İzolasyon ve Kemirgen Aort eksizyonu; Kardiyovasküler Hastalığı Çalışmasında Çok Yönlü Tekniği

Medicine

Your institution must subscribe to JoVE's Medicine section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations | Reprints and Permissions

Robbins, N., Thompson, A., Mann, A., Blomkalns, A. L. Isolation and Excision of Murine Aorta; A Versatile Technique in the Study of Cardiovascular Disease. J. Vis. Exp. (93), e52172, doi:10.3791/52172 (2014).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Introduction

Aort oksijenli kan ve vücut burada da benzer kısımlar ile vücut temin kardiyovasküler fonksiyon çok önemli bir rol oynar, hastalığa karşı hassastır. Ortak aort hastalıkları diyet, sigara ve sedanter yaşam tarzı 1 olmak üzere genetik ve çevresel faktörlerin sonuçları ateroskleroz ve anevrizma içerir. Ateroskleroz, tipik olarak kronik hiperlipidemi 2 olan hastalarda bulunan aort duvarının bir kalsiyum ve lipit bazlı plak birikmesidir. Anevrizma sonuçta 3 yırtılmasına neden olabilecek bir artış çapı ardından aorta ve damar duvarının incelme yapısal elemanların bozulma ile karakterize edilir.

Hayvan modelleri hastalık ve potansiyel tedavilerin etkinliğinin mekanizmasını incelemek için kullanılan önemli araçlardır. Kardiyovasküler araştırmalarda yaygın olarak kullanılan hayvan modelleri, özellikle vasküler ve metabolik bozuklukların araştırılması aratmakBöyle Apolipoprotein E gen nakavt ve düşük yoğunluklu lipoprotein reseptör gen nakavt fareler 4 olarak lipid düzeylerini değiştirmek için genetiği değiştirilmiş fareler vardır. hastalık ve tedavinin etkinliğinin mekanizmasının değerlendirilmesi için yöntemlerin çoğunluğu, aort izole edilmesini ve çıkarılmasını içerir.

Aort lokalize ve izole edildikten sonra, morfometrik analizi, anevrizma varlığında, tipik olarak çap 5 daha büyük bir% 50 artış olarak tarif edildiği gibi belirlenebilir. Yerinde analiz gerekli işlemi tamamlandıktan sonra, aort, ileri analiz için çıkartılır. Bir eksize edilen aort örneğin protein ve / veya gen sentezleme tahlilleri ya da moleküler çalışmalar yapmak için dondurulmuş flaş olabilir% 4 paraformaldehid ile sabitlenmiş ve sonra sarılır, bölümlere ayrılır ve histopatolojik analiz için boyanmıştır. Aort histolojik analiz gibi yapısal bozulma, plak oluşumu ve lökositlerin sızması gibi aort hastalığı ortak özellikler göstermektedir <sup> 6,7. Buna ek olarak, bir eksize edilen orta damar alındı, in vitro çalışmalar 7 çok çeşitli kullanılabilir endotel ve düz kas hücreleri dahil olmak üzere birincil hücre hatları izole etmek için kullanılabilir.

Şu anda, aort hastalığı bu derinlemesine karakterizasyonu sağlamak yanı sıra kardiyovasküler hastalık çalışma araçları ile araştırmacılara sunmak için başka yöntemler vardır. Manyetik rezonans görüntüleme, bilgisayarlı tomografi ve ultrasonografi gibi görüntüleme yöntemleri ancak bu küçük hayvanlarda zor ve yeterli teknolojisine sahip bir aygıtı elde 8 pahalı, morfolojik aorta değerlendirmek için yakın yöntemlerdir. Ölümsüzleşmiş hücre hatları, ancak bu hücrelerin yapay doğa hücre yaşam döngüsü ve apoptoz 9 üzerindeki etkileri araştırmakla sınırlayıcı hastalık ve tedavilerin etkinliğinin potansiyel mekanizmaları, araştırmak için satın alınabilir.

genel amacıBu yazının kardiyovasküler hastalık soruşturma kemirgen aorta steril izolasyon ve eksizyonu göstermektir.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Tüm hayvan prosedürleri, Cincinnati Üniversitesi Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Komitesi ve Ulusal Sağlık Enstitüleri Laboratuar Hayvanlarının Bakımı ve Kullanımı Kılavuzu uyarınca onay (NIH Yayın No. 85-23 ile yapıldı ) 1996 Revize.

1. Fare Hazırlanması

  1. Anestezik bir tedavi üstü doz hayvan teşhir ederek Euthanize, izofluran etkisi inhale. Bir zararlı uyarıcı olarak ayak tutam yoluyla birincil ötenazi doğrulayın. Ötenazi, diyafram kesme İkincil yöntem, yaklaşan adım ortaya çıkar. Alternatif yöntemler kullanılmıştır verilen ötenazi elde edilir edilebilir.
  2. Sanitizie nem alanına için% 70 etanol ile, ilk kesim yapılacaktır karın bölgesi boyunca kürk püskürterek fare dış yüzeyi, böylece kürk, etanol ile ıslatılmış ve herhangi bir serbest / kuru tüyleri girmezler bölge.
  3. Bir sur üzerinde fare dışarı LayÜst ve alt uzantıları ile yatar pozisyonda rahi kurulu dışa genişletilmiş.
  4. Cerrahi bandı kullanarak kuruluna Güvenli uzantıları.

Kalp ve Aort 2. izolasyonu

  1. Farenin doğru konumlandırma sonra, bulmak ve sternum kılıç şeklinde sürecine sadece aşağı karın cildi izole etmek forseps kullanabilir.
  2. Düz yukarı kaldırarak cilt gerginliği oluşturun ve periton ve göğüs boşluğunun alt kısmının üstün kısmını açığa yüzeysel cilt kaldırmak için makas kullanın.
  3. Kılıç şeklinde sürecini kaldırma ve subkostal kenarları boyunca sürecine sadece aşağı yan kesiler yaparak periton boşluğuna girin.
  4. Kalp veya herhangi bir büyük kan damarları lacerate emin olmak, diyafram geçiyor, göğüs boşluğuna kadar parçalara ayır.
  5. Göğüs kafesi ön kısmını kaldırmak için adım 2.3 cranially yapılan yanal kesiler uzatın. EğerGerekli, künt diseksiyon ile göğüs ön duvarından kalp ücretsiz.
  6. Malzeme emmek için steril gazlı bez kullanılarak gereksiz kan ve sıvı göğüs boşluğunu temizleyin. Alan daha görünür sonra, daha iyi kalp ve aorta maruz akciğerleri kaldırmak.

Kalp ve Aort 3. Perfüzyon

NOT: Bu adım çok hemen önce yapmak, kalp delinerek kan elde etmek için.

  1. Steril buz soğuk 1x Fosfat tampon çözeltisi (PBS), 10 ml bir 10 cc şırınga doldurun ve şırıngaya bir 25 gauge iğne takılır.
  2. Yavaşça kalbin sol ventrikül içine iğne takın.
  3. Perfüzyon basınç birikimini hafifletmek için sağ atrium kesin. 3 dakika - 2 üzerinde fare içine şırınga içeriğini serpmek.
  4. Perfüzyon sıvıyı emmek için sağ atrium açılışında steril gazlı bez kullanın.

Aort 4. İzolasyon ve eksizyonu

  1. PE tamamlanması üzerinerfusion, göğüs boşluğu içinde görüş alanını karıştırdığın kalan sıvıyı emmek için steril gazlı bez kullanın.
  2. Suprapubik bölgeye kesi uzanan, karın duvarından kaudal keserek gastrointestinal içeriğini Açığa. Bilateral aşağı tuş veya eksize edilebilir cilt flep oluşturmak için alt ekstremitelerde yönünde daha fazla kesi uzatın.
  3. Daha iyi aorta görselleştirmek için karaciğer, pankreas, mide, dalak, bağırsaklar ve lobları çıkarın. Aort renal arterlerin şubelerinde yüzeysel olarak, perirenal bölgesi yakınında diseksiyon dikkatli olun.
    NOT: kesin bu adımı gerçekleştirin ve gastrointestinal sistem kirlenme eğilimi artırır bakteri ile zengin olarak şekilde kaydolur.
  4. 1x PBS ile bölgeyi durulayın ve bir steril gazlı bez ile emilim bütün sıvıyı çıkarın.
  5. Steril Microscissors ve microforceps kullanarak, omurga dorsal ve ventral yemek borusu gelen aort ayırın.Bu künt diseksiyon ve bunun için bir diseksiyon mikroskobu kullanarak kullanmak en iyisidir.
    NOT: aort izole iliyak bifürkasyonunda kaudal başlayacak ve kaudal diseksiyon karotis ve brakiyosefalik arterlerde cranially cranially temizlik ve kavite dorsal yüzeyinden aort ayıran taşımak veya başlatın. Her iki yöntem uygun ve araştırmacılar konfor kadar.
  6. Aort duvarının bir kısmını kaldırmak için emin olmak ince microscissors kullanarak perivasküler yağ dokusu çıkarın. Bu aortik düz kas hücrelerinin kültür sırasında fibroblast ve kirlenme ihtimalini en aza indirmek için önemlidir.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Prosedürün tamamlanmasından sonra, hala (Şekil 1A) bağlı renal arter ile göğüs ve karın boşlukları içerisine inen kalp kaynaklı sağlam bir aort, orada olacak. Buradan, aort abdominal aort anevrizması (Şekil 1B ve 1C) çalışmalarında tanısal olan morfometrik değişiklikleri ölçmek için yerinde görüntülü olabilir. Daha sonra, aort, kaldırıldı sabit ve histolojik değişikliklere bakmak lekeli olabilir. Aort genel ve ortak leke hematoksilin ve eozin boyama (Şekil 2A ve 2B) 'dir. Buna ek olarak, aort yapısal bütünlüğü niteliksel elastin bant (Şekil 2C ve 2D) bakmak için Verhoff van Geison lekeleme kullanılarak ölçülebilir. Bunun yerine bir histolojik analiz elde, yanıp sönebilir araştırmacı sonraki protein ve ribonükleik asit Expre için aorta dondurmaksalgılanması. araştırmacı için son seçenek birincil hücre izolasyon elde etmek için aorta kullanmaktır. Bu hücreler, kültür (Şekil 3A) büyütüldü ve canlılık çalışmaları (Şekil 3B) ve protein lokalizasyonu (Şekil 3C) de dahil olmak üzere, in vitro çalışmalar çeşitli kullanılabilir.

Şekil 1,
Kemirgen aort yerinde temsilcisi görüntüleri Şekil 1.. (A) kalp ve böbrekler olmak üzere aort izolasyonu sonra normal fare anatomi Tasvir. (B) Normal sağlam kemirgen abdominal aorta görüntü Büyütülmüş. (C) suprarenal bir anevrizma ile hastalıklı karın aort görüntü Büyütülmüş bölge. th büyük halini görmek için buraya tıklayınızrakam.

Şekil 2,
Kemirgen aort 2. histolojik analiz Şekil. 20X büyütmede (A) sağlıklı böbreküstü aort normal hematoksilen ve eozin leke Temsilcisi görüntü. (B) 20X büyütme hematoksilen ve eozin boyası sonrası intramural trombüs ile anevrizmal böbreküstü aort Temsilcisi görüntü. (C) Temsilcisi görüntü 10X büyütmede normal böbreküstü aortun elastin bantları vurgulayarak Verhoff van Geison leke. (D) incelmesi ve elastin bantları ve kalınlaşması çizgilenmeler tarafından belirtildiği bir böbreküstü aort gelişmekte hastalığın elastin bantları vurgulayarak Verhoff van Geison leke Temsilcisi görüntü adventisyal tabakanın. Lütfen cliBu rakamın büyük halini görmek için buraya ck.

Şekil 3,
Şekil 3. Primer aort myocytes aortadan kültür. (A), abdominal aort elde 20X büyütme kültürü birincil aort miyositlerin Örnek görüntüsü. (B) 'den elde 20X büyütmede H2O 2, 500 uM tedavi sonrası Trypan mavi dışlama tahlili esnasında birincil aort miyositlerin Örnek görüntü abdominal aort. (C) abdominal aorta birincil izole aort düz kas hücrelerinde alfa aktin için bir immünohistokimya leke Temsilcisi görüntü. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Yazarlar ifşa hiçbir şey yok.

Acknowledgments

Yazarlar herhangi bildirimleri var.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Isoflurane Med-Vet International #RXISO-250
70% ethanol Fisher 07-678-001
Phosphate buffered saline Sigma Aldrich P5368-10PAK
Surgical tape 3M 1527-1
Sterile gauze Dukal Corporations 1312
25 gauge needle BD 305122
10 ml syringe BD 309604

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Go, A. S., et al. Heart disease and stroke statistics--2014 update: a report from the American Heart Association. Circulation. 129, (3), 28-292 (2014).
  2. Ross, R., Harker, L. Hyperlipidemia and atherosclerosis. Science. 193, (4258), 1094-1100 (1976).
  3. Clouse, W. D., et al. Acute aortic dissection: population-based incidence compared with degenerative aortic aneurysm rupture. Mayo Clin Proc. 79, (2), 176-180 (2004).
  4. Daugherty, A., Cassis, L. A. Mouse models of abdominal aortic aneurysms. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 24, (3), 429-434 (2004).
  5. Pleumeekers, H. J., et al. Aneurysms of the abdominal aorta in older adults. The Rotterdam Study. Am J Epidemiol. 142, (12), 1291-1299 (1995).
  6. Brophy, C. M., Reilly, J. M., Smit, G. J., Tilson, M. D. The role of inflammation in nonspecific abdominal aortic aneurysm disease. Ann Vasc Surg. 5, (3), 229-233 (1991).
  7. Ray, J. L., Leach, R., Herbert, J. M., Benson, M. Isolation of vascular smooth muscle cells from a single murine aorta. Methods Cell Sci. 23, (4), 185-188 (2001).
  8. Weiss, R. G. Imaging the murine cardiovascular system with magnetic resonance. Circ Res. 88, (6), 550-551 (2001).
  9. Graham, E. L., Balla, C., Franchino, H., Melman, Y., del Monte, F., Das, S. Isolation culture, and functional characterization of adult mouse cardiomyoctyes. J Vis Exp. (79), 50289 (2013).
  10. Wassef, M., Upchurch, G. R. Jr, Kuivaniemi, H., Thompson, R. W., Tilson, M. D. 3rd Challenges and opportunities in abdominal aortic aneurysm research. J Vasc Surg. 45, (1), 192-198 (2007).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics