अलगाव और murine महाधमनी के छांटना; हृदय रोग के अध्ययन में एक बहुमुखी तकनीक

Medicine

Your institution must subscribe to JoVE's Medicine section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations | Reprints and Permissions

Robbins, N., Thompson, A., Mann, A., Blomkalns, A. L. Isolation and Excision of Murine Aorta; A Versatile Technique in the Study of Cardiovascular Disease. J. Vis. Exp. (93), e52172, doi:10.3791/52172 (2014).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Introduction

महाधमनी ऑक्सीजन युक्त रक्त और शरीर के अन्य लोगों के समान भागों के साथ शरीर की आपूर्ति हृदय समारोह में एक निर्णायक भूमिका निभाता है, बीमारी के लिए अतिसंवेदनशील है। आम महाधमनी रोगों भोजन, धूम्रपान और आसीन जीवन शैली एक सहित आनुवांशिक और पर्यावरणीय कारकों का परिणाम हैं जो atherosclerosis और धमनीविस्फार, शामिल हैं। Atherosclerosis आम तौर पर पुरानी हाइपरलिपिडीमिया 2 के साथ रोगियों में पाया महाधमनी दीवार के लिए एक कैल्शियम और लिपिड आधारित पट्टिका का बयान है। Aneurysms अंततः तीन टूटना करने के लिए ले जा सकता है जो एक बढ़ा व्यास द्वारा पीछा महाधमनी और पोत दीवार के thinning के संरचनात्मक घटकों, की गिरावट की विशेषता है।

पशु मॉडलों की बीमारी और संभावित उपचार की प्रभावकारिता के तंत्र का अध्ययन करने के लिए इस्तेमाल महत्वपूर्ण उपकरण हैं। हृदय अनुसंधान में इस्तेमाल आम पशु मॉडल, विशेष रूप से संवहनी और चयापचय विकारों की जांच के लिए अनुसंधानऐसे अपोलीपोप्रोटीन ई जीन पीटा और कम घनत्व वाले लिपोप्रोटीन रिसेप्टर जीन पीटा चूहों के रूप में 4 लिपिड स्तर में परिवर्तन करने के लिए आनुवंशिक रूप से संशोधित चूहों शामिल हैं। रोग और उपचार की प्रभावकारिता के तंत्र का मूल्यांकन करने के तरीकों में से बहुमत महाधमनी के अलगाव और छांटना भी शामिल होगा।

महाधमनी स्थानीय और अलग-थलग हो जाने के बाद, morphometric विश्लेषण ऐसे धमनीविस्फार की उपस्थिति, आम तौर पर व्यास 5 में एक अधिक से अधिक से अधिक 50% की वृद्धि के रूप में परिभाषित के रूप में निर्धारित किया जा सकता है। सीटू विश्लेषण में आवश्यक पूरा होने पर, महाधमनी आगे के विश्लेषण के लिए excised जा सकता है। एक excised महाधमनी ऐसे प्रोटीन और / या जीन अभिव्यक्ति assays के रूप में या आणविक अध्ययन का संचालन करने के लिए जमे हुए फ्लैश किया जा सकता है 4% paraformaldehyde का उपयोग कर तय की और बाद में, एम्बेडेड sectioned और histological विश्लेषण के लिए दाग। महाधमनी के histological विश्लेषण इस तरह के संरचनात्मक गिरावट, पट्टिका गठन, और leukocytes की घुसपैठ के रूप में महाधमनी रोग के आम सुविधाओं का प्रदर्शन कर सकते हैं <समर्थन> 6,7। इसके अतिरिक्त, एक excised महाधमनी बाद में इन विट्रो अध्ययन में 7 की एक किस्म के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है जो endothelial और चिकनी मांसपेशियों की कोशिकाओं सहित प्राथमिक सेल लाइनों को अलग-थलग करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है।

वर्तमान में, महाधमनी रोग के इस में गहराई लक्षण वर्णन उपलब्ध कराने के साथ ही आगे हृदय रोग का अध्ययन करने के उपकरण के साथ शोधकर्ताओं प्रदान करने के लिए कोई अन्य तरीके हैं। ऐसे चुंबकीय अनुनाद इमेजिंग, गणना टोमोग्राफी और अल्ट्रासोनोग्राफी के रूप में रूपरेखा इमेजिंग लेकिन इस छोटे जानवरों में मुश्किल है और पर्याप्त प्रौद्योगिकी के साथ एक डिवाइस प्राप्त आठ महंगा है, आकृति विज्ञान महाधमनी का मूल्यांकन करने के लिए करीब तरीके हैं। अमर सेल लाइनों हालांकि इन कोशिकाओं के कृत्रिम प्रकृति सेल जीवन चक्र और apoptosis 9 पर प्रभाव का अध्ययन करने में सीमित कर रहे हैं रोग और उपचार की प्रभावकारिता के संभावित तंत्र, जांच करने के लिए खरीदा जा सकता है।

के समग्र लक्ष्यइस पांडुलिपि हृदय रोग की जांच में murine महाधमनी के बाँझ अलगाव और छांटना प्रदर्शित करने के लिए है।

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

सभी पशु प्रक्रियाओं, सिनसिनाटी विश्वविद्यालय की संस्थागत पशु की देखभाल और उपयोग समिति की और राष्ट्रीय स्वास्थ्य संस्थान से प्रयोगशाला पशुओं की देखभाल और उपयोग के लिए गाइड के अनुसार अनुमोदन (एनआईएच प्रकाशन संख्या 85-23 के साथ प्रदर्शन किया गया ) 1996 में संशोधन किया।

1. माउस की तैयारी

  1. संवेदनाहारी के supratherapeutic खुराक के लिए पशु उजागर द्वारा Euthanize, isoflurane के प्रभाव को साँस। एक हानिकारक प्रोत्साहन के रूप में पैर की अंगुली चुटकी के माध्यम से प्राथमिक इच्छामृत्यु की जाँच करें। इच्छामृत्यु, डायाफ्राम काटने की माध्यमिक विधि, एक आगामी चरण में घटित होगा। वैकल्पिक तरीकों का इस्तेमाल दी इच्छामृत्यु प्राप्त किया जाता है हो सकता है।
  2. Sanitizie नमी की बात करने के लिए 70% इथेनॉल के साथ, प्रारंभिक कटौती बनाया जाएगा, जहां पेट क्षेत्र, साथ फर छिड़काव से माउस की बाहरी सतह इतनी है कि फर इथेनॉल के साथ गीला है और किसी भी ढीली / ड्राई बाल दर्ज नहीं करते क्षेत्र।
  3. एक सुर पर माउस बाहर रखनाऊपरी और निचले appendages के साथ लापरवाह स्थिति में gical बोर्ड जावक बढ़ाया।
  4. सर्जिकल टेप का उपयोग कर बोर्ड को सुरक्षित उपांग।

दिल और महाधमनी के 2. अलगाव

  1. माउस के उचित स्थिति के बाद, पता लगाने और उरोस्थि के असिरूप प्रक्रिया के लिए सिर्फ अवर पेट की त्वचा अलग करने के लिए संदंश का उपयोग करें।
  2. सीधे त्वचा को हटाने के द्वारा तनाव पैदा और पेरिटोनियम और वक्ष गुहा के अवर भाग के बेहतर भाग उजागर सतही त्वचा को हटाने के लिए कैंची का उपयोग करें।
  3. असिरूप प्रक्रिया उठाने और subcostal मार्जिन के साथ प्रक्रिया करने के लिए सिर्फ अवर पार्श्व चीरों बनाकर पेरिटोनियल गुहा दर्ज करें।
  4. दिल या किसी भी प्रमुख रक्त वाहिकाओं फाड़ना के लिए नहीं सुनिश्चित किया जा रहा, डायाफ्राम के माध्यम से जा रहे हैं, वक्ष गुहा में काटना।
  5. Ribcage के अग्र भाग को दूर करने के लिए कदम 2.3 cranially में किए गए पार्श्व चीरों बढ़ाएँ। अगरआवश्यक हो, कुंद विच्छेदन का उपयोग कर पूर्वकाल छाती दीवार से दिल को मुक्त।
  6. सामग्री अवशोषित करने के लिए बाँझ धुंध का उपयोग करके बाहरी रक्त और तरल पदार्थ की छाती गुहा को साफ करें। क्षेत्र में अधिक दिखाई दे रहा है एक बार, बेहतर दिल और महाधमनी का पर्दाफाश करने के फेफड़ों को हटा दें।

दिल और महाधमनी के 3. छिड़काव

नोट: इस कदम को इसलिए बस से पहले करते हैं, हृदय पंचर के माध्यम से रक्त प्राप्त करने के लिए।

  1. बाँझ बर्फ के ठंडे 1x फॉस्फेट बफर समाधान (पीबीएस) के 10 एमएल के साथ एक 10 सीसी सिरिंज भरें, और सिरिंज के लिए एक 25 गेज सुई देते हैं।
  2. धीरे दिल के बाएं वेंट्रिकल में सुई डालने।
  3. छिड़काव से दबाव buildup को कम करने के लिए सही आलिंद काटें। 3 मिनट - 2 पर माउस में सिरिंज की सामग्री छिड़कना।
  4. छिड़काव तरल पदार्थ को अवशोषित करने के लिए सही अलिंद में उद्घाटन के अवसर पर बाँझ धुंध का प्रयोग करें।

महाधमनी के 4. अलगाव और छांटना

  1. पीई के पूरा होने परrfusion, वक्ष गुहा के भीतर देखने के क्षेत्र झाई युक्त किसी भी शेष तरल पदार्थ को अवशोषित करने के लिए बाँझ धुंध का उपयोग करें।
  2. Suprapubic क्षेत्र के लिए चीरा बढ़ा है, पेट की दीवार के माध्यम से दुमदारी काटने से जठरांत्र सामग्री को बेनकाब। द्विपक्षीय स्तर नीचे टिकी या excised किया जा सकता है जो त्वचा फ्लैप बनाने के लिए निचले अंगों की दिशा में आगे चीरा बढ़ाएँ।
  3. बेहतर महाधमनी कल्पना करने के लिए जिगर, अग्न्याशय, पेट, प्लीहा, और आंतों की पालियों निकालें। महाधमनी गुर्दे की धमनियों की शाखाओं में सतही है, के रूप में perirenal क्षेत्र के पास विदारक जब ख्याल रखना।
    ध्यान दें: एक सटीक में इस चरण पर कार्यवाई और जठरांत्र संबंधी मार्ग संदूषण के लिए प्रवृत्ति बढ़ जाती है, जो बैक्टीरिया के साथ समृद्ध है के रूप में ढंग से मैट्रिक पास।
  4. 1x पीबीएस के साथ क्षेत्र कुल्ला और एक बाँझ धुंध के साथ अवशोषण द्वारा सभी तरल पदार्थ को हटा दें।
  5. बाँझ microscissors के और microforceps का उपयोग करना, रीढ़ की हड्डी के पीछे की ओर और पेट के बल घेघा से महाधमनी अलग।यह कुंद विच्छेदन और इस के लिए एक विच्छेदन खुर्दबीन के उपयोग का उपयोग करने के लिए सबसे अच्छा है।
    नोट: महाधमनी अलग-थलग करने में, श्रोणिफलक विभाजन पर दुमदारी शुरू करने और दुमदारी विदारक carotids और प्रगंडशीर्षी धमनियों में cranially cranially सफाई और गुहा की पृष्ठीय सतह से महाधमनी को अलग करने के लिए कदम या शुरू करते हैं। या तो विधि उपयुक्त है और शोधकर्ताओं के आराम करने के लिए है।
  6. महाधमनी दीवार के एक हिस्से को हटाने के लिए नहीं सुनिश्चित किया जा रहा है ठीक microscissors का उपयोग कर परिवाहकीय वसा ऊतकों निकालें। यह महाधमनी चिकनी मांसपेशियों की कोशिकाओं संवर्धन जब तंतुप्रसू संदूषण के लिए संभावित कम करने के लिए आवश्यक है।

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

प्रक्रिया के पूरा होने पर, अभी भी (चित्रा 1 ए) जुड़ी गुर्दे धमनियों के साथ वक्ष और उदर cavities में उतरते दिल से होने वाले एक अक्षुण्ण महाधमनी, वहाँ हो जाएगा। यहाँ से, महाधमनी उदर महाधमनी aneurysms (चित्रा 1 बी और 1 सी) के अध्ययन में नैदानिक ​​हैं जो morphometric परिवर्तन यों के लिए बगल में imaged किया जा सकता है। बाद में, महाधमनी, हटाया तय की और ऊतकीय परिवर्तन को देखने के लिए कलंकित किया जा सकता है। महाधमनी के एक सामान्य और आम दाग hematoxylin और eosin दाग (2A चित्रा और 2 बी) है। इसके अतिरिक्त, महाधमनी के संरचनात्मक अखंडता गुणात्मक इलास्टिन बैंड (चित्रा -2 और 2 डी) को देखने के लिए Verhoff वैन Geison धुंधला का उपयोग मात्रा निर्धारित किया जा सकता है। इसके बजाय एक histological विश्लेषण प्राप्त करने की, फ्लैश सकता है अन्वेषक बाद प्रोटीन और Ribonucleic एसिड Expre के लिए महाधमनी फ्रीजssion। अन्वेषक के लिए अंतिम विकल्प प्राथमिक सेल अलगाव प्राप्त करने के लिए महाधमनी का उपयोग करने के लिए है। इन कोशिकाओं को संस्कृति (चित्रा 3A) में वृद्धि हुई है और व्यवहार्यता अध्ययन (3B चित्रा) और प्रोटीन स्थानीयकरण (चित्रा -3 सी) सहित इन विट्रो अध्ययन की एक किस्म के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है।

चित्रा 1
Murine महाधमनी के सीटू प्रतिनिधि छवियों में चित्रा 1। (ए) के दिल और गुर्दे सहित महाधमनी के अलगाव के बाद सामान्य माउस शरीर रचना विज्ञान के चित्रण। (बी) के एक सामान्य बरकरार murine उदर महाधमनी की छवि को बढ़ाया। (सी) suprarenal में एक धमनीविस्फार के साथ एक रोगग्रस्त उदर महाधमनी की छवि को बढ़ाया क्षेत्र। वें का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करेंआंकड़ा है।

चित्रा 2
Murine महाधमनी के 2. histological विश्लेषण चित्रा। 20X बढ़ाई (ए) एक स्वस्थ suprarenal महाधमनी का एक सामान्य hematoxylin और eosin दाग के प्रतिनिधि छवि। (बी) 20X बढ़ाई hematoxylin और eosin दाग के बाद अंदर का थक्का के साथ एक aneurismal suprarenal महाधमनी के प्रतिनिधि छवि। (सी) एक के प्रतिनिधि छवि 10X बढ़ाई पर एक सामान्य suprarenal महाधमनी के इलास्टिन बैंड पर प्रकाश डाला Verhoff वैन Geison दाग,। (डी) thinning और इलास्टिन बैंड और उमड़ना की striating द्वारा नोट एक suprarenal महाधमनी विकासशील रोग के इलास्टिन बैंड पर प्रकाश डाला एक Verhoff वैन Geison दाग के प्रतिनिधि छवि adventitial परत की। कृपया सीएलआईइस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां सी.के.।

चित्रा 3
चित्रा 3. प्राथमिक महाधमनी myocytes महाधमनी से सुसंस्कृत। (ए) उदर महाधमनी से प्राप्त 20X बढ़ाई संस्कृति में प्राथमिक महाधमनी myocytes के प्रतिनिधि छवि। (बी) से प्राप्त 20X बढ़ाई एच 22 के 500 माइक्रोन उपचार के बाद एक Trypan नीले अपवर्जन परख के दौरान प्राथमिक महाधमनी myocytes के प्रतिनिधि छवि उदर महाधमनी। (सी) उदर महाधमनी से प्राथमिक अलग महाधमनी चिकनी मांसपेशियों की कोशिकाओं में अल्फा actin के लिए एक immunohistochemistry दाग के प्रतिनिधि छवि। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

लेखकों का खुलासा करने के लिए कुछ भी नहीं है।

Acknowledgments

लेखकों कोई स्वीकृतियां है।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Isoflurane Med-Vet International #RXISO-250
70% ethanol Fisher 07-678-001
Phosphate buffered saline Sigma Aldrich P5368-10PAK
Surgical tape 3M 1527-1
Sterile gauze Dukal Corporations 1312
25 gauge needle BD 305122
10 ml syringe BD 309604

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Go, A. S., et al. Heart disease and stroke statistics--2014 update: a report from the American Heart Association. Circulation. 129, (3), 28-292 (2014).
  2. Ross, R., Harker, L. Hyperlipidemia and atherosclerosis. Science. 193, (4258), 1094-1100 (1976).
  3. Clouse, W. D., et al. Acute aortic dissection: population-based incidence compared with degenerative aortic aneurysm rupture. Mayo Clin Proc. 79, (2), 176-180 (2004).
  4. Daugherty, A., Cassis, L. A. Mouse models of abdominal aortic aneurysms. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 24, (3), 429-434 (2004).
  5. Pleumeekers, H. J., et al. Aneurysms of the abdominal aorta in older adults. The Rotterdam Study. Am J Epidemiol. 142, (12), 1291-1299 (1995).
  6. Brophy, C. M., Reilly, J. M., Smit, G. J., Tilson, M. D. The role of inflammation in nonspecific abdominal aortic aneurysm disease. Ann Vasc Surg. 5, (3), 229-233 (1991).
  7. Ray, J. L., Leach, R., Herbert, J. M., Benson, M. Isolation of vascular smooth muscle cells from a single murine aorta. Methods Cell Sci. 23, (4), 185-188 (2001).
  8. Weiss, R. G. Imaging the murine cardiovascular system with magnetic resonance. Circ Res. 88, (6), 550-551 (2001).
  9. Graham, E. L., Balla, C., Franchino, H., Melman, Y., del Monte, F., Das, S. Isolation culture, and functional characterization of adult mouse cardiomyoctyes. J Vis Exp. (79), 50289 (2013).
  10. Wassef, M., Upchurch, G. R. Jr, Kuivaniemi, H., Thompson, R. W., Tilson, M. D. 3rd Challenges and opportunities in abdominal aortic aneurysm research. J Vasc Surg. 45, (1), 192-198 (2007).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics