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Maus Nierentransplantation: Modelle der Transplantatabstoßung

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Tse, G. H., Hesketh, E. E., Clay, M., Borthwick, G., Hughes, J., Marson, L. P. Mouse Kidney Transplantation: Models of Allograft Rejection. J. Vis. Exp. (92), e52163, doi:10.3791/52163 (2014).

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Abstract

Introduction

Erfolgreiche Nierentransplantation für die Behandlung von Nierenversagen wurde erstmals im Jahr 1955 zwischen eineiigen Zwillingen 1 beschrieben, seitdem hat es sich eine revolutionäre Behandlung für Patienten mit terminaler Niereninsuffizienz in der ganzen Welt und bietet sowohl eine Verbesserung in der Länge und der Lebensqualität 2. Langfristige Transplantatüberleben hat sich jedoch durch eine Vielzahl von pathologischen Prozessen, was zu chronischen Allograft-Schaden 3 behindert.

Abstoßung des transplantierten Niere beim Menschen bleibt eine der Hauptursachen für Morbidität, trotz erheblicher Verbesserungen in immunosupporessive Regimen. Das Ziel der Entwicklung eines Maus-Modell der Nierentransplantation ist es, den Prozess und die Pathologie im menschlichen Nierentransplantation 4 gefunden eng replizieren. Skoskiewicz et al. Beschrieb als erster die Maus-Modell der Nierentransplantation im Jahr 1973 5. Obwohl fortgeschrittenen mikrochirurgischen Fähigkeiten erforderlich sind, ist es ein wertvolles tool aus mehreren Gründen: die Maus-Genom ist gut charakterisiert und es gibt eine große Vielfalt von experimentellen Methoden und Techniken für die Maus-Studien zur Verfügung.

Viele Gruppen unter Verwendung des Maus-Modell der Nierentransplantation wurden die transplantierten Niere als lebenserhaltende Organ jedoch in anderen Studien und in unserem beschriebenen Methodik einer nativen Nieren des Empfängermaus wird in situ während der Dauer des Experiments 4 links verwendet. Der Vorteil ist, dass die Maus durchläuft einen einzigen Narkose und Operation, wodurch die Morbidität an die Maus und das Risiko des Todes von einem zweiten Verfahren zu reduzieren. Zusätzlich wird die Maus nicht von den negativen Auswirkungen der schrittweisen Nierenversagen leiden.

Obwohl Modelle von allogenen Abstoßung in anderen Organen wie dem Herzen und der Haut vorhanden sind, sind diese nicht immer unmittelbar relevant Nierentransplantation. Es gibt Hinweise, dass diese Modelle zu entlocken verschiedenen Modi und dymik der Abstoßung, beispielsweise der zeitliche Verlauf der Abstoßung des Herztransplantat und Nierentransplantat unterscheidet sich signifikant in bestimmten Stammkombinationen 6. Wir haben akute Nierentransplantatabstoßung Muster in BALB / c-Spendern in den nicht-transgenen FVB / NJ Mäusen beschrieben, zeigte das Modell zellulären vermittelte Schädigung mit Anhäufung von T-Zellen und Makrophagen 7. Alternativ haben wir auch beschrieben ein Modell der chronischen Transplantatschäden, die interstitielle Fibrose und tubuläre Atrophie zeigt, führt dies aus Transplantation einer Niere von C57BL / 6 BM12 Spender in C57BL / 6 Empfängern, da diese Mäuse werden von einem einzigen MHC-Klasse-II-Loci mis gekennzeichnet -match 8.

Mehrere Aspekte der Transplantation wurden mit dem Maus-Modell der Nierentransplantation einschließlich akuten Abstoßung, zelluläre und humorale Ablehnung, Ischämie Reperfusionsschaden und Erprobung neuartiger therapeutischer Wirkstoffe untersucht. Wir haben die chirurgischen t modifiziertenechnik um die Betriebszeit zu verringern und die Leichtigkeit der Operation. Besonders haben wir gleichzeitige Spender und Empfänger Vorbereitung und eine vereinfachte Gefäßanastomose Technik durch die Verwendung eines kontinuierlichen Aorten-Patch-Anastomose beschrieben. Dieses Video und Manuskript liefert wichtige Punkte bei der Errichtung dieser Technik zu unterstützen.

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Protocol

Entsprechenden nationalen und lokalen Ethik sollten vor der Durchführung von Tierversuchen sein. Insbesondere in Großbritannien die folgenden Experimente wurden unter den Tiere (Scientific Procedures) Act 1986 Wo zwei Mikrochirurgen zur Verfügung, um gleichzeitig arbeiten der Spender Chirurgen durchführen sollten unternommen Schritte 1,1-1,16 dann 3.1 bis 3.5, während der Empfänger Chirurg führt 2.1 bis 2.8 . Für einen einzelnen Bediener kann die Schritte nacheinander folgen.

1. Spender Vorbereitung

Hinweis: Die hier vorgestellte Verfahren ist auf ein Spender C57BL / 6 BM12 und Empfänger C57BL / 6 männlichen Mäusen zwischen 8 bis 16 Wochen alt im Alter mit einem Körpergewicht von mehr als 20 g. Jedoch kann dieses Verfahren reproduzierbar auf einer Vielzahl von Maus-Stämmen durchgeführt werden. Die in der repräsentative Ergebnisse Abschnitt vorgestellten Daten wurden aus C57BL / 6, C57BL / 6 BM12 und BALB / c-Mäusen erhalten.

  1. Verhalten Verfahren Using sterilen chirurgischen Instrumenten und Verbrauchsmaterialien (autoklaviert), mit Bemühungen, die Betriebsbereich so steril wie möglich zu halten. Führen Sie die Vorbereitung Spender gleichzeitig mit dem Empfänger Vorbereitung, wenn zwei Chirurgen zur Verfügung.
  2. Betäuben die Maus mit einer intraperitonealen Injektion (31G-Nadel) von Medetomidin (0,5 mg / kg) und Ketamin-Hydrochlorid (200 mg / kg). Dies führt zu einem Anästhetikum-Ebene, die für 4 Stunden mit genügend Zeit für das gesamte Verfahren gehalten wird, um durchgeführt werden. Zusätzliche Betäubung ist nicht erforderlich.
  3. Bestätigen Sie, dass die Maus betäubt (keine Antwort auf Zehen Prise).
  4. Rasieren Sie die Maus Bauch und entfernen Sie alle losen Haare mit Klebeband.
  5. Platzieren Sie die Maus auf dem Rücken auf einem steril drapiert beheizten Matte und die Glieder mit sterilem Kreppband locker zu immobilisieren.
  6. Überwachen Sie die Maus während des gesamten Verfahrens für Verbrennungen. Wenn möglich verwenden Sie eine nicht-elektrische Wärmequelle.
  7. Gelten ein Auge Schmiermittel und sanitize die Bauchdecke mit einer verdünnten Jodlösung.
  8. Machen Sie eine Mittellinienschnitt in den Bauch, um die Bauchhöhle geben und legen Sie eine 3 cm Bauchdeckenhalter Calibri.
  9. Gelten erwärmt Kochsalzlösung, um den Darm und chirurgischen Bereich feucht halten und vermeiden unnötige Trocknen der Eingeweide.
  10. Decken Sie die Maus mit sterilen Tüchern und bewegen den Darm zur Fahrer linken (rechten Maus), um die Aorta, Vena Cava und linke Niere freizulegen.
  11. Tragen Sie eine ratcheted forcep in den Magen und ziehen souverän, um die großen Gefäße und linke Niere vollständig freizulegen. Packung dämpfen sterile Tupfer (2 mm x 2 mm) in die Bauchhöhle, um Gewebe zurückzuziehen aus dem Operationsbereich, wie den Leberlappen, Samenblasen und Darm.
  12. Isolieren Sie die linke Niere aus den umliegenden Adventitia, Fett und der linken Nebenniere in der Bauchhöhle durch unverblümt Sezieren des Bindegewebes mit feiner Spitze Pinzette. Legen Sie die geschlossene Spitzen der Zange zwischen den Bereichen, die need getrennt werden und langsam, damit die Pinzettenspitzen zu öffnen, um den Raum zu sezieren.
  13. Isolieren Sie die linke Nierenvene durch Ligation und dann Teilen des linken Neben Vene und links Gonaden Vene mit 9 / O-Nylon. Legen Sie den Faden in der Nähe des Nierenvenen.
  14. Ligat und teilen den Harnleiter mit 7 / A-Seidennaht in der Nähe der Blase Verlassen der Fadenenden lang. Diese lange Fadenenden wird verwendet, wenn die Nieren geerntet und für die Harnleiter-Anastomose erforderlich ist.
  15. Zu mobilisieren und voll sezieren die Aorta und Vena Cava superior und inferior in die Nierenarterie und Vene verwenden feine Spitze Pinzette stumpf sezieren Lymphgefäße und Fett von der Front und an den Seiten der Gefäße.
  16. Finden Sie die Gewebeebene zwischen der Aorta und Vena Cava und langsam breitete der Zange. Langsam öffnen die Spitzen der Pinzette mit feiner Spitze, um das Gewebe mit minimalem Trauma zu verbreiten.
  17. Binden Sie eine lockere 7 / A-Seide um die Aorta oberhalb und unterhalb der Nierenarterie, indem eine abgewinkelte FeinSpitze Pinzette um die Rückseite der Gefäße und Zeichnen einer Naht durch. Diese Nähte vor dem Nieren Abruf angezogen werden, um retrograde Perfusion der University of Wisconsin-Lösung zu ermöglichen.

2. Empfänger Vorbereitung

Nach dem Spender Vorbereitung Folgeschritte 1.2 bis 1.8.

  1. Bewegen Sie den Darm, um das Recht des Betreibers (Maus links), um die Aorta, Hohlvene aus. Decken den Darm mit einer sterilen Kochsalzlösung getränkten Tupfer.
  2. Führen Sie ein Recht Nephrektomie durch Ligation des rechten Nierenarterie und Vene zusammen mit 7/0 Seidennaht und dann teilen.
  3. Ligieren das Recht Harnleiter mit 7 / A-Seidennaht und teilen.
  4. Mobilisieren und voll sezieren die Aorta und untere Hohlvene in die Nierenarterie und Vene, wie in Schritt 1.14 und 1.15 beschrieben. Stellen Sie sicher, komplette Dissektion zwischen der Aorta und Vena Cava. Achten Sie darauf, um die interne Samen Arterie, die anterior der Hohlvene und aort läuft bewahrenein zusammen mit dem lymphatischen Bündel.
  5. Identifizieren Lendengefäße im retroperitoneum aus der Vena cava und Vene an der Wirbelsäule ausgeführt werden, zu ligieren, mit 9 / O-Seide in Kontinuität, gibt es keine Notwendigkeit, die Behälter zu unterteilen.
  6. Identifizieren ausreichend Platz, um mikrovaskuläre Schellen mit Platz für zwischen Gefäßanastomosen zu platzieren.
  7. Verwalten intravenösen Heparin (5 Einheiten) über dorsalis penis Vene.

3. Spenderniere Retrieval

Ziehen Sie die 7 / A-Seidenkrawatten, die um den unteren und oberen Aorta platziert wurden, um die Niere aus dem arteriellen Blutkreislauf zu isolieren.

  1. Infuse retrograde kalt 0.2 - 0.5 ml University of Wisconsin-Lösung mit einer Nadel (31G) in die Aorta.
  2. Teilen Sie die Aorta in den Nähten und teilen das Nierenvenen an ihrer Verbindung mit der Vena Cava, die Nieren und die Nierenarterie mit einer Länge von Aorta zu entfernen. Teilen Sie Lendenwirbelgefäße aus der Aorta, wenn sie vorhanden sind, whne Ligation.
  3. Legen Sie die Niere in kalten Kochsalzlösung auf einem sterilen Tupfer in einer Kulturschale.
  4. Euthanize den Spender Maus durch zervikale Dislokation.

4. Nierentransplantation - Nieren-Vorbereitung

  1. Erstellen Sie ein Aorten-Patch durch Division der Aortenwand in Längsrichtung direkt gegenüber der Nierenarterie. Identifizieren Sie alle Gefäßlumen in der Patch, der auf ligiert oder vermieden werden müssen, wenn die Durchführung der arteriellen Anastomose.
  2. Legen Sie eine 10 / O Naht von außen nach innen der Nierenvenenlumen nach oben und ein zweites separates Naht inferior. Die Nahtmaterialien verwendet, um die Nebennierenvenen teilen und Gonaden Vene verwendet, um das Gefäß zu orientieren.
  3. Legen Sie die Niere in der rechten Flanke des Empfängers (Abbildung 1.1) und sicherzustellen, dass die Nähte sind gut aufgestellt, um sicherzustellen, Gefäßanastomosen kann, ohne die Nähte werden bei Tupfer oder andere Instrumente verflochten abgeschlossen sein.

5. Nierentransplantation - Gefäßanastomose

Gelten mikrovaskulären Schellen ersten inferior dann souverän umfasst die Vena Cava und Aorta.

  1. Machen Sie eine ventomy mit einer Nadel (31G), die durch Punktion der vorderen Wand der Vena Cava. Bündig Blut aus der Vena cava durch die Injektion etwa 50 ul 0,9% NaCl.
  2. Erweitern die Venenschnitt mit feiner Spitze Pinzette von innerhalb der Venenschnitt zu öffnen, so dass die Länge entspricht der Durchmesser des Spendernierenvenen.
  3. Platzieren Sie die 10 / A überlegen Naht (die bereits in dem Lumen der Nierenvene ist) zuerst an der Spitze des Venenschnitt (Figur 1.2) und sich der Rückwand der Anastomose in einem laufenden Faden, bis der untere Scheitelpunkt erreicht ist (Abbildung 1.3).
  4. Legen Sie die 10 / A unterlegen und erste Naht eine Krawatte mit einem einzigen Knoten (Abbildung 1.4), dann auf die fortlaufende Naht binden von der Rückwand.
  5. Verwendung des minderwertigen Faden schaffen die Front wall der Anastomose (Abbildung 1.5) mit einer fortlaufenden Naht und binden an das übergeordnete Nahtende am oberen Scheitelpunkt (Abbildung 1.6).
  6. Neues Aortotomie durch Abheben des Aortawand mit einer Zange und Schneiden einer elliptischen Fleck mit einer Schere (ungefähr die Aortotomie sollte ein Fünftel des Umfangs der Aorta und dreimal der Nierenarterie Lumen in der Länge).
  7. Legen Sie eine 10 / O Naht am oberen Punkt der Aorten-Patch von außen nach innen (Abbildung 1.7) und durch die Aorta, um außerhalb der Gefäße an der oberen Spitze des Aortotomie zu binden.
  8. Erstellen Sie die arterielle Anastomose mit einer fortlaufenden Naht ab superior (Abbildung 1.8) Anastomosieren dem Spender-Patch an den Empfänger Aorta, darauf achten, nicht die Anastomose durch das Binden die Naht zu eng (Abbildung 1.9) einengen.
  9. Entfernen Sie die schlechtere Gefäßklemmen zuerst, dann die überlegene Haken, um den Nieren reperfuse (Abbildung 1.10 und 1.11). Sichtbare Peristaltik des Ureters vielleicht gesehen, wenn ausreichende Blutversorgung des Ureters erreicht.

6. Nieren-Transplantation - Ureteric Anastomose

  1. Teilen Sie alle Anhänge der Blase von der Bauchwand.
  2. Übergeben Sie eine Nadel (21G) von links nach rechts von der Blase durch beide Wände.
  3. Zeigen gerade Pinzettenspitzen in den Nadellumen und passieren beide wieder durch die Blase, so dass die Zange passieren jetzt von rechts, aus der linken Seite der Blase gelassen.
  4. Ziehen des Fadens auf der Spender Harnleiter durch die Blase, so dass die Harnröhre verläuft auf der linken Schlauchdefekt dann von der rechten Seite.
  5. Naht der Adventitia des Harnleiters in die Adventitia der Blase mit drei Einzelknopfnähten um die Eintrittsstelle mit 9 / O Nylonnaht auf einem runden Körper Nadel.
  6. Schneiden Sie den Harnleiter proximal der Ligatur und eröffnet damit the Harnleiter, damit Urin zu fließen und es dem Harnleiter Ende in den Körper der Blase zurückziehen. Sichtbar Produktion von Urin kann zusammen mit Blutungen aus peri-ureteric Gefäße beobachtet werden.
  7. Schließen Sie die rechte Blasendefekt mit einer einzigen Unterbrechung 9 / O Seidennaht.

7. Wiederherstellung und post-operative Betreuung

Ersetzen Sie den Magen-Darm-Eingeweide in die Bauchhöhle in ihrer ursprünglichen Ausrichtung und schließen Sie die Bauchwand durch die Angleichung der geraden Muskeln mit 6 / O resorbierbares Nahtmaterial.

  1. Annäherung an die Haut mit Metall-Haut-Clips.
  2. Teilweise Umkehr der Anästhesie mit einer subkutanen Injektion von atipamazole Hydrochlorid (10 ul / g).
  3. Verabreichen Analgesie durch subkutane Buprenorphin-Hydrochlorid (0,05 mg / kg) und für Haltefluid Injektion von 1 ml 0,9% NaCl subkutane.
  4. Wiederherstellen der Maus in einem Wärmeschrank bei 28 ° C für 24 bis 48 Stunden. Beachten Sie die Maus für die Krankheit bis zu derBeendigung des Experiments.
  5. Entfernen Metallhautklammern 7-10 Tage nach der Operation.
  6. Nachdem das Experiment abgeschlossen ist einschläfern die Maus durch Genickbruch.
  7. Entfernen und die kontralateralen Niere und Allograft für die histologische Analyse.

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Representative Results

Nierentransplantatabstoßung durch histologische Analyse Methacarn in Paraffin eingebetteten Gewebeschnitten der transplantierten Niere (2) bewertet werden. Transplantation von Nieren Isotransplantat zwischen syngenen Mäusen zu einer Nieren ischämischen Reperfusionsschäden jedoch um 4 Wochen werden die Tubuli haben sich erholt und sind histologisch vergleichbar mit nativen Nieren. Akute Abstoßung kann durch C57BL / 6 Nierentransplantation in BALB / c-Empfänger modelliert werden, innerhalb von 1 Woche gibt es diffuse mononukleare Zellinfiltration in der gesamten Nierenparenchym, an denen das Interstitium, Glomeruli und Tubuli. Chronischen Transplantatschäden können durch C57BL / 6 BM12 Nieren in C57BL / 6 Rezipienten transplantiert modelliert werden, ergeben sich die typischen Merkmale der menschlichen Pathologie aus der interstitiellen Fibrose und schrittweise Tubulus Verlust gefunden. Brutto Röhrchen Zahl pro High-Power-Bereich (x200 Vergrößerung) erlaubt eine Quantifizierung der funktionellen Nephronmasse (FiAbbildung 3), Verlust der Tubuli spiegelt Rohrschäden durch Ablehnung. Interstitieller Fibrose kann mit dem pan-Kollagen Fleck Picrosirius rot (Abbildung 4) identifiziert werden. Normalen endogenen Kollagen beobachtet wird, aber während der chronischen Schäden neues Kollagen abgelagert, was zu progressive Fibrose. Die chronische Schädigung zeigt sich zwischen 8 und 12 Wochen nach der Transplantation (Abbildung 5).

Eine signifikante Lernkurve muss, um das Modell (Abbildung 6) zu etablieren überwunden werden. Schätzungsweise 40 Verfahren wurden in Mäusen gewonnen, bevor eine reproduzierbare Gefäßanastomose Zeit wurde mit akzeptablen Lebens frei von Komplikationen erreicht geführt. Der häufigste Grund für euthanizing Die Maus wurde durch Lähmung der hinteren Gliedmaßen sekundär zu der unteren Extremitäten und Rückenmark Ischämie im Zusammenhang mit Thrombose arteriellen jedoch nach unserer Erfahrung systemische heparization verringert die Häufigkeit dieser. Mäuse waren routinemäßig monach lokal vereinbarten Kriterien für die Beendigung der Experimente nitored. Überlebensversuche in der Plateauphase der Lernkurve durchgeführt führte zu einer mittleren Gefäßanastomose Zeit von 28,9 ± 0,47 min.

Figur 1
Abbildung 1 Schematische Darstellung der vaskulären Anastomose-Technik. Die Spenderniere wird in die rechte Flanke des Empfängermaus gegeben. Der Spender Nierenvene in einer End-zu-Seit-Weise anastomosiert und der Spender Nierenarterie auf einem Patch von Aorta wird an den Empfänger Aorta anastomosiert.

Figur 2
Abbildung 2. Repräsentative histologische tubuläre Schädigung in der transplantierten Niere. Nach der Fixierung in Methyl Carnoyl Lösung Gewebe wurden in Paraffin eingebettetFlosse und Gewebeschnitte von 4 um wurden durch Hemotoxylin und Eosin gefärbt. 4 Wochen nach der Transplantation Isotransplantat Nieren nicht tubuläre Schädigung aufweisen und sind vergleichbar mit nativen Nieren in Erscheinung. C57BL / 6 BM12 Nieren in BALB / c-Empfänger transplantiert unterziehen akuten Transplantatabstoßung mit diffuser mononukleare Zell Infiltrate (*) und nekrotischen Tubuli (**) und Tubulitis. C57BL / 6 BM12 Nieren in C57BL / 6 Ergebnisse bei chronischen Allograft-Schäden gekennzeichnet durch perivaskuläre lymphozytäre Infiltrate (Blockpfeil ⬆) und interstitielle Fibrose und tubuläre Atrophie (Hohlpfeilen ⇧) transplantiert. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Figur 3
Abbildung 3. Quantifizierung von Rohrschäden in der tr ansplanted Niere. Gesunde Tubuli (durch die Anwesenheit einer intakten Basalmembran intakt Tubuluslumen, gesund Zytoplasma-Volumen und einer gepflegten apikalen Mikrovilli Pinsel Grenze definiert) reflektieren funktioniert Nephronmasse kann durch Zählen der durchschnittlichen Anzahl der Tubuli pro Feld quantifiziert werden (x200 Vergrößerung ) (n = 6, Durchschnitt von 10 aufeinanderfolgenden Halbbildern, ** p <0,01).

Figur 4
Abbildung 4. Chronische Transplantatschäden können durch interstitielle Fibrose (repräsentative Bilder). Ablagerung von Kollagen identifiziert innerhalb der transplantierten Niere ist offensichtlich durch den Nachweis von Picrosirius-Rot-Färbung von Kollagen werden. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

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Abbildung 5. Quantifizierung von interstitieller Fibrose. Interstitielle Fibrose durch Picrosirius rot Positivität in C57BL / 6BM12 angehoben gemessen ⇒ C57BL / 6 Empfänger zwölf Wochen nach der Transplantation (N = 6, Durchschnitt von 10 aufeinanderfolgenden Halbbildern, ** p <0,01, * p < 0,05).

Figur 6
Abbildung 6. Lernkurve. Erste nicht-Recovery-Experimente in terminal narkotisierten Mäusen wurden durchgeführt, um die OP-Technik zu entwickeln. Dies wurde durch Wiederfindungsversuche gefolgt, um einen erfolgreich wieder durchblutet transplantierten Niere mit einer überlebenden Maus ohne Komplikationen zu erreichen.

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Discussion

Die bekann beschriebenen Weise, um die arterielle Anastomose an dem distalen Aorta des Spender zum Empfänger Aorta zu verwenden, mit der Nierenarterie in Fortsetzung, die in einem Ende-zu-Seite-Weise. Wir beschreiben die Verwendung eines aortischen Patch, ähnlich dem "Carrell Patch" Spiegeln, die in der menschlichen Niere Transplantation von denen wir glauben, um bequemer durchgeführt. Obwohl in der Literatur von Spender und Empfänger operativen Zeit spärlich sind wir der Meinung, dass die Verwendung eines aortischen Patch Empfänger Aorta anstelle von Ende-zu-Seite-Donor an Empfänger Aorta Aorta bevorzugt. Mit einem Patch negiert die Notwendigkeit, alle Lenden-Spender Aortenäste sezieren, und auch die Zeit, um sie einzeln zu ligieren, als Anastomose eines Patch natürlich schließt diesen.

Wichtige Schritte, um dieses Modell zu erreichen, zählen wobei darauf zu achten, dass es keine anderen, als die Nierenarterie in der arteriellen Anastomose Patch arterielle Lumen sieundicht wird, wenn Mikro-Gefäßklemmen entfernt werden. Die Nähte der Konstruktion der anastamoses dicht gebunden, aber bewusst sein, die Tabaksbeuteleffekt, der die Anastomose und die Ursache einzugrenzen Ischämie oder einen Blutfluss hemmen können, in Praktikabilität haben wir beobachtet, dass die elliptische Aortotomie versehen werden eine ausreichende Größe der Tabaksbeutel Effekt nicht auftritt. Die Venenschnitt wird mit einer Nadel dann durch Strecken mit einer Pinzette erweitert gemacht, wir glauben, das ist besser, als Schneid Dehnung mit Zange schafft einen Ring von Venengewebe, das leicht gesehen werden kann und die Hilfe, um eine stabile Naht Anastomose erstellen. Der Harnleiter in die Blase Anastomose ist eine sehr wichtige Komponente, um zu prüfen, wir befürworten die lieber hier beschrieben als eine Blase-Kuppel Blase Re-Konstruktion, die mit Urin Leck und ureteric Stenose vermutlich aufgrund Ischämie wurde Technik. Unsere beschriebene Technik ermöglicht eine kürzere Länge ureteric Donor verwendet, da es direkt mit dem bladd anastomierendenEr 5. Durch die Verwendung dieser technischen Verbesserungen, die wir in der Lage, die Menge an Zeit benötigt, um dieses experimentelle Modell kann beträchtlich reduzieren. In der Tat mit zwei Operatoren gleichzeitig arbeiten fünf Transplantatempfängern können pro Tag mit ausreichend Zeit durchgeführt werden, um Wiederherstellung und Überwachung der Mäuse zu ermöglichen.

Eine wesentliche Einschränkung des beschriebenen Modells und der Technik in dieser Arbeit ist, dass die Maus mit einem seiner nativen Nieren in situ belassen, so dass die Maus ist nicht abhängig von der Niere zu überleben. Einige Autoren haben die Entfernung des zweiten nativen Nieren sofort zum Zeitpunkt der Transplantation oder fünf bis zehn Tage nach der Transplantation, wodurch die Maus Verlassen abhängig von der transplantierten Niere. Dies würde es ermöglichen, um das Überleben als experimentelles Ergebnis sowie Blutentnahme Marker der Nierenfunktion wie Serum-Kreatinin oder Harnstoff im Blut zu messen verwendet werden. Jedoch gibt es keinen Unterschied in histologischen Ergebnissebeim Vergleich Mäusen abhängig von der Allograft und diese mit einem einzigen nativen Nieren 9. Unsere beschriebenen Protokoll stehe dem nicht entgegen, und zwar die zweite Mutter Niere kann zu einem gegebenen Zeitintervall entfernt werden. Eine weitere Einschränkung ist, dass erweiterte mikrochirurgische Expertise, um eine arterielle und venöse Anastomose erforderlich ist, wenn mit der Ausbildung und durch Verwendung der technischen Wert für diese Anweisung kann überwunden werden. Vaskulären Komplikationen können auftreten, wobei diese Nierenarterie oder Venenthrombose, dies führt unweigerlich in der Maus mit Anzeichen für eine Not, schlechter Gesundheit oder speziell hinter-Beinlähmung. Daher ist die strikte Governance und Überwachung von Mäusen unbedingt bei der Nutzung dieses Modell.

Akute Abstoßung der Nierentransplantation wurde weitgehend durch Immunsuppression und Induktionstherapie abbau zirkulierenden Lymphozyten behandelt, jedoch Episoden zellvermittelte Abstoßung noch in den Nierentransplantaten auftreten,Leben. Daher Studien über die Mechanismen dieser zugrunde liegen, sind noch immer relevant und können neue Wege für die Behandlung zu identifizieren. In völliger Fehlanpassung MHC, wie C57BL / 6 in BALB / c, die mittlere Überlebens abhängig von der Nierentransplantation wurde berichtet, so niedrig wie 7,4 Tage 10 sein. Histologisch akute zelluläre und vaskuläre Abstoßung kann durch Lymphozyteninfiltration, Blutungen und Ödeme im Interstitium, Tubulitis, Vaskulitis, mit glomerulären und tubulären Nekrose identifiziert werden. Die kombinierten Prozesse, die zur chronischen Allograft-Schäden haben in diesem Bereich schwer zu untersuchen gemacht. Die histologischen Merkmale sind interstitiellen Fibrose, tubuläre Atrophie, Glomerulosklerose und Intima-Proliferation. Die fortschreitende Schädigung mit persistierender T-Zell-Infiltration assoziiert, es wird jedoch zunehmend klar, dass viele andere Faktoren beteiligt sein können. Potential vermittelt der anhaltenden Verletzungen gehören Ergänzung Ablagerung durch Spender-spezifische Antikörper, B-Zellen, natürliche Killerzellen, Makrophagen und Zellen eigen Transplantats wie dem Endothel 3. Daher ist dieses Modell ermöglicht die Untersuchung der verschiedenen Facetten der Ablehnung.

Es gibt trotz der frühen Beschreibung 4 war etwa 70 veröffentlichten Studien mit diesem Modell, das ist im Vergleich zu Maus-Modellen der Niere Ischämie-Reperfusion Verletzungen, wo es mehrere hundert Artikel. Die Bedeutung dieses Mausmodell für intraabdominale Nierentransplantation ist, dass es direkt erstellt den Prozess der menschlichen Nierentransplantation, ferner aus der Verwendung von wohldefinierten Inzucht-Mausstämmen, die verwendet werden können, um verschiedene Mechanismen der Abstoßung Modells basiert. Daher sind die Studien unter Verwendung dieses Modells sind sehr übersetzbar. Andere zukünftige Anwendungen sind unter anderem die Eigen Studium Nierenveränderungen durch die Transplantation von Nieren mit spezifischen Phänotypen von Knockout-Modelle in Wildtyp-Mäusen oder umgekehrt Wildtyp-Nieren in genetischveränderten Empfänger.

Dieses Modell kann den Prozess der menschlichen Nierentransplantation erfolgreich zu replizieren. Die Verwendung von Inzuchtmausstämme ermöglicht die Auswahl der Spender-Empfänger-Kombinationen mit unterschiedlichen MHC-Unterschiede. Ferner kann die Verwendung von Mäusen erlaubt die Verwendung von verschiedenen Techniken, einschließlich KO und induzierbare Systeme, die verschiedenen Aspekte der Abstoßung zu untersuchen.

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Disclosures

Die Autoren haben nichts zu offenbaren.

Acknowledgments

Finanzierung von Kidney Research UK, The Royal College of Surgeons of Edinburgh und der Europäischen Gesellschaft für Organtransplantation unterstützt diese Studie.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Surgical Instruments
Blunt Dissecting Scissors Fine Science Tools  14072-10 For skin cutting
Curved Castoviejo scissors Fine Science Tools 15017-10 For tissue cutting
Spring Scissors – straight Fine Science Tools 15000-08 For suture cutting
Toothed forceps 1x2 teeth Fine Science Tools 11021-12
2 x Fine Tip forceps (Dumont No.5) Fine Science Tools 11251-20
Angled Fine Tip forceps (Dumont No. 5/45) Fine Science Tools 11253-25 For blunt dissecting
Curved Fine Tip forcep (Dumont No.7) Fine Science Tools 11273-22 Useful to pass around vessels
Curved Crile Haemostat Fine Science Tools 1300-04
Micro clip applicator with lock Fine Science Tools 18056-14
2 x Micro serrefines spring width 2mm, jaw length 4mm Fine Science Tools 18055-04 Microvascular clamps
2 x Colibri 3cm wire retractor Fine Science Tools 17000-03
Castroviejo needle holder with lock Fine Science Tools 120660-01
Wound clip applicator Fine Science Tools 12031-07
7mm wound clips Fine Science Tools 12032-07 Remove 7 to 10 days after surgery
Equipment
OPMI pico microscope Carl Zeiss S100
Thermal cautery unit with fine tip Geiger 150A
Heat electronic pad Cozee Cumfort n/a
Euroklav 23-S Melag n/a Autoclave
Disposable equipment
7/O Silk braided suture Pearsall 30514
10/O Dafilon (polyamide) suture B-Braun  G1118099
6/O Vicryl (plygalectin) Ethicon W9537
Regular bevel needle, 1 inch, 21G Bection, Dickinson and Company 305175 For ureteric anastamosis
Regular bevel needle, 5/8 inch, 25G Bection, Dickinson and Company 305122
Regular bevel needle, 1/2 inch, 30G Bection, Dickinson and Company 304000
Insulin needle 1ml, 29G Bection, Dickinson and Company 324827
Insulin needle 0.3ml, 30G Bection, Dickinson and Company 324826
1 ml syringe slip tip Bection, Dickinson and Company 300184
5 ml syringe slip tip Bection, Dickinson and Company 302187
Wypall paper swabs Kimberley-Clark L40 sterilised by autoclave
Cotton wool buds Johnson and Johnson n/a sterilised by autoclave
Plain drapes Guardian CB03 sterilised by autoclave
Cell culture dish 60mm x 15mm Corning Incorporated 430166
Dispensing Pin B-Braun DP3500L / 413501 Used with NaCl 0.9%
Re-agents and Drugs
(Lacri-Lube) White soft paraffin 57.3%, mineral oil 42.5% and lanolin alcohols 0.2% Allergan Ltd 21956GB10X
(Videne) Povidone-iodine 10% Ecolab Ltd PL 04509/0041
(Vetalar V) Ketamine hydrochloride Pfizer Animal Health Vm 42058/4165 100mg/ml solution (dose 200mg/kg)
(Domitor) Medetomidine hydrochloride  Orion Pharma Vm 06043/4003 1mg/ml (dose 0.5mg/kg)
(Vetergesic) Bupernorphine hydrochloride  Alsto Animal Health Vm 00063/4002 0.3mg/ml (dose 0.05mg/kg)
(Antisedan) Atipamezole hydrochoride Orion Pharma Vm 06043/4004 5mg/ml (dose 2mg/kg)
University of Wisconsin Solution Belzer Bridge to Life n/a dose approximately 500 microlitres/mouse
NaCl 0.9% Baxter FKE1323
Heparin Sulphate non-proprietary n/a 5000units/ml (dose 5units/mouse)

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

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