل 1.8) anastomosing التصحيح المانحة إلى الشريان الأورطي المتلقي، والحرص على عدم تقليص مفاغرة من خلال ربط الخيط ضيقة جدا (الشكل 1.9).
  9. إزالة المشابك الأوعية الدموية أدنى أولا ثم المشبك متفوقة على reperfuse الكلى (الرقم 1.10 و 1.11). التمعج المرئي من الحالب ينظر ربما لو يتحقق يكفي من الدم إلى الحالب.

6. زرع الكلى - التحام الحالبي

  1. تقسيم أي مرفقات المثانة من جدار البطن.
  2. تمرير إبرة (21G) من اليسار إلى اليمين من المثانة عن طريق كل الجدران.
  3. وضع نصائح forcep متتالية في التجويف إبرة وتمرير كل مرة أخرى من خلال المثانة بحيث ملقط تمر الآن من اليمين إلى اليسار من الجانب الأيسر من المثانة.
  4. رسم خياطة على المانحين من خلال الحالب المثانة بحيث يمر الحالب في المثانة الخلل الأيسر ثم من الجانب الأيمن.
  5. خياطة البرانية من الحالب إلى المثانة البرانية مع ثلاثة خيوط متقطعة واحدة حول نقطة الدخول مع 9 / O النايلون خياطة على إبرة ذهابا وجسديا.
  6. قطع الحالب الأقرب إلى ضمد، مما فتح الالبريد الحالب للسماح لتدفق البول والسماح للنهاية الحالب ليتراجع إلى الجسم من المثانة. ويمكن ملاحظة إنتاج المرئي من البول مع نزيف من شبه الحالبي السفن.
  7. إغلاق الصحيح الخلل الجانب المثانة مع واحدة انقطاع 9 / O خياطة الحرير.

7. الإنعاش والعناية بعد الجراحة

استبدال الأحشاء الهضمي في البطن في توجهها الأصلي وإغلاق جدار البطن عن طريق تقريب العضلات المستقيمة مع 6 / O خياطة للامتصاص.

  1. تقريب الجلد مع الجلد مقاطع معدنية.
  2. عكس جزئيا التخدير مع الحقن تحت الجلد من هيدروكلوريد atipamazole (10 ميكرولتر / ز).
  3. إدارة التسكين تحت الجلد بواسطة هيدروكلوريد البوبرينورفين (0.05 ملغ / كلغ) ودعم للحقن السوائل تحت الجلد 1 مل من كلوريد الصوديوم 0.9٪.
  4. استرداد الماوس في خزانة ارتفاع درجة حرارة عند 28 درجة مئوية لمدة 24 إلى 48 ساعة. مراقبة الماوس للمرض حتىالانتهاء من التجربة.
  5. إزالة مقاطع جلد معدن 7 - 10 أيام مرحلة ما بعد الجراحة.
  6. وبمجرد اكتمال التجربة الموت ببطء الماوس عن طريق خلع عنق الرحم.
  7. إزالة وجمع الكلى المقابل وطعم خيفي للتحليل النسيجي.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

يمكن تقييم الرفض طعم خيفي كلوي عن طريق التحليل النسيجي جزءا لا يتجزأ من البارافين أقسام الأنسجة الثابتة methacarn من زرع الكلى (الشكل 2). زرع الكلى طعم إسوي بين النتائج الفئران مسانج في الكلى إصابة إعادة إشباع الخلايا الدماغية، ولكن قبل 4 أسابيع وانتعشت الأنابيب وقابلة للمقارنة تشريحيا إلى الكليتين الأصلية. الرفض الحاد يمكن أن تكون على غرار بواسطة C57BL / 6 زرع الكلى في المتلقين BALB / ج، في حدود 1 في الاسبوع هو منتشر هناك تسلل خلية وحيدة النواة في جميع أنحاء حمة الكلوي، التي تنطوي على الخلالي، الكبيبات والأنابيب. الضرر المزمن طعم خيفي يمكن أن تكون على غرار بواسطة C57BL / 6 BM12 الكلى المزروعة في C57BL / 6 المتلقين، وهذا يؤدي إلى المظاهر التقليدية وجدت في علم الأمراض البشري يتكون من التليف الخلالي وفقدان أنبوب صغير تدريجية. عدد نبيب الإجمالي لكل حقل رفيع المستوى (X200 التكبير) يسمح الكمي من كتلة كليون وظيفية (فايجوري 3)، وفقدان الأنابيب تعكس إصابة أنبوبي بسبب الرفض. يمكن التعرف على التليف الخلالي باستخدام عموم الكولاجين وصمة عار picrosirius الحمراء (الشكل 4). ويلاحظ الكولاجين الذاتية العادي، ولكن خلال الضرر المزمن الكولاجين الجديد وتودع مما أدى إلى التليف التدريجي. الضرر المزمن يصبح واضحا بين 8 و 12 أسابيع بعد الزرع (الشكل 5).

يحتاج منحنى التعلم كبيرة يجب التغلب عليها من أجل إنشاء نموذج (الشكل 6). تم تنفيذ ما يقدر ب 40 إجراء في الفئران تعافى قبل التوصل إلى استنساخه الأوعية الدموية الوقت مفاغرة مع بقاء مقبول خالية من التعقيدات. وكان السبب الأكثر شيوعا لالقتل الرحيم الماوس بسبب الشلل هند أطرافهم الثانوي لخفض الأطراف الاصطناعية ونقص التروية الحبل الشوكي المتعلقة تخثر الشرايين، ولكن في تجربتنا heparization النظامية يقلل من حدوث هذا. كانت الفئران بشكل روتيني موnitored وفقا لمعايير متفق عليها محليا لإنهاء التجارب. أسفرت التجارب التي أجريت في بقاء المرحلة هضبة منحنى التعلم في الوقت نفسه مفاغرة الأوعية الدموية من 28.9 ± 0.47 دقيقة.

الشكل 1
الرقم 1. تمثيل بياني لتقنية مفاغرة الأوعية الدموية. يتم وضع الكلى المانحة في الجهة اليمنى من الماوس المتلقي. هو anastomosed الوريد الكلوي المانحة بطريقة نهاية إلى جانب وهو anastomosed الشريان الكلوي المانحة على رقعة من الشريان الأورطي إلى الشريان الأورطي المتلقي.

الشكل 2
الشكل 2. التمثيلية إصابة أنبوبي النسيجية في الكلى المزروعة. بعد تثبيت الأنسجة في حل الميثيل في Carnoyl كانت جزءا لا يتجزأ في parafكانت ملطخة أقسام الزعانف والأنسجة من قبل 4μm Hemotoxylin ويوزين. في 4 أسابيع بعد زرع الكلى طعم إسوي لا يحمل إصابة أنبوبي وقابلة للمقارنة إلى الكلى الأم في المظهر. C57BL / 6 BM12 الكلى المزروعة في BALB المتلقين / ج تخضع الرفض الحاد طعم خيفي مع تتسرب منتشر الخلايا وحيدات النوى (*) والأنابيب نخرية (**) وtubulitis. C57BL / 6 BM12 الكلى المزروعة في C57BL / 6 النتائج في الضرر المزمن طعم خيفي تتميز تتسرب حول الأوعية اللمفاوية (كتلة السهم ⬆) والتليف الخلالي وضمور أنبوبي (سهام جوفاء ⇧). يرجى النقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.

الرقم 3
الرقم 3. الكمي لإصابة أنبوبي في آر ansplanted الكلى. الأنابيب الصحية (التي يحددها وجود غشاء الطابق السفلي سليمة، التجويف أنبوب صغير سليمة، حجم حشوية صحي وزغيبات قمية الحدود فرشاة حافظ) التي تعكس أداء كتلة كليون يمكن كميا عن طريق حساب متوسط ​​عدد الأنابيب في الحقل (X200 التكبير () ن = 6، بمعدل 10 حقول متتالية، ** P <0.01).

الرقم 4
الرقم 4. الضرر المزمن طعم خيفي يمكن تحديدها من قبل التليف الخلالي (صور تمثيلية). ترسب الكولاجين داخل الكلى المزروعة واضح من خلال الكشف عن picrosirius تلطيخ الأحمر الكولاجين. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.

جوري 5 "SRC =" / الملفات / ftp_upload / 52163 / 52163fig5highres.jpg "/>
الشكل 5. الكمي من التليف الخلالي. التليف الخلالي تقاس picrosirius يتم رفع الإيجابية الحمراء في C57BL / 6BM12 ⇒ C57BL / 6 المتلقين اثني عشر أسبوعا بعد زرع (ن = 6، بمعدل 10 حقول متتالية، ** P <0.01، * ع < 0.05).

الرقم 6
الشكل منحنى التعلم 6.. التجارب عدم استرداد الأولية في الفئران الخدر عضال أجريت لتطوير تقنية جراحية. وأعقب ذلك التجارب لتحقيق الانتعاش زرع الكلى بنجاح إعادة perfused لمع ماوس على قيد الحياة من دون مضاعفات.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

الطريقة الأكثر موصوفة وصفا جيدا لإجراء مفاغرة شريانية هو استخدام الأبهر القاصي من الجهات المانحة، مع الشريان الكلوي في استمرار، بطريقة نهاية إلى جانب الشريان الأورطي إلى المتلقي. وصفنا استخدام التصحيح الأبهر، على غرار النسخ المتطابق "كاريل التصحيح" التي أجريت في زرع الكلى البشرية التي نعتقد أن تكون أكثر ملاءمة. على الرغم من التقارير في الأدب من الجهات المانحة والمتلقية الوقت المنطوق هي متفرق نعتقد أن استخدام التصحيح الأبهري إلى الشريان الأبهر المتلقي بدلا من الشريان الأورطي المانحة نهاية إلى الجانب المتلقي إلى الشريان الأورطي هو الأفضل. باستخدام التصحيح ينفي الحاجة لتشريح جميع فروع الشريان الأبهر أسفل الظهر المانحة، وكذلك الوقت المستغرق لligate منهم على حدة، كما anastomosing رقعة يستثني بشكل طبيعي هذه.

وتشمل الخطوات الحاسمة لتحقيق هذا النموذج مع الحرص على ضمان عدم وجود شمعة الشرايين أخرى غير الشريان الكلوي داخل مفاغرة شريانية التصحيح لأنهاسوف تسرب عندما تتم إزالة المشابك-الأوعية الدموية الصغيرة. الغرز بناء على anastamoses يمكن ربط بإحكام ولكن يكون على بينة من تأثير محفظة سلسلة التي يمكن تضييق مفاغرة وسبب نقص التروية أو منع أي تدفق الدم، في التطبيق العملي لاحظنا أن قدمت بضع الأبهر بيضاوي الشكل هو من حجم كاف لمحفظة سلسلة ليس مصادفة تأثير. ويتكون فصد بإبرة ثم اتسعت التي تمتد بالملقط، ونحن نعتقد أن هذا هو الأفضل لقطع وتمتد مع ملقط يخلق حلقة من الأنسجة الوريدية وهو ما يمكن ملاحظته بسهولة وخياطة المساعدات لإنشاء مفاغرة مستقرة. مفاغرة الحالب إلى المثانة هو عنصر مهم جدا للنظر، ندعو إلى تقنية الموضحة هنا بدلا من القبة إلى المثانة المثانة إعادة البناء التي ارتبط تسرب البول والحالب تضيق المفترض نقص التروية المناسب. تسمح تقنية لدينا وصف أقصر طول الحالبي المانحة لاستخدامها هو anastomosed مباشرة إلى bladdإيه 5. من خلال الاستفادة من هذه التحسينات الفنية كنا قادرين على الحد بشكل كبير من مقدار الوقت المطلوب لإكمال هذا النموذج التجريبي. بالفعل مع اثنين من مشغلي العمل في الوقت نفسه خمسة متلقي زرع لا يمكن أن يؤديها يوميا مع ما يكفي من الوقت للسماح الانتعاش ورصد الفئران.

وجود قيود الرئيسي للنموذج وصف والتقنية في هذه الورقة هو أن يتم ترك الماوس مع واحدة من الكليتين الأم في الموقع مثل أن الماوس لا يتوقف على الكلى من أجل البقاء. وأفادت بعض الكتاب إزالة الكلى الأصلي الثاني على الفور في وقت زرع أو خمسة إلى عشرة أيام بعد الزرع، وبالتالي ترك الماوس تعتمد على الكلى المزروعة. وسيتيح ذلك بقاء لاستخدامها النتيجة التجريبية وكذلك اخذ عينات من الدم لقياس علامات وظيفة الكلى مثل اليوريا والكرياتينين في مصل الدم أو الدم. ومع ذلك ليس هناك فرق في النتائج النسيجيةعند مقارنة الفئران تعتمد على المزروع والذين لديهم الكلى الأصلي واحد 9. يمكن إزالتها لدينا بروتوكول وصف لا يمنع هذا بل والكلى الأصلي الثاني في فترة زمنية معينة. قيود إضافية هو أن الخبرة المتقدمة الجراحية الصغرى هو مطلوب من أجل إجراء مفاغرة شريانية وريدية، ولكن مع التدريب واستخدام هذا الرقم للتعليم الفني هذا يمكن التغلب عليها. يمكن أن تحدث مضاعفات الأوعية الدموية، وهذه يجري الشريان الكلوي أو خثار الأوردة، وهذا يؤدي دائما في الماوس تظهر علامات الضائقة، اعتلال الصحة أو على وجه التحديد القائمة الخلفية الشلل. لذلك الحكم الصارم ورصد الفئران لا بد عند استخدام هذا النموذج.

لقد تم التعامل إلى حد كبير الرفض الحاد للزرع الكلى من كبت المناعة والحث العلاج أوزون تعميم الخلايا الليمفاوية، ولكن نوبات الرفض بوساطة الخلايا لا تزال تحدث في جميع أنحاء الطعوم الكلىالحياة. لذا دراسات الآليات الكامنة وراء هذه لا تزال ذات الصلة، ويمكن تحديد مسارات جديدة للعلاج. في MHC عدم تطابق كامل، مثل C57BL / 6 في BALB / ج، ​​يعني تم الإبلاغ بقاء تعتمد على زرع الكلى أن تكون منخفضة مثل 7.4 أيام 10. تشريحيا رفض خلوي والأوعية الدموية الحاد يمكن تحديدها من قبل لمفاوي تسلل نزف وذمة في الخلالي، tubulitis، التهاب الأوعية الدموية، مع نخر أنبوبي والكبيبي. جعلت العمليات مجتمعة تساهم في الضرر المزمن طعم خيفي هذا المجال الصعب للدراسة. وتشمل الميزات النسيجية التليف الخلالي، وضمور أنبوبي، الكبيبات وانتشار باطنة. ويرتبط إصابة التدريجي مع استمرار تسلل خلية T، ومع ذلك يحظى بتقدير متزايد بأن العديد من العوامل الأخرى قد تصاب. وتشمل يتوسط المحتملة للإصابة المستمرة ترسب المتممة بسبب الأجسام المضادة المانحة الخاصة، والخلايا B والخلايا القاتلة الطبيعية، الضامة، والخلايا الذاتية إلى الكسب غير المشروع مثل البطانة 3. ولهذا النموذج يسمح للدراسة هذه الجوانب المختلفة من الرفض.

كان هناك ما يقرب من 70 دراسة نشرت الاستفادة من هذا النموذج على الرغم من وصف في وقت مبكر هذا بالمقارنة مع نماذج الماوس من نقص تروية الكلى إصابة ضخه، حيث كانت هناك عدة مئات من المقالات. أهمية هذا نموذج الفأر من زرع الكلى داخل البطن هو أنه يعيد عملية زرع الكلى البشرية مباشرة، علاوة على ذلك فهي تستفيد من استخدام سلالات الفئران الفطرية واضحة المعالم التي يمكن استخدامها لنمذجة آليات مختلفة من الرفض. ومن هنا جاءت الدراسات التي تستخدم هذا النموذج هي ترجمة للغاية. وتشمل التطبيقات المستقبلية الأخرى من هذا النموذج يدرس التشوهات الكلوية الذاتية عن طريق زرع الكلى مع الظواهر محددة من النماذج خروج المغلوب في البرية من نوع الفئران أو على العكس من النوع البري في الكلى وراثياغيرت المتلقين.

يمكن تكرار هذا النموذج بنجاح عملية زرع الكلى البشري. استخدام الماوس السلالات الفطرية يسمح اختيار توليفات المانح والمتلقي متفاوتة الاختلافات MHC. وعلاوة على ذلك استخدام الفئران يسمح باستخدام مختلف التقنيات بما في ذلك خروج المغلوب وأنظمة محرض للتحقيق في جوانب مختلفة من الرفض.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

الكتاب ليس لديهم ما يكشف.

Acknowledgments

تمويل أبحاث الكلى من المملكة المتحدة، والكلية الملكية للجراحين في ادنبره والجمعية الأوروبية لزراعة الأعضاء دعمت هذه الدراسة.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Surgical Instruments
Blunt Dissecting Scissors Fine Science Tools  14072-10 For skin cutting
Curved Castoviejo scissors Fine Science Tools 15017-10 For tissue cutting
Spring Scissors – straight Fine Science Tools 15000-08 For suture cutting
Toothed forceps 1x2 teeth Fine Science Tools 11021-12
2 x Fine Tip forceps (Dumont No.5) Fine Science Tools 11251-20
Angled Fine Tip forceps (Dumont No. 5/45) Fine Science Tools 11253-25 For blunt dissecting
Curved Fine Tip forcep (Dumont No.7) Fine Science Tools 11273-22 Useful to pass around vessels
Curved Crile Haemostat Fine Science Tools 1300-04
Micro clip applicator with lock Fine Science Tools 18056-14
2 x Micro serrefines spring width 2mm, jaw length 4mm Fine Science Tools 18055-04 Microvascular clamps
2 x Colibri 3cm wire retractor Fine Science Tools 17000-03
Castroviejo needle holder with lock Fine Science Tools 120660-01
Wound clip applicator Fine Science Tools 12031-07
7mm wound clips Fine Science Tools 12032-07 Remove 7 to 10 days after surgery
Equipment
OPMI pico microscope Carl Zeiss S100
Thermal cautery unit with fine tip Geiger 150A
Heat electronic pad Cozee Cumfort n/a
Euroklav 23-S Melag n/a Autoclave
Disposable equipment
7/O Silk braided suture Pearsall 30514
10/O Dafilon (polyamide) suture B-Braun  G1118099
6/O Vicryl (plygalectin) Ethicon W9537
Regular bevel needle, 1 inch, 21G Bection, Dickinson and Company 305175 For ureteric anastamosis
Regular bevel needle, 5/8 inch, 25G Bection, Dickinson and Company 305122
Regular bevel needle, 1/2 inch, 30G Bection, Dickinson and Company 304000
Insulin needle 1ml, 29G Bection, Dickinson and Company 324827
Insulin needle 0.3ml, 30G Bection, Dickinson and Company 324826
1 ml syringe slip tip Bection, Dickinson and Company 300184
5 ml syringe slip tip Bection, Dickinson and Company 302187
Wypall paper swabs Kimberley-Clark L40 sterilised by autoclave
Cotton wool buds Johnson and Johnson n/a sterilised by autoclave
Plain drapes Guardian CB03 sterilised by autoclave
Cell culture dish 60mm x 15mm Corning Incorporated 430166
Dispensing Pin B-Braun DP3500L / 413501 Used with NaCl 0.9%
Re-agents and Drugs
(Lacri-Lube) White soft paraffin 57.3%, mineral oil 42.5% and lanolin alcohols 0.2% Allergan Ltd 21956GB10X
(Videne) Povidone-iodine 10% Ecolab Ltd PL 04509/0041
(Vetalar V) Ketamine hydrochloride Pfizer Animal Health Vm 42058/4165 100mg/ml solution (dose 200mg/kg)
(Domitor) Medetomidine hydrochloride  Orion Pharma Vm 06043/4003 1mg/ml (dose 0.5mg/kg)
(Vetergesic) Bupernorphine hydrochloride  Alsto Animal Health Vm 00063/4002 0.3mg/ml (dose 0.05mg/kg)
(Antisedan) Atipamezole hydrochoride Orion Pharma Vm 06043/4004 5mg/ml (dose 2mg/kg)
University of Wisconsin Solution Belzer Bridge to Life n/a dose approximately 500 microlitres/mouse
NaCl 0.9% Baxter FKE1323
Heparin Sulphate non-proprietary n/a 5000units/ml (dose 5units/mouse)

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Guild, W. R., Harrison, J. H., Merrill, J. P., Murray, J. Successful homotransplantation of the kidney in an identical twin. Trans. Am. Clin. Climatol Assoc. 67, 167-173 (1955).
  2. Wolfe, R. A., et al. Comparison of mortality in all patients on dialysis, patients on dialysis awaiting transplantation, and recipients of a first cadaveric transplant. N. Engl. J. Med. 341, 1725-1730 (1999).
  3. Nankivell, B. J., Alexander, S. I. Rejection of the Kidney Allograft. N. Engl. J. Med. 363, 1451-1462 (2010).
  4. Tse, G. H., Hughes, J., Marson, L. P. Systematic review of mouse kidney transplantation. Transplant International. 26, 1149-1160 (2013).
  5. Skoskiewicz, M., Chase, C., Winn, H. J., Russell, P. S. Kidney transplants between mice of graded immunogenetic diversity. Transplant. Proc. 5, 721-725 (1973).
  6. Zhang, Z., et al. Pattern of liver, kidney, heart, and intestine allograft rejection in different mouse strain combinations. Transplantation. 62, 1267-1272 (1996).
  7. Qi, F., et al. Depletion of cells of monocyte lineage prevents loss of renal microvasculature in murine kidney transplantation. Transplantation. 86, 1267-1274 (2008).
  8. Dang, Z., Mackinnon, A., Marson, L. P., Sethi, T. Tubular atrophy and interstitial fibrosis after renal transplantation is dependent on galectin-3. Transplantation. 93, 477-484 (2012).
  9. Jabs, W. J., et al. Heterogeneity in the Evolution and Mechanisms of the Lesions of Kidney Allograft Rejection in Mice. Am. J. Transplant. 3, 1501-1509 (2003).
  10. Lin, T., et al. Deficiency of C4 from Donor or Recipient Mouse Fails to Prevent Renal Allograft Rejection. Am. J. Pathol. 168, 1241-1248 (2006).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics